CN1319021A - 联合治疗中的趋化因子受体拮抗剂和环孢菌素 - Google Patents

联合治疗中的趋化因子受体拮抗剂和环孢菌素

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Abstract

本文公开了采用趋化因子受体拮抗剂和环孢菌素产生一种药物组合物,来治疗或预防对移植器官、组织或细胞的排斥。还公开并要求了同时、分别或依次使用其活性成分,用于上述特定治疗的所述药物组合物。具体说,实验性显示了用Met－RANTES和环孢菌素A产生药物组合物,用于治疗肾脏同种异体移植排斥。

Description

联合治疗中的趋化因子受体拮抗剂和环孢菌素
发明领域
本发明涉及使用趋化因子受体拮抗剂和环孢菌素来产生药物组合物，用于治疗或防止移植器官、组织或细胞的排斥。它还涉及同时、分别或依次使用所述药物组合物的活性成分，用于上述特定治疗。
具体说，它涉及用Met-RANTES和环孢菌素A来产生药物组合物，用于治疗肾脏同种异体移植物的移植排斥。
发明背景
T细胞对外来(同种或异种)的蛋白质或细胞或器官发动应答的机制已经被很好的理解。抗原递呈细胞(APC)吸附在炎症或损伤(可能由手术移植引起)的区域。外周T细胞的所有组成成分常常巡查组织中有无病原体的证据或外源(同种或异种)组织的存在。一旦识别了任何这些警报信号，APC吞没该蛋白，将其消化并将其递呈给宿主的免疫系统。
免疫系统配备良好，能迅速识别外源、疾病或发炎的组织，并迅速破坏它。这常常是组织、器官和细胞移植以及基因治疗中主要的障碍。主要的问题通常和慢性免疫抑制、包围或免疫隔离有关。慢性免疫抑制的不良副作用包括对机会性感染和肿瘤形成的易感性。
具体说，急性肾脏同种异体移植的排斥是由同种抗原-依赖性和非依赖性因素介导的，而且它的特征是主要由T淋巴细胞、单核细胞/巨噬细胞和偶然的嗜伊红粒细胞构成的单核细胞浸润(Grne H.J.,1996,Valente J.F.等，1998,Bishop G.A.等，1986)。这些白细胞从外周循环中集中进入移植器官涉及在白细胞和内皮细胞表面表达的一系列分子之间的复杂相互作用(Butcher E.C.,1991,Butcher E.C.等，1996,Springer T.A.,1994)。
在不存在持续的免疫抑制下，对长期接受移植组织的需要是人类医学的一个长期目标。
已显示趋化因子，一种结构相关细胞因子的大超家族，能选择性促进特异性白细胞效应亚群的迅速粘着、化学趋向和活化(Springer T.A.,1994,Nelson P.J.等，1998,Luster A.D.,1998,Schlndorff D等，1997)。
趋化因子的特征是一系列共享的结构元件，包括用来确定C、C-C、C-X-C和C-X3-C趋化因子亚组的保守半胱氨酸残基(其中X代表在前两个邻近氨基末端的半胱氨酸之间插入的氨基酸残基)。趋化因子的所有各种生物作用看来是通过它们和7个跨膜(跨越C-蛋白偶联受体)的大家族相互作用指导的(Nelson P.J.等，1998,Luster A.D.1998,Schlndorff D.等，1997)。特异性表达这些受体的细胞类型看来在显著程度上控制着趋化因子作用的白细胞特异性(Nelson P.J.等，1998,Luster A.D.,1998,Schlndorff D.等，1997)。
趋化因子RANTES(激活后调控，正常T细胞表达并分泌的)，一种C-C趋化因子亚家族的成员，是许多趋化因子受体，包括人的CCR1、CCR3、CCR5、CCR9和DARC(趋化因子的Duffy抗原受体)的配体(Nelson P.J.等，1998,Luster A.D.,1998,Schlndorff D.等，1997,Nibbs R.J.等，1997)。RANTES是一种T细胞。单核细胞、自然杀伤细胞、嗜硷细胞和嗜伊红粒细胞的强大趋化诱引剂(Nelson P.J.等，1998)。
认为RANTES等趋化因子在引起各种疾病过程的细胞渗出中起着中枢作用。例如，RANTES在体内特征是单核细胞浸润的疾病，包括迟发型超敏反应、坏死性肾小球肾炎、肺部炎症疾病和肾脏异体移植排斥中表达(Schlndorff D.等，1997,Nelson P.J.等，1998,Devergne O.等，1994,Luckas N.W.等，1996,Lloyd C.M.等，1997,Pattison J.等，1994,Wiedermann C.J.等，1993)。在对经受急性细胞排斥的人肾脏的研究中，发现RANTES蛋白定位在单核细胞浸润性细胞、肾小管上皮细胞和小管周围毛细血管内皮上(Pattison J等，1994,Wiedermann C.J.等，1993)。由于急性细胞排斥的特征是：单核细胞/巨噬细胞、T淋巴细胞和偶而嗜伊红粒细胞构成的血管内异常的间质细胞浸润，RANTES可能是急性排斥病理中的关键因素(Schlndorff D.等，1997,Nelson P.J.等，1998,Pattison J.等，1994,Wiedermann C.J.等，1993)。
