CN1372598A - 诱导细胞死亡的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及诱导细胞死亡的方法。
Description
本发明涉及诱导细胞死亡的方法，更确切地说，但不仅仅局限于使用从乳头状瘤病毒中得到的E2和/或E7蛋白杀死细胞的方法。
乳头状瘤病毒(PV)，属于乳多空病毒家族的病毒，是具有双链环状DNA的DNA病毒，该双链环状DNA有许多基因包括E2、E6和E7基因。它们感染上皮细胞并通常诱导良性高增殖病变的形成。无数男人和女人患有由一种人体乳头状瘤病毒(HPV)所引起的生殖器道感染，该导致外阴部疣的病毒至少有95种类型。然而，一些类型的乳头状瘤病毒与更严重的情况如癌有关。例如，HPV16型和18型与女性的子宫颈癌(zur Hausen，H(1991)Virology，184，9-13)有关，牛乳头状瘤病毒(BPV)2型和4型分别与牛的膀胱癌和上消化道癌有关(Campo，M.S.，等(1992)Cancer Res.52，6898-6904，CampoM.S.，等(1994)Carcinogenesis，15，1597-1601)。人体子宫颈癌细胞表达病毒E6和E7癌基因，这些基因的产物增加了细胞的增殖并促进了细胞的无限增殖化(Crook，T.，andVousden，K.H.(1996)Papillomavirus Reviews：Current Research onPapillomaviruses(Lacey，C.，ed)55-60页，Leeds University Press，Leeds)。人体乳头状瘤病毒E2基因或缺少人体乳头状瘤病毒E2基因都被认为与感染PV的细胞一起在子宫颈癌的形成中起着主要作用。大多数子宫颈癌包含经染色体整合的HPV基因组的拷贝，其中病毒E2基因由于病毒环状DNA的开环而导致分离(Baker，C.C.，等(1987)J.Virol.，61，962-971)。进一步，E2基因的突变增加了HPV16的无限增殖能力(Romanczuk，H.，and Howley，P.M.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89，3159-3163)。
乳头状瘤病毒E2基因编码序列特异性DNA结合蛋白，该序列特异性DNA结合蛋白调控病毒基因表达，在病毒DNA复制中也需要该蛋白(Thierry，F.(1996)Papillomavims Reviews：Current Researchon Papillomaviruses(Lacey，C.，ed)21-29页，Leeds UniversityPress，Leeds)。E2蛋白与在病毒长调控区(LCR)内发现的一个反向重复序列的多个拷贝相结合为二聚体。依靠特定的PV病毒和被研究的特定E2蛋白，E2与这些位点的结合能激活或阻遏E6和E7癌基因的转录。例如，HPV16 E2蛋白激活从位于HPV16 LCR的3’末端的P97启动子的转录，它引起E6和E7癌基因的转录增加，而在几乎相同的条件下，BPV1 E2蛋白阻遏P97启动子的活性(Boulvard，V.等(1994)EMBO J.，13，5451-5459，Kovelman，R等(1996)Virol，70，7549-7560)。E2二聚体的每个亚单位包含两个被柔性绞链区分开的结构域：每个亚单位的N末端结构域介导病毒转录的调控，而C末端结构域介导DNA的结合(Giri，I.，和Yaniv，M(1998)EMBOJ.，7，2823-2329)。在BPV中，缺少N末端转录结构域的截短的E2蛋白也被表达。这些截短的E2蛋白(E2-TR)能阻遏病毒转录，并也能与具有全长的E2形成转录失活的异源二聚体(Barsoum，J.等(1992)J.Virol.，66，3941-3945)。
从HPV16、HPV18和BPV1得到的E2蛋白都对子宫颈癌细胞系的增殖和生存具有显著作用。我们已说明了HPV16 E2蛋白在经修饰的SiHa细胞中的表达。SiHa细胞是一个包含E2基因片段的单拷贝的HPV16转化细胞系。我们在重金属诱导的金属硫蛋白启动子的控制下，制造了表达HPV16 E2蛋白的SiHa-E2稳定细胞系。使用重金属诱导E2在这些细胞中的表达导致了经由细胞凋亡的细胞死亡(Sanchez-Perez，A.等(1997)J.Gen.Virol.，78，3009-3018)。E2诱导的细胞死亡表现出细胞凋亡的几个典型特征，包括：细胞膜出现气泡、染色质凝聚和出现带有亚-G0 DNA成分的细胞片段。类似地，HPV18 E2蛋白诱导HeLa细胞的细胞凋亡，HeLa细胞也是一个包含E2基因片段的拷贝的HPV18转化细胞系(Desaintes，C.，等，(1997)EMBO J.16.504-514)。BPV1 E2蛋白在SiHa或HeLa细胞中的表达表明它是，至少部分是，通过阻断细胞从G1期到S期的碱基转换来阻遏增殖(Hwang，E.S.，等(1993)J.Virol.，67，3720-3729，Dowhanick，J.J.，等(1995)J.Virol.，69，7791-7799，Hwang，E.S.，等(1996)Oncogene，12，795-803)。由于在这些实验中使用的增殖测定，几天后培养物上得到了菌落形成，BPV1 E2可能也在这些细胞系中诱导细胞凋亡。
还有证据表明E2蛋白可能对非HPV转化细胞有影响。HPV31 E2蛋白使用重组腺病毒在HPV阴性正常人体包皮角质形成细胞(NHKcells)中的表达，导致在细胞周期的S期抑制，及带有亚-G0 DNA成分的细胞的出现：是一个细胞凋亡的典型特征(Frattini，M.G.，等(1997)EMBO J.，16，318-331)。然而，BPV1 E2对C33a细胞或SAOS细胞的增殖没有作用，C33a细胞是一种HPV阴性子宫颈癌细胞系，SAOS细胞是一种HPV阴性骨肉瘤细胞系(Dowhanick，J.J.等(1995)J.Virol.69.7791-7799)。进一步，HPV18 E2蛋白对C33a细胞、SAOS细胞或HACat细胞的细胞凋亡的数量没有作用，HACat细胞是一种自动无限增殖的HPV阴性人体角质形成细胞系(Desaintes，C.，等(1997)EMBO J.，16.504-514)。
目前，没有模型能满意地解释E2蛋白对细胞增殖的影响。图1是从HPV16 E2蛋白到诱导细胞凋亡的几个可能途径的示意图。底线代表整合HPV基因组，弯箭头表示P97启动子。E2蛋白调控HPV16E6和E7基因(开放框)的转录。E6与p53结合并减少了细胞内p53的半衰期。E7与Rb结合并导致E2F的释放。p53和E2F都能产生细胞凋亡。注意到即使不依赖于E2对E6和E7转录的影响，E2也能诱导细胞凋亡。在包含整合的HPV DNA的细胞系中，已表明BPV1E2和HPV18 E2能阻遏HPV18 E6和E7癌基因的转录(Hwang，E.S.，等(1993)J.Virol.，67，3720-3729，Desaintes，C.，等(1997)EMBOJ.，16.504-514)。
