CN1319666A - 人睾丸发育相关基因编码蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明属于人类基因组技术领域,所述人睾丸发育相关基因(Aprotein related to testis development),全长cDNA序列为3957bp,其开放阅读框为3759bp,编码1253个氨基酸,该基因在基因库(Genbank)中的编号为AY009106。利用本发明的人睾丸发育相关基因表达克隆,可制备融合蛋白,用该蛋白免疫动物可制备单克隆和多克隆抗体,并可将基因克隆用于睾丸特异功能基因表达芯片的制备。

Description

人睾丸发育相关基因编码蛋白

本发明属于人类基因组技术领域。

本发明所述人睾丸发育相关基因是发明人在南京医科大学生殖医学江苏省重点实验室用基因芯片方法筛选获得，首先制备人睾丸功能基因表达芯片，通过比较胚胎和成年人睾丸功能基因的表达，获得差异表达克隆，经序列测定证明为全长cDNA，为3957bp；其开放阅读框架为3759bp，其编码1253个氨基酸。查阅基因库，可见同源的EST片段，且为多脏器表达。由于该基因是成人睾丸高表达，而胚胎与成人睾丸的主要差别是后者有精子发生，因此发现的人睾丸发育相关基因很可能与精子发生相关，用该基因克隆，可制备成融合蛋白，用该蛋白免疫家兔，可获得单克隆和多克隆抗体，该基因也可用于制备睾丸功能基因表达芯片。

