CN1318647A - 一种新的nadh脱氢酶及编码它的多核苷酸序列 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新的分离的NADH脱氢酶基因的多核苷酸序列及其编码的多肽,以及制备这种多肽的方法。并且公开了通过检测该基因核酸水平的突变及多肽水平的改变,检测与该基因的核酸及其编码的多肽异常有关的疾病的诊断方法,也公开了利用该基因的多核苷酸序列和多肽治疗与该基因异常有关的疾病的用途和用于上述治疗的药物组合物。

Description

一种新的NADH脱氢酶及编码它的多核苷酸序列

本发明公开了一种新的人NADH脱氢酶(NADH脱氢酶10，以下简称为NADHDH10)及编码它的多核苷酸序列，还涉及所述蛋白质和多核苷酸在诊断、预防和治疗与该蛋白质表达异常相关疾病中的应用。呼吸链NADH脱氢酶(EC1.6.5.3)(又称复合物Ⅰ或NADH-泛醌氧化还原酶)是包埋在质膜的脂质双分子层中，一小部分突出在质膜胞质面的寡聚酶复合物。它参与哺乳动物线粒体呼吸链电子转递、生物氧化的第一步，此复合物跨越线粒体内膜或细菌胞质膜，转移电子从NADH到泛醌，转移质子从线粒体基质到胞质。(Weiss H.等人，1991，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.),197:563-576))。

NADH脱氢酶亚基含有黄素单核苷酸FMN和铁硫蛋白，以二聚体形式存在。此复合物可被分解为水溶性黄素蛋白、水溶性铁硫蛋白和不溶于水的部分。其膜结构域有利于结合底物(苯醌)及其抑制剂(粉蝶霉素和鱼滕酮)，外周结构域是NADH的结合位点。[Belogrudov G，等人，生物化学(Biochemistry),1994；33:4571-6]。此酶的作用是催化NADH的两个电子传递至辅酶Q。运载电子的铁硫蛋白由75、49、30、20、18、15、13kd等25-30个多肽构成，其中的75kD亚基是哺乳动物复合物Ⅰ中最大的亚基。它可与两个4Fe-4S簇(称为N-3和N-4)相结合。

75Kd亚基与一些细菌基因高度同源，如：真养产碱菌(Alcaligeneseutrophus)NAD还原氢化酶γ亚基(基因hoxU)、脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)NADH-泛醌氧化还原酶NQO3亚基、大肠杆菌NADH-泛醌氧化还原酶G亚基(基因nuoG)。在75KD和细菌氢化酶γ亚基都含有3段保守的富含半胱氨酸的片段，这些片段可能涉及铁硫的结合。三段保守序列分别为(1)P-x(2)-C-[YWS]-x(7)-G-x-C-R-x-C,(2)C-P-x-C-[DE]-x-[GS](2)-x-C-x-L-Q,(3)C-P-x-C-[DE]-x-[GS](2)-x-C-x-L-Q(Weidner U.等人(1993)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)233:109-122)(Fearnley I.M.，等人(1992)生物化学生物物理学通报(Biochim.Biophys.Acta)1140:105-134)。除NQO3和nuoG不含有第三段保守序列，其余该家族的成员均含有此三个保守片段，其中各序列中的三个半胱氨酸是蛋白质发挥正常生理学功能的中心区域。NADH脱氢酶在生物体内调节呼吸链的作用，其表达异常则呼吸链无法正常地提供生物体能量代谢所需的能量，从而直接影响各种与呼吸链相关的代谢反应，引发各种与能量代谢相关的代谢紊乱性疾病。

由于如上所述可知，作为NADH脱氢酶的一种，10kd的NADH脱氢酶10在机体重要功能中起重要作用。由于呼吸链中会涉及大量的此类蛋白，为了进一步了解呼吸链中诸多生理过程的机制，本领域中一直需要鉴定更多参与这些过程的NADH脱氢酶，特别是鉴定这种蛋白的氨基酸序列。新NADH脱氢酶10编码基因的分离也为研究确定该蛋白在健康和疾病状态下的作用提供了基础。这种蛋白可能构成开发疾病诊断和/或治疗药的基础。

本发明的目的就是提供一种新的人NADH脱氢酶10及编码它的多核苷酸。本发明的多肽含有NADH脱氢酶75KD家族保守序列，因而本发明的NADHDH10是该家族中的一个新成员。

本发明涉及一种分离的多肽，它包含：具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽、或其保守性变体、生物活性片段或衍生物。

本发明还涉及一种分离的多核苷酸，它包含选自下组的一种核苷酸序列或其变体：

(a)编码具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸；

(c)与(a)或(b)的多核苷酸序列具有至少80％相同性的多核苷酸。

本发明另外涉及一种含有本发明多核苷酸的载体，特别是表达载体；一种用该载体遗传工程化的宿主细胞，包括转化、转导或转染的宿主细胞；一种包括培养所述宿主细胞和回收表达产物的制备本发明多肽的方法。

本发明还涉及一种能与本发明多肽特异性结合的抗体。

本发明还涉及一种筛选的模拟、激活、拮抗或抑制该NADH脱氢酶10活性的化合物的方法，其包括利用本发明的多肽。本发明还涉及用该方法获得的化合物。

本发明还涉及一种体外检测与该NADH脱氢酶10异常表达相关的疾病或疾病易感性的方法，包括检测生物样品中所述多肽或其编码多核苷酸序列中的突变，或者检测生物样品中本发明多肽的量或生物活性。

本发明也涉及一种药物组合物，它含有本发明多肽或其模拟物、激活剂、拮抗剂或抑制剂以及药学上可接受的载体。

本发明还涉及本发明的多肽和/或多核苷酸在制备用于调节血管平滑肌细胞增殖、恢复或增强神经功能、治疗线粒体肌病的药物的用途。

本发明还涉及本发明多肽的拮抗剂或反义多核苷酸在制备用于治疗能量及物质代谢相关的代谢紊乱性疾病、生长发育障碍性疾病，某些肿瘤，某些遗传性，血液性疾病及免疫系统疾病等的药物中的用途。

图1是本发明含NADH脱氢酶75KD活性中心结构域的NADH脱氢酶10的7-61氨基酸和NADH脱氢酶75KD活性中心结构域的氨基酸序列(共55个氨基酸)同源性比较图。上方序列(S)是NADHDH10，下方序列(P)是NADH脱氢酶75KD活性中心。两者的同源率为25％，得分为13.68，阈值为13.48。

图2为本发明分离的NADHDH10的聚丙烯酰胺凝胶电泳图(SDS-PAGE)。其中泳道1为蛋白质分子量标准，泳道2、3为含有目标蛋白质的样品，泳道4为经纯化的目标蛋白质(箭头所指)，分子量大小为22kDa。

本发明上述的和其它的方面对于本领域的技术人员来说，从本文以下的详细描述看应该是很清楚的。

本说明书和权利要求书中使用的下列术语除非特别说明具有如下的含义：

“核酸序列”是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，也可以指基因组或合成的DNA或RNA，它们可以是单链或双链的，代表有义链或反义链。类似地，术语“氨基酸序列”是指寡肽、肽、多肽或蛋白质序列及其片段或部分。当本发明中的“氨基酸序列”涉及一种天然存在的蛋白质分子的氨基酸序列时，这种“多肽”或“蛋白质”不意味着将氨基酸序列限制为与所述蛋白质分子相关的完整的天然氨基酸。

蛋白质或多核苷酸“变体”是指一种具有一个或多个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列或编码它的多核苷酸序列。所述改变可包括氨基酸序列或核苷酸序列中氨基酸或核苷酸的缺失、插入或替换。变体可具有“保守性”改变，其中替换的氨基酸具有与原氨基酸相类似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸。变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。