肿瘤抑制蛋白p53被很好地表征。有许多p53的突变体以及p53相关基因，例如p73和p63(White，E.和Prives.C.，Nature，399.61999)。E6蛋白与肿瘤抑制蛋白p53相结合，这种作用导致细胞内p53的半衰期减少(Werness，B.A.等(1990)Science.248，76-79，Scheffner，M.，等(1990)Cell.63，1129-1136，Lechner，M.S.等(1992)EMBOJ.，11，3045-3052，Hubbert，N.L.等(1992)J.Virol.，66.6237-6241)。山于p53能阻断细胞周期进程和/或诱导细胞凋亡(Gottlieb，T.M.和Oren，M.(1998)Seminars in Cancer Biol.，8.359-368)，E6的降低可能期望导致p53的增加和细胞周期抑制的增加和/或细胞死亡(如图1中图解)。与此观点相一致，BPV1 E2在HeLa细胞中的表达显示出可以稳定p53(Hwang，E.S.，等(1993)J.Virol.，67，3720-3729，Desaintes，C.，等(1997)EMBO J.，16.504-514)。然而，E2-TR也阻遏E6和E7在这些细胞中的转录，但这截短的E2蛋白既不能稳定p53，也不能诱导细胞凋亡(Desaintes，C.，等(1997)EMBO J.，16.504-514)。这表明N末端转录调控结构域对这些作用负责，E2对E6转录的阻遏不是诱导细胞凋亡的关键因素。另外，HPV31 E2在NHK细胞中的表达显示出使p53不稳定(Frattini.M.G.等(1997)EMBO J.16.318-331)。
E7蛋白与Rb肿瘤抑制蛋白、Rb相关蛋白p107和p130相结合(Dyson，N.，等(1989)Science，243，934-937，Hu，T.，等(1995)Int.J.Oncology.6.167-174)。E7与Rb的结合导致从Rb-E2F复合物中释放出E2F蛋白，也被认为是为依赖于泛蛋白的蛋白酶解作用而进攻Rb(Boyer.S.N.等(1996)Cancer Res.56.4620-3624，Jones，D.L.和Munger，K.(1997)J.Virol.，71，2905-2919，Virology，239，97-107)。当从Rb中释放后，转录因子E2F家族的成员激活S期所需的基因转录，E2F-1的过量表达可诱导血清饥饿细胞的细胞凋亡(Wu X.，和Levine，A.J.(1994)Proc.Natl.Acad.USA 91.3602-3606，Qin.X.Q.，等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91.10918-10922)。所以，E2对E7转录的阻遏可能被期望降低游离E2F的数量，并导致细胞周期的抑制(见所附图1)。
BPV1 E2蛋白在HeLa细胞中的表达伴随着E2F-1 mRNA和蛋白的降低以及E2F依赖性基因的表达减少(Hwang，E.S.等(1996)Oncogene，12，795-803)。而HPV16 E2蛋白在SiHa细胞中的表达伴随着E2F活性增加(Sanchez-Perez，A.M.等(1997)J.Gen.Virol.78.3009-3018)。进一步，HPV31 E2蛋白在NHK细胞中的过量表达伴随着E2F-1 mRNA的增加(Frattini.M.G.等(1997)EMBOJ.16.318-331)。另一复杂之处在于不象BPV1 E2阻遏转录，HPV16和HPV18 E2蛋白都显示出能激活HPV16 E6和E7癌基因的转录(Bouvard，V.，等(1994)EMBO J.13.5451-5459，Kovelman，R.，等(1996)Virol，70.7549-7560)。E7数量的任何增加都可能导致游离E2F的增加，这反过来又会导致细胞死亡(Sanchez-Perez，A.M.等(1997)J.Gen.Virol.78.3009-3018)。
试图通过E6和E7基因的转录阻遏或激活来解释E2蛋白对细胞增殖影响的模型，显然都局限于HPV阳性细胞。然而，HPV31 E2蛋白显示出可诱导HPV阴性NHK细胞内的细胞凋亡(Frattini.M.G.等(1997)EMBO J.16.318-331)。此外，HPV16 LCR内的突变阻断E2与启动子近侧的E2位点结合，而且阻止E2介导的对E6和E7转录的阻遏，并不能完全减少E2对转化效率的负面影响。(Romanczuk，H.，and Howley.P.M.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89.，3159-3163)。这些报告表明E2可能独自影响细胞增殖，而与它对E6和E7转录的影响无关。为处理这个问题，我们在多种被瞬时转染的细胞系中表达了HPV16 E2蛋白。我们已说明这个E2蛋白能意外地在HPV转化和非HPV转化细胞系内诱导细胞凋亡。另外，我们已说明HPV16 E2诱导的细胞凋亡是p53依赖性的，以及诱导细胞死亡不需要E2蛋白的DNA结合活性。
WO98/01148(Harvard)公开了干扰被PV感染和/或转化的细胞的增殖的方法和成分。但没有披露使用E2来杀死PV阴性细胞、细胞的p53状态、被处理细胞内细胞凋亡的诱导或对PV免疫应答的产生。
WO94/04686(Biogen)说明了蛋白包括HPV E2多肽传递到基于HIV TAT蛋白的细胞的方法。但没有披露使用E2来杀死HPV阴性细胞、细胞的p53状态、被处理细胞内细胞凋亡的诱导或对PV免疫应答的产生。
WO92/12728(Biogen)公开了非功能性E2衍生多肽，特别是E2转激活阻遏蛋白，它与正常E2二聚并阻断它在HPV感染的细胞内的功能。但没有披露使用E2来杀死PV阴性细胞、细胞的p53状态、被处理细胞内细胞凋亡的诱导或对PV免疫应答的产生。
WO98/32861(Pasteur)公开了干扰被PV感染和/或转化的细胞的增殖的方法和成分。但没有披露使用E2来杀死PV阴性细胞或对PV免疫应答的产生，没有披露使用E7来杀死细胞，以及在DNA结合中使用任何缺陷型E2蛋白。
WO98/05248(Bristol-Myers Squibb公司)公开了使用多肽来应答PV感染，该多肽对应于在哺乳动物细胞内表达的肽，该肽对应于部分E6和E7蛋白。但没有披露使用E2肽或E2 DNA序列来预防PV感染或子宫颈癌。
一方面，本发明提供了一种诱导PV阴性p53野生型、p53突变型或p53相关基因阳性细胞的细胞凋亡的方法，包括用PV E2和/或E7蛋白或它们的功能部分或衍生物与这些细胞接触，或向这些细胞提供一个编码PV E2和/或E7蛋白或它们的功能部分或衍生物的DNA序列。
另一方面，本发明提供了一种杀死PV阳性细胞的方法，包括用PV E2和/或E7蛋白或它们的功能部分或衍生物与这些细胞接触，或向这些细胞提供一个编码PV E2和/或E7蛋白或它们的功能部分或衍生物的DNA序列。
进一步，本发明提供了一种杀死感染非HPV致癌病毒的细胞的方法，包括用PV E2和/或E7蛋白或它们的功能部分或衍生物与这些细胞接触，或向这些细胞提供一个编码PV E2和/或E7蛋白或它们的功能部分或衍生物的DNA序列。
