CN1320360C - 超酸性植物的蛋白图谱 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于植物香叶天竺葵(天竺葵种)的超酸性气生部分的蛋白提取物的图谱制作方法，所述方法包含下列步骤：选择有效的提取介质，由0.2M碳酸钠组成的提取介质提高了提取百分比约600%，选择有效介质以确定所述提取物中的多肽模式，多肽模式介质的组成为0.2-0.4M的碳酸钠，以及0.2M碳酸钠含有50%二甲基亚砜，选择有效介质以确定所述提取物中酶的多分子形式，酶多分子形式介质的组成为pH7.5的0.2M Tris-HCl缓冲液并任选含50%二甲基亚砜；碳酸钠的浓度为0.2-0.4M并任选含50%二甲基亚砜，以及在所述方法中采用包含凝胶电泳、分光光度法、离心、蛋白测定的生物化学和生物物理技术，以确定所述提取物中蛋白质的定量、定性、结构和功能方面，及其提取组合物。

Description

超酸性植物的蛋白图谱
技术领域
本发明涉及一种用于植物香叶天竺葵(天竺葵种)的超酸性气生部分的蛋白提取物的图谱制作方法，所述方法包含下列步骤：选择有效的提取介质，由0.2M碳酸钠组成的提取介质提高了约600％的提取百分比，选择有效介质以确定所述提取物中的多肽模式，多肽模式介质的组成为0.2-0.4M的碳酸钠，以及0.2M碳酸钠含有50％二甲基亚砜，选择有效介质以确定所述提取物中酶的多分子形式，酶多分子形式介质的组成为pH 7.5的0.2M Tris-HCl缓冲液并任选含50％二甲基亚砜；碳酸钠的浓度为0.2-0.4M并任选含50％二甲基亚砜，以及在所述方法中采用包含凝胶电泳、分光光度法、离心、蛋白测定的生物化学和生物物理技术，以确定所述提取物中蛋白质的定量、定性、结构和功能方面，及其提取组合物。
背景技术
通常通过生化方法的酶学研究包括以活性和/或天然结构形式的定量和定性分离，然后是用于催化水平、酶/同工酶分子形式的分析/图谱制作，以分辨功能面，蛋白质和/或其多肽模式及其进一步分析，由此构成了主题术语“蛋白质组”。
该主题与来自细胞、组织、器官或生物体的几乎有益健康的蛋白质补体的分离有关，以用于后续的鉴定、表征和定量，蛋白质与多肽图谱的电泳显示，酶和同工酶的催化水平监测，酶的多分子形式的辨别等等。
目前，蛋白质组覆盖了大量的基因产物或功能基因组的功能分析。仅仅数据库中的DNA序列是不能解码生物学功能的，因此，蛋白质组对于理解和调节生物学功能及机理是至关重要的。有鉴于此，蛋白质组是包括基因操作和代谢工程的现代生物技术的一个关键组分。
实际上，对基因生物学功能的理解较之仅仅获得序列是困难得多的命题。从植物(尤其是具有次级代谢物产生途径的植物)角度来看，由于对代谢网络和其中包含的催化/调节蛋白质知之甚少，情况则显得更为复杂。
蛋白质组初始最关键的要求是细胞蛋白质补体从试验组织/器官中的定量分离。虽然，在接近中性pH的缓冲条件下，一些蛋白分离的通用方案可从文献中得到，然而，这些方案应用于香叶天竺葵的一些组织(象叶子、花瓣和萼片)则不能令人满意。
实际上，目前关于雄性可繁殖基因型香叶天竺葵的水性分离和非变性条件下的蛋白图谱只有个别报道，并且只与花药有关(S.Tokumasu，F.Yano和M.Kato，1977，Japan J.Genet.52：197-205)。
但是该现有技术对于更大的蛋白质组工作几乎没有任何关联，因为(i)大部分香叶天竺葵的培育克隆是雄性不育的，(ii)该方法不能应用于其他气生部分，像叶、花瓣和萼片，(iii)从代谢途径和有价值的用作香料、化妆品和调味品工业及芳香疗法的外来精油的生产的观点来看，该植物的其他气生部分对于蛋白质组工作的重要性胜于花药(E.Gildemeister和Fr.Hoffman，1959，Die atherischen Ole vol 5，p350，Akademie Verlag，Berlin)。