“缺失”是指在氨基酸序列或核苷酸序列中一个或多个氨基酸或核苷酸的缺失。

“插入”或“添加”是指在氨基酸序列或核苷酸序列中的改变导致与天然存在的分子相比，一个或多个氨基酸或核苷酸的增加。

“替换”是指由不同的氨基酸或核苷酸替换一个或多个氨基酸或核苷酸。

“生物活性”是指具有天然分子的结构、调控或生物化学功能的蛋白质。类似地，术语“免疫学活性”是指天然的、重组的或合成蛋白质及其片段在合适的动物或细胞中诱导特定免疫反应以及与特异性抗体结合的能力。

“激动剂”是指当与NADHDH10结合时，一种可引起该蛋白质改变从而调节该蛋白质活性的分子。激动剂可以包括蛋白质、核酸、碳水化合物或任何其它可结合NADHDH10的分子。

“拮抗剂”或“抑制物”是指当与NADHDH10结合时，一种可封闭或调节NADHDH10的生物学活性或免疫学活性的分子。拮抗剂和抑制物可以包括蛋白质、核酸、碳水化合物或任何其它可结合NADHDH10的分子。

“调节”是指NADHDH10的功能发生改变，包括蛋白质活性的升高或降低、结合特性的改变及NADHDH10的任何其它生物学性质、功能或免疫性质的改变。

“基本上纯”是指基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化NADHDH10。基本上纯的NADHDH10在非还原性聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。NADHDH10多肽的纯度可用氨基酸序列分析。

“互补的”或“互补”是指在允许的盐浓度和温度条件下通过碱基配对的多核苷酸天然结合。例如，序列“C-T-G-A”可与互补的序列“G-A-C-T”结合。两个单链分子之间的互补可以是部分的或全部的。核酸链之间的互补程度对于核酸链之间杂交的效率及强度有明显影响。

“同源性”是指互补的程度，可以是部分同源或完全同源。“部分同源”是指一种部分互补的序列，其至少可部分抑制完全互补的序列与靶核酸的杂交。这种杂交的抑制可通过在严格性程度降低的条件下进行杂交(Southern印迹或Northern印迹等)来检测。基本上同源的序列或杂交探针可竞争和抑制完全同源的序列与靶序列在的严格性程度降低的条件下的结合。这并不意味严格性程度降低的条件允许非特异性结合，因为严格性程度降低的条件要求两条序列相互的结合为特异性或选择性相互作用。

“相同性百分率”是指在两种或多种氨基酸或核酸序列比较中序列相同或相似的百分率。可用电子方法测定相同性百分率，如通过MEGALIGN程序(Lasergene软件包，DNASTAR,Inc.,MadisonWis.)。MEGALIGN程序可根据不同的方法如Cluster法比较两种或多种序列(Higgins,D.G.和P.M.Sharp(1988)Gene 73:237-244)。Cluster法通过检查所有配对之间的距离将各组序列排列成簇。然后将各簇以成对或成组分配。两个氨基酸序列如序列A和序列B之间的相同性百分率通过下式计算：

也可以通过Cluster法或用本领域周知的方法如Jotun Hein测定核酸序列之间的相同性百分率(Hein J.,(1990)酶学方法(Methods inemzymology)183:625-645)。

“相似性”是指氨基酸序列之间排列对比时相应位置氨基酸残基的相同或保守性取代的程度。用于保守性取代的氨基酸例如，带负电荷的氨基酸可包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸可包括赖氨酸和精氨酸；具有不带电荷的头部基团有相似亲水性的氨基酸可包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸和苏氨酸；苯丙氨酸和酪氨酸。

“反义”是指与特定的DNA或RNA序列互补的核苷酸序列。“反义链”是指与“有义链”互补的核酸链。

“衍生物”是指NADHDH10或编码其的核酸的化学修饰物。这种化学修饰物可以是用烷基、酰基或氨基替换氢原子。核酸衍生物可编码保留天然分子的主要生物学特性的多肽。

“抗体”是指完整的抗体分子及其片段，如Fa、F(ab’)2及Fv，其能特异性结合NADHDH10的抗原决定簇。

“分离的”一词指将物质从它原来的环境(例如，若是自然产生的就指其天然环境)之中移出。比如说，一个自然产生的多核苷酸或多肽存在于活动物中就是没有被分离出来，但同样的多核苷酸或多肽同一些或全部在自然系统中与之共存的物质分开就是分离的。这样的多核苷酸可能是某一载体的一部分，也可能这样的多核苷酸或多肽是某一组合物的一部分。既然载体或组合物不是它天然环境的成分，它们仍然是分离的。

本发明一方面提供了一种新的人NADH脱氢酶10，及其具有生物活性的的片段、类似物和衍生物。本发明的另一方面，提供了编码这些多肽的分离的核酸分子，包括mRNA、DNA、cDNA和基因组DNA，及其具有生物活性的片段、类似物和衍生物。本发明的再一方面提供了核酸的探针，它包含足够长度的核酸分子以及与NADHDH10基因序列进行特异性杂交的序列。

依据本发明的一方面，它提供了一种分离的多核苷酸，这些核苷酸编码具有SEQ ID No.2所示的推定的氨基酸序列的多肽。

编码NADHDH10的多核苷酸可以从许多成人和胎儿的cDNA文库中分离，如人胎脑cDNA文库。SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列全长为1330个碱基，具有编码一个含91个氨基酸残基的多肽的开放阅读框架。根据氨基酸序列同源比较发现，此多肽与NADH脱氢酶75Kd具有25％的同源性。

本发明的多核苷酸可以RNA或DNA的形式存在，其中DNA包括cDNA、基因组DNA和合成的DNA。DNA可以是双链或者单链的，单链也可以是有义链或者反义链。编码多肽的多核苷酸序列可以与SEQ IDNo.1所示的多核苷酸序列相同，或者可以是一个由于遗传密码的冗余或简并性而不同的多核苷酸序列，但它与SEQ ID No.1编码相同的成熟多肽。

编码SEQ ID No.2的多肽的多核苷酸可以包括：仅仅编码成熟多肽的多核苷酸序列(如SEQ ID No.1中296-568位多核苷酸)、包含编码成熟多肽的多核苷酸序列和任选的其它编码序列或非编码序列(例如内含子或编码成熟多肽的多核苷酸序列5’端和/或3’端的非编码序列)的多核苷酸序列(如SEQ ID No.1中1-1330位多核苷酸)。

本发明进一步涉及上面所描述的多核苷酸的各种变体，它们编码含有SEQ ID No.2所示的推定的氨基酸序列多肽的片段、类似物和衍生物。这些多核苷酸变体可以是天然存在的等位基因变体或非天然存在的多核苷酸变体。

编码本发明多肽的多核苷酸也可能与特定的标记序列在同一读框中相融合，标记序列可帮助本发明多肽的纯化。标记序列在使用细菌宿主时可以是pQE载体的六聚组氨酸标记，以利于融合有标记的成熟多肽的纯化，或者当使用哺乳类宿主(如猴肾成纤维细胞的COS-7细胞系)时，标记序列可以是一种血细胞凝集素(HA)标记。此外，包含编码本发明多肽的多核苷酸序列还可包含同源或异源的特定信号肽序列，以帮助目的蛋白质分泌到原核细胞或真核细胞膜外。本领域普通技术人员知晓，上述标记序列和信号肽序列也可通过重组方法或化学法添加在用于表达本发明多肽的载体上。

本发明的多核苷酸序列也包括全长cDNA的片段，例如编码SEQ IDNo.2中至少20个，优选至少30个，更优选至少50个，最好至少80个氨基酸的多核苷酸片段。这些片段例如具有SEQID No.1所示序列中连续的至少10个，优选的至少20个核苷酸，更优选的至少50个核苷酸，特别是至少60、90、150或240个核苷酸。

本发明进一步涉及能与上述序列杂交的多核苷酸，这两个序列间至少有70％，较优选至少80％，优选至少90％，更优选至少95％的同源性。本发明特别涉及在严格条件下能与上述多核苷酸杂交的多核苷酸。这里所用的术语“严格条件”意味着两序列之间有95％，优选至少97％同源性才能发生杂交。在一优选的实施方案中，与上述多核苷酸互补链杂交的多核苷酸编码的多肽基本保持了与SEQ ID No.2所示多肽相同的生物功能或活性。