进一步，本发明提供了一种杀死致癌细胞或致癌前体的方法，包括用PV E2和/或E7蛋白或它们的功能部分或衍生物与这些细胞接触，或向这些细胞提供一个编码PV E2和/或E7蛋白或它们的功能部分或衍生物的DNA序列。
进一步，本发明提供了一种治疗子宫颈癌的方法，包括用PV E2和/或E7蛋白或它们的功能部分或衍生物与被治疗者的子宫颈细胞接触，或向这些细胞提供一个编码PV E2和/或E7蛋白或它们的功能部分或衍生物的DNA序列。这种方法除了对引起癌细胞死亡有利外，还对由E2衍生物产生的对HPV的免疫应答有利。
进一步，本发明提供了一种诱导PV阴性细胞的细胞凋亡的方法，包括用PV E2和/或E7蛋白、它们的功能部分或衍生物和p53野生型蛋白或其功能部分或衍生物与这些细胞接触。
进一步，本发明提供了一种诱导PV阳性细胞的细胞凋亡的方法，包括用PV E2和/或E7蛋白、它们的功能部分或衍生物和p53野生型蛋白或其功能部分或衍生物与这些细胞接触。这种方法对可能由E2衍生物产生的对HPV的免疫应答有利。
进一步，本发明提供了一种诱导PV致癌细胞的细胞凋亡的方法，包括用PV E2和/或E7蛋白、它们的功能部分或衍生物和p53野生型蛋白或其功能部分或衍生物与这些细胞接触。
进一步，本发明提供了一种诱导PV子宫颈癌细胞的细胞凋亡的方法，包括用PV E2和/或E7蛋白、它们的功能部分或衍生物和p53野生型蛋白或其功能部分或衍生物与这些细胞接触。这种方法对可能由E2衍生物产生的对HPV的免疫应答有利。
进一步，本发明提供了一种诱导PV阴性细胞的细胞凋亡的方法，包括用PV E2和/或E7蛋白、它们的功能部分或衍生物和p53野生型蛋白与这些细胞接触。
进一步，本发明提供了一种诱导PV阴性细胞的细胞凋亡的方法，包括用PV E2和/或E7蛋白、它们的功能部分或衍生物和p53野生型蛋白和/或以包含p53突变型的细胞诱导p53野生型或p53野生型功能的药物与这些细胞接触。
进一步，本发明提供了一种诱导PV阴性细胞的细胞凋亡的方法，包括用PV E2和/或E7蛋白、它们的功能部分或衍生物和p53野生型与这些细胞接触。
进一步，本发明提供了一种诱导PV阴性细胞的细胞凋亡的方法，包括用PV E2和/或E7蛋白、它们的功能部分或衍生物和p53野生型蛋白以及能激活p53功能的任何诱导剂，例如DNA损害药物或UV、X射线或其它形式的辐射，来与这些细胞接触。
E2或E7或衍生物可由病毒手段提供如腺病毒、腺病毒相关病毒和痘病病毒，或由非病毒手段提供如VP22、穿透蛋白(penetratin)和脂质体。
在本发明中，尽管考虑使用E7蛋白和它的功能衍生物或其部分，但优选使用E2蛋白和它的功能衍生物或其部分。
按照本发明的方法，特别优选使用DNA结合缺陷型E2衍生物，因为它们不允许或不参与病毒复制，但仍杀死细胞并诱导免疫应答。
从HPV16、HPV18和BPV1中得到的E2蛋白都影响子宫颈癌细胞系的增殖和/或存活(Sanchez-Perez，A.M.等(1997)J.Gen.Virol.，78.3009-3018，Desaintes，C.等(1997)EMBO J.16.504-514，Hwang，E.S.，等(1993)J.Virol.67.3720-3729)。前面我们提出HPV16 E2蛋白通过激活病毒E7基因的转录，诱导HPV16转化SiHa细胞的细胞凋亡(Sanchez-Perez，A.M.等(1997)J.Gen.Virol.，78.3009-3018)。相反，其他人提出了HPV18 E2蛋白通过阻遏病毒E6和E7基因的转录，诱导HPV18转化HeLa细胞的细胞凋亡(Desaintes，C.等(1997)EMBO J.16.504-514)。这里，我们说明了HPV16 E2蛋白诱导几个非HPV转化HeLa细胞系内的细胞凋亡，支持了HPV31 E2蛋白显示出能诱导HPV阴性NHK细胞系内细胞凋亡的论证(Frattini，M.G.等(1997)EMBO J.16.318-331)。这些资料表明上述任一机理都不完全正确。E2蛋白或是不依赖于HPV基因组诱导细胞凋亡，或是这些蛋白通过两个途径来诱导细胞凋亡：一个需要其它HPV蛋白，另一个不依赖于其它HPV蛋白。
E7主要作为癌蛋白被广泛研究，但也作为细胞凋亡的诱导物。例如，E7被发现能致敏角质形成细胞，使其进行自发的细胞凋亡和对肿瘤坏死因子α应答的细胞凋亡(Stoppler，H.等(1998)Oncogene.17.1207-1214)。有证据提出E7诱导的细胞凋亡可通过依赖于p53和不依赖于p53两种途径发生(Howes，K.A.等(1994)Genesand Dev.8，1300-1310，Pan.H.，和Griep.A.E.(1994)Genes andDev.8，1285-1299，Stoppler，H.等(1998)Oncogene.17.1207-1214)。这里我们说明了在HeLa细胞系内，HPV16 E7蛋白的过量表达诱导细胞凋亡。E7诱导的细胞凋亡可被HPV16 E6的过量表达抵消，或被反式内源性失活(trans-dominant negative)p53突变体的表达抵消。这些结果强有力地提出HPV16 E7蛋白诱导这些细胞中的p53依赖性细胞凋亡。我们已说明，类似E7，HPV16 E2蛋白诱导HeLa细胞的细胞凋亡，且此细胞凋亡是p53依赖性的。E7和E2都能诱导包含HPV16 E6基因的细胞的细胞凋亡。鉴于E6与p53结合且这种作用导致p53半衰期的减少，这些活动也许看起来十分显著。然而，p53活性已在几个HPV阳性细胞系内得到证明(Butz，K.，等(1995)Oncogene，10，927-936，Desaintes，C.等(1997)EMBO J.16.504-514)。
我们说明了诱导HeLa细胞的细胞凋亡不需要HPV16 E2蛋白的序列特异性DNA的结合活性。相反，N末端结构域，包括转录激活结构域和绞链区域，对促进细胞死亡是必需的。BPV1 E2引起的生长抑制需要一个功能性DNA结合结构域和一个功能性转录激活结构域(Goodwin，E.C.等(1998)J.Virol.72.3925-3934)。这些资料表明HPV16 E2蛋白诱导的细胞凋亡和BPV1 E2蛋白诱导的生长抑制，都可由两个分别的途径得到。BPV1 E2蛋白产生的生长抑制被认为需要整合HPV癌基因的转录调控。所以，BPV1 E2蛋白诱导的生长抑制是整合E6和E7基因转录阻遏的结果(Goodwin，E.C.等(1998)J.Virol.72.3925-3934)。BPV E2对E6转录的阻遏可能导致p53的数量增加，这又导致p53依赖性的细胞凋亡(Hwang，E.S.，等(1996)Oncogene 12.795-803，Desaintes，C.等(1997)EMBOJ.16.504-514)。相反，HPV16 E2诱导的细胞凋亡的发生与DNA的结合活性无关，也与整合HPV序列的存在无关。
我们说明了HPV16 E2诱导的细胞凋亡需要两个功能性转录激活结构域。类似的用BPV1 E2和BPV1 E2-TR做的异源二聚体实验表明，有效的转录激活需要两个功能性转录激活结构域(Barsoum，J.等(1992)J.Virol.66，3941-3945)。目前还不清楚为什么每个E2二聚体的两个激活结构域对转录激活或诱导细胞凋亡是必需的。