基于这些观察，已提出了一个在肾脏异体移植排斥中RANTES作用的模型(Nelson P.J.等，1998,Pattison J等，1994,Wiedrmann C.J.等，1993)。在排斥早期，微血管内皮变得发炎，血小板脱颗粒，释放与内皮表面结合的RANTES蛋白。发炎的肾小管和内皮细胞产生额外的趋化因子，包括RANTES。然后该聚集的表面结合趋化因子向循环性白细胞提供滚过内皮表面的导向信号(Butcher E.C.等，1991,Butcher E.C.等，1996,Springer T.A.,1994,Nelson P.J.等，1998,Pattison J.等，1994,Wiedermann C.J.等，1993)。白细胞识别该表面结合的蛋白，上调整联蛋白，并牢固的粘着于内皮表面，经历白细胞渗出和外渗。随着白细胞活化，它们产生其它细胞因子和趋化因子，从而放大并传播炎症反应(Nelson P.J.等，1998,Pattison J.等，1994,Wiedermann C.J.等，1993)。
修饰RANTES蛋白的氨基末端可显著改变其性能(Proudfoof等，1996,Gong J.H.等，1996,Simmons G.等，1997)。加入一个甲硫氨酸残基将促效蛋白变成具有纳摩尔效价的RANTES受体拮抗剂(Proudfoof A.E.等，1996)。该拮抗剂，Met-RANTES，在小鼠和大鼠中是生物活性的(Proudfoot未发表)，而且已显示在小鼠的过敏性皮肤和类风湿性关节炎模型中能抑制炎症，并部分抑制坏死性肾小球肾炎(TeixeiraM.M等，1997,Plater-Zyberk C.等，1997,LLoyd C.M等，1997)。
环孢菌素代表一组非极性环状寡肽，具有免疫抑制剂活性，由真菌Tolypocladium inflatum Gams和其它半知菌产生。已鉴定了其主要成分环孢菌素A和几种其它微量代谢产物，环孢菌素B到N。还已经制备了许多合成的同类物。环孢菌素A是商业可购得的药物，它获得了广泛的临床应用，如作为器官移植程序中的免疫抑制剂。
环孢菌素A的主要问题是它的肾脏毒性(Martindale,1996)，特征是液体潴流，血清肌酐和尿素浓度提高，肾小球滤过率的下降，和钠和钾排泄减少。具体说，在肾脏异体移植中，接受者可能难于将移植排斥和肾脏毒性分开。
发明描述
我们现在已发现，用趋化因子受体拮抗剂和低剂量的环孢菌素组合处理，和单用环孢菌素处理比较，导致与移植排斥相关的炎症活动降低。
具体说，我们已发现Met-RANTES减少了对脉管和肾小管的损伤，并导致肾脏异体移植中间质排斥的显著减弱。
因此，本发明的主要目的是联合使用趋化因子的受体拮抗剂和环孢菌素来产生一种药物组合物，以治疗或预防移植器官、组织或细胞的排斥。趋化因子受体拮抗剂和环孢菌素可以同时、分开或依次施用。
因此，本发明的另一个目的是通过同时、分别或依次施用有效量的趋化因子受体拮抗剂和有效量的环孢菌素，以及药物学上可接受的赋形剂，治疗或防止对移植器官、组织或细胞的排斥。
“有效量”指一定量的活性成分，它足以影响移植器官、组织或细胞排斥的过程和严重性，导致这些病理过程的减弱和缓和。有效量将视施药途径和病人的情况而定。
本发明的另一个目的是含有趋化因子受体拮抗剂和环孢菌素，并存在一种或多种药物学上可接受的赋形剂的药物组合物，通过同时、分别或依次施用其活性成分，以治疗或防止移植器官、组织或细胞的排斥。
就分开和依次使用两种活性成分而言，本发明的药物组合物将含有两种不同的制剂，每一种含有两种活性成分之-，和一种或多种药物学上可接受的赋形剂。
“药物学上可接受”指包括任何不干涉活性成分的生物活性效果，并对宿主无毒的载体。例如，对于胃肠道外施用，上述活性成分可以单剂形式配制在载体，如盐水、葡萄糖溶液、血清清蛋白和Ringer’s溶液中。
除了药物学上可接受的载体，本发明的组合物还可包含微量的添加剂，如稳定剂、赋形剂、缓冲液和防腐剂。
这些活性成分的施用可以是静脉内、肌肉内或皮下途径。本发明也包括其它以达到各成分所需血液水平的施药途径。
本发明的组合治疗适合于治疗或防止任何移植器官、组织或细胞的排斥，但它特别适合肾脏移植，由于环孢菌素A的肾脏毒性。
术语“趋化因子受体拮抗剂”指任何对成熟的、全长的、天然存在趋化因子有拮抗剂作用，并优选不显示显著的趋化诱引剂活性的分子。对于测量这些趋化诱引剂活性，可参见例如(Nelson P.J.等，1998)。
趋化因子受体拮抗剂优选选自在国际专利申请WO 97/44462中报道的截短的RANTES分子，截短的MCP-3，国际专利申请WO98/06751中描述的RANTES和MIP-1α，欧洲专利申请号97116863.8中描述的截短的RANTES和MCP-2，或WO96/17935中描述的N-末端延长的RANTES。Met-RANTES是特别优选的。对于上述专利出版物，还参考了制备所述的趋化因子受体拮抗剂的方法。
环孢菌素选自环孢菌素A，其代谢产物或合成的同类物。优选的是环孢菌素A。