另外，本发明涉及可与本发明的多核苷酸杂交的多核苷酸，其至少含20个碱基，优选至少30个碱基，更优选至少50个碱基并且具有上面所描述的同源性，其可以保留或不保留活性。例如，这样的多核苷酸可以用作为检测SEQ ID No.1所示多核苷酸或其它来源的相似序列的探针；又如，其可以用于本发明多核苷酸的回收或者作为一种诊断探针或PCR引物。

本发明的DNA序列可用多种方法获得。例如，用本领域熟知的杂交技术分离DNA。这些技术包括但不局限于：1)用探针与基因组或cDNA文库杂交以检出同源性多核苷酸序列，和2)表达文库的抗体筛选以检出具有共同结构特征的克隆的DNA片段。

编码NADHDH10的特异DNA片段序列也能用下列方法获得：1)从基因组DNA分离双链DNA序列；2)化学合成DNA序列以获得所需多肽的双链DNA。

分离感兴趣的cDNA的标准方法是从高表达该基因的供体细胞中分离mRNA并进行逆转录，形成质粒或噬菌体cDNA文库。提取mRNA的方法已有多种成熟的技术，试剂盒也可从商业途径获得(Qiagene)。而构建cDNA文库也是本领域技术人员周知的方法(Sambrook等人，分子克隆，一种实验室手册(Molecular Cloning,a Laboratory Manual)，冷泉港实验室，纽约，1989)。还可得到商业供应的cDNA文库，如Clontech公司的不同cDNA文库。当结合使用聚合酶反应技术时，即使极少的表达产物也能克隆。

可用常规方法从这些cDNA文库中筛选本发明的多核苷酸序列。这些方法包括但不限于：(1)DNA-DNA或DNA-RNA杂交；(2)标志基因的功能出现或丧失；(3)测定NADHDH10的转录本的水平；(4)应用免疫学技术或测定生物学活性检测基因表达的蛋白产物。上述方法可单独使用，也可多种方法联合应用。

在第(1)种方法中，杂交所用的探针可与本发明多核苷酸的任何一部分具有相同性，其长度至少是15个核苷酸，优选是20-30个核苷酸，更优选是50-60个核苷酸，最优选是100个核苷酸以上。此处所用的探针通常是在本发明的基因DNA序列信息的基础上化学合成的DNA序列。本发明的基因本身或者片段当然可以用做探针。DNA探针可用放射性同位素、荧光素或酶(如碱性磷酸酶)等标记。第(4)种方法中，检测NADHDH10基因表达的蛋白产物可用免疫学技术如Western印迹、放射免疫沉淀法、酶联免疫吸附法(ELISA)等。

由于本申请提供了NADHDH10的全长cDNA序列，应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，等人，科学(Science)1985；230:1350-1354)优先用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE:cDNA末端快速扩增法)，在上述PCR方面所用的引物根据本文所公开的本发明的序列信息可适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

如上所述得到的本发明的基因，或者各种DNA片段的核苷酸序列的测定可用常规方法如双脱氧链终止法(Sanger等人，美国国家科学院院报，1977,74:5463-5467)。这类核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒等。为了获得全长的cDNA序列，测序需反复进行。有时需要测定多个克隆的cDNA序列，以拼接成全长的cDNA序列。

本发明的多核苷酸序列的全部或部分也可通过本领域周知的化学方法合成(Caruthers,M.H.等人，(1980)Nucl.Acids Res.Symp.Ser.215-223；Horn,T.等人，(1980)Nucl.Acid Res.Symp.Ser.225-232)。

本发明进一步涉及具有SEQ ID No.2所示推定氨基酸序列的多肽及其活性片段、类似物和衍生物。SEQ ID No.2所示推定氨基酸序列的多肽为一个含91个氨基酸残基的多肽。

SEQ ID No.2所示多肽的“片段”、“衍生物”和“类似物”指能基本保留该多肽的生物学功能或活性的多肽或无活性的前体。由此，本发明的多肽包括了其前原蛋白、前蛋白和蛋白原等形式，其经过加工后(如蛋白质水解或修饰)可被激活，产生一个有活性的成熟多肽。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然存在的多肽或合成的多肽，优选为重组多肽。SEQ ID No.2所示的多肽的片段、衍生物和类似物可以是：(ⅰ)一个或多个氨基酸残基被保守性或非保守性氨基酸残基所取代(优选是保守性氨基酸残基)的多肽，取代的氨基酸残基是或不是由遗传密码所编码的氨基酸。例如，可以通过氨基酸残基的插入、取代和/或删除，得到NADHDH10的沉默突变体或功能等同物。可基于氨基酸残基之间在极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性等方面的相似性进行保守性氨基酸取代，只要保留NADHDH10的活性；或(ⅱ)一个或多个氨基酸残基带有取代基团的多肽；或(ⅲ)成熟多肽与其它功能性化合物，如提高多肽半寿期的化合物(例如聚乙二醇)融合在一起的多肽；或(ⅳ)成熟多肽与其它氨基酸序列相融合的多肽，其中所述其它氨基酸序列包括诸如帮助纯化成熟蛋白的氨基酸序列或蛋白原序列等。这些帮助纯化的结构域包括但不限于：金属鳌合肽，如用于在固定化金属上纯化的组氨酸-色氨酸模块；用于在固定化免疫球蛋白上纯化的蛋白A结构域以及用于FLAGS延伸/亲和纯化系统的结构域(IMMUNEX公司，Seattle,Wash)。特异于因子XA或肠激酶的断裂接头序列也可用于帮助目的蛋白质的纯化(Porath,J.等人(1992)，蛋白质试验纯化(Prot.Exp.Purif.)3:263-281)。从这些公开内容看，这样的片段、衍生物和类似物的应处于本领域技术人员的知识范围内。

本发明的多肽包括SEQ ID No.2所示的多肽(特别指成熟多肽)，也包括与SEQ ID No.2多肽至少有80％相似性(优选是80％相同性)的多肽，优选至少有90％相似性(优选是90％的相同性)的多肽，更优选至少有95％相似性(优选是95％相同性)的多肽，也包括这些多肽的一些部分，通常这些多肽部分至少含有30个氨基酸、优选至少50个氨基酸。

本发明的多肽、其保守性变体和生物活性片段及衍生物可以用常规的肽合成的方法制备，例如固相肽合成(Merrifield J.(1963)，美国化学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)85:2149-2154；Roberge,J.Y.等人，(1995)科学，269:202-204)。蛋白质合成可以手工完成，也可利用肽自动合成仪如Applied Biosystems 431A肽合成仪进行(Perkin Elmer)。本发明多肽也可以从天然生物材料中经分离纯化得到，但优选利用本发明提供的多核苷酸用重组DNA技术制备。根据重组生产方法中所用的宿主不同，本发明中的多肽可能被糖基化或不被糖基化。该多肽也可能具有起始的甲硫氨酸残基。

根据普通的重组DNA技术，利用本发明的多核苷酸序列可表达或制备重组的NADHDH10多肽(科学，1984；224:1431)。本发明因而涉及制备本发明NADHDH10多肽的方法，一般包括以下步骤：

(1)用本发明编码NADHDH10的多核苷酸(或变体)或含有该多核苷酸的重组表达载体转化合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中及适当的培养条件下培养宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化目的蛋白质。

本发明也涉及包含本发明多核苷酸的重组载体、带有本发明重组载体的遗传工程化宿主细胞和通过重组技术制备本发明多肽的方法。

本发明的多核苷酸可以用来经重组技术产生多肽。例如，该多核苷酸可以存在于选自多种用于表达多肽的表达载体中的任一载体上，这些载体包括染色体的、非染色体的及合成的DNA序列，例如，SV40的衍生物、细菌质粒、噬菌体DNA、酵母质粒、衍生于质粒和噬菌体DNA结合的载体、病毒DNA、杆状病毒、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒及伪狂犬病毒，包括但不限于pQE系列(Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pBluescript SK、pBSKS、pNH系列(Stratagene)、pTRC99a、pKK223-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)；pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。不过，只要是能在宿主中复制和存活，其它质粒或载体也可应用。