用于本发明的科学解释是，香叶天竺葵的气生部分，像叶片，花瓣和萼片具有高酸性性质，细胞液的pH约3.0(R.S.Sangwan，B.R.Tyagi及N.S.Sangwan，2000，通过天竺葵种香叶天竺葵的化学变性碱土的植物修复的生态学方法，已提交专利，NF399/00，CSIR，New Delhi)。发现这些新鲜组织的两个体积的水性提取物的酸度超过5毫克当量的氢氧化钠(R.S.Sangwan，B.R.Tyagi及N.S.Sangwan，2000，通过天竺葵种香叶天竺葵的化学变性碱土的植物修复的生态学方法。相同主题的美国专利申请09/776,502最近被授权。
本发明目的
本发明的主要目的是开发一种用于香叶天竺葵植物(天竺葵种)蛋白质图谱制作的方法学。
本发明的另一主要目的是开发一种用于香叶天竺葵植物(天竺葵种)超酸性部分的蛋白质图谱制作的方法学。
本发明的主要目的是开发来自香叶天竺葵植物(天竺葵种)高纯度蛋白质提取物的组合物。
本发明的主要目的是开发来自香叶天竺葵植物(天竺葵种)超酸性部分的高纯度蛋白提取物的组合物。
本发明的另一目的是确定所述植物各种蛋白质的酶活。
本发明的另一目的是开发所述植物蛋白质的多肽图谱。
发明概述
本发明涉及一种用于香叶天竺葵植物(天竺葵种)超酸性气生部分的蛋白质提取物的图谱制作方法，所述方法包含下列步骤：选择有效的提取介质，由0.2M碳酸钠组成的提取介质提高了约600％的提取百分比，选择有效介质以确定所述提取物中的多肽模式，多肽模式介质的组成为0.2-0.4M的碳酸钠，以及0.2M碳酸钠含有50％二甲基亚砜，选择有效介质以确定所述提取物中的酶多分子形式，酶多分子形式的介质组成为pH 7.5的0.2M Tris-HCl缓冲液并任选含50％二甲基亚砜；碳酸钠浓度为0.2-0.4M并任选含50％二甲基亚砜，以及在所述方法中采用包含凝胶电泳、分光光度法、离心、蛋白测定的生物化学和生物物理技术，以确定所述提取物中蛋白质的定量、定性、结构和功能方面，及其提取组合物。
发明详述
相应地，本发明涉及一种香叶天竺葵植物(天竺葵种)超酸性气生部分的蛋白质提取物的图谱制作方法，所述方法包含下列步骤：选择有效的提取介质，由0.2M碳酸钠组成的提取介质提高了约600％的提取百分比，选择有效介质以确定所述提取物中的多肽模式，多肽模式介质的组成为0.2-0.4M的碳酸钠，以及0.2M碳酸钠含有50％二甲基亚砜，选择有效介质以确定所述提取物中的酶多分子形式，酶多分子形式介质的组成为pH 7.5的0.2M Tris-HCl缓冲液并任选含50％二甲基亚砜；碳酸钠的浓度为0.2-0.4M并任选含50％二甲基亚砜，以及在所述方法中采用包含凝胶电泳、分光光度法、离心、蛋白测定的生物化学和生物物理技术，以确定所述提取物中蛋白质的定量、定性、结构和功能方面，及其提取组合物。
在本发明进一步实施方案中，一种组合物可用于pH约3.0的香叶天竺葵植物(天竺葵种)超酸性部分的蛋白质提取物的酸性中和与图谱制作，所述组合物包含约0.2M碳酸钠，及任选约50％二甲基亚砜(v/v)，显示蛋白质提取百分比增长约600％，其中所述组合物在提取物中的最终pH为6.5-8.0。
在本发明的进一步实施方案中，一种组合物可用于pH约3.0的香叶天竺葵植物(天竺葵种)超酸性部分的蛋白质提取物的酸性中和与图谱制作，所述组合物包含约0.2M Tris-HCl缓冲液，约0.2M碳酸钠，pH约7.5，并且显示蛋白质提取百分比增长约300％，其中所述组合物在提取物中的最终pH为5.5-6.5。
在本发明的进一步实施方案中，一种组合物可用于pH约3.0的香叶天竺葵植物(天竺葵种)超酸性部分蛋白质提取物的酸性中和与图谱制作，所述组合物包含约0.2M Tris-HCl缓冲液及约50％二甲基亚砜(v/v)，pH约7.5，并且显示蛋白质提取百分比增长约300％，其中所述组合物在提取物中的最终pH为6.0-7.0。
在本发明的一个实施方案中，一种方法可用于pH约3.0的香叶天竺葵植物(天竺葵种)超酸性部分蛋白质提取物的图谱制作。
在本发明的另一实施方案中，用含有酸性中和盐与酸性螯合化合物的缓冲液均质所述植物的超酸性部分。
在本发明的另一实施方案中，对所述匀浆物离心约30分钟。
在本发明的另一实施方案中，在上清液中得到所述蛋白质提取物。
在本发明的另一实施方案中，通过常规方法测定得到的水溶性蛋白质提取物。