因此，本发明的一个优选例包括组合使用Met-RANTES和环孢菌素A，以治疗或预防肾脏同种异体移植的排斥。就此，本申请人已发现可能减少环孢菌素的有效剂量，而且考虑到已知和环孢菌素治疗有关的剂量依赖性的肾脏毒性，这是一个极大的优点。
已在大鼠的体内实验中显示了上述作用。
现在，本发明将通过下列实施例描述，这些实施例不应以任何方式看成是对本发明的限制。实施例将参考附图。
附图描述
图1：测定了在用IL-1β(5ng/ml)刺激之前和之后12小时RANTES和微血管内皮直接结合的能力。DMVEC在96孔板上生长，用改良的ELISA程序测定RANTES。
图2a和b：在生理流动下，Met-RANTES对MonoMac 6细胞在活化的微血管内皮上牢固停滞、铺展和转移的影响。用IL-1β(5ng/ml)刺激DMVEC在Petri皿中生长至汇合，或放置不处理12小时，并预先用或不用RANTES(10ng/ml)预培育30分钟。用或不用Met-RANTES(1微克/毫升)预处理MonoMac 6细胞30分钟，并以稳定流速1.5dyn/cm2灌流。(a)5分钟后，计算多个视野中牢固粘附的单核细胞数，确定对DMVEC的牢固粘着，表示为：细胞/平方毫米。(b)5分钟后，在多个高倍视野中对经历铺展或转移的单核细胞计数，表示为初始牢固结合细胞的百分数。数据代表三个独立实验的平均数±标准偏差。(注意：结果在0.01-1微克/毫升的Met-RANTES范围内可重现)。
实施例
材料和方法
所用细胞
如前所述，在补充了10％FCS的RPMI1640中培养单核肿瘤细胞系MonoMac6(Ziegler-Heitbrock H.W.L.等，1988)。在24孔培养板(Costar)中常规培养细胞，测试培养液和血清的低LPS含量。从K.Degitz博士获得了人新生儿包皮(forskin)的原代人皮肤微血管内皮细胞(DMVEC)(Dermatology,LMU,Munich,Germany)。在补充了10％胎牛血清(Boehringer Mannheim,Germany)、1mg/ml醋酸氢化可的松(Sigma,Deisenhofen,Germany)、5×105M二丁酰腺苷一磷酸(Sigma,Deisenhofen,Germany)、2mM谷氨酰胺(Seromed,Berlin,Germany)、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素、25mg/ml Amphtericin B(抗生素/抗霉素溶液，Gibco BRL,Eggenstein,Germany)的MCDB 131培养液(GibcoBRL,Eggenstein Germany)中，37℃,5％CO2下培养细胞。细胞在T75瓶，35毫米Petri皿(Costar,Corning,New York)或用0.5％明胶(Sigma,Deisenhofen,Germany)预包被的96孔平底培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中生长。每2-3天换一次培养液。确定细胞特征，通过形态学外观和免疫荧光流式细胞计数确定培养物的CD31表面表达的纯度。
材料
从Merck(Darmstadt,Germany)获得了用于组织学研究的材料。Sigma(Munich,Germany)提供了化学和免疫学测定的材料。从Sigma(Munich,Germany)购得IL-1β和TNFα。先前已描述了重组RANTES和RANTES特异性单克隆抗体VL1的产生(Von Luettichau I.,1996)。如前所述，产生Met-RANTES并除去内毒素，用于体内研究(Proudfoof A.E.等，1996,Teixeira M.M等，1997,Plater-Zyberk C.等，1997,Lloyd C.M等，1997)。
动物和肾脏移植
在所有实验中使用近交雄性大鼠。Lewis(LEW,RT11)大鼠作为Fisher344(F344 RT11v1)或Brown Norway(BN RT1*)肾脏的接受者。动物购自CharlesRiver GmbH,Sulzfeld,Germany。大鼠重量在190-250gm(Lew和F344)和140-170gm(BN)，以校准输尿管直径。采用改良的原来由Fisher和Lee(Fisher B.等，1965)描述的技术进行移植。简单说，用乙醚点滴麻醉剂麻醉动物，用5毫升冷的含或不含100微克Met-RANTES的0.9％NaCl(4℃)冲洗供体肾脏。整个取下肾脏和输尿管，包括用5毫米主动脉钳取下肾动脉和用3毫米腔静脉塞片取下肾静脉。将肾脏保存在4℃的0.9％NaCl中。
在左肾脏主动脉下方，用8-0不可吸收的单根尼龙缝线端侧吻合手术将供体肾脏移植到受体动物的腹部主动脉和下腔静脉上。用11-0不可吸收单根尼龙缝线进行对端输尿管缝合。供体肾脏的总缺血时间在30-40分钟之间变化。同时死亡时肉眼检查和用光学显微镜观察肾积水。从实验组中除去所有具有肾积水的动物。在移植时，总是除去接受者的左肾。在Fisher到Lewis移植中，保留右肾，以获得对Met-RANTES作用的内部对照。在Brown Norway到Lewis移植中，在移植时进行双侧肾切除。