本发明也包括含有本发明多核苷酸的重组构建体。该构建体包括载体，如上述质粒或病毒载体，其中可正向或反向插入本发明的多核苷酸序列。构建体中还包含调节序列，例如，有效地连接到本发明多核苷酸序列上的启动子(包括组成型和诱导型启动子)，介导下游结构序列的转录。合适的启动子包括但不限于，λ噬菌体的PL启动子、杆状病毒多角体蛋白启动子；细菌启动子如；LacI、LacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL和trp；真核启动子如：CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、逆转录病毒的LTR和小鼠金属硫蛋白I启动子；还包括衍生自植物细胞基因组中的启动子，如热休克蛋白、RUBISCO启动子。

表达载体也包含翻译起始所需要的核糖体结合位点和转录终止子，其还可以具有增强表达的合适序列，如增强子。增强子是DNA的顺式作用因子，通常有大约10-300bp，作用于启动子，提高它的转录。例如，SV40中位于复制起点后侧100-270bp处的增强子，巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复制起点后侧的多形瘤增强子及腺病毒增强子。此外，表达载体优选还包含能提供表型特征的一种或多种选择性基因、抗性基因和/或标记基因，以便于转化宿主细胞的筛选。选择性基因如帮助细胞利用吲哚或组氨醇的trpB、hisD(Hartman,S.C.，和R.C.Mulligan(1988)美国国家科学院院报85:8047-51)，用于tk^-或aprt^-细胞的肝疱疹病毒胸苷激酶(Wigler,M.等人(1977)细胞11:223-32)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy,I.等人(1980)细胞22:817-23)；抗性基因如赋予氨甲蝶呤抗性的二氢叶酸还原酶DHFR(Wigler,M等人(1989)，美国国家科学院院报，77:3567-70)或赋予新霉素和G-418抗性的npt(Colbere-Garapin,F.等人(1981)分子生物学杂志，150:1-14)，以及四环素或氨苄青霉素抗性基因。哺乳类表达载体一般包括复制起点、适当的启动子、增强子及任何必需的核糖体结合位点、多腺苷化位点、拼接供体和受体位点、转录终止序列和5’侧翼非转录序列。衍生于SV40拼接序列的DNA序列和多腺苷化位点可用于提供所需要的非转录遗传元件。此外，包含编码本发明多肽的核苷酸序列的载体还可包含同源或异源的特定信号肽序列，以帮助目的蛋白质分泌到原核细胞或真核细胞膜外。本领域普通技术人员知晓，上述表达载体及构建体中含有的标记序列和信号肽序列也可通过重组方法或化学法添加在编码本发明多肽的多核苷酸上。

合适载体和启动子的选择为本领域普通技术人员周知。细菌适用的有效表达载体可以这样来构建：将编码目的蛋白的结构DNA序列随同适当的翻译起始和终止信号被插入到带有一个功能启动子的可操纵的阅读框中。本领域普通技术人员周知用于构建含有本发明核苷酸序列以及合适的转录及翻译调控元件的方法。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术以及体内遗传重组技术(Sambrook,J.(1989)，《分子克隆，实验室手册》，Cold Spring Harbor Press；Plainview,N.Y.；Ausubel,F.M.(1989)现代分子生物学方法(Current Protocols in MolecularBiology),John Wiley & Sons,N.Y.)。

包含上述合适的DNA序列、合适的启动子或控制序列的载体可以用于转化合适的宿主，让宿主表达该蛋白。

本领域技术人员知晓，根据本发明DNA序列所插入的表达载体或构建体的种类和特性选择合适的宿主以表达目的蛋白质。适于表达本发明的多肽的宿主包括但不限于：原核宿主，诸如大肠杆菌、芽孢杆菌属、链霉菌属等；真核宿主，诸如：酵母属、曲霉属、昆虫细胞，诸如果蝇S2和草地夜蛾Sf9；动物细胞，如CHO、COS(猴肾成纤维细胞系，Gluzman，细胞，23:175,1981)及其它的能表达相容载体的细胞系，例如C127、3T3、CHO、HeLa、BHK、Bowes黑素瘤细胞；植物细胞以及腺病毒等等。各种哺乳动物细胞的培养系统也能用于表达重组蛋白。从这些讲授看，合适宿主的选择应该在本领域技术人员的知识范围内。

带有如上所述的含有本发明核苷酸序列之载体或构建体能够通过传统的方法导入合适的宿主细胞中以产生重组产物。将构建体导入上述宿主细胞的方法为本领域技术人员周知，包括但不限于：氯化钙介导的转化、磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、电穿孔、显微注射、粒子轰击法或基因枪方法(Sambrook,J.(1989)，《分子克隆，实验室手册》，Cold Spring Harbor Press；Plainview,N.Y.；Ausubel,F.M.(1989)现代分子生物方法，John Wiley & Sons,N.Y.；Hobbs,S.等人，McGraw Hill科技年鉴(1992),McGraw Hill,N.Y.191-196；Engelhard,E.K.等人，美国国家科学院院报，91:3224-3227；Logan,J.等人，美国国家科学院院报，81:3655-3659)。

在适当的培养条件与培养基中培养经转化的宿主菌株或细胞，使其生长到恰当的细胞密度之后，用适当的方法(例如温度转变或化学药品诱导)诱导所选择的启动子，并将细胞再培养一段时间。针对不同的宿主菌株或细胞选择以及所表达的目的蛋白质的性质相应的培养条件和培养基在本领域技术人员知识范围之内。

在合适的启动子控制下可以在哺乳类细胞、酵母、细菌或其它细胞中表达成熟蛋白。利用由本发明的DNA构建体衍生的RNA，也可以用无细胞翻译体系产生这种蛋白质(Sambrook,J.(1989)，《分子克隆，实验室手册》，第18章第4节，Cold Spring Harbor Press；Plainview,N.Y.)。

通常用离心的方法收获细胞或培养液。对于目的蛋白质保留在胞内的情况，一般可用任何便捷的物理、化学方法或酶法，包括冻融循环、超声波、机械破碎，或使用细胞溶解剂或特定的酶破碎细胞，将粗提物保留以进一步纯化。对于对于目的蛋白质分泌到胞外的情况，可直接回收培养上清液。这些方法都是本领域的技术人员熟知的。

多肽可以从重组细胞培养物中回收和纯化出来，回收和纯化的方法有硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、体积排阻层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和植物凝集素层析。形成成熟蛋白的完整构象还需要蛋白质的重折叠步骤。通常高效液相层析(HPLC)或毛细管电泳可应用于最后的纯化步骤。

本发明中的多核苷酸和多肽可用作研究试剂和材料，以发现人类疾病的治疗和诊断方法。这种多核苷酸和其编码的多肽也可用于体外的相关科学研究、DNA合成和DNA载体的制备，还用于设计治疗和诊断人类疾病的方法。

全长NADHDH10基因的片段可以用作cDNA文库的杂交探针，从而分离出全长基因和与之有高度序列相似性或相似生物学活性的其它基因。这种类型的探针一般至少有20个碱基。但是，这些探针优选至少有30个碱基并且一般不超过50个碱基，尽管它们可以具有更多的碱基。该探针也可以用于鉴定相应于全长转录物的cDNA克隆或具有完整基因，包括调节和启动子区域、外显子及内含子的基因组克隆。筛选的一种方法是，利用已知的DNA序列合成一个寡核苷酸探针，用它去分离出基因的编码区域。与本发明的多核苷酸序列互补的经标记的寡核苷酸可用于筛选人类cDNA文库、基因组文库、mRNA文库，以确定文库中哪些成员可与探针杂交。