简而言之，我们说明了在没有其它HPV基因产物的情况下，HPV16 E2蛋白导致了细胞凋亡，还说明了这种E2诱导的细胞凋亡是p53依赖性的。HPV基因组整合进入宿主染色体和随之发生的E2基因断裂除去了这一原细胞凋亡的信号。由于整合HPV序列继续产生E6和E7蛋白，这些细胞继续增殖并可能形成子宫颈癌肿瘤。
在本说明书中，下列表达式为解释所给出的、非限制性的下列含义：
1)“PV阳性”意为一个被PV感染或转化的细胞，而“PV阴性”则具有相反含义。
2)“蛋白”和“多肽”可以互换使用，尽管“蛋白”可能通常被认为是自然产生的多肽。
E2或E7的功能性衍生物是具有E2或E7的某些生物功能的蛋白质或多肽，例如，E2蛋白的N末端转录/复制结构域(氨基酸1-200)或E2蛋白的C末端结合结构域(氨基酸279-365)。E2或E7的功能性部分分别是具有至少部分天然的E2或E7序列的多肽。
按照本发明，诱导细胞死亡的方法和产物将通过例子并参照附图进行说明，图2至图14为：
图2说明HPV 16 E2对HeLa细胞的影响；
图3说明使用E2和E7诱导HeLa细胞的细胞凋亡的实验结果；
图4说明证明E2-诱导和E7-诱导的细胞凋亡为p53依赖性的实验结果；
图5说明在N296，K299和R304突变的截短E2蛋白E2Ct折叠和二聚，但未能结合DNA的实验结果；
图6说明诱导细胞凋亡不需要DNA结合，但需要N末端转录调控结构域的实验结果；
图7说明证明E2-E2Ct异源二聚体不诱导细胞凋亡的实验结果；以及
图8图解说明了用于下列实验的蛋白质；
图9说明HPV 16 E2的DNA和氨基酸序列；
图10说明HPVE2DBM的DNA和氨基酸序列；
图11说明E2Ct的DNA和氨基酸序列；
图12说明E2CtDBm的DNA和氨基酸序列；
图13说明VP22-E2融合蛋白诱导HeLa细胞内的细胞凋亡；
图14说明HPV 16 E2特异T细胞的应答。
1.试验程序-概要a.质粒
质粒pCB6+p53和pCB6+p53173L分别代表p53野生型和p53突变体，由Dr Moshe Oren和Dr Andy Phillips提供。质粒pCMX-GFP3代表绿荧光蛋白，由Dr Jeremy Tavare提供。从pUHD 15-1中除去携带CMV启动子的XhoI-EcoRI片段，用此片段取代pUHD 10-3中的诱导性四环素启动子，从而制得pWEB质粒。将从HPV16基因组DNA得到的适当HPV序列克隆至pWEB的唯一Eco RI位点，紧靠着CMV启动子的下游，从而得到HPV16 E2(图9)、E6和E7表达质粒。使 用 寡 核 苷 酸 引 物 E25’ 5’CTACGAATTCATGGAGACTCTTTGCCAACG 3’ 和E23’5’GATAGAATTCTCATATAGACATAAATCCAG 3’，从HPV 16 DNA模板中通过PCR(94℃1分钟，53℃3分钟，72℃1分钟，如此循环30次)将E2基因扩增。这些引物取代位于E2编码序列的5’和3’末端的Eco RI限制位点(全部以粗体强调)。PCR产物被克隆到pWEB的Eco RI位点，并用一组E2特异性测序引物测序以检查任何点突变的发生。使 用 具 有 Eco RI 位 点 的 引 物 E65’ 5’TGAGAATTCATGCACCAAAAGAGAACTGCAATGTTTCAG 3’和E63’5’ATCGAATTCTTACAGCTGGGTTTCTCTAGG 3’，从HPV16模板中通过PCR(95℃1分钟，52℃1分钟，68℃2分钟，如此循环30次)将E6基因扩增。PCR产物被克隆到pWEB的Eco RI位点，并用一组E6特异性测序引物测序。使 用 具 有 Eco RI 位 点 的 引 物 E75’ 5’TCGGAATTCATGCATGGAGATACACCTAC 3’和E73’5’AGCGAATTCTTATGGTTTCTGAGAACAGATGG 3’，从HPV 16模板中通过PCR(94℃1分钟，54℃2分钟，72℃1分钟，如此循环30次)将E7基因扩增。PCR产物被克隆到pWEB，并用一组E7 PCR引物测序。
突变的E2结构由使用PCR所产生。质粒pWEB-E2DBDm表达一突变的E2蛋白，其中E2 DNA结合结构域内的三个氨基酸(N296，K299和R304)被丙氨酸取代。通过PCR(94℃1分钟，55℃1分钟，68℃1分钟，如此循环30次)，同时使用引物pWEB 5’5’ACCTCCATAGAAGACACCGGG 3’和E2m5’CGACACTGCAGTATACAATGTACAATGCTTTTTAAATGCATATCTTAAACATGCTAAAGTAGCAGCATCACC 3’，并以pWEB-E2为模板，从而诱导突变。斜体的碱基与E2基因错配而诱导突变。PCR产物在3’末端包含一个PstI位点(以粗体强调)。这个位点和位于CMV启动子内的SstI位点被用来取代带有突变的E2DBDm序列的pWEB-E2内的野生型E2序列。整个PCR产物用一组E2特异性测序引物测序，以检查任何不想要的突变的发生。
质粒pWEB-E2Ct表达一截短E2蛋白，它缺少E2蛋白从1到279的N末端氨基酸，但能正常地二聚和结合DNA(Lewis，H.，和Gaston，K.(1999)J.Mol.biol.294：885-896)。为产生这一突变，通过PCR(94℃1分钟，55℃1分钟，68℃1分钟，如此循环30次)，同时使用引物E2Ct5’5’GAAACAGAATTCATGAACTGTAATAGTAACACTACACCC 3’和E23’，并以pWEB-E2为模板，使碱基对3592和3852之间的HPV 16序列扩增。这些引物取代产物两端的EcoRI限制位点(粗体)，并诱导一ATG翻译起始密码子(斜体)。PCR产物被克隆到pWEB内的EcoRI位点，并用E2特异性引物测序。质粒pWEB-E2CtDBDm表达一DNA结合缺陷型E2Ct。除了在PCR反应中使用pWEB-E2DBDm(它包括了具有N296A K299A和R304A突变的完全长度的E2)作为模板外，该质粒的生产与pWEB-E2Ct完全相同。
86氨基酸E2Ct(图11)和E2Ct DBDm(图12)蛋白在Escherichiacoli XL1-blue细胞中用表达载体pKK223-3(Pharmacia Biotech)被表达。序列编码E2Ct和2CtDBDm分别从pWEB-E2Ct和pWEB-E2Ct DBDm中作为EcoRI片段被切除，并克隆至pKK223-3内Ptac启动子下游的唯一EcoRI位点。该插入可用E2和pKK233-3特异性引物测序。
质粒pVP22-E2是由将整个HPV16 E2开放阅读框架克隆至具有VP22开放阅读框架的质粒pVP22/Myc-His(Invitrogen)的多克隆位点而产生。该插入可用pVP22/Myc-His-特异性引物测序。b.蛋白质纯化和圆二色性光谱学