实验组：
实验组如下：
组1:Fisher 344肾脏移入具有一个内源肾脏的Lewis大鼠。
组1a：用Met-RANTES200微克/日，7天(n=9)
组1b：不用Met-RANTES，7日(n=9)
组2:Brown Norway肾脏移入双侧肾切除的Lewis大鼠中，每日给予CyA2.5mg/kg体重。
组2a：用Met-RANTES,50微克/日，12日(n=4)。
组2b：不用Met-RANTES,12日(n=4)。
将环孢菌素A(Cya)(Sandoz,Basel,Switzerland慷慨提供)溶于橄榄油中，并以2.5mg/kg体重每日皮下施药12日，移植后4小时开始。将Met-RANTES溶于水，并调节到0.9％氯化钠，每日一次静脉内注射Fisher到Lewis200微克，Brown Norway到Lewis移植实验中50微克剂量每日注射一次。
血清分析
在处死时，从主动脉取血，用自动化血清分析仪分析肌酐、尿素、葡萄糖和胆红素。这对Fisher到Lewis模型不提供肾脏功能的信息，因为该移植动物有一只内源肾脏，但这些测量在Brown Norway到Lewis移植模型中是相关的。
组织学
在深度麻醉下，取出器官(肺、肝、肾脏和脾脏)。快速吸干器官的血液，称重，然后按组织学、免疫组织化学，或原位杂交的需要处理。将各器官切成1毫米的切片，用含有4％甲醛的pH7.35的磷酸缓冲盐(PBS)(PBS:99mMNaH2PO4xH2O,108mM NaH2PO4x2H2O和248mMNaCl)中浸没固定24小时，或用甲醇固定8小时并用石蜡包埋，或冻在液氮中，储藏在-80℃，直到用于免疫组织化学。在用高碘酸-Schiff或Goldner-Elastica染色的3微米切片上用光学显微镜观察。
免疫组织化学
对甲醇固定、石蜡包埋的组织(3微米)使用单克隆抗体ED1(Serotech/Camon,Wiesbaden,Germany)，来显示单核细胞/巨噬细胞。为了检测细胞毒性T淋巴细胞上表达的CD8抗原，在用冰冷的丙酮固定5分钟后，对冷冻切片使用单克隆小鼠抗体(Serotech/Camon,Wiesbaden,Germany)。使用了碱性磷酸酶抗-碱性磷酸酶检测系统(Dako,Hamburg,Germany)。对于每个测试切片删去第一或第二抗体的对照呈阴性。
形态测量
血管损伤评分：按显示无损伤(0)、轻微(1)、中度(2)和严重(3)的损伤程度，评估了具有内皮损伤、血栓和内皮炎的肾小球前输入血管，并在整个肾脏切片，包括皮质、外髓质和内髓质中评估。程度特异性的血管损伤指标被定义成在整个肾脏切片中发生各种损伤程度的血管百分数。总血管损伤评分计算为具有各种程度血管损伤的所有血管之和，其中具有程度1的血管数乘以1，程度2的乘以2，程度3的乘以3(Stojanovic T等，1996)。肾小管炎症评分：按在20个皮质和外髓质切条中的高能场(HPF)中所判断的，肾小管损伤分为不存在(0)、轻微(1)、中度(2)和严重(3)。总肾小管损伤评分如总脉管损伤评分所述计算，间质炎症评分：单核细胞的间质浸润程度被判断为不存在(0)、轻微(1)、中度(2)和严重(3)，而总评分计算按总血管损伤评分所述的那样。肾小球毛细管攀内单核细胞/巨噬细胞和T细胞的数目计算为一个肾脏切片中所有肾小球中各细胞数的平均值。
原位杂交
体外转录大鼠RANTES的cDNA克隆，产生了单链的RNA探针(Dr.H.Sprenger,Marburg,Germany)。用Trans-Probe-T试剂盒(Pharmacia,Freiburg,Germany)和异羟基洋地黄毒甙元标记的尿苷三磷酸(Boehriger,Mannheim,Germany)进行了体外转录。用BamHⅠ切开载体(pBluescriptKS(+)Stratagene,Heidelberg,Germany)，并用T3-RNA聚合酶转录，得到反义探针和有义探针，用EcoRⅠ切开该质粒，然后用T7 RNA聚合酶转录。除去石蜡后，用含20微克/毫升的蛋白酶K(Boehringer)的PBS消化肾脏切片16分钟。然后在4％甲醛中固定切片5分钟，并乙酸化(含0.25％乙酸酐的0.1M三乙醇胺，10分钟)。为了与异羟基洋地黄毒甙元标记的mRNA原位杂交，使用了下列杂交缓冲液：5x标准柠檬酸盐水(SSC)、50％甲酰胺、50微克/毫升tRNA、50微克/毫升肝素和0.1％十二烷基磺酸钠。
56℃杂交16小时后，用4xSSC和2xSSC 37℃洗涤载玻片10分钟，然后22℃在0.55xSSC中洗涤30分钟，在0.1SSC中洗涤15分钟。按照厂商说明书(Boehringer,Mannheim,Germany)进行抗异羟基洋地黄毒甙元抗体培育和碱性磷酸酶反应，采用氮蓝四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸作为显色剂(Stojanovic T等，1996,Simon等，1995)。