可利用部分核苷酸序列及利用本领域已知方法延伸编码NADHDH10的核酸序列，以检测其上游序列如：启动子和调控元件。例如，可利用通用引物通过限制位点PCR(RESTRICTION-SITE PCR)以找回与已知基因座相邻的未知序列(Sarkar,G.(1993)PCR方法应用(PCRMethod Applic.)2:318-322)。基于已知区域利用不同的引物通过逆转录PCR扩增或延伸序列(Triglia,T.等人，(1988)，核酸研究(Nucleic Acids Res.)16:8186)。其他可用的PCR方法包括捕获PCR(capture PCR)，如用邻近人和酵母人工染色体DNA的DNA片段进行PCR扩增(Lagerstrom,M等人，(1991)PCR方法应用1:111-119)。此外，本领域技术人员也可通过PCR利用巢式引物(nested primer)及PromoterFinder^TM文库进行基因组DNA步行(Clontech,Palo Alto,Calif.)。

本发明还涉及利用NADHDH10基因产物检测与NADHDH10的多核苷酸序列突变相关的疾病或对疾病的易感性的诊断方法。这些疾病与本发明的NADHDH10基因的mRNA及编码的蛋白质表达异常有关，例如代谢紊乱性疾病、生长发育障碍性疾病，某些肿瘤，某些遗传性，血液性疾病及免疫系统疾病等。

可以用各种技术在DNA的水平上检测出NADHDH10基因突变的个体。用于诊断的核酸可以从病人的细胞中获得，例如血液、尿液、唾液、活组织检查和尸体解剖材料。基因组DNA可以直接用于检测，也可以在检测分析前用PCR进行酶法扩增(Saiki等人，自然324:163-166,1986)。RNA或cDNA也可用于同样目的。例如，与编码NADHDH10基因的核酸互补的PCR引物可用来鉴定和分析NADHDH10基因的突变。例如，从扩增产物的大小与正常基因型相比发生的变化中可以检出缺失和/或插入突变。将扩增的DNA与放射性标记的NADHDH10 RNA杂交可检测点突变，或者使用放射性标记NADHDH10反义DNA序列来进行杂交。用RNA酶A消化或从解链温度的不同或改变可以区分完全配对的序列与错配的双螺旋。

通过检测DNA片段在含有或不含有变性剂的凝胶中电泳迁移率的变化，可以进行基于DNA序列差异的遗传学测试。小序列的缺失和插入可以从高分辨率的凝胶电泳中看出。例如，不同大小的DNA片段可以在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)中区别出来。含有点突变的DNA序列与正常的DNA序列分别变性后在不含变性剂的聚丙烯酰胺凝胶中可因构象的不同(泳动速度不同)而区别开来。

本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(Microarray)或DNA芯片(又称为基因芯片)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。

核酸酶保护实验可以揭示特定位置的序列变化，比如RNA酶和S1酶保护法或者化学断裂法(Cotton等人，美国国家科学院院报85:4397-4401,1985)。

总之，特异DNA序列可以用下述方法检测：杂交、RNA酶保护、化学断裂、直接DNA测序或使用限制性内切酶(例如，限制片段长度的多态性RFLP)及基因组DNA的Southern印迹技术。

除了较传统的凝胶电泳和DNA测序方法外，突变还可用原位分析检测出来。

本发明也涉及用于检测各种组织中NADHDH10基因的mRNA表达异常的诊断方法。mRNA水平的变化可用逆转录PCR(RT-PCR)、Northern印迹、点杂交或RNA原位杂交等方法进行检测。这些方法对于本领域的技术人员来说是周知的。

本发明还涉及用于检测各种组织中NADHDH10基因蛋白水平改变的诊断方法，与正常对照组织样品相比，NADHDH10蛋白的减少可检测疾病或对疾病易感性的存在(如肿瘤)。测定宿主样品中NADHDH10基因蛋白水平的方法是本领域技术人员熟知的，包括放射性免疫测定法、竞争性结合测定法、Western印迹分析、酶联免疫吸附法和夹心测定法。酶联免疫吸附法(ELISA)(Coligan等人，现代免疫学方法(CurrentProtocols in Immunology)卷1,No.2，第6章，1991)要预先准备针对NADHDH10抗原的特异性抗体，优选是单克隆抗体。另外，还要准备抗单克隆抗体的报告抗体。报告抗体上连有一个可检测的试剂，诸如放射性同位素、荧光或辣根过氧化物酶等标记。例如，从宿主取得样品并在一个固相载体上温育，例如聚苯乙烯反应板，它能吸附样品中的蛋白质。然后用一种非特异性蛋白如牛血清白蛋白(BSA)温育，覆盖板上任何游离的蛋白结合位点。第二步，加入单克隆抗体在板中温育，这时，单克隆抗体与附着在聚苯乙烯反应板上的NADHDH10蛋白质结合。所有未结合上的单克隆抗体用缓冲液洗去。与辣根过氧化物酶相连的报告抗体此时加入板中，结果报告抗体就与结合在NADHDH10抗原上的单克隆抗体相结合。未结合上的报告抗体也被洗掉。然后加入过氧化物酶的底物，在一定的时间内所形成的颜色的深浅与标准曲线作比较，就能测出一定体积的病人样品中NADHDH10蛋白质的含量。

竞争测定法也可用于这项检测。将NADHDH10抗原的特异性抗体连到一个固相载体上，然后让标记的NADHDH10和从宿主获得的样品一起通过固相载体并检测标记物的数量，例如用液相闪烁计数器。标记物的数量与样品中的NADHDH10的数量相关。夹心测定法类似于酶联免疫吸附法，包括双抗原夹心法和双抗体夹心法。在双抗体夹心测定法中，NADHDH10通过固体载体，与吸附在固相载体上的抗体结合。第二种抗体又结合到NADHDH10上。第三种抗体是被标记的并对第二种抗体有特异性，当它通过固相载体时就结合到第二种抗体上，然后检测它的数量。

利用标记的NADHDH10在受体结合实验中可以检测表达NADHDH10受体的恶性细胞。可以根据NADHDH10受体的存在与否和其密度区分细胞，从而提供预测这种细胞对NADHDH10活性之敏感性的基础。

本发明的多肽以及该多肽的拮抗剂、激动剂和抑制剂可直接用于疾病治疗。NADHDH10蛋白或多肽可做为药物治疗NADH脱氢酶10KD亚基功能低下或丧失所致的疾病。NADHDH10的拮抗剂可用来治疗或预防免疫紊乱，免疫紊乱包括(但不局限于)：肾小球性肾炎、红斑狼疮、格雷夫氏病、糖尿病、贫血、肺气肿、胰腺炎、Sjogren’s综合症、阿迪森氏症、骨关节炎、痛风、多发性肌炎、重症肌无力、遗传性过敏性皮炎、哮喘、支气管炎、自身免疫甲状腺炎等。与NADHDH10特异性结合的抗体可直接用作拮抗剂，或间接以靶向或传递机制将药剂带到表达NADHDH10的细胞或组织中。

NADHDH10的拮抗剂或片段或衍生物可用来治疗或预防神经系统退行性疾病，神经系统退行性疾病包括(但并不局限于)：老年痴呆症、亨廷顿氏症、帕金森氏症、癫痫病、唐氏综合症、多样性硬化症等。

NADHDH10的拮抗剂或片段或衍生物可用来治疗或预防交感神经系统紊乱，交感神经系统紊乱包括(但并不局限于)：高血压、心血管休克、哮喘、偏头痛、心律不齐、过敏性休克等。

NADHDH10的拮抗剂或片段或衍生物可用来治疗或预防线粒体肌病，线粒体肌病包括(但并不局限于)：进行性外周眼肌瘫痪、Kearns-Sayre综合症、肌阵挛症、脑病、心肌炎、乳酸中毒症等。

NADHDH10的拮抗剂或片段或衍生物可用来治疗或预防癌症，癌症包括(但并不局限于)：腺癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤等；尤其是肾、膀胱、胰腺、骨、脑、乳腺、子宫、胆囊、肝、肺、甲状腺、食道、睾丸、皮肤、肠系膜等部位有关的癌症。与NADHDH10特异性结合的抗体可直接用作拮抗剂，或间接以靶向或传递机制将药剂带到表达NADHDH10的细胞或组织中。NADHDH10的拮抗剂或片段或衍生物可用来治疗或预防癌症免疫紊乱。