由于人睾丸发育相关基因在Genbank数据库中尚无人的同源基因，本发明人对于该基因的结构和功能研究成果全都是开创性的。美国国家生物技术情报中心(National Center for BiotechnologyInformation,NCBI)已正式接受该基因为Genbank的新成员，接受号为AY009106。1 ggaggcgcgg gcagcgggga cggcatgccc gagaagaggc tcaccgcgga gccaccaact61 attacagaag aagaatttga agattctctg gcaacagatg atttccttgt agactacttt121 aatgaattcc taagccttcc aaccttttca gaggcaatta gatttaatgc agattatgga181 gtttttgaag tagctaatga tgctccacaa tttctggaaa aacaactgaa aaaaattcta241 caaaaccagc aacctcgaaa tcccatttat gatgttgtaa ggaaaggaaa gaatgaggtt301 aaacctgttc aaatgaatgc ccccgatgaa gatgagacca ttaatgtcaa ctacaatatt361 atgtgtctca gtcgtgaaga aggtattaag tggatcaaaa aagaaagact tccagcattt421 ctggaaagtg attgttactt tgaatacagg ttagccaaat tggtctcaca agtaagatgg481 agcaagtccg gcatgaattt cacagtagga tcaaattttt cttcctggat cgtgaaaaaa541 ccacccagtc taccacctcc tgccactgaa gaagataatc ttgcttccta tactcaaaca601 aaagattggt ttgcattagc aaaacaaagt cagcaaacag tatcaacctt ttcgttaccc661 tgttgtgtac cctacaacaa acttaaatca ccagctattt catctgtttc tgagaatttt721 atctttgatg atggagttca ccctaggaca aaaaaggacc catctaaaac caacaaattg781 atttctgaat ttgaagaaga agaaggagaa gaagaagagg tgtctgtatc tctacaagac841 actccttctc aagctcttct gagagtatac cttgaaaaga aacaggatgt tgatgaaagc901 ctgacaatgc atttctcaac atgtgaagaa tttttaagct cctatatata ctttattttg961 agaggagcaa ttcagcaaat tgttggaaag ccagttggag aaaccccaga ctatataaac1021 ttcaacaata taacaaaagt gtcatttgat gattgttttg agtctattca tggcaagaat1081 tttttaagtg aattagttca aactacaaag gagaggtcag aagagataga acaaacaagt1141 ttaagttcaa agaatgagag cgctggacca gagagcaggg cggactggtg tatttctcat1201 aggacttatg acattggcaa tagaaaggag tttgaaagat ttaagaaatt tataagaggt1261 acattgggag agagatattg gtggctatgg atggatattg agaggttaaa agttcttaag1321 gatcctggaa gacatcaaag acatcttgag aagatgaaaa aatgctatct agtgagcaat1381 ggagattact acctttctgc agaaatctta tcaaaattta aactgttaga tggatcacag1441 tggaatgaag agcatttaag aaatattcag tctgaagttt taaaaccttt acttctgtat1501 tgggcaccaa gattctgtgt tactcattca gcctcaacaa aatatgctag tgctgaactg1561 aaattctggc acctccgtca agcaaaacca aggaaggata ttgacccttt tccacaaatg1621 gcaaccctct tgccattaag acccaaatct tgcattccac agatacctga gatccagaaa1681 gaagaattca gcttatcaca acctcctaaa tctcccaata aatcacctga agtaaaaaca1741 gcaactcaaa agccttggaa gcgggagctt ttgtatccag gttcttctaa ggatgatgtg1801 attgagaaag ggtcaaagta catgtcagaa agcagcaaag tcattcattt aacatctttt1861 actgacattt ctgaatgtct caagccccag ctggatagaa gatacgctta tacagaagat1921 cctagggtta aaaccgtgtc agatgttggt gccttgggag gatctgacat ggaaaatttg1981 ttgcaatctt tgtatgtaga aaatagagct ggattcttct ttactaaatt ctgcgagcat2041 tcagggaaca agttgtggaa ggacagtgtg tacttttggt ttgacctgca ggcttatcat2101 cagcttttct accaagaaac acttcagcct tttaaagtat gcaagcaagc gcaatatctt2161 tttgccacat acgttgctcc ttctgccact cttgacattg gactccaaca ggaaaagaaa2221 aaagaaattt atatgaaaat acagccacca tttgaagacc tttttgacac agcagaggaa2281 tatatccttc tcctccttct tgagccatgg acaaagatgg taaaatcgga ccaaattgct2341 tataaaaagg tggagctggt ggaagaaact cgacagttag actccacata cttcagaaag2401 ctacaggctt tgcataaaga gacattttcc aagaaagctg aggacaccac ttgtgaaatt2461 ggaactggca ttttatcact ctctaacgtc tctaaacgaa cagaatattg ggataatgtt2521 cctgcagaat acaagcattt taagtttagt gatctgctta acaacaaactggagtttgaa2581 catttccgtc agtttcttga gactcattct tcaagcagga tcttatgtgc ggacagacat2641 tggagcagtt ccggagaaat aacttacaga gatcgaaatc aaaggaaggc aaaatctata2701 tacattaaaa acaaatacct taataaaaaa tatttctttg gacccaacag tccagcttct2761 ctgtatcagc agaaccaggt aatgcattta agtggtggct gggggaagat tcttcatgag2821 cagcttgatg cacctgttct agttgaaatc cagaagcatg tgcaaaatag gctagaaaat2881 gtatggctgc cattgtttct tgcaagtgaa cagtttgcag cacgtcagaa gataaaggta2941 cagatgaaag acatagcaga agagctctta ctacagaagg ctgaaaagaa aatcggggtc3001 tggaagcctg tggagagtaa gtggatctct tcatcttgta aaatcattgc ttttcgcaaa3061 gcattattga atccagttac ttcaagacaa tttcaacgtt ttgtggctct aaaaggagat3121 ttattggaaa atggtttact cttttggcaa gaagtacaaa aatataagga cttgtgccat3181 tctcattgtg atgagactgt catccagaag aagattacaa ctattatcaa ctgctttatt3241 aattccagta ttccaccagc tttacaaatt gacattccag tagagcaagc ccagaagatt3301 attgaacacc ggaaggagtt aggaccatat gtatttagag aggcacagat gacaattttt3361 ggggttctgt ttaaattctg gcctcagttc tgtgagttta ggaagaattt aacagatgaa3421 aatattatga gtgttttaga gagaagacaa gaatataata agcagaaaaa aaaattggca3481 gtcctagaag acgaaaaatc tggaaaggat ggaatcaagc aatatgcaaa tacttcagtg3541 cctgctatca aaactgcttt actcagtgat tccttcctag gcctccaacc atatggccga3601 cagccaacct ggtgctactc aaagtatata gaagccttag aacaggagag aattcttctt3661 aagatccaag aagaactaga aaaaaagttg tttgcaggct tgcaacctct cacaaatttt3721 aaggctagct cttcaactat gtctttgaaa aagaatatgt ctgcccacag cagccagaag3781 tgacagcatt cttgtgaatg tttacatcct gctgctgata ggttcaagga attctttaaa3841 ccagattctg ctgacatgag aagctccagt gatttgtttt tttgaaggtc tgtatcagag3901 caagcctaac atctaaataa agtttgattc tggattttcc agggggaaaa aaaaaaa人睾丸发育相关基因cDNA序列MPEKRLTAEPPTITEEEFEDSLATDDFLVDYFNEFLSLPTFSEAIRFNADYGVFEVANDAPQFLEKQLKKILQNQQPRNPIYDVVRKGKNEVKPVQMNAPDEDETINVNYNIMCLSREEGIKWIKKERLPAFLESDCYFEYRLAKLVSQVRWSKSGMNFTVGSNFSSWIVKKPPSLPPPATEEDNLASYTQTKDWFALAKQSQQTVSTFSLPCCVPYNKLKSPAISSVSENFI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本发明的目的是：鉴于人睾丸发育相关基因是本发明人发现的全新基因，目前人类对此基因的认识和了解仅限于本发明人所做的科学研究工作。由于该基因是与睾丸特异功能相的基因，而且是胚胎低表达，成人高表达，因此该基因很可能与睾丸内的精子发生有关，其异常表达可能影响男性的生殖功能，因此该基因的研究可用于：①通过制备该基因的融合蛋白，用于研究该基因与睾丸功能的关系，还可能成为一种治疗男性睾丸相关疾病的生物药品。