如前所述(Simon M等，1995)中从整个大鼠肾脏中分离出总RNA。用商品RPA试剂盒(PharMingen,San Diego,California，探针rCK-1)进行RNase保护实验。该试剂盒能同时测定大鼠的mRNA种类：IL-1α、IL-1β、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IFN-γ和持家基因GAPDH和L32，对每次测定使用了20微克总RNA。在预制凝胶(QuickpointTM快速核酸分离系统，按厂商推荐使用，Novex,San Diego,California)上走保护的样品。用Molecular Dynamics Storm 840 Phosphorimager定量特异性条带的强度，对L32基因表达标准化，并取分析的三只动物的平均值。
体外结合试验
DMVEC在包被的96孔平底培养板上生长至汇合。不处理，或用各种浓度的IL-1β(0.1-5ng/ml)处理得到的单层内皮12小时。RANTES结合试验是前述程序(Pattison J.等，1994,Wiedermann C.J.等，1993)的改良。25℃在DMVEC生长培养液(无补充)中预培育偶联有抗-人-RANTES单克隆抗体VL1的辣根过氧化物酶(HRP)(0.1微克)和过量的重组人RANTES(20微克/毫升)30分钟。然后加入趋化因子-抗体复合物，并用来分析微血管内皮的相对趋化因子结合能力。用未补充的生长培养液(25℃)温和洗涤内皮单层1次，并加入趋化因子-抗体复合物，25℃培育30分钟。然后用不含血清的培养液25℃洗涤孔4次。HRP反应进行5分钟或更短。用ELISA平板阅读仪测定平板在406纳米处的光密度。结果证明内皮细胞活化后，发炎的微血管内皮对RANTES蛋白的结合能力的改变。所有实验进行4次，显示的结果是三个独立实验的代表。
荧光激活细胞分选(FACS)分析
基本如所述(Weber C等，1995)进行皮肤微血管细胞(DMVEC)的流式细胞计数分析。简单说，用胰蛋白酶消化经IL-1β(5ng/ml)刺激12小时或未处理的汇合DMVEC，与IL饱和浓度的ICAM-1 mAb RR1/1(Dr.R.Rothlein慷慨赠与)、E-选择素mAb、VCAM-1 mAb(都是Serotec)、或同型抗原对照在冰上反应30分钟，用异硫氰酸荧光素(FITC)-偶联的山羊抗-小鼠IgG(Boehringer Mannheim)染色，并在FACScan(Becton Dickinson)中分析。纠正非特异性结合后，数据表达成通道中的特异性平均对数荧光强度(sMFI)。
在生理流动条件下，单核细胞在微血管内皮上聚集的体外模式系统
基本如所述(Weber C等，1997,Kukerti S.等，1997,Piali L等，1998)，在层流试验中研究了单核细胞和DMVEC的相互作用。简单说，DNVEC在35毫米Petri培养皿中生长至汇合，并用IL-1β(5ng/ml)刺激12小时或不处理。将平板收集在平行壁流通室中，并安放在具有20X和40X的相差物镜的OlympusIMT-2倒置显微镜的载物台上。如报道(Ziegler-Heitbrock H.W.L.等，1988,Weber C等，1993)培养单核细胞(MonoMac 6细胞)，并以106/毫升重悬浮在含有10mM Hepes/pH7.4和0.5％HAS的试验缓冲液(HBSS)中。在试验前不久，加入1mM Mg2+和1mM Ca2+。在试验过程中，将细胞悬液保存在37℃的加热区中，并以1.5dyn/cm2速度灌流入流通室中5分钟、对于抑制实验，将单核细胞与不同浓度(0.01-1微克/毫升)的Met-RANTES在冰上预培育30分钟。在多个视野中(至少每实验5个)通过分析用长集成JVC 3CCD摄像机和JVC SR L900E录像机记录的影象，定量测定5分钟后牢固粘附的细胞数，并表示为细胞数/平方毫米。所分析的粘附类型限于初级，即，单核细胞和内皮直接作用。作为牢固停滞的反相测量值，在5分钟间隔的最后30秒内测定了以降低的速度在内皮上滚动的细胞数，并评估为视野中所有相互作用的百分数。5分钟间隔后铺展或转移的细胞数在高能场中如所述(Luscinskas F.W.等，1994)测定，并表示为牢固粘附的细胞百分数。
统计分析
给出ms roman+/-SEM值。用Mann-Whithney U-Wilcoxon秩次和检验进行统计分析。小于0.05的p值认为显示两组之间有显著性差异。
结果
Fisher344(F344 RT11v1)肾脏移到Lewis(LEW,RT11)的同种移植
在不存在免疫抑制下，将Fisher(344)大鼠肾脏移植到Lewis大鼠中导致手术后7天特征性的单核细胞浸润和组织损伤。组织学检测显示，肾小球前动脉和肾小管间质内膜有局部单核细胞浸润。该间质中单核细胞浸润的主要成分包括单核细胞/巨噬细胞。对动脉、小动脉、肾小管的损伤程度，和单核细胞的间质浸润程度，使用前面描述的、基于半定量形态测量(见材料和方法)的程序评级分为：不存在(0)、轻微(1)、中度(2)、严重(3)。