NADHDH10多肽及其具有生物活性的片段、类似物和衍生物可以与药学可接受载体一起在组合物中使用，这样的组合物中包括有效治疗剂量的多肽和药学可接受的载体或赋形剂。这样的载体包括但并不限制于盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇及其组合。配制品应该适合给药方式。

本发明的药物组合物还包括利用本发明的多肽制备的疫苗，其包括本发明的多肽或其具有生物学活性或免疫学活性的片段，其中任选地还含有弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂以及其它药学可接受的载体。

本发明也提供了一种药物包装或试剂盒，包括一个或多个装有一种或多种本发明的药物组合物的成分的容器。另外，这些多肽及其具有生物活性的片段、类似物和衍生物也可与其它的治疗化合物组合使用。

这些药物组合物可用一种方便的方式给药，诸如表皮、静脉内、腹膜内、肌肉内、肿瘤内、皮下、鼻内或真皮内途径。这些药物组合物以治疗和/或预防具体适应症的有效剂量使用。

本发明的NADHDH10多核苷酸可用于基因治疗，经体内表达NADHDH10或利用反义技术而达到治疗目的。

基因治疗方法例如包括将病人的细胞在离体情况下用编码NADHDH10多肽的多核苷酸(DNA或RNA)工程化，再将工程化的细胞供给待治疗的病人。这样的方法是本领域中大家所熟悉的。例如，可以用包含编码本发明NADHDH10多肽的RNA的逆转录病毒颗粒进行细胞工程化。

同样，用本领域所知的方法可以在体内工程化细胞以体内表达多肽。如本领域中所知，用于产生含有编码本发明多肽的RNA的逆转录病毒颗粒的生产细胞可以注入病人体内，使体内细胞工程化并在体内表达该多肽。从本发明的讲授看，这些以及其它的多肽给药方式对于本领域技术人员是很清楚的。例如除了逆转录病毒外，还有别的用于工程化细胞的表达载体，例如腺病毒，把它与一个合适的运输载体结合后可在体内工程化细胞。

可以衍生出上述逆转录病毒质粒载体的逆转录病毒包括但不限于Moloney鼠白血病病毒、脾坏死病毒、劳斯氏肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽白血病病毒、长臂猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和哺乳动物肿瘤病毒。

上述载体中可包含一个或多个启动子。可使用的合适启动子包括但不限于逆转录病毒的LTR、SV40启动子、人巨细胞病毒(CMV)启动子(Miller：生物技术(Biotechniques)，卷7,No.9,980-990页，1989)或其它启动子(例如，真核细胞启动子包括但不限制于组蛋白、polⅢ、β-肌动蛋白启动子)。其它可用的病毒启动子包括但不限于腺病毒启动子、胸苷激酶(TK)启动子和B19细小病毒启动子。从这里的讲授，合适启动子的选择在本领域技术人员知识范围之内。

编码本发明多肽的多核苷酸序列应在合适启动子的控制之下。合适的启动子包括但不限于，腺病毒的启动子，比如腺病毒主要晚期启动子；或异源启动子，比如巨细胞病毒(CMV)启动子；呼吸道合胞体病毒(RSV)启动子；可诱导的启动子，比如MMT启动子、金属硫蛋白启动子；热休克启动子；白蛋白启动子；ApoAⅠ启动子；人珠蛋白启动子；病毒胸苷激酶启动子，比如单纯性疱疹胸苷激酶启动子；逆转录病毒的LTR(包括上面所描述的修饰的逆转录病毒的LTR)；β-肌动蛋白启动子；及人生长激素启动子。也可以是控制编码该多肽的基因的自身启动子。

用逆转录病毒质粒载体转导包装细胞系而形成生产细胞系。用于转染的包装细胞包括，但不限制于，PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、ψCRE、ψCRIP、GP+E-86、GP+enVAM12和DNA细胞系，如Miller所描述(人类基因治疗(Human GeneTherapy)，卷1,5-14页，1990)，此处全文引入作为参考。可用本领域的已知方法用载体转导包装细胞系。这些方法包括但不限于，电穿孔、使用脂质体和磷酸钙沉淀。一种可选择的方法是将逆转录质粒载体包裹进脂质体中或与脂类偶联，然后注入宿主中。

生产细胞系产生具感染性的逆转录病毒颗粒，此病毒颗粒中包含编码这些多肽的核酸序列。这样的逆转录病毒载体颗粒可用于体外或体内转染真核细胞。被转染的真核细胞将表达编码多肽的核酸序列。可用于转染的真核细胞包括但不限于，胚胎干细胞、胚胎癌细胞、造血干细胞、肝细胞、成纤维细胞、成肌细胞、角质细胞、内皮细胞和支气管上皮细胞。

另一方面，利用反义技术可以改变本发明多肽的体内表达也以治疗与多肽表达相关的的疾病。可以利用NADHDH10基因编码区、控制或调节区的反义分子(DNA、RNA、或肽核酸(PNA))。最近，文献中报道了利用三螺旋DNA在治疗中的应用(Gee,J.E.等人，(1994)Huber,B.E.与B.I.Carr等编，分子及免疫学方法(Molecular and ImmunologicApproaches),Futura Publishing Co.,Mt.Kisco,N.Y.,163-177页)。互补序列或反义分子也可通过防止转录本与核糖体的结合以阻止mRNA的翻译。

“肽核酸”是指一种反义分子或反基因物，其包含与以赖氨酸结尾的氨基酸残基之肽骨架连接的寡核苷酸，寡核苷酸的长度至少为5个核苷酸。末端的赖氨酸赋予对组合物的溶解性。肽核酸优先结合互补性单链DNA或RNA，终止转录的延伸，也可延长其在细胞中的半寿期(Nielsen,P.E.等人，(1993)抗肿瘤药物研究(Anticancer Drug Res.),8:53-63)。

多肽及其片段、衍生物或类似物或表达它们的细胞可用作免疫原以产生其抗体。这些抗体可以是多克隆或单克隆抗体。本发明也包含了嵌和的、单链的和人源化的抗体以及Fab片段、或Fab表达文库的产物。本领域已知的各种方法可用于这样的抗体和片段的产生。

所产生的针对本发明多肽的抗体可通过直接将本发明的多肽注射给动物或将其导入动物(最好不是人)而获得。所得到的抗体可与多肽本身结合。用这种方法，甚至用只编码本发明多肽的片段序列也能获得结合整个天然多肽的抗体。然后，抗体可用来把多肽从表达它的组织中分离出来。

制备单克隆抗体可以用连续细胞系培养产生抗体的技术。例如，用杂交瘤技术(Kohle & Milstein：自然256:495-497,1975)、Trioma技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等人，今日免疫学(ImmunologyToday)4:72,1983)和EBV-杂交瘤技术产生人的单克隆抗体(Cole等人，单克隆抗体和癌症治疗(Monoclonal Antibodies and CancerTherapy),Alan R.Liss,Inc.,77-96,1985)。

单链抗体产生技术(美国专利4,946,778)适用于产生本发明的免疫原性多肽产物的单链抗体。转基因动物也可用来表达本发明的免疫原性多肽产物的人源化抗体。

NADHDH10特异性抗体可用于癌症的诊断和治疗，因为许多癌症细胞在瘤形成和增生过程中上调NADH脱氢酶家族中的各种成员。这些抗体结合并灭活NADHDH10。

抗体也可用于设计针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如与本发明NADH脱氢酶10有高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂合抗体可用于杀灭该NADH脱氢酶10阳性的细胞，特别是癌细胞。

