CN1294193A - 一种新的人Fe65L2－2蛋白及编码它的多核苷酸序列 - Google Patents

Abstract

本发明公开了分离的人Fe65L2－2基因的多核苷酸序列及其编码的多肽,以及制备这种多肽的方法。并且公开了通过检测该基因核酸水平的突变及多肽水平的改变,检测与该基因的核酸及其编码多肽异常有关的疾病的诊断方法,也公开了利用该基因的多核苷酸序列和多肽治疗与该基因异常有关的疾病的用途和用于上述治疗的药物组合物。

Description

一种新的人Fe65L2-2蛋白及编码它的多核苷酸序列

本发明公开了一种新的人Fe65L2-2蛋白及编码它的多核苷酸序列，还涉及所述蛋白质及其编码多核苷酸序列在诊断、预防和治疗与该蛋白质表达异常相关疾病中的应用。

Fe65是一个基因家族的总称，目前已发现的成员都有三个重要结构域PID1、PID2和WW区域。Fe65蛋白被认为是一个连接分子，包括有三个蛋白-蛋白相互作用区：两个磷酸酪氨酸作用区(PID)或磷酸酪氨酸结合区(PTB)和一个含有两个保守色氨酸残基的WW区。其中，Fe65蛋白的PID2区域可与淀粉样沉淀前体蛋白(APP)的胞内结构域结合。Fe65的另一个PID／PTB区，即N末端的PID1区域，它可与CP2、LSF、LBP1等蛋白作用，参与一个复杂的细胞内运输过程。Fe65还有另一个区域-WW区域。WW区域为一个由38个半保守氨基酸组成的特征序列。WW区域主要功能是介入一系列复杂的细胞内信号传递作用。综上所述，Fe65的两个PID／PTB区域与WW区域都具有信号传递蛋白的特征，同复杂的信号传导网络有关。

已知淀粉样沉淀是阿尔茨海默症的主要病理特征(Glenner，G．G．，等人，(1984)，生物化学生物物理研究通讯(Biochem．Biophy．Res．Commu．)，120：885-890)。淀粉样沉淀的主要成分Aβ衍生自APP的蛋白质水解加工(Goldgaber，D．等人，(1987)，科学(Science)，235：877-880；Kang，J．等人，(1987)，自然(Nature)，325：733-736)。至少有三种分泌酶(secretase)即：α-分泌酶、β-分泌酶和γ-分泌酶参与了APP的加工(Weidmann，A．等人，(1989)细胞(Cell)，57：115-126；Esch，F．S．等人，(1990)科学248：1122-1124；Seubert，P．等人，(1992)，自然，359：325-327)。其中，经过β-分泌酶和γ-分泌酶切割APP产生Aβ，而α-分泌酶在形成Aβ之前于APP的Aβ结构域中切割得到APP。大量的Aβ的积累和聚集促进了淀粉样沉淀的形成。Sabo等人于美国专利5，928，882中指出，膜上APP蛋白的量与最终形成Aβ的量正相关。而Fe65可通过结合APP，增加APP从高尔基体中向质膜运输的量，或是增加了在被内吞后重新回到细胞表面的APP的量。因此，如果抑制Fe65与APP的结合，可降低膜上APP的量，从而可减少Aβ的形成和聚集。

最近Tanahashi等人报道从人胎脑cDNA文库中克隆到的hFe65L2基因，它编码484个氨基酸，其序列与小鼠的Fe65L2蛋白有86％的同源性，并同时报道了一种缺少两个氨基酸残基的剪切变体(Tanahashi，H．等人，(1999)，神经科学通讯(NeuroscienceLetters)261：143-146)。