包含pKK-E2Ct或pKK-E2CtDBDm的E.coli XL1-blue细胞(Stratagene公司)生长为在600nm下OD值是0.5。然后用1mMIPTG诱导蛋白质表达，且细胞在37℃下培育过夜。通过离心分离收集细胞，在含1mM MgCl2和1％2-巯基乙醇的50mM三乙酸盐-EDTA缓冲溶液(PH7.5)中再悬浮，然后在4℃下经超声处理裂解。细胞裂解物经离心分离(15,000g在4℃下进行30分钟)澄清，然后在20℃下用0.1％DNase I培育30分钟。细胞抽提液用含1％2-巯基乙醇的50mM磷酸盐缓冲溶液(PH5.7)透析3小时，然后再次离心。上清液装入一S-琼脂糖凝胶阳离子交换培养基柱内，并用含10mM DTT的50mM磷酸盐缓冲溶液(PH5.7)使之平衡，在用50柱体积的磷酸盐缓冲溶液冲洗后，使用一线性浓度梯度为0.2～1MNaCl的同一缓冲溶液超过500ml(速度为1ml/分)时，E2蛋白被洗脱。用SDS-PAGE和凝胶阻滞测定(数据未列出)来收集和分析蛋白峰(用A280nm检测)。收集的E2片段用10体积的含10mM DTT的50mM磷酸盐缓冲溶液(PH5.7)透析3小时，然后放入MonoS HR16/10阳离子交换柱内，并以相同缓冲溶液使之平衡。E2用线性浓度梯度为0.1～1M NaCl洗脱，在急速冷却和-70℃下保藏前，用含1mMDTT的25mM磷酸钠缓冲溶液(PH7.9)透析3小时。用Expasy Tools从E2野生型(pI 9.7；Mr 10016.6)和E2突变体(pI 9.4；Mr 9831.4)中的氨基酸序列测定等电点(pI)和分子量。分子量在一台VG Quattro三节四极质谱仪上通过电雾化电离作用得到证实。结构完整性在一台Jobin Yvon CD6旋光分光仪用远紫外和近紫外圆二色性光谱学得到证实，该旋光分光仪在1nm/分下采用0.05cm光程长度和0.5nm分离度。c.凝胶阻滞测定
与 HPV 16 E2 位 点 1 的 从 核 苷 酸 4 6 到 65(5’TTGAACCGAAACCGGTTAGT 3’)的序列相符的双链寡核苷酸(100ng)，端部用T4多核苷酸激酶(Stratagene公司)以[γ-32P]ATP标记。未包含的标记用一Sephadex G-50柱(Stratagene公司)除去。标记寡核苷酸(10000cpm)与纯化蛋白在结合缓冲溶液(20mMHEPES(pH7.9)，25mMKCl，1mMDTT，0.1％NP-40，10％甘油酰，0.5μg/μl牛血清清蛋白，80ng/μl poly[d(I·C)])中培育。在20℃下经过20分钟后，游离并被标记的DNA在0.5x TBE的6％非变性聚丙烯酰胺凝胶上解析，并用放射自显影术显示。在3M尿素(20℃下1小时)中将蛋白质混合和变性，然后在结合缓冲液中用0.1M尿素稀释使蛋白质再折叠，从而形成E2Ct野生型和E2CtDBDm的异源二聚体。异源二聚体的DNA结合活性的测定如上所述。d.细胞培养基和转染
SiHa、C33a、Saos-2、MCF-7和COS-7细胞在Dulbecco改进的Eagles培养基(Dulbecco’s Modified Eagles Medium，DMEM：Sigma)中保存，并补充10％胎牛血清(Foetal Bovine Serum，FBS：Sigma)、青霉素(1000000单位/升)和链霉素(100mg/升)。NIH 3T3细胞在DMEM中保存，并补充10％小牛血清(CS：Sigma)和青霉素/链霉素。HeLa细胞在极限必需培养基(Minimal Essensial Medium，MEM：Sigma)中保存，并补充10％FBS、2mM L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素。866、873、877、915和808F细胞在DMEM中保存，并补充5％FBS、青霉素/链霉素、2mM L-谷氨酰胺、5μg/ml胰岛素、0.01μg/ml上皮生长因子(EGF)、0.01μg/ml霍乱毒素和0.4μg/ml氢化可的松。所有细胞均在37℃下的5％CO2中保存。
在瞬时转染前，将细胞涂布在6个凹穴平皿内的盖玻片上，每个凹穴上有3×105个细胞，然后培育过夜，得到传代铺满培养物。根据制造商的操作指南，用于SiHa、NIH 3T3细胞的脂质体试剂Tfx-50和用于所有其它细胞的脂质体试剂Tfx-20(Promega)在每一转染中，按1ml血清游离培养基内脂质体：DNA的比例为3∶1来使用。用于每个转染的DNA在本文中均有描述。在18小时(E7实验)或30小时(E2实验)后，盖玻片在PBS中冲洗，细胞在22℃下用4％低聚甲醛/PBS固定30分钟。在进一步用PBS冲洗后，细胞用二苯并酰亚胺(bisbenzimide，Hoechst No.33258：Sigma)染色30分钟，然后用PBS冲洗，再用10μl MOWIOL(Calbiochem)将细胞固定在显微镜载片上。e.荧光显微术和成象
用Leica DM IRBE倒置落射荧光显微镜来进行荧光显微术，该显微镜配有FITC、DAPI过滤组和20x物镜(Leica)。成象用LeicaDM IRBE倒置共焦显微镜来观察，该显微镜配有63x油镜(Leica)和TCS-NT4软件(Leica)。2.HPV 16 E2和E7蛋白在HeLa细胞中诱导细胞凋亡
质粒pWEB-E2、pWEB-E6和pWEB-E7分别表达HPV 16 E2、E6和E7蛋白。每个质粒被瞬时转染用脂质体以提高其进入生长在盖玻片上的HeLa细胞的数量。图2显示了一组有代表性的HeLa细胞，可用装配有40x油镜的落射荧光显微镜观察到：(a)Bright field显微术(b)GFP荧光(c)DAPI荧光。在每个实验中，GFP表达质粒pCMX-GFP3被共转染入细胞内；pCMX-GFP3表达绿荧光蛋白(GFP)并允许通过其荧光经FITC过滤组的激发作用鉴别转染细胞。由于GFP均匀分布转染细胞内表达，它也允许细胞形态学的测定(图2b)。细胞用能进入所有细胞的细胞核的二苯并酰亚胺(Hoechststain)染色，且无论它们的转染状态如何，都允许比较未转染细胞与转染细胞的染色质凝聚情况(图2c)。单个细胞用GFP标记为未转染或转染，并分别用Hoechst染料和GFP测定染色质凝聚和细胞膜鼓泡。图2中显示了一个典型的正在经历细胞凋亡的转染细胞。细胞膜鼓泡在(a)和(b)中可见。正在经历细胞凋亡的未转染细胞和转染细胞的百分比可通过计数确定。
在与E2和E7表达质粒瞬时转染后，所见的细胞凋亡的HeLa细胞比例由图2示出。在每个实验中，大约有5％的未转染细胞和5％的带有空pWEB载体的转染细胞为细胞凋亡。E2和E7表达质粒都显著增加了转染细胞群(population)中细胞凋亡的数量(分别如图3a和图3b所示)。如图2所示，在未转染和转染细胞群中的细胞凋亡的细胞被鉴别。转染完全相同地重复进行三次。这些数据表明HPV16 E2和E7蛋白都在HeLa细胞中诱导了细胞凋亡。接下来我们开始确定这些蛋白在其它细胞系中是否诱导细胞凋亡。3.E2和E7在HPV转化和非HPV转化细胞系中诱导细胞凋亡
我们测定了HPV 16 E2和E7蛋白在六个HPV转化细胞系和4个非HPV转化细胞系中诱导细胞凋亡的能力。比较结果如表1所示。表1 E2和E7在多种细胞系中诱导细胞凋亡