在本发明的另一实施方案中，采用分光光度法计算所述提取物中过氧化物酶的酶活和酶动力学。
在本发明的另一实施方案中，将步骤(d)的水溶性蛋白质提取物与十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺(SDS)样品缓冲液混合。
在本发明的另一实施方案中，将所述混合物持续煮沸1-10分钟。
在本发明的另一实施方案中，将煮沸的混合物快速冷却。
在本发明的另一实施方案中，采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)对所述混合物进行电泳。
在本发明的另一实施方案中，采用分子量标记(marker)确定电泳混合物的多肽图谱。
在本发明的另一实施方案中，采用催化特异性显色反应混合物，温育不带十二烷基硫酸钠的步骤(i)的非变性聚丙烯酰胺凝胶。
在本发明的另一实施方案中，使催化活性条带显形。
在本发明的另一实施方案中，确定所述蛋白质提取物酶的多分子形式模式(pattern)。
在本发明的另一实施方案中，其中所述植物在气生部分具有超酸性的。
在本发明的另一实施方案中，其中所述植物的气生部分选自叶片、花瓣和萼片。
在本发明的另一实施方案中，其中的酸性中和盐和酸性螯合化合物选自碳酸盐、碳酸氢盐、氨合物和二甲基亚砜。
在本发明的另一实施方案中，其中对所述植物部分的均质优选采用手工。
在本发明的另一实施方案中，其中在室温或0-4℃的冷冻条件下均质所述植物部分。
在本发明的另一实施方案中，其中在7,000×g至14,000×g的速率下离心所述匀浆物。
在本发明的另一实施方案中，其中在室温或0-4℃的冷冻条件下离心所述匀浆物。
在本发明的另一实施方案中，其中蛋白质水溶性提取物与十二烷基硫酸钠的比例介于1∶5到5∶1。
在本发明的另一实施方案中，其中在水浴中煮沸所述混合物。
在本发明的另一实施方案中，其中对电泳凝胶进行染色的染料选自考马斯亮蓝R-250和银染。
在本发明的另一实施方案中，其中SDS-PAGE的类型为一维和两维。
在本发明的另一实施方案中，其中多肽模式缓冲介质选自(a)0.2-0.4M的碳酸钠，(b)0.2-0.4M的碳酸钠及10-50％(v/v)的二甲基亚砜，(c)pH为7.0-8.0的约0.2M的Tris-HCl缓冲液，以及(d)pH为7.0-8.0的约0.2M的Tris-HCl与浓度为10-50％(v/v)的二甲基亚砜。
在本发明的另一实施方案中，其中用于酯酶催化活性的催化特异性显色反应混合物在pH约6.5的0.1M磷酸缓冲液中含有约2mMα-醋酸萘酯，约2mMβ-醋酸萘酯，约1mM固蓝盐。
在本发明的另一实施方案中，其中用于谷氨酸草酰乙酸转氨酶(GOT)催化活性的催化特异性显色反应混合物在pH约8.5的约0.1MTris-HCl中含有约2mM磷酸吡哆醛，约4mM L-天冬氨酸，约4.3mMα-酮戊二酸和约5.4mM的固蓝BB盐。
在本发明的另一实施方案中，其中所述方法用于具有超酸性特性的植物和动物组织中的蛋白质组。
在本发明的另一实施方案中，其中对所述植物采用选自如下的缓冲液进行均质：(a)pH约10.5或以上的约0.2M Tris溶液，(b)pH约7.5的约0.2M Tris-HCl缓冲液，含有约0.2M碳酸钠，(c)约0.2M碳酸钠，(d)pH约7.5的约0.2M Tris-HCl，含有高至50％的二甲基亚砜(v/v)，以及(e)约0.2M碳酸钠，含有高至50％的二甲基亚砜(v/v)。
在本发明的另一实施方案中，其中的均质缓冲液补充有7-14％的甘油。
在本发明的另一实施方案中，其中含有约0.2M碳酸钠的缓冲液组合物显示蛋白质提取百分比增长约600％。
在本发明的另一实施方案中，其中含有约0.2M碳酸钠、约50％二甲基亚砜(v/v)的缓冲液组合物显示蛋白质提取百分比增长约600％。
在本发明的另一实施方案中，其中含有约0.2M Tris-HCl、约0.2M碳酸钠的pH约为7.5的缓冲液组合物显示蛋白质提取百分比增长约300％。
在本发明的另一实施方案中，其中的SDS-PAGE具有垂直电泳系统中的带有堆积胶和分离胶的不连续系统。