由于如上所述可知，Fe65蛋白与APP蛋白的相互作用对于Aβ的积累和聚集以及淀粉样沉淀的形成有重要影响，减少Fe65蛋白的含量或抑制其与APP蛋白结合对于治疗与Aβ的积累和聚集以及淀粉样沉淀的形成相关的疾病如阿尔茨海默症、痴呆等十分重要。因此本领域一直迫切需要更全面的鉴定和了解参与上述结合过程的Fe65家族的各个蛋白质成员，特别是鉴定这些蛋白质成员的氨基酸序列。本发明基于对Fe65家族中的一个新成员，即：本发明的Fe65L2-2及其编码基因的分离与表征，为诊断、治疗和／或预防神经退行性疾病如与Aβ的积累和聚集以及淀粉样沉淀的形成相关的疾病打下了基础。本发明的蛋白具有针对上述疾病的诊断、治疗和／或用途的前景，因此分离其编码多核苷酸序列是非常重要的。

本发明的目的就是提供一种新的人Fe65L2-2蛋白及编码它的多核苷酸序列。

本发明涉及一种分离的多肽，它包含：具有SEQ ID No．2氨基酸序列的多肽、或其保守性变体、生物活性片段或衍生物。

本发明还涉及一种分离的多核苷酸，它包含选自下组的一种核苷酸序列或其变体：

(a)编码具有SEQ ID No．2氨基酸序列的多肽的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸；

(c)与(a)或(b)的多核苷酸序列具有至少89％相同性的多核苷酸，不包括已报道的hFe65L2基因。

本发明另外涉及一种含有本发明多核苷酸的载体，特别是表达载体；一种用该载体遗传工程化的宿主细胞，包括转化、转导或转染的宿主细胞；一种包括培养所述宿主细胞和回收表达产物的制备本发明多肽的方法。

本发明还涉及一种能与本发明多肽特异性结合的抗体。

本发明还涉及一种筛选拮抗或抑制Fe65L2-2蛋白与APP蛋白质相互作用的化合物的方法，其包括利用本发明的多肽。本发明还涉及利用所得的化合物治疗、检测和／或预防疾病的方法。

本发明还涉及一种体外检测与Fe65L2-2蛋白含量增加或活性升高相关的疾病或疾病易感性的方法，包括检测生物样品中所述多肽或其编码多核苷酸序列中的突变，或者检测生物样品中本发明多肽的量或生物活性。

本发明还涉及利用本发明的多核苷酸作为引物用于核酸扩增反应、作为探针用于杂交反应以及用于制备基因芯片或微阵列的用途。

本发明也涉及一种药物组合物，它含有针对本发明多肽的抗体或其免疫活性片段、或者是本发明多肽的模拟物、拮抗剂或抑制剂以及药学上可接受的载体。

本发明还涉及针对本发明的多肽的抗体和／或反义多核苷酸在制备用于治疗神经退行性疾病如阿尔茨海默症和痴呆等的药物的用途。

本发明上述的和其它的方面对于本领域的技术人员来说，从本文以下的详细描述看应该是很清楚的。

图1为用GCG软件包中的gap程序将人FE65L2-2的核酸序列(中间)与hFE65L2(下排)的序列作双序列比较的结果，发现多出一段21bp的序列。而在做相似性比较时可以找到与人FE65L2-2基因完全对应的基因组序列(上排)，其是序列号为ac005214的BAC。从比较的结果可看到这段21bp的序列位于内含子与外显子的交界处。其中斜黑体的部分为内含子部分。

本说明书和权利要求书中使用的下列术语除非特别说明具有如下的含义：

“核酸序列”是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，也可以指基因组或合成的DNA或RNA，它们可以是单链或双链的，代表有义链或反义链。类似地，术语“氨基酸序列”是指寡肽、肽、多肽或蛋白质序列及其片段或部分。当本发明中的“氨基酸序列”涉及一种天然存在的蛋白质分子的氨基酸序列时，这种“多肽”或“蛋白质”不意味着将氨基酸序列限制为与所述蛋白质分子相关的完整的天然氨基酸。

蛋白质或多核苷酸“变体”是指一种具有一个或多个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列或编码它的多核苷酸序列。所述改变可包括氨基酸序列或核苷酸序列中氨基酸或核苷酸的缺失、插入或替换。变体可具有“保守性”改变，其中替换的氨基酸具有与原氨基酸相类似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸。变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。