*凋亡细胞百分比测定如文中所述。*细胞凋亡的背景水平(background level)指未转染细胞群和经空pWEB质粒转染的细胞群。除了MCF-7细胞外，这些数据都是相周的，括号内给出了MCF-7细胞内经pWEB转染后的细胞凋亡的百分比。
| 细胞系 | HPV种类 | 凋亡细胞(％)* | ||
| 背景* | HPV 16 E2 | HPV 16 E7 | ||
| HeLa | HPV 18 | 5±2 | 26±3 | 27±3 |
| SiHa | HPV 16 | 5±2 | 44±3 | 46±3 |
| 866 | HPV 16 | 5±2 | 22±2 | 22±2 |
| 873 | HPV 18 | 7±2 | 35±3 | 24±2 |
| 877 | HPV 18,45 | 6±2 | 28±3 | 28±3 |
| 915 | HPV 16 | 7±2 | 33±3 | 23±2 |
| C33a | - | 8±2 | 9±2 | 8±3 |
| COS-7 | - | 6±2 | 6±2 | 5±2 |
| 808F | - | 6±2 | 26±3 | 20±3 |
| NIH3T3 | - | 6±2 | 25±3 | 20±2 |
| Saos-2 | - | 11±2 | 12±2 | 12±2 |
| MCF-7 | - | 5±2(20±2) | 60±3 | 52±3 |
pWEB转染的MCF-7细胞表现出较高的细胞凋亡的背景水平。
E2和E7在HeLa细胞和SiHa细胞中诱导细胞凋亡，HeLa细胞和SiHa细胞分别为一种HPV18转化和一种HPV16转化子宫颈癌细胞系。E2和E7都能在人体866、873、877和915角质形成细胞中诱导细胞凋亡：866细胞和915细胞包含HPV 16，873细胞包含HPV18，877细胞同时包含HPV 18和HPV 45(Bartholomew，J.等(1997)Cancer Res.57，937-942和P.Stern，unpublished observations)。有趣的是，E2和E7都不能在C33a细胞、COS-7细胞或Saos-2细胞中诱导细胞凋亡，C33a细胞、COS-7细胞和Saos-2细胞分别为一种非HPV转化子宫颈癌细胞系、一种SV40转化猴成纤维细胞系和一种人体骨肉瘤细胞系。然而，E2和E7在三种其它HPV阴性细胞系中却能诱导高数量的细胞凋亡：即808F细胞、NIH3T3细胞和MCF-7细胞，它们分别是一种人体成纤维细胞系、一种鼠成纤维细胞系和一种人体乳腺癌细胞系。所以，E2能在HPV阴性细胞系中诱导细胞凋亡。这些结果的另一个引人注意的特征是：所有能被E2诱导发生细胞凋亡的细胞系也都能被E7诱导发生细胞凋亡。类似地，对E2表达不敏感的细胞系也都对E7表达不敏感。因此，E2和E7是经过相同的途径，或经过能汇合于同一点的途径来诱导细胞凋亡。
所有对E2或E7表达的应答产生细胞凋亡的细胞系，都被认为包含p53野生型。例如，NIH3T3细胞包含p53野生型，并发生p53依赖性的细胞凋亡(Chirillo，P.等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.94.8162-8167)。与此对比，C33a细胞包含突变的p53(Crook.T.，等(1991)Oncogene.6 873-875)，Saos-2不包含p53，这两个细胞系都不能发生细胞凋亡以应答E2或E7。为确定p53是否在E2和/或E7诱导细胞死亡中发挥作用，接下去我们来看，反式内源性失活p53突变体和HPV 16 E6蛋白表达对表达这些蛋白的细胞中的细胞凋亡数量的影响。4.E2和E7经p53依赖性途径诱导细胞凋亡
HeLa细胞被这些质粒瞬时转染：GFP-表达质粒pCMX-GFP3和pWEB(或pWEB-E2或pWEB-E7)以及表达p53野生型(wt)的pCB6+p53(或表达p53突变体(mt)的pCB6+p53173L)。凋亡细胞如图2所示被鉴别。
p53野生型的共表达将E2和E7诱导的细胞凋亡数量增加了几乎50％(比较图4a中的4、5、7和8列)。相反，反式内源性失活p53173L突变体的共表达却将E2和E7诱导的细胞凋亡数量减少至接近基础水平(分别为图4a中的6列和9列)。这些数据表明，在这些条件下，HPV16 E2和E7蛋白诱导的细胞凋亡是通过p53依赖性途径发生的。为确认这一结论，HeLa细胞被pWEB-E2(或pWEB-E7)和pWEB-E6(或空pWEB)载体瞬时共转染。HPV16 E6蛋白与E3泛蛋白连接酶E6-AP一起结合p53，这导致p53通过泛蛋白依赖性蛋白酶降解(Scheffner，M.等(1990)Cell.63.1129-1136，Huibregtse，J.M.等(1991)EMBO J.，10.4129-4135)。pWEB-E6质粒的增加数量导致E2诱导的细胞凋亡数量逐渐降低(图4b)。类似地，E7蛋白诱导的细胞凋亡数量也由于E6的共表达而显著降低(图4c)。在pWEB-E6大量存在的情况下，E2和E7蛋白诱导的细胞凋亡降低到基础水平附近。综上所述，这些结果证实了HPV16 E6蛋白和HPV16E7蛋白诱导的细胞凋亡都需要功能性p53。5.诱导细胞凋亡不需要E2的DNA结合活性
虽然已有几个似乎可信的机理用以解释E7过量表达导致细胞凋亡，但从E2的过量表达到细胞凋亡的途径还不清楚。我们起初提出在SiHa细胞内，E2可能增加整合E7癌基因的转录，并提出这可能会导致E7诱导的细胞死亡。但是，这里我们阐述了E2可诱导几个非HPV转化细胞系的细胞凋亡(表1)。这些数据表明E2不能简单地通过激活E7转录杀死细胞。为证实这一假设，我们在E2 DNA结合结构域(DBD)内，在已知对蛋白质-DNA的相互作用重要的位置上放置三个点突变。HPV16 E2 DBD和BPV1 E2 DBD-DNA复合物的晶体结构表明，HPV16 E2 DBD内的氨基酸N296、K299和R304对特异性E2结合位点的识别很关键(Hegde，R.S.和Androphy.E.J.(1998)J.Mol.Biol.284.1479-1489，Hegde，R.S.等(1992)Nature 359.505-512)。使用定点诱变，我们以丙氨酸取代了所有这三个氨基酸。在E2蛋白的全部长度内和仅仅在E2 DNA结合结构域内，突变被诱导。
为确定这些突变不需要DNA结合活性，且不扰乱E2 DBD的整个折叠，我们在细菌内表达了DBD野生型和突变的DBD。质粒pKK-E2Ct表达一种能正常二聚和结合DNA的截短E2蛋白(氨基酸280到365)(Lewis H.和Gaston.K(1999)J.Mol.Biol.294：885-896)。质粒pKK-E2CtDBDm表达含N296A、K299A和R304A突变的相当的E2片段。E2Ct和E2CtDBDm蛋白从携带各自质粒的细菌中纯化得到(图5a)。具体地，在图5(a)实验中，纯化后的E2Ct和E2CtDBDm样品用SDS-PAGE分析。标记的尺寸如图中所示。在图5(b)和图5(c)实验中，用圆二色性表明N296、K299和R304突变的存在不影响E2CtDBDm的折叠或二聚作用。(d)将数量逐渐增加(分别为10、50和250nM)的E2Ct(2-4道)或E2CtDBDm(5-7道)加入到被标记的寡核苷酸中，该标记寡核苷酸携带有来自HPV16基因组的E2结合位点1：E2(1)。游离的和被结合的DNA在6％聚丙烯酰胺凝胶上分离，并可用放射自显影术显示。E2Ct-E2(1)复合物如箭头所示。然后，用圆二色性(CD)检测突变的存在是否改变了E2 DBD的折叠或二聚作用。E2Ct和E2CtDBDm蛋白的CD光谱非常相似。这意味着突变对这些性能影响很小或没有影响。图5d显示了凝胶阻滞测定结果，其中数量逐渐增加的E2Ct蛋白(2-4道)或E2CtDBDm蛋白(5-7道)被加入到携带有一个E2结合位点的标记的寡核苷酸中。由图可见，E2Ct与标记DNA结合紧密，而E2CtDBDm对此位点没有任何可检测出的结合。