通过每日每只动物静脉内注射Met-RANTES200微克，处理移植的动物，来检测Met-RANTES对该过程的作用。在移植手术中，血管吻合术后1小时内第一次注射Met-RANTES。在实验过程中，不再施给额外的免疫抑制剂。光学显微镜和免疫组织学显示Met-RANTES处理对内源肾脏没有明显作用。
器官移植排斥中，一般移植的器官由于炎症而重量增加。表1总结的结果显示，用Met-RANTES处理的动物相对于未处理动物在移植器官重量上有统计学上显著的下降。该结果还提示，肾小球T细胞和单核细胞浸润降低，然而考虑该降低无统计学显著性(Mann-Whitney U-Wilcoxon秩次和检验)。表2总结了Met-RANTES治疗最深的影响。数据证明，Met-RANTES处理的动物，与未处理动物所见比较，血管损伤和肾小管排斥评分显著降低。虽然关于间质排斥评分的总趋势显示在Met-RANTES处理的动物中明显降低，这不能认为有统计学显著性(Mann-Whithney U-Wilcoxon评级总和试验)。
检查了组织切片和免疫组织化学染色，来评估Met-RANTES对排斥过程的作用。移植后7天，取下肾脏，并如材料和方法中所述进行制备。
在未处理的肾脏中观察到动脉腔和壁中存在单核细胞造成的血管损伤。相反，Met-RANTES处理的动物未显示血管排斥。未处理动物的间质区显示了在间质和肾小管中许多染色深的单核细胞浸润。相反，Met-RANTES处理的动物显示减少的单核细胞浸润，较少肾小管损伤和发育良好的近端小管的红色刷状缘。
原位杂交定位大鼠RANTES mRNA
在原位杂交研究中，使用取自排斥性Fisher大鼠肾脏的组织切片，来证明RANTES mRNA在排斥肾脏中的细胞特异性表达。结果和先前描述的人肾脏异体移植排斥过程中RANTES的表达相似(Pattison J等，Wiedermann C.J.等，1993,Von Luettichau L.,1996)。见到了浸润性单核细胞和肾小管的强烈表达和一些内皮细胞有限但可鉴定的表达。
Met-RANTES处理的动物如RNase保护试验测定的那样，显示促炎细胞因子mRNA表达的下降
促炎细胞因子，如IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-6、TNFβ、TNFα和IFNγ表达的增加是肾脏移植排斥的特征(Nickerson P.等，1997,SchmouderR.L.等，1995,Strom T.B.等，1996,Castro M.D.等，1998)。这些细胞因子的表达是正在进行的炎症过程的指标。我们使用定量RNase保护试验，检测了Met-RANTES移植的Fisher大鼠肾脏中对一系列细胞因子表达的影响。从正常的对照肾脏、未处理的移植肾脏和Met-RANTES处理的移植肾脏中分离出整个器官RNA样品。对比内部标准品L32和GAPDH测定了代表细胞因子：IL-1α、IL-1β、TNFβ、TNFα、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IFNγ的mRNA水平。结果显示，移植后7天，未处理的肾脏上调了编码IL-1α(24倍)、TNFβ(3.2倍)和IFNγ(1.7)的mRNA，在IL-1β(8.4倍)和TNFα(4.6倍)中可见最显著的增加。在该时间点(移植后7日)在肾脏中未检测到表达IL-2、IL-4或IL-5的mRNA。相应的用Met-RANTES处理的动物相对于未处理动物显示IL-1α(25％)、IL-1β(48％)、TNFβ(34％)、TNFα(24％)和IFNγ(24％)的平均表达减少。
Brown Norway大鼠肾脏移植到Lewis大鼠中：Met-RANTES联合低剂量环孢菌素A(CyA)的效果
然后我们将该试验扩展到测定是否Met-RANTES能在肾脏移植排斥中补充低剂量CyA处理的效果。对于该程序，我们选择了能产生更剧烈排斥现象(即Brown Norway肾脏移植到Lewis大鼠中)的肾脏移植模型。在移植时进行双侧肾切除。每日皮下施用2.5mg/kg体重水平的CyA，这在先前该模型中显示不能显著阻止肾脏排斥(Grne未发表的结果(Stojanovic T等，1996))。最后，为了更好的检测任何协同作用，在这些实验中使用了每日每只动物50微克的减少剂量的Met-RANTES。总结于表3的这些结果显示，血管和肾小管损伤对Met-RANTES/低剂量-CyA处理的动物，与仅用低剂量-CyA处理的动物比较，有统计学上的显著降低。另外，可见间质区单核细胞浸润的显著减少。功能性测定(其中血清肌酐在Met-RANTES处理的动物中相对于未处理的对照有减少(0.98±0.12对1.42+0.17mg％,(n=3)))肯定了这些组织学观察。