在本发明的另一实施方案中，其中的堆积胶浓度为2-6％(T)。
在本发明的另一实施方案中，其中的分离胶浓度为10-18％(T)。
进一步地，本发明提供了用于香叶天竺葵(天竺葵种)组织的蛋白质组的方法，包含：用一半至一个体积(1g鲜重加入0.5至1.0毫升或更多，这依赖于组织的性质和状态)的补充有甘油(10％)的合适缓冲液(像Tris-HCl)，或含有高至0.4M浓度(根据用途)的如碳酸盐或碳酸氢盐等的酸性中和盐的蒸馏水，或在合适浓度(高至50％)的如二甲基亚砜的酸性螯合(如与有机酸形成络合物)化合物的条件下，通过手工匀化(在室温下或0-4℃冷冻条件，依赖于蛋白质组工作的最终目的)提取特定组织(叶片、花瓣和萼片)，然后于周围环境温度下或0-4℃(依赖于蛋白质组工作的最终目的)冷冻条件下在离心机内以10,000×g离心30分钟，以回收上清液中分离的水溶性蛋白质，该水溶性蛋白质可满意地进一步用于各种蛋白质组工作，这些工作如进行蛋白质浓度的真实定量测定，酶催化活性测定和其他酶/蛋白质物理动力学和调节研究，分辨和研究酶的多分子形式，包括其非变性PAGE电泳后的原位催化定位以及通过变性或采用标准技术的其他电泳技术进行的多肽模式的图谱制作。
在本发明的一个实施方案中，可相容的细胞酸性取消方法(nullifying process)不可或缺的用于香叶天竺葵(天竺葵种)植物蛋白质组工作的实施，起始用于组织中蛋白质补体的定量回收。
在本发明的另一实施方案中，组织均质介质可补充有(依赖于特殊目的，可选择性地和/或另外地)诸如二甲基亚砜的化合物，以完成香叶天竺葵的蛋白质组工作。
在本发明的另一实施方案中，方法提供了用于各种类型蛋白质组分析/检测的专题解决方案，从定量测定到催化活性测定，以及香叶天竺葵中指定组织的蛋白质/酶/多肽模式的电泳显示的完成。
在本发明的另一实施方案中，该酸性较之通常缓冲提取介质可承受的酸性强得多。因此，在匀浆物中出现了惊人低的pH条件，不仅彻底限制了蛋白质的提取(通过水溶解度的极度减少)，并且定性和/或定量地改变了其天然的物理-化学(包括催化/酶学)属性。
在本发明的另一实施方案中，组织提取介质中包含合适水平可相容的酸性中和化学品(如碳酸盐、碳酸氢盐、氨/氨合物等)或络合(如二甲基亚砜)化学品可帮助去除在实施植物/植物部分上蛋白质组工作中的障碍。
在本发明的另一实施方案中，迄今为止，在植物样品蛋白质分离中已遭遇到一些困难，并从蛋白酶、多元酚等占优的立场通过技术得以解决。这种数量级的组织超酸性在农作物植物中是很少见的。相应地，从这种组织中水性分离蛋白质的问题可能还是很少遭遇到。
在本发明的另一实施方案中，即使在有把握情况下，植物中试验组织的变化也可能留下未解决的上述问题。由此，本发明提供了用于方便香叶天竺葵(天竺葵种)超酸性组织中蛋白质组研究/分析的新颖方法。
附图简述
图1表示香叶天竺葵叶片组织蛋白质制备物(A-E)的SDS-PAGE(考马斯染色)凝胶。泳道1，A；泳道2，B；泳道3，C；泳道4，D；泳道5，E；泳道6，空缺；泳道7，分子量标记(磷酸化酶b-66000，BSA-66000，卵白蛋白-43000，碳酸酐酶(carbonic anhydrous)-29000，STI-201000，溶菌酶-14300)。
图2表示香叶天竺葵叶片组织蛋白质制备物(A-C)的SDS-PAGE(考马斯染色)凝胶。泳道1，A；泳道2，B；泳道3，C；泳道4，空缺；泳道5，分子量标记(磷酸化酶b-66000，BSA-66000，卵白蛋白-43000，碳酸酐酶-29000，STI-201000，溶菌酶-14300)。
图3表示天竺葵叶片组织制备物(A-E)中酯酶催化活性的非变性PAGE和原位染色。泳道1，A；泳道2，B；泳道3，C；泳道4，D；泳道5，E。反应混合物(12.5ml)在0.1M磷酸盐缓冲液(pH6.5)中含有2mMα-乙酸萘酯，2mMβ-乙酸萘酯，1mM固蓝RR盐。
图4表示天竺葵叶片组织制备物(A-E)中谷氨酸草酰乙酸转氨酶(GOT)催化活性的非变性PAGE和原位染色。泳道1，A；泳道2，B；泳道3，C；泳道4，D；泳道5，E。反应混合物(12.5ml)在0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.5)中含有2mM磷酸吡哆醛，4mM L-天冬氨酸，4.3mMα-酮戊二酸及5.4mM固蓝RR盐。