为确定诱导细胞死亡是否需要E2的DNA结合活性，我们用质粒pCMX-GFP3瞬时转染HeLa细胞，该质粒表达野生型全部长度的E2蛋白(pWEB-E2)，或带有N296A、K299A和R304A突变的全部长度的E2(pWEB-E2DBDm)。图2中显示了被鉴别的凋亡细胞。转染完全相同地重复进行三次。令人惊讶的是，pWEB-E2和pWEB-E2DBDm质粒诱导细胞死亡的数量几乎相同(图6)。相反，仅仅表达E2 DBD因而缺少N末端转录激活结构域的质粒pWEB-E2Ct，不能诱导细胞死亡(图6)。所以，尽管诱导HeLa细胞的细胞凋亡不需要E2的序列特异性DNA结合活性，但N末端转录激活结构域是必不可少的。为确认和扩展这些结论，我们接下去看E2异源二聚体诱导细胞死亡的能力。6)E2诱导细胞死亡所需要的两个功能性N末端结构域
以前已经说明了BPV1 E2和E2-TR蛋白能形成异源二聚体(Barsoum，J.等(1992)J.Virol.66.3941-3945)。尽管据报道这些异源二聚体在体外结合DNA，但他们不能在完整细胞内激活转录(Barsoum，J.等(1992)J.Virol.66.3941-3945)。考虑到这个情况，我们想确定HPV16 E2和E2Ct蛋白是否能形成异源二聚体，这些异源二聚体是否能诱导细胞死亡。为确定异源二聚体能否在体外形成，我们将一固定数量的E2Ct野生型与数量逐渐增加的DNA结合缺陷型E2Ct DBDm蛋白相混合。图7a中所示数量的E2Ct和E2CtDBDm相混合后，然后在3M尿素中变性，以方便亚基的交换。稀释进入0.1M尿素中，经过再折叠后，蛋白被加到标记的寡核苷酸中，该标记寡核苷酸携带有HPV16 E2结合位点1：E2(1)。游离的和被结合的DNA在6％聚丙烯酰胺凝胶上分离，并可用放射自显影术显示。E2Ct-E2(1)复合物如箭头所示。再折叠的E2Ct与携带一个E2结合位点的标记寡核苷酸结合，而再折叠的E2CtDBDm显示出无DNA结合活性(图7a，分别为3和4道)。向固定数量的E2Ct中加入数量逐渐增加的E2CtDBDm，导致DNA结合活性逐渐降低(图7a，5-8道)。这些数据表明，至少在这个体外测定中，这些蛋白能形成异源二聚体。
为详细研究异源二聚体在完整细胞内的形成，用pWEB-E2和数量逐渐增加的空pWEB质粒(空心方框)，或pWEB-E2Ct和数量逐渐增加的pWEB(实心圆)，或pWEB-E2和数量逐渐增加的pWEB-E2Ct(实心方框)瞬时转染HeLa细胞，图2中显示了被鉴别的凋亡细胞，转染完全相同地重复进行三次。pWEB-E2质粒在转染细胞群中诱导了高数量的细胞死亡，而pWEB-E2Ct质粒没有影响(图7b)。然而，随着数量逐渐增加的pWEB-E2Ct质粒被加入到含pWEB-E2的转染混合物中，转染细胞群中细胞凋亡的百分比下降，最终达到背景水平(图7b)。数量逐渐增加的pWEB-E2CtDBDm质粒也降低了pWEB-E2诱导的细胞死亡的数量，而数量逐渐增加的pWEB没有影响(没有示出)。这些数据表明，在完整细胞内形成了含有E2和E2Ct的异源二聚体，这些异源二聚体不能诱导细胞凋亡。所以，看来为诱导细胞死亡，E2二聚体需要两个功能性N末端结构域。7.VP22-E2融合蛋白能诱导细胞凋亡
单纯疱疹病毒1型(HSV-1)蛋白VP22是在病毒衣壳和包膜之间病毒颗粒的外被区域内发现的一种38kDa蛋白。当在瞬时转染细胞中表达时，VP22被转运入细胞质，接着以一个非典型分泌机理从合成细胞输出。然后蛋白高效率地进入周围细胞，并基于一依赖于细胞骨架肌动蛋白的作用机制，定位于细胞核。一旦位于细胞核内，VP22与染色质结合，并被分离到子代细胞中。细胞间的VP22转运是如此高效，以至蛋白能进入一个转染单分子层中的每一个细胞(Elliott，G和O’Hare，P(1997)Cell 88：223-233)。
为了将E2 ORF克隆到正确阅读框架的VP22载体(Invitrogen)内，先将它从pWEBE2质粒中除去，再作为EcoR1片段插入pBluesciptII KS(Stratagene公司)的多克隆位点。然后这个结构与EcoRV和BamHI一起被酶切消化，得到的E2片段插入到pVP22的多克隆位点。用pVP22和E2的特异性引物进行DNA序列分析。
质粒pVP22-E2、pVP22和pWEB-E2与pCMX-GFP3共转染入HeLa细胞，转染和未转染细胞群内凋亡细胞的百分比测定如前面所述。在与pVP22-E2瞬时转染后，凋亡细胞的百分比增加至30％左右(图13)。相反，pVP22质粒对细胞凋亡数量没有影响。这些数据表明VP22-E2融合蛋白能诱导HeLa细胞的细胞凋亡。8.E2和免疫应答E2和对HPV的免疫应答
在子宫颈癌和恶性前的HPV相关疾病中控制HPV感染方面，已有的资料显示出E2免疫性可能起作用(Rocha-Zavaleta等，(1997)Brit.J.Cancer 75，1144-1150)。针对E2而诱导出来的免疫可能是保护性的，原则上，可能把子宫颈上皮的基底/副基底细胞中病毒表达的最早阶段作为靶子攻击。在消灭带有游离型DNA的细胞方面，刺激局部长寿粘膜免疫比基于衣壳蛋白的疫苗更好。带有游离型HPVDNA的细胞可能形成库(潜伏状态)，其中整合作用(反应进行的一个主要危险因素)可能会随之发生。妇女中PV阳性在15～25岁性活跃的女性中大约占39％。它随着年龄显著下降，证明这样的观点，即存在对感染的获得性免疫。
致免疫E2蛋白或经修饰E2蛋白的局部传递可激活一种细胞凋亡途径的预兆将代表一种与治疗性和预防性组成一起、对任一种子宫颈病变的补充进攻。这与高危险和低危险病毒感染包括外阴疣或其它疣有关。一个有趣的可能性在于，E2蛋白的免疫原性可由于与靶DNA结合而得到提高。此复合物可能传递单一抗原表位，此抗原表位可被自然清除的免疫应答所识别。
我们已说明T辅助细胞对HPV16 E2的应答显示出与病毒感染的清除相关，强调的是该蛋白作为预防性和治疗性的免疫目标的潜力(Bontkes，H.J等(1999).Gen Virol 80：2453-2459)。为检测HPV 16E2特异性T细胞应答，我们已经使用γ干扰素ELISPOT做了测定。图14显示了T细胞对HPV 16 E2的记忆是在供体1内而不是在供体2内的证据。然而，从外周血液单核细胞中制备的自体树状细胞长期暴露于HPV 16 E2 C末端片段，能产生特异T细胞的初次激活。我们用GM-CSF和IL-4从血清游离培养基内的粘附外周血液单核细胞中制备了树状细胞(DCs)。该细胞的主体是CD1a+、HLA-DR+、CD80+和CD14-。去除CD4细胞后的外周血液淋巴细胞用自体Dcs和10μg/ml E2Ct(制备如1b部分所述)、或在无抗原的情况下，培育4或11天(在第9天洗涤应答细胞，并加入新鲜的DCs和E2或无抗原加入)。在再次平皿接种(replating)和培育过夜后，用ELISPOT测定。对三份不同的细胞浓度计算斑点，并归一数据，计算平均和标准误差。这些数据证明了具有抗HPV病变活性的E2 T细胞在人体内产生和/或增加的可能性。