“缺失”是指在氨基酸序列或核苷酸序列中一个或多个氨基酸或核苷酸的缺失。

“插入”或“添加”是指在氨基酸序列或核苷酸序列中的改变导致与天然存在的分子相比，一个或多个氨基酸或核苷酸的增加。

“替换”是指由不同的氨基酸或核苷酸替换一个或多个氨基酸或核苷酸。

“生物活性”是指具有天然分子的结构、调控或生物化学功能的蛋白质。类似地，术语“免疫学活性”是指天然的、重组的或合成蛋白质及其片段在合适的动物或细胞中诱导特定免疫反应以及与特异性抗体结合的能力。

“拮抗剂”或“抑制物”是指当与Fe65L2-2结合时，一种可封闭或调节Fe65L2-2的生物学活性或免疫学活性的分子。拮抗剂和抑制物可以包括蛋白质、核酸、碳水化合物或任何其它可结合Fe65L2-2的分子。

“调节”是指Fe65L2-2的功能发生改变，包括蛋白质活性的升高或降低、结合特性的改变及Fe65L2-2的任何其它生物学性质、功能或免疫性质的改变。

″基本上纯″是指基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化Fe65L2-2。基本上纯的Fe65L2-2在非还原性聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。Fe65L2-2多肽的纯度可用氨基酸序列分析。

“互补的”或“互补”是指在允许的盐浓度和温度条件下通过碱基配对的多核苷酸天然结合。例如，序列“C-T-G-A”可与互补的序列“G-A-C-T”结合。两个单链分子之间的互补可以是部分的或全部的。核酸链之间的互补程度对于核酸链之间杂交的效率及强度有明显影响。

“同源性”是指互补的程度，可以是部分同源或完全同源。“部分同源”是指一种部分互补的序列，其至少可部分抑制完全互补的序列与靶核酸的杂交。这种杂交的抑制可通过在严格性程度降低的条件下进行杂交(Southern印迹或Northern印迹等)来检测。基本上同源的序列或杂交探针可竞争和抑制完全同源的序列与靶序列在的严格性程度降低的条件下的结合。这并不意味严格性程度降低的条件允许非特异性结合，因为严格性程度降低的条件要求两条序列相互的结合为特异性或选择性相互作用。

“相同性百分率”是指在两种或多种氨基酸或核酸序列比较中序列相同或相似的百分率。可用电子方法测定相同性百分率，如通过MEGALIGN程序(Lasergene软件包，DNASTAR，Inc．，MadisonWis．)。MEGALIGN程序可根据不同的方法如Cluster法比较两种或多种序列(Higgins，D．G．和P．M．Sharp(1988)基因73：237-244)。Cluster法通过检查所有配对之间的距离将各组序列排列成簇。然后将各簇以成对或成组分配。两个氨基酸序列如序列A和序列B之间的相同性百分率通过下式计算：

也可以通过Cluster法或用本领域周知的方法如Jotun Hein测定核酸序列之间的相同性百分率(Hein J．，(1990)酶学方法(Methods inenzymology)183：625-645)。

“相似性”是指氨基酸序列之间排列对比时相应位置氨基酸残基的相同或保守性取代的程度。用于保守性取代的氨基酸例如，带负电荷的氨基酸可包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸可包括赖氨酸和精氨酸；具有不带电荷的头部基团有相似亲水性的氨基酸可包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸和苏氨酸；苯丙氨酸和酪氨酸。