实施例
下列实施例仅以说明本发明的方式给出，不应解释为限制本发明的范围。
实施例1
将1克栽培品种为“Bourbon”的香叶天竺葵(天竺葵种)新鲜叶片组织进行可溶蛋白质的水性分离，采用一半体积(0.5ml提取介质每1.0克新鲜组织)的(A)0.2M Tris-HCl，pH7.5或(B)双蒸水或(C)0.2M Tris溶液，pH10.5以上或(D)pH7.5的0.2M Tris-HCl缓冲液，含0.2M Na2CO3或(E)0.2M Na2CO3或(F)pH7.5的0.2M Tris-HCl缓冲液，含50％(v/v)二甲基亚砜或(G)0.2M Na2CO3含50％(v/v)二甲基亚砜，用全玻璃研棒和研钵在室温下进行手工均质。组织匀浆物在10,000×g下离心30分钟，收集上清液。记录上清液的pH。在每种情况下向微离心管内的400fil上清液中加入400jal 12％的三氟乙酸(TCA)，并维持30分钟。内含物在微型离心机内离心，并保留蛋白沉淀物。将蛋白质溶于400jal的0.1NNaOH溶液中。用100至200^1等分样的溶液，采用标准Lowry法(O.HLowry，N.J.Rosebrough，A.L.Farr和R.J.Randall，1951，J.Biol.Chem.193：265)对蛋白质定量。显色反应后在660nm下读取吸光度。蛋白质采用BSA作为标准进行定量，结果制表如下。
表1
  处理   提取物pH   提取的蛋白质(mg/g鲜重)   对比情况(对照％)   作为最大百分比的对比情况
  A[对照]   3.0   82.9   100.0   15.29
  B   3.0   87.7   105.8   16.17
  C   4.5   68.8   83.0   12.69
  D   6.0   293.4   353.9   54.12
  E   7.5   542.1   653.9   100.0
  F   6.5   304.0   366.7   56.07
  G   7.0   497.4   600.0   91.75
显然，本发明技术方法(像处理E和G)可导致蛋白质从组织中基本分离。相比较而言，它使得组织蛋白回收率提高达6.5倍。这对于蛋白质组工作和分析是具有定量和定性的本质。
实施例2
将1克栽培品种为“Bourbon”的香叶天竺葵(天竺葵种)新鲜叶片组织进行可溶蛋白质的水性分离，采用一半体积(0.5ml提取介质每1.0克新鲜组织)的冷却提取介质：(A)0.2M Tris-HCl，pH7.5或(B)0.2M Tris溶液，pH 10.5以上或(C)pH7.5的0.2M Tris-HCl缓冲液，含0.2M Na2CO3或(D)0.2M Na2CO3或(E)pH7.5的0.2M Tris-HCl缓冲液，含50％(v/v)二甲基亚砜或(F)0.2M Na2CO3含50％(v/v)二甲基亚砜，用全玻璃研棒和研钵在0-4℃下进行手工均质。组织匀浆物在0-4℃冷冻离心机内及10,000×g下离心30分钟，收集上清液并用作为酶提取物检测过氧化物酶的催化水平。催化活性的检测采用愈创木酚作为底物，30℃下通过分光光度计由470nm下吸光度的增长速率确定。标准分析混合物(3.0ml)的组成为5ml 0.1M醋酸缓冲液(pH5.5)，0ml的.0mM愈创木酚，300^1的1.3mM H2O2，10至50^1(依赖于催化水平)等分样的酶制备物(EP)，用蒸馏水定容。结果制表如下。
表2
  处理   ΔA470/50μlEP min-1   催化活性监测单位*/   对比情况[对照活性％；每克]   作为最大百分比的对比情况(在鲜重基础上的数据)
  mg鲜重   mg蛋白质
  A[对照]   0.0001   0.1   1.206   100   0.30
  B   0.0016   1.6   23.256   1600   4.73