本发明还涉及一种筛选NADHDH10的激动剂、拮抗剂及抑制剂的方法，包括使用本发明的多肽或其片段筛选多肽库或药物候选物文库用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激NADHDH10功能的分子。本发明多肽的激动剂、拮抗剂以及抑制剂的筛选可利用本领域普通技术人员周知的方法进行。本发明也提供了筛选药物以鉴定提高(激动剂)或阻遏(拮抗剂)NADHDH10活性的药物的方法。激动剂提高NADHDH10刺激细胞增殖等生物功能，而拮抗剂阻止和治疗与细胞过度增殖有关的紊乱如各种癌症。例如，哺乳动物细胞或表达NADHDH10的膜制剂能在药物的存在下与标记的NADHDH10一起培养。然后测定药物提高或阻遏此相互作用的能力。NADHDH10蛋白的拮抗剂可以与人NADHDH10蛋白结合并消除其功能，或是抑制人NADHDH10蛋白的产生，或是与多肽的活性位点结合使多肽不能发挥生物学功能。在筛选化合物作为拮抗剂时，可以将此种新的人NADHDH10蛋白加入生物分析测定中，通过测定此种新的人NADHDH10蛋白受化合物影响和其受体之间的相互作用来确定化合物是否是拮抗剂。以上述筛选化合物的同样方法，可以筛选出起拮抗剂作用的分子。这些通过本发明方法获得的NADHDH10或其片段的激动剂、拮抗剂及抑制剂可如上所述配制成药物组合物用于上述疾病的治疗。

本发明将在下面的实施例中进一步描述。但是本发明并不局限于这些实施例。所有的份和量，除非另有说明都按重量计。

DNA的“消化”指用限制酶对DNA进行催化性切割，限制酶只作用于DNA序列的特定位点。这里所用的各种限制酶可从商业获得，它们的反应条件、辅助因子和其它的要求按照一般技术人员所知的应用。为了分析需要，通常在大约20μl的缓冲溶液中加入1μg质粒或DNA片段和大约2个单位的酶。为了分离DNA片段用于质粒构建，通常在一个较大的的体积中用20到250个单位的酶消化5到50μg的DNA。生产厂家会指明对特异限制酶合适的缓冲液和底物的量。通常所用的温育时间大约是37℃一个小时，但根据厂家的指示可以有所改变。限制性消化之后直接在聚丙烯酰胺胶上进行电泳，分离出想要的片段。

根据所切割成的片段大小进行分离可用8％的聚丙烯酰胺凝胶(Goedde等人，核酸研究8:4057,1980)。

“连接”指在两个双链核酸片段间形成磷酸二酯键的过程。除非提供了别的方法，连接可以在已知的缓冲液和条件下进行，即每0.5mg约等摩尔量的用于连接的DNA片段加10个单位的T4 DNA连接酶(“连接酶”)。

除非另有说明，转化均用Graham & Van der Eb：病毒学(Virology)52:456-457，1973中所描述的方法进行。实施例1：NADHDH10的cDNA的克隆

用异硫氰酸胍/酚/氯仿一步法提取人胎脑总RNA。用Quik mRNA分离试剂盒(Qiegene)从总RNA中分离poly(A)mRNA。2μg poly(A)mRNA经逆转录形成cDNA.用Smart cDNA克隆试剂盒(购自Clontech)将cDNA片段定向插入到载体pBSK(+)(Clontech公司产品)的多克隆位点上，转化大肠杆菌DH5α形成cDNA文库。共获得3028个克隆。用双末端循环反应测序试剂盒(Perkin-Elmer公司产品)和ABI377型自动测序仪(Perkin-ELmer公司产品)测定所有克隆的5′和3′末端的序列。将测定的cDNA序列与已有的公共DNA序列数据库(GeneBank)进行比较，结果发现有一个克隆1281g06的DNA序列为新的DNA。通过合成一系列引物对此克隆所含的DNA序列进行双向序列测定。计算机分析表明，该克隆所含的全长cDNA是一个新的DNA序列(Seq ID No 1)，从第296bp至568bp有一个273bp的开放阅读框架，编码一个新的91个氨基酸残基的多肽(Seq ID No 2)。我们将此蛋白质命名为NADH脱氢酶10(NADHDH10)。实施例2：用RT-PCR方法克隆NADHDH10

用胎脑细胞总RNA为模板，以oligo-dT为引物进行逆转录反应合成cDNA，用Qiagen的试剂盒纯化后，用下列引物进行PCR扩增：

正向引物F1 5’-TGTGTAATTTACAAGAGACAGATGTA-3’位于SEQ ID No1的起始处；

反向引物R1:5’-ACATAGGCCGAGGCGGCCGACATGT-3’位于SEQ ID No1的1306-1330bp。

扩增反应的条件：在50μl的反应体积中含有50mmol/L KCl,10mmol/L Tris-Cl,(pH8.5),1.5mmol/L MgCl₂,200μmol/L dNTP,25pmol引物，2.5U的Taq DNA聚合酶(Clontech公司产品)。在PE9600型DNA热循环仪上按下列条件反应25个周期：94℃30秒；55℃,30秒；72℃2分钟。在RT-PCR时同时以模板空白为阴性对照。扩增产物QIAGEN试剂盒纯化后，用TA克隆试剂盒连接到pCR载体上(InVitrogen)，并测定DNA序列。结果PCR产物的DNA序列与Seq IDNo 1所示的1-1330bp完全相同。实施例3：重组NADHDH10的体外表达、分离和纯化

分别在NADHDH10基因起始密码子处及终止密码子处设计了一对引物，

引物3:5’-CATATGATGTTGGCGTTTGGCTTCCAG-3’(SEQ IDNO:5)

引物4:5’-GGATCCTTATGGGAGCTAATTAAGCAG-3’(SEQ IDNO:6)

此两段引物的5’端分别含有NdeⅠ和BamHⅠ酶切位点，其后分别为目的基因5端和3’端的编码序列，NdeⅠ和BamHⅠ酶切位点相应于表达载体质粒pET-28b(+)(Novagen公司产品，Cat.No.69865.3)上的选择性内切酶位点。以含有全长目的基因的pBS-1281g06质粒为模板，进行PCR扩增获得CBACP基因编码区序列。PCR反应条件为：总体积50μl中含pBS-1281g06质粒10pg、引物3和引物4分别为10pmol、Advantage polymeraseMix(Clontech公司产品)1μl。循环参数：94℃ 20秒，60℃ 30秒，72℃2分钟，共25个循环。用NdeⅠ和BamHⅠ分别对扩增产物和质粒pET-28(+)进行双酶切，分别回收大片段，并用T4连接酶连接。连接产物转化用氯化钙法大肠杆细菌DH5α，在含卡那霉素(终浓度30μg/ml)的LB平板培养过夜后，用菌落PCR方法筛选阳性克隆，并进行测序。挑选序列正确的阳性克隆(pET-1281g06)用氯化钙法将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plySs(Novagen公司产品)。在含卡那霉素(终浓度30μg/ml)的LB液体培养基中，宿主菌BL21(pET-1281g06)在37℃培养至对数生长期，加入IPTG至终浓度1mmol/L，继续培养5小时。离心收集菌体，经超声波破菌，离心收集上清，用能与6个组氨酸(6His-Tag)结合的亲和层析柱His.Bind Quick Cartridge(Novagen公司产品)进行层析，得到了纯化的目的蛋白NADHDH10。经SDS-PAGE电泳，在10kDa处得到一单一的条带。将该条带转移至PVDF膜上用Edams水解法进行N-端氨基酸序列分析，结果N-端15个氨基酸与SEQ ID NO:2所示的N-端15个氨基酸残基完全相同。实施例4：抗NADHDH10的抗体的产生