由于单核细胞渗入血管腔空隙的减少代表了Met-RANTES处理在两种移植模型中的突出特征，我们开始研究该作用的可能机制。在RANTES在肾脏移植排斥中作用的模型中，推测RANTES蛋白(由激活的血小板释放或由局部发炎组织所分泌)在发炎的内皮上聚集，在该处它可能支持单核细胞聚集(Nelson P.J.等，1998,Pattison J等，1994,Wiedermann C.J.等，1993)。为了研究RANTES和微血管内皮的直接结合，我们采用了先前用来检测组织切片中内皮表面结合RANTES的试验(Pattison J.等，1994,Wiedermann C.J.等，1993)的改进方法，检测了激活的皮肤微血管内皮(DMVEC)汇集RANTES蛋白质的能力。将对RANTES特异性的HRP-偶联的mAb与过量的RANTES蛋白一起培养，将产生的复合物加到在96孔平底培养板中生长的、休眠的或IL-1β激活的微血管内皮中。用ELISA样方法，以单用mAb为对照测定了DMVEC结合抗原-mAb复合物的能力。虽然微血管内皮在不经预刺激的情况下能结合一些RANTES蛋白，但该结合在用促炎细胞因子IL-1α预刺激后大大增加(图1)。而对未受刺激或激活的内皮的非复合物性mAb的背景染色是可以忽略的。
为了进一步确定微血管内皮的炎症性激活，在DMVEC上用先前建立的流式细胞计数程序(Weber C.等，1995)测定了与单核细胞粘附有关的分子，即E-选择素和Ig超家族成员ICAM-1和VCAM-1的表面表达。分析揭示，休眠DMVEC表达了组成型的ICAM-1表面水平，然而几乎检测不到VCAM-1或E-选择素(表4)。用IL-1激活DMVEC12小时导致ICAM-1表达的上调，和VCAM-1及E-选择素表面表达(表4)的显著诱导。
Met-RANTES阻止单核细胞对发炎的微血管内皮的牢固粘附，但不影响随后的白细胞渗出活动
在尝试获得对Met-RANTES作用可能机制的理解中，我们研究了阻断RANTES受体是否可抑制单核细胞在微血管内皮上的停滞和白细胞渗出。为此，我们使用了能显示粘附特征和成熟单核细胞整合素，并表达几种趋化因子受体，包括CCR1单核细胞系MonoMac 6细胞，(Erl W等，1995)。DMVEC在Petri培养皿上生长至汇合，不刺激或用IL-1β(5ng/ml)激活12小时。然后在平行流动室中测试微血管内皮，其中MonoMac 6细胞以1.5dyn/cm2的剪切速率灌流通过该室。在这样的生理流动条件下，MonoMac 6细胞经过短期的滚动，可将一部分细胞的吸附轻易的转化成抗剪切力的停滞。聚集5分钟后，测定已牢固吸附在内皮上的MonoMac 6细胞数(图2(a))。
少数单核细胞牢固吸附在未受刺激的微血管内皮上，而内皮细胞预先接触RANTES蛋白质不显示显著的作用。用IL-1β预刺激微血管内皮导致单核细胞抗剪切力的吸附增加。mAb的抑制确证了先前的发现，即该过程是由单核细胞α4和β2整合素介导的，它们分别与激活内皮上表达的ICAM-1和VCAM-1相互作用(Kukerti S.等，1997,Luscinskas F.W.等，1994)。与直接结合试验中RANTES的固定化一致，IL-1β激活的微血管内皮预先接触RANTES蛋白在5分钟内显著增强了单核细胞的牢固停滞和聚集(图2a)。值得注意的是，单核细胞与各种浓度(0.01-1微克/毫升)的Met-RANTES一起预培育，完全阻止了RANTES-介导的单核细胞在IL-1β激活的DMVEC上抗剪切力的吸附(图2a，数据未显示)，相似的，预先接触RANTES后在激活的微血管内皮上滚动的单核细胞组分(它可用作牢固停滞的反相量度)减少，但可用Met-RANTES恢复，表明与激活的内皮的起始作用数未受影响。牢固停滞后，一组单核细胞经历了形状改变或铺展，一些最终迁移到内皮细胞之间或之下。然而，RANTES或Met-RANTES不改变铺展或转移(图2b)，暗示涉及其它信号。因此，这些结果表明Met-RANTES可能在肾脏移植排斥过程中通过阻止单核细胞停留于发炎微血管内皮，而减少单核细胞的聚集。
表格
                          表1
将Fisher大鼠肾脏移植到Lewis大鼠中。计算肾小球毛细管攀中的单核细胞/巨噬细胞和T细胞数，表示为一张肾脏切片中肾小球中各种细胞数目的平均数。
对照(n=9) Met-RANTES(n=9)
体重(g) 211.8±5.15  195±5.98
移植肾脏重量 1.41±0.048  1.15±0.08*
内源肾脏重量 0.91±0.04  0.8±0.04
肾小球中的T细胞 3.98±0.81  2.75±0.45
肾小球中的巨噬细胞 9.16±1.69  5.98±0.87
*表明在测试的组之间有显著性(p＜0.05)差异。
                           表2
将Fisher肾脏移植到Lewis大鼠中。对Met-RANTES在血管损伤、和间质单核细胞浸润的组织学和免疫组织学分析的总结
血管损伤 肾小管损伤 间质炎症