  C   0.0193   19.3   65.781   19300   57.10
  D   0.0320   32.0   59.030   32000   94.67
  E   0.033   33.8   111.184   33800   100.0
  F   0.0297   29.7   59.710   29700   87.87
一个单位酶活定义等同为每分钟吸光度增长0.010。
显然，本发明技术对于香叶天竺葵组织酶催化活性的实际评价是一个先决条件。以酶特异性方式的适当应用还需要根据酶或实验者的要求对方法进行标准化/优化。
实施例3
将1克栽培品种为“Bourbon”的香叶天竺葵(天竺葵种)新鲜叶片组织进行可溶蛋白质的水性分离，采用一半体积(0.5ml提取介质每1.0克新鲜组织)的冷却提取介质：(A)0.2M Tris-HCl缓冲液，pH7.5或(B)pH7.5的0.2M Tris-HCl，含50％(v/v)二甲基亚砜或(C)0.2M Na2CO3或(D)0.4M Na2CO3(E)0.2M Na2CO3含50％(v/v)二甲基亚砜，用全玻璃研棒和研钵在0-4℃下进行手工均质。组织匀浆物在0-4℃冷冻离心机内及10,000×g下离心30分钟，收集上清液用于进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以显示组织提取物中的多肽图谱。为此，将100μl提取物与相同体积的SDS样品缓冲液混合于微离心管内，并置于沸水浴中持续3分钟。将样品置于冰块上快速冷却，并贮存于-20℃下直到用于电泳。变性的SDS-PAGE采用垂直电泳系统(MiniProtean-II，Bio Rad)中的堆积胶和分离胶不连续系统进行实施。将等量体积(每种25fil用于考马斯染色)的每种样品制备物加入加样孔中，并在每块胶中用标准分子量标记混合物进行共同电泳。凝胶中的聚合物浓度是堆积胶内4.0％(T)，分离胶内14.0％(T)。采用溴酚蓝试剂作为跟踪染料。电泳在恒定电压下进行(样品在堆积胶内移动时150伏特，而在分离胶内移动时100伏特)。电泳结束后，堆积胶区域用刮刀切除，分离胶上的蛋白质图谱用考马斯亮蓝R-250进行染色。一些代表性的显示有蛋白质组模式的凝胶如后所示。(图1)
显然，只有采用构成本发明技术领域的提取介质(尤其像C，D和E处理)用于香叶天竺葵组织的蛋白质组(多肽模式)溶液才是可行的。这作为关键特征可同时用于该种植物的一维和二维蛋白质组。
实施例4
将1克栽培品种为“Bourbon”的香叶天竺葵(天竺葵种)新鲜叶片组织进行可溶蛋白质的水性分离，采用一半体积(0.5ml提取介质每1.0克新鲜组织)的冷却提取介质：(A)0.2M Tris-HCl，pH7.5或(B)pH7.5的0.2M Tris-HCl，含50％(v/v)二甲基亚砜或(C)0.2M Na2CO3，用全玻璃研棒和研钵在0-4℃下进行手工均质。组织匀浆物在0-4℃冷冻离心机内及10,000×g下离心30分钟，收集上清液用于进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以显示组织提取物中的多肽图谱。为此，将100μl提取物与等体积的SDS样品缓冲液混合于微离心管内，并置于沸水浴中持续3分钟。
将样品置于冰块上快速冷却，并贮存于-20℃下直到用于电泳。变性的SDS-PAGE采用垂直电泳系统(Mini Proten-II，Bio Rad)中的堆积胶和分离胶不连续系统进行。将等体积(10jjl)的每种样品制备物加入加样孔中，并在每块胶中用标准分子量标记混合物进行共同电泳。凝胶中的聚合物浓度是堆积胶内4.0％(T)，分离胶内14.0％(T)。采用溴酚蓝试剂作为跟踪染料。电泳在恒定电压下进行(样品在堆积胶内移动时150伏特，而在分离胶内移动时100伏特)。电泳结束后，堆积胶区域用刮刀切除，分离胶中的蛋白质图谱采用银染方案(非双胺化学显色的蛋白质染色)进行染色。一些代表性的显示有蛋白质组模式的凝胶如后所示。(图2)