用多肽合成仪(PE-ABI)合成NADHDH10特异性的多肽：NH2-Met-Leu-Ala-Phe-Gly-Phe-Gln-Leu-Leu-Gln-Leu-Pro-Leu-Val-Leu-COOH。将该多肽分别与血蓝蛋白和牛血清蛋白耦和形成复合物，方法参见：Avrameas.等人，免疫化学(Immunochemistry),1969；6:43。用4mg上述血蓝蛋白多肽复合物加上完全弗氏佐剂免疫家兔，15天后再用血蓝蛋白多肽复合物加上不完全弗氏佐剂加强免疫一次。采用经15μg/ml牛血清蛋白多肽复合物包被的滴定板做ELISA测定抗体的滴度。用蛋白A-Sepharose从抗体阳性的家兔血清中分离总IgG。将多肽结合与溴化氰活化的Sepharose 4B柱上，用亲和层析法从总IgG中分离多肽抗体。免疫沉淀法证明纯化的抗体可特异性的与NADHDH10结合。实施例5：cDNA克隆的结构域分析

将本发明的NADH脱氢酶10的序列及其编码的蛋白序列，用GCG中的profile scan程序(Basiclocal Alignment search tool)[Altschul,SF等人，分子生物学杂志，1990；215:403-10]，在prosite等数据库进行结构域分析。本发明的NADH脱氢酶10在7-61与结构域NADH脱氢酶75KD活性中心有一定的同源性。同源结果示于图1，同源率为25％，得分为13.68；阈值为13.48。

                序列表(1)一般信息：(ⅰ)申请人：

  (A)姓名：上海生元基因开发有限公司

  (B)街道：北京东路668号610室

  (C)城市：上海

  (E)国家：中国

  (F)邮政编码：200001

  (ⅱ)发明名称：一种新的NADH脱氢酶及编码它的多核苷酸序列(ⅲ)序列数：2(2)SEQ ID NO:1的信息：

(ⅰ)序列特征：

   (A)长度：1330个碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)扑类型：线性(ⅱ)分子类型：cDNA(ⅸ)特性：

   (A)名称/关键词：CDS

   (B)位置：296..568(ⅹⅰ)SEQ ID NO:1的序列描述：1 TGTGTAATTTACAAGAGACAGATGTAAAACATAATTATATGGAAAAAAGACAAAGAGTGG61 AAGAAAATATCCATTCGAATTGTGACAGCTTTGTATTGTGTCGGTACAACTGAGCTGGAA121 CTACTTTTCCGAGAATTTCCTTTCCAAAATAGTTTCAGTTTGGGTCAGCCACAAGAGAAA181 TTTGCATGTTCTTTGTAAGGTAGAAGTGAAGAGCTGTATTTCTGCTCAGAAGGTTGGTAT241 ATGGTCAGGCACTGTTGCAGCTCACACACCCTGTCACTGACTTGGCTGTATCACCATGTT301 GGCGTTTGGCTTCCAGCTCCTCCAGCTCCCACTGGTTCTTTTCCATCAGCTTCTCCAAAT361 TCTAGGTCAGATTTGTGGGCTCTGTCATGAAGGGTGCCAGCTTATACTGCAAATTCTCTG421 TCACAGATTGGTGAGAAATAAATGTGACTTCCAGTCTGTCCTTGTTCTTCCCCAACTTCA481 CATCCATCTTTCCTTCCCTGTTGCCTGCCCTTTGATTTCTATCCCAACACTAGATGGAGA541 AGCAACAGCCCTATACAAACTGCTTAATTAGCTCCCATAATTACTGGTCAAATCTCTATA601 ATCCTTATCACTCATAGTGGTTTTGCTTCTGTGATGAAACCCTAATACTAATTGAAAAAT661 AGTTTGTGGAATAATATTAATATTAGGAAAAAATACGTAAGGCAAAAAACAAAGAGACCA 721 GTGCACAATGATACTGGAACAGTTCTTTCAGGAGACGTAACAAGCCCGAACCTGCACTGA781 ATAACATAGTCTCAAAACATATAAAGCAAAAACTGACAGAATTTTACGGAGAAATGAAGA841 AAACTGTAGTCTTAGTTGGAGATAGTCACATCTCTCTCTCGAAGTAGGCATAAACTTACT901 AAGGCCATAGAAGATTTGAACAACACAATGACAAGATTGGTCTGTTGATACATGTAAAAC961 TTTGCACCCAACAAGTAAAGAAGATAGACTTTTTCAAGCATAATTGGAACTTAATAACAA1021 TAGCCCACAGGGCCAGTTTTAGTGAATACTGCAGAGACAGTGTCATTACAGATCATTAGT1081 TGTGTCATTATAATGAAGTAAAATTGGAAACAGTGACAAAAAATAGGCAGTCTGTTCCTA1141 CCATGTGTTTAAAAACCAAACTCTTGGCCGGGCACGGTGGCTCACGCCTGTGATCCCAGC1201 ACTTTGGGAGGTCAAGGTGGGTGGATCATGAGGTCAGGAGATCGAGAGCATCCTGGCTAA1261 CACGGTGAAACCCCGTCTCTACTGAAAATACAAAAAAAAAAAAAAACATGTCGGCCGCCT132l CGGCCTATGT(2)SEQ ID NO:2的信息：

(ⅰ)序列特征：

  (A)长度：91个氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：多肽

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2:1 Met  Leu  Ala  Phe  Gly  Phe  Gln  Leu  Leu  Gln  Leu  Pro  Leu  Val  Leu16 Phe  His  Gln  Leu  Leu  Gln  Ile  Leu  Gly  Gln  Ile  Cys  Gly  Leu  Cys31 His  Glu  Gly  Cys  Gln  Leu  Ile  Leu  Gln  Ile  Leu  Cys  His  Arg  Leu46 Val  Arg  Asn  Lys  Cys  Asp  Phe  Gln  Ser  Val  Leu  Val  Leu  Pro  Gln61 Leu  His  Ile  His  Leu  Ser  Phe  Pro  Val  Ala  Cys  Pro  Leu  Ile  Ser76 Ile  Pro  Thr  Leu  Asp  Gly  Glu  Ala  Thr  Ala  Leu  Tyr  Lys  Leu  Leu91 Asn

Claims (16)

1．一种新的分离的NADH脱氢酶，它包含具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽、或其保守性变体或其活性片段或衍生物。

2．如权利要求1所述的多肽，其是具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽。

3．一种分离的多核苷酸，其包含选自下组的一种核苷酸序列或其变体：

(a)编码如权利要求1或2所述多肽的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸；

(c)与(a)或(b)的多核苷酸序列具有至少80％相同性的多核苷酸。

4．如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的多肽。

5．如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组的一种：

(a)具有SEQ ID No.1中296-568位的序列；

(b)具有SEQ ID No.1中1-1330位的序列。

6．一种含有权利要求3所述的多核苷酸的重组载体。

7．一种用权利要求3所述的多核苷酸或权利要求6所述的载体转化、转导或转染的宿主细胞。

8．一种具有权利要求1所述多肽活性的多肽的制备方法，该方法包括：

(a)在适合表达权利要求1所述多肽的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出具有权利要求1所述多肽活性的多肽。

9．一种能与权利要求1所述多肽特异性结合的抗体。

10．一种筛选模拟、促进、拮抗或抑制权利要求1所述多肽活性的化合物的方法，其包括利用权利要求1的多肽或其活性片段。

11．一种体外检测与权利要求1所述多肽异常表达相关的疾病或疾病的易感性的方法，包括检测生物样品中权利要求1所述多肽或其编码多核苷酸序列的突变。

12．根据权利要求11的方法，其中所述多核苷酸是DNA或mRNA。

13．一种体外检测与权利要求1所述多肽异常表达相关的疾病或疾病的易感性的方法，包括检测生物样品中权利要求1所述多肽的含量或生物活性。

14．一种药物组合物，它含有权利要求1所述的多肽或其模拟物、激活剂、拮抗剂或抑制剂或以上各个组分的组合，其还包括药学上可接受的载体。

15．权利要求1的多肽或权利要求3的多核苷酸在制备用于恢复或增强神经功能、治疗线粒体肌病等的药物中的用途。

16．权利要求1所述多肽的拮抗剂或权利要求1所述多肽编码序列的反义多核苷酸在制备用于治疗神经系统退行性疾病、肌病、交感神经系统紊乱、免疫紊乱和癌症等药物中的用途。

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