Claims (51)
1.一种诱导PV阴性p53野生型、p53突变型或p53相关基因阳性细胞的细胞凋亡的方法，包括用PV E2和/或E7蛋白或它们的功能部分或衍生物与这些细胞接触，或向这些细胞提供一个编码PVE2和/或E7蛋白或它们的功能部分或衍生物的DNA序列。
2.一种杀死PV阳性细胞的方法，包括用PV E2和/或E7蛋白或它们的功能部分或衍生物与这些细胞接触，或向这些细胞提供一个编码PV E2和/或E7蛋白或它们的功能部分或衍生物的DNA序列。
3.一种杀死感染致癌病毒细胞的方法，包括用PV E2和/或E7蛋白或它们的功能部分或衍生物与这些细胞接触，或向这些细胞提供一个编码PV E2和/或E7蛋白或它们的功能部分或衍生物的DNA序列。
4.一种杀死PV阴性和PV阳性致癌细胞或致癌前体的方法，包括用PV E2和/或E7蛋白或它们的功能部分或衍生物与这些细胞接触，或向这些细胞提供一个编码PV E2和/或E7蛋白或它们的功能部分或衍生物的DNA序列。
5.一种诱导PV阴性和PV阳性细胞细胞凋亡的方法，包括用PV E2和/或E7蛋白或它们的功能部分或衍生物和p53野生型蛋白或它的功能部分或衍生物与这些细胞接触。
6.一种诱导致癌细胞细胞凋亡的方法，包括用PV E2和/或E7蛋白或它们的功能部分或衍生物和p53野生型蛋白或它的功能部分或衍生物与这些细胞接触。
7.一种诱导PV阳性子宫颈癌细胞细胞凋亡的方法，包括用PV E2和/或E7蛋白或它们的功能部分或衍生物和p53野生型蛋白或它的功能部分或衍生物与这些细胞接触。
8.如权利要求1～7中任一项所述的一种诱导细胞凋亡的方法，包括用PV E2和/或E7蛋白和p53野生型蛋白和/或以包含突变体p53的细胞诱导p53野生型或p53野生型功能的药物或药物组成与这些细胞接触。
9.如权利要求1～7中任一项所述的一种诱导细胞凋亡的方法，包括用编码PVE2和/或E7的DNA和编码p53野生型蛋白的DNA和/或以包含突变体p53的细胞诱导p53野生型或p53野生型功能的化合物与这些细胞接触。
10.如权利要求1～7中任一项所述的一种诱导细胞凋亡的方法，包括用PV E2和/或E7蛋白和至少一种激活p53功能的作用剂与这些细胞接触。
11.如上述中任一项权利要求所述的方法，其中被处理细胞群中的大部分细胞被杀死。
12.如上述中任一项权利要求所述的方法，其中细胞被HPV感染。
13.如上述中任一项权利要求所述的方法，其中细胞被HPV转化。
14.如权利要求12或13所述的方法，其中HPV被整合入细胞基因组。
15.如权利要求12、13或14所述的方法，其中HPV为16型和/或18型。
16.如上述中任一项权利要求所述的方法，其中细胞为哺乳动物细胞。
17.如权利要求16所述的方法，其中细胞为例如子宫颈、乳房、肺、脑、结肠、食道、黑素瘤、骨肉瘤、皮肤、肝、头、癌或白血病细胞。
18.如权利要求17所述的方法，其中细胞在哺乳动物体内。
19.如权利要求17或18所述的方法，其中细胞为人体细胞。
20.如权利要求1、2或11～19中任一项所述的方法，其中细胞为致癌细胞或其前体。
21.如上述中任一项权利要求所述的方法，其中细胞被病毒感染。
22.如权利要求19所述的方法，其中细胞被致癌病毒或反转录病毒感染。
23.如权利要求22所述的方法，其中致癌病毒为HPV、Hepatitis B、Herpesvirus B、Epstein-Barr病毒或人体T细胞亲淋巴病毒1型或2型。
24.如权利要求20所述的方法，其中细胞被HIV或HIV相关病毒感染。
25.如上述中任一项权利要求所述的方法，其中在细胞内或被治疗者体内诱导了免疫应答，特别是粘膜应答。
26.如权利要求25所述的方法，其中免疫应答为粘膜应答。
27.如上述中任一项权利要求所述的方法，其中细胞过度表达p53或相关基因或其突变体。
28.如上述中任一项权利要求所述的方法，其中E2衍生物或功能部分与DNA的结合不如E2野生型与DNA的结合。
29.一种治疗子宫颈癌的方法，包括用E2和/或E7或它们的功能部分与被治疗者的子宫颈细胞接触，或向这些细胞提供一个编码PVE2和/或E7蛋白或它们的功能部分的DNA序列。
30.如权利要求29所述的方法，其中被治疗者为人。
31.如权利要求29或30所述的方法，包括在被治疗者体内诱导对PV的免疫的应答。
32.如权利要求25、26、29、30或31所述的方法，其中E2与另一蛋白质或其功能部分融合，该蛋白质或其功能部分引发免疫应答。
33.如权利要求32所述的方法，其中蛋白质为破伤风类毒素片段C。
34.如上述中任一项权利要求所述的方法，其中使用编码E2部分或E2衍生物的DNA序列，与E2野生型相比，该部分或衍生物在DNA结合中为缺陷型。
35.如上述中任一项权利要求所述的方法，其中E2蛋白或其部分或其衍生物与DNA复合。
36.一种PV疫苗，至少包含E2的一部分或E2的衍生物。
37.如权利要求28所述的PV疫苗，其中E2是从HPV衍生得到。
38.一种DNA结合缺陷型变体，包括一个缺少天然E2序列C末端部分的E2氨基酸序列。
39.如权利要求38所述的一种DNA结合缺陷型变体，包括一个缺少天然E2蛋白的最后86个氨基酸的E2序列。
40.如权利要求38或39所述的一种DNA结合缺陷型变体，包括一个E2序列，该E2序列缺少天然E2蛋白的氨基酸296、299和304。
41.包括如权利要求38、39或40所述的E2变体的同源二聚体。
42.包括如权利要求38、39或40所述的E2变体的异源二聚体。
43.一种载体，包括经修饰的E2或E7 DNA序列，或至少E2或E7 DNA序列的一部分。
44.如权利要求43所述的载体，其中E2或E7 DNA序列编码能杀死p53阳性细胞、PV阳性细胞、感染致癌病毒的细胞或癌细胞的E2或E7衍生物。
45.如权利要求43或44所述的载体，它编码多肽，该多肽在哺乳动物细胞内产生免疫应答，特别是粘膜应答。
46.如权利要求44所述的载体，其中产生粘膜应答。
47.如权利要求43、44或45所述的载体，其中E2或E7 DNA序列编码能抑制病毒复制的E2或E7衍生物。
48.如权利要求47所述的载体，其中衍生物能抑制HPV的复制。
49.如权利要求43、44、45、46或47所述的载体，其中E2或E7 DNA序列编码E2衍生物，与E2野生型或E7相比，该E2衍生物在DNA结合中为缺陷型。
50.如权利要求36所述的一种编码E2衍生物的核苷酸序列。
51.如权利要求38所述的核苷酸序列，其中该序列为DNA或RNA序列。
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