显然，即使使用银染辅助检测，采用构成本发明技术领域的提取介质(尤其像C处理)用于香叶天竺葵组织蛋白质组(多肽图谱)溶液也是相当可行的。这作为关键特征可同时用于该种植物的一维和二维蛋白质组。
实施例5
将1克栽培品种为“Bourbon”的香叶天竺葵(天竺葵种)新鲜叶片组织进行可溶蛋白质的水性分离，采用一半体积(0.5ml提取介质每1.0克新鲜组织)的冷却提取介质：(A)pH7.5的0.2M Tris-HCl，含50％(v/v)二甲基亚砜或(B)0.2M Tris-HCl缓冲液，pH7.5或(C)0.2M Na2CO3或(D)0.4M Na2CO3或(E)0.2M Na2CO3含50％(v/v)二甲基亚砜，用全玻璃研棒和研钵在0-4℃下进行手工均质。组织匀浆物在0-4℃冷冻离心机内及10,000×g下离心30分钟，收集上清液用于在非变性聚丙烯酰胺凝胶中实施酶多分子模式。非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳采用垂直电泳系统(Mini Proten-II，Bio Rad)中的堆积胶和分离胶不连续系统进行。将等体积(25jal)的每种样品制备物加入加样孔中。凝胶中的聚合物浓度是堆积胶内4.0％(T)，分离胶内14.0％(T)。采用溴酚蓝试剂作为跟踪染料。电泳在0-4℃、恒定电压下进行(样品在堆积胶内移动时150伏特，而在分离胶内移动时100伏特)。电泳结束后，堆积胶区域用刮刀切除，分离胶用催化特异性显色反应混合物在37℃下进行培育，以进行催化活性条带的原位定位。催化活性条带显形后，在采用光学增强扫描仪(420oe，pdi Inc)及Diversity DatabaseTM的凝胶记录系统(pdi Inc.，USA)上进行同工酶模式的图象捕捉。一些显示有原位催化模式的代表性的酶/同工酶定位凝胶如后所示。
显然，只有采用构成本发明技术领域的提取介质用于香叶天竺葵组织的蛋白质组(酶)溶液才是可行的。
本发明主要优点：
1.它提供了从香叶天竺葵顽拗型组织(recalcitrant tissues)中水性提取可溶蛋白质的可行性。实际上，这些组织从商业和学术用途上讲都非常重要。
2.它使得组织的蛋白质组得以施行，这对于理解功能基因组是很关键的。
3.它方便了组织中一些信号多肽/蛋白质涉及从发育到调节等的内在或外源因子的分离与鉴定。
4.该方法可用于进行酶/同工酶/蛋白质/多肽模式形成，以用于不同应用，包括多样性评价，谱系分析，种系发生，基因型/栽培品系诊断，遗传，杂交评价，以及其他应用，像基于蛋白质的共显性标记(同工酶，抗体探针的多肽等等)等。
5.该方法可有助于代谢/酶学研究，这对于了解初级和次级代谢途径的机理和调节是很重要的。这也形成其调节的基础。
6.它可用作为天然(内源的)或外源基因(转基因)等表达(翻译或翻译后水平)研究的一个有效工具。

Claims (31)

1.一种可用于pH3.0的香叶天竺葵植物超酸性部分蛋白质提取物的酸性中和与图谱制作的组合物，所述组合物由0.2M碳酸钠及50％(v/v)二甲基亚砜组成。
2.权利要求1中所述的组合物，其中所述组合物中所述提取物的pH为6.5-8.0。
3.权利要求2中所述的组合物，其中所述组合物中所述提取物的pH优选7.0。
4.一种可用于pH3.0的香叶天竺葵植物超酸性部分蛋白质提取物的酸性中和与图谱制作的组合物，所述组合物由0.2M Tris-HCl缓冲液及0.2M碳酸钠组成，pH7.5。
5.权利要求4中所述的组合物，其中所述组合物中所述提取物的pH为5.5-6.5。
6.权利要求5中所述的组合物，其中所述组合物中所述提取物的pH优选6.0。
7.一种可用于pH3.0的香叶天竺葵植物超酸性部分蛋白质提取物的酸性中和与图谱制作的组合物，所述组合物由0.2M Tris-HCl及50％v/v二甲基亚砜组成，pH7.5。
8.权利要求7中所述的组合物，其中所述组合物中所述提取物的pH为6.0-7.0。
9.权利要求8中所述的组合物，其中所述组合物中所述提取物的pH优选6.0。
10.一种用于pH3.0的香叶天竺葵植物超酸性部分蛋白质提取物的图谱制作的用途，所述用途包含：