②制备特异性抗体：基因编码蛋白的特异性抗体是研究基因结构和功能的不可缺少的重要工具，人睾丸发育相关基因编码蛋白的多克隆和单克隆抗体，可用作免疫组织化学染色、ELISA、免疫电镜、免疫共沉淀等多种根据免疫学原理设计的检测方法，可用于该基因编码蛋白在组织细胞中的定位和定量研究，也可用于各种生物样本(如血液、精液、尿液等)中的含量变化研究以及蛋白质一蛋白质相互作用研究等。因此，该抗体有可能用于制备与人睾丸发育相关基因表达异常相关疾病诊断试剂盒，并有可能用于制备抗生育药物。

③制备基因诊断芯片：将功能基因用于制备基因诊断芯片是基因开发研究的一个重要方面，在疾病诊断(如男性不育、性功能低下)和药物筛选等方面均具有重要意义。本发明技术方案1．人睾丸发育相关基因融合蛋白的制备

以人睾丸发育相关基因开放阅读框的核苷酸序列与质粒pDEST^TM15制备成GST-SP2-pDEST15表达质粒，在无NaCl的LB中30℃培养到0.5 OD600，经0.3M NaCl诱导后，超声粉碎后经GST亲和层析柱纯化，得到纯化的融合蛋白。2．人睾丸发育相关基因编码蛋白特异性多克隆抗体

取融合蛋白与载体蛋白KLH(Keyhole Limpet Hymocyanin)结合，经透析后再与完全/不完全佐剂(Complete/Incomplete Freund’sAdjuvant)等量混合，免疫新西兰兔(背部皮下注射)，每隔3～4周激发注射一次，共三次，于三个月后取血分离血清。以免疫前动物血清作为对照做ELISA，测定各免疫兔血清中抗体滴度。筛选高滴度血清，进一步用抗原作竞争抑制免疫试验确定抗体的特异性。根据ELISA结果确定其用于免疫组织化学染色的稀释倍增数为1∶200～500。3．人睾丸发育相关基因编码蛋白特异性单克隆抗体

取融合蛋白与载体蛋白KLH(Keyhole Limpet Hymocyanin)结合，经透析后再与完全/不完全佐剂(Complete/Incomplete Freund’sAdjuvant)混合，免疫Balb/C小鼠(腹腔内注射)，隔周一次，连续2-3次，融合前静脉加强一次，用ELISA方法证实抗体的产生后，取脾脏分离脾细胞，然后与骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞。阳性克隆经多次亚克隆，直至获得分泌抗人睾丸发育相关基因的单克隆杂交瘤细胞株。4．人睾丸发育相关基因用于制备睾丸功能基因表达芯片

(1)以获取的人睾丸发育相关基因的核苷酸序列设计引物，扩增全长的人睾丸发育相关基因序列，用作点膜的样品。

(2)用英国BioRobotics自动点膜仪将标本点在8×12cm尼龙膜上，每一标本点2个点，每点的DNA量约几ng。；阳性对照8个housekeeping genes (a.ribosomal protein S9；b.Actin gamma；c.glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；d.hypoxanthinephosphoribosyltransferase 1；e.H.sapiens mRNA for 23KD highly basicprotein；f.ubiqnitin C；g.Phospholipase A2；h.ubiquitin carboxy I-ferminal esterase L I)。阴性对照加λ噬菌体DNA和P-blue质粒。