对照 Met-RANTES 对照 Met-RANTES 对照 Met-RANTES
 0级 50.67±9.02  85.5±2.66  15.56±6.03  46.00±12.15  1.39±1.11  16.00±7.14
 1级 40.44±5.5  12.8±4.17  32.22±8.25  30.00±6.06  44.17±12.39  58.00±8.7
 2级 4.44±2.22  0.9±0.6  20.56±5.68  13.00±4.1  18.33±5.95  9.50±4.62
 3级 5.55±5.55  0±0.0  31.67±14.19  8.50±7.46  36.11±14.88  10.50±9.44
评分 62.67±18.64  16.1±5.2* 33.00±6.44  15.70±5.22  37.78±5.58  24.45±4.62
*表明在测试的组之间有显著性(p＜0.05)差异。
                         表3
将Brown-Norway大鼠肾脏移植到Lewis大鼠中。对存在低剂量CyA时，Met-RANTES对血管和肾小管损伤、和间质单核细胞浸润作用的组织学分析的总结
评分 环孢菌素2.5mg/kg b.w./d     环孢菌素2.5mg/kg b.w./d+Met-RANTES50微克/日
血管损伤 60.7±1.8  13.7±7.5*
肾小管损伤 124.3±28.7  28.3±14.8*
间质炎症 157.3±21.3  71±6.1*
*表明在测试的组之间有显著性(p＜0.05)差异。
表4
IL-1β对人微血管内皮细胞中粘附分子表面表达的影响。DMVEC用IL-1β(5ng/ml)激活或留着不处理(对照)12小时，并与ICAM-1、VCAM-1、E-选择素或同种型对照mAb反应。用FACS在3个独立试验中分析表面蛋白质的表达，在收集通道中非特异性结合后，作为特异性平均荧光密度(sMFI)给出。
SMFI(通道) 对照 IL-1β
 ICAM-1 实验1  339  502
实验2  386  592
实验3  327  432
 VCAM-1 实验1  10  76
实验2  72  236
实验3  25  129
 E-选择素 实验1  1  120
实验2  44  265
实验3  28  177
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Claims (16)

1．一种趋化因子受体拮抗剂的用途，其特征在于，将该趋化因子与一种环孢菌素联合，产生一种药物组合物，用于治疗或预防移植器官、组织或细胞的排斥。
2．如权利要求1所述的用途，其特征在于，同时、分开或依次使用该趋化因子受体拮抗剂和环孢菌素。
3．如上述任一项权利要求所述的用途，其特征在于，该趋化因子受体拮抗剂是一种氨基末端截短的趋化因子。
4．如权利要求1或2的用途，其特征在于，该趋化因子受体拮抗剂是一种氨基末端延伸的RANTES。
5．如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，该趋化因子受体拮抗剂是Met-RANTES。
6．如上述任一项权利要求所述的用途，其特征在于，所述环孢菌素选自环孢菌素A和它的代谢物或合成的同类物。
7．如上述任一项权利要求所述的用途，其特征在于，所述环孢菌素是环孢菌素A。
8．如上述任一项权利要求所述的用途，其特征在于，该用途是用于治疗或防止肾脏同种异体移植。
9．一种药物组合物，其特征在于，该药物组合物含有一种趋化因子受体拮抗剂和一种环孢菌素，并存在一种或多种药物学上可接受的赋形剂，该药物组合物用于治疗或防止移植器官、组织或细胞的排斥。
10．一种药物组合物，其特征在于，该药物组合物含有一种趋化因子受体拮抗剂和一种环孢菌素，并存在一种或多种药物学上可接受的赋形剂，以同时、分别或依次使用所述组合物的活性成分，来治疗或防止移植器官、组织或细胞的排斥。
11．如权利要求9或10所述的药物组合物，其特征在于，所述趋化因子受体拮抗剂是一种氨基末端截短的趋化因子。
12．如权利要求9或10所述的药物组合物，其特征在于，所述趋化因子受体拮抗剂是一种氨基末端延伸的RANTES。
13．如权利要求9或10所述的药物组合物，其特征在于，该趋化因子受体拮抗剂是Met-RANTES。
14．如权利要求9到13任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述环孢菌素选自环孢菌素A和它的代谢物或合成的同类物。
15．如权利要求10到14任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述环孢菌素是环孢菌素A。
16．如权利要求9到15任一项所述的药物组合物，其特征在于，该药物组合物是用于治疗或防止肾脏同种异体移植。
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