(a)采用含有酸性中和盐和下列酸性螯合化合物的缓冲液均质所述植物的超酸性部分：(i)0.2M碳酸钠及50％v/v二甲基亚砜；(ii)0.2MTris-HCl缓冲液及0.2M碳酸钠，pH7.5；或(iii)0.2M Tris-HCl缓冲液及50％v/v二甲基亚砜，pH7.5，
(b)将所述匀浆物离心30分钟，
(c)从上清液中获得所述蛋白质提取物，
(d)通过常规方法测定所获得的蛋白质提取物，
(e)利用分光光度法计算所述提取物中过氧化物酶的酶活与酶动力学，
(f)将步骤(d)的水性蛋白质提取物与十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺(SDS)样品缓冲液混合，
(g)将所述混合物煮沸1-10分钟，
(h)快速冷却煮沸混合物，
(i)采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对所述混合物进行电泳，
(j)采用分子量标记确定电泳混合物的多肽图谱，
(k)采用催化特异性显色反应混合物，将非变性聚丙烯酰胺凝胶进行温育，
(l)显形催化活性条带，以及
(m)确定所述蛋白质提取物的酶多分子形式模式。
11.权利要求10所述的用途，其中所述植物的气生部分具有超酸性。
12.权利要求10所述用途，其中所述植物的气生部分选自叶片、花瓣和萼片。
13.权利要求10所述的用途，其中对植物部分的均质优选采用手工。
14.权利要求10所述的用途，其中在室温或0-4℃冷冻条件下均质所述植物部分。
15.权利要求10所述的用途，其中在7,000×g至14,000×g速率下离心所述匀浆物。
16.权利要求10所述的用途，其中在室温或0-4℃冷冻条件下离心所述匀浆物。
17.权利要求10所述的用途，其中蛋白质水性提取物与十二烷基硫酸钠比例为1∶5至5∶1。
18.权利要求10所述的用途，其中所述混合物的煮沸在水浴中进行。
19.权利要求10所述的用途，其中电泳凝胶染料选自考马斯亮蓝R-250或银染用染料。
20.权利要求10所述的用途，其中SDS-PAGE可以是一维也可以是二维形式。
21.权利要求10所述的用途，其中用于酯酶催化活性的催化特异性显色反应混合物于pH6.5的0.1M磷酸盐缓冲液中含有2mM α-乙酸萘酯，2mM β-乙酸萘酯，1mM固蓝盐。
22.权利要求10所述的用途，其中用于谷氨酸草酰乙酸转氨酶(GOT)催化活性的催化特异性显色反应混合物于pH8.5的0.1MTris-HCl中含有2mM磷酸吡哆醛，4mM L-天冬氨酸，4.3mM α-酮戊二酸及5.4mM固蓝BB盐。
23.权利要求10所述的用途，其中对所述植物的均质采用选自如下的缓冲液：(a)0.2M Tris溶液，pH10.5及以上，(b)pH7.5的0.2MTris-HCl缓冲液，含0.2M碳酸钠，(c)0.2M碳酸钠，(d)pH7.5的0.2MTris-HCl，含高达50％v/v的二甲基亚砜，以及(e)0.2M碳酸钠，含高达50％v/v的二甲基亚砜。
24.权利要求23中所述用途，其中用于均质的缓冲液补充有7-14％的甘油。
25.权利要求23中所述的用途，其中含有0.2M碳酸钠的酸性中和缓冲液组合物显示蛋白质提取百分比增长600％。
26.权利要求23中所述的用途，其中含有0.2M碳酸钠、50％(v/v)二甲基亚砜的酸性中和缓冲液组合物显示蛋白质提取百分比增长600％。
27.权利要求23中所述的用途，其中含有0.2M Tris-HCl缓冲液、0.2M碳酸钠、pH7.5的酸性中和缓冲液组合物显示蛋白质提取百分比增长300％。
28.权利要求23中所述的用途，其中含有0.2M Tris-HCl以及50％v/v二甲基亚砜、pH7.5的酸性中和缓冲液组合物显示蛋白质提取百分比增长300％。
29.权利要求23中所述的用途，其中SDS-PAGE具有垂直电泳系统中带有堆积胶和分离胶的不连续系统。
30.权利要求29中所述的用途，其中堆积胶浓度为2-6％T。
31.权利要求29中所述的用途，其中分离胶浓度为10-18％T。
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