(3)将含有该基因的芯片用于人睾丸发育相关基因缺失的诊断和药物筛选

³³P:标记：

抽提待检标本mRNA或DNA，用Random Primer标记法标记已待检标本mRNA或DNA，作为杂交的探针。杂交：

将点制好的尼龙膜标记探针杂交后，杂交炉(68℃)内烘干，用磷屏压片。

信号扫描和分析：

用记录仪分析杂交信号。根据杂交信号的强弱分析影响人睾丸发育相关基因蛋白表达水平或人睾丸发育相关基因的缺失。

Claims (4)

1．一种精子功能特异基因克隆制备的融合蛋白，其特征是人睾丸发育相关基因全部开放阅读框氨基酸，序列为：MPEKRLTAEPPTITEEEFEDSLATDDFLVDYFNEFLSLPTFSEAIRFNADYGVFEVANDAPQFLEKQLKKILQNQQPRNPIYDVVRKGKNEVKPVQMNAPDEDETINVNYNIMCLSREEGIKWIKKERLPAFLESDCYFEYRLAKLVSQVRWSKSGMNFTVGSNFSSWIVKKPPSLPPPATEEDNLASYTQTKDWFALAKQSQQTVSTFSLPCCVPYNKLKSPAISSVSENFIFDDGVHPRTKKDPSKTNKLISEFEEEEGEEEEVSVSLQDTPSQALLRVYLEKKQDVDESLTMHFSTCEEFLSSYIYFILRGAIQQIVGKPVGETPDYINFNNITKVSFDDCFESIHGKNFLSELVQTTKERSEEIEQTSLSSKNESAGPESRADWCISHRTYDIGNRKEFERFKKFIRGTLGERYWWLWMDIERLKVLKDPGRHQRHLEKMKKCYLVSNGDYYLSAEILSKFKLLDGSQWNEEHLRNIQSEVLKPLLLYWAPRFCVTHSASTKYASAELKFWHLRQAKPRKDIDPFPQMATLLPLRPKSCIPQIPEIQKEEFSLSQPPKSPNKSPEVKTATQKPWKRELLYPGSSKDDVIEKGSKYMSESSKVIHLTSFTDISECLKPQLDRRYAYTEEPRVKTVSDVGALGGSDMENLLQSLYVENRAGFFFTKFCEHSGNKLWKDSVYFWFDLQAYHQLFYQETLQPFKVCKQAQYLFATYVAPSATLDIGLQQEKKKEIYMKIQPPFEDLFDTAEEYILLLLLEPWTKMVKSDQIAYKKVELVEETRQLDSTYFRKLQALHKETFSKKAEDTTCEIGTGILSLSNVSKRTEYWDNVPAEYKHFKFSDLLNNKLEFEHFRQFLETHSSSRILCADRHWSSSGEITYRDRNQRKAKSIYIKNKYLNKKYFFGPNSPASLYQQNQVMHLSGGWGKILHEQLDAPVLVEIQKHVQNRLENVWLPLFLASEQFAARQKIKVQMKDIAEELLLQKAEKKIGVWKPVESKWISSSCKIIAFRKALLNPVTSRQFQRFVALKGDLLENGLLFWQEVQKYKDLCHSHCDETVIQKKITTIINCFINSSIPPALQIDIPVEQAQKIIEHRKELGPYVFREAQMTIFGVLFKFWPQFCEFRKNLTDENIMSVLERRQEYNKQKKKLAVLEDEKSGKDGIKQYANTSVPAIKTALLSDSFLGLQPYGRQPTWCYSKYIEALEQERILLKIQEELEKKLFAGLQPLTNFKASSSTMSLKKNMSAHSSQK

2．根据权利要求1所述针对人睾丸发育相关基因开放阅读框氨基酸序列制备的多克隆抗体，其特征是融合蛋白与完全和不完全佐剂混合后，免疫新西兰兔制备多克隆抗体。

3．根据权利要求1所述针对人睾丸发育相关基因开放读框氨基酸序列制备的单克隆抗体，其特征是融合蛋白与完全和不完全佐剂混合，免疫Balb/C小鼠，分离脾脏B淋巴细胞并和骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞，进一步用亚克隆方法、ELISA和抗体分型方法筛选分泌IgG抗体的单克隆，制备单克隆抗体。

4．根据权利要求1所述针对将人睾丸发育相关基因开放读框氨基酸序列用于制备睾丸功能基因表达芯片，其特征是PCR扩增人睾丸发育相关基因cDNA，点于芯片用于芯片制备。