“反义”是指与特定的DNA或RNA序列互补的核苷酸序列。“反义链”是指与“有义链”互补的核酸链。

“衍生物”是指Fe65L2-2或编码其的核酸的化学修饰物。这种化学修饰物可以是用烷基、酰基或氨基替换氢原子。核酸衍生物可编码保留天然分子的主要生物学特性的多肽。

“抗体”是指完整的抗体分子及其片段，如Fa、F(ab’)2及Fv，其能特异性结合Fe65L2-2的抗原决定簇。

“分离的”一词指将物质从它原来的环境(例如，若是自然产生的就指其天然环境)之中移出。比如说，一个自然产生的多核苷酸或多肽存在于活动物中就是没有被分离出来，但同样的多核苷酸或多肽同一些或全部在自然系统中与之共存的物质分开就是分离的。这样的多核苷酸可能是某一载体的一部分，也可能这样的多核苷酸或多肽是某一组合物的一部分。既然载体或组合物不是它天然环境的成分，它们仍然是分离的。

本发明一方面提供了一种新的人Fe65L2-2蛋白，及其具有生物活性或免疫活性的片段、类似物和衍生物。本发明的另一方面，提供了编码这些多肽的分离的核酸分子，包括mRNA、DNA、cDNA和基因组DNA，及其具有生物活性的片段、类似物和衍生物。本发明的再一方面提供了核酸的探针，它包含足够长度的核酸分子以及与Fe65L2-2基因序列进行特异性杂交的序列。

依据本发明的一方面，它提供了一种分离的多核苷酸，这些核苷酸编码具有SEQ ID No．2所示的推定的氨基酸序列的多肽。

编码本发明多肽的多核苷酸可以从许多成人和胎儿的cDNA文库中分离，如人胎脑cDNA文库。SEQ ID No．1所示的多核苷酸序列全长为1809个碱基，具有编码一个含491个氨基酸残基的多肽的开放阅读框架。根据氨基酸序列同源比较发现，此多肽与大鼠Fe65L2-2蛋白有88％的相同性，与已知hFe65L2基因有很高的相同性，只是本发明的多核苷酸在hFe65L2基因第678位与679位核苷酸之间还存在一段21bp的核苷酸序列。这提示本发明的多肽是Fe65蛋白家族中的一个新成员或是一种新的剪切变体。

本发明的多核苷酸可以RNA或DNA的形式存在，其中DNA包括cDNA、基因组DNA和合成的DNA。DNA可以是双链或者单链的，单链也可以是有义链或者反义链。编码多肽的多核苷酸序列可以与SEQID No．1所示的多核苷酸序列相同，或者可以是一个由于遗传密码的冗余或简并性而不同的多核苷酸序列，但它与SEQ ID No．1编码相同的成熟多肽。

编码SEQ ID No．2的多肽的多核苷酸可以包括：仅仅编码成熟多肽的多核苷酸序列(如SEQ ID No．1中21-1493位多核苷酸)、包含编码成熟多肽的多核苷酸序列和任选的其它编码序列或非编码序列(例如内含子或编码成熟多肽的多核苷酸序列5’端和／或3’端的非编码序列)的多核苷酸序列(如SEQ ID No．1中1-1801位多核苷酸)。

本发明进一步涉及上面所描述的多核苷酸的各种变体，它们编码含有SEQ ID No．2所示的推定的氨基酸序列多肽的片段、类似物和衍生物。这些多核苷酸变体可以是天然存在的等位基因变体或非天然存在的多核苷酸变体。

编码本发明多肽的多核苷酸也可能与特定的标记序列在同一读框中相融合，标记序列可帮助本发明多肽的纯化。标记序列在使用细菌宿主时可以是pQE载体的六聚组氨酸标记，以利于融合有标记的成熟多肽的纯化，或者当使用哺乳类宿主(如猴肾成纤维细胞的COS-7细胞系)时，标记序列可以是一种血细胞凝集素(HA)标记。此外，包含编码本发明多肽的多核苷酸序列还可包含同源或异源的特定信号肽序列，以帮助目的蛋白质分泌到原核细胞或真核细胞膜外。本领域普通技术人员知晓，上述标记序列和信号肽序列也可通过重组方法或化学法添加在用于表达本发明多肽的载体上。

本发明的多核苷酸序列也包括全长cDNA的片段，例如含有SEQID NO 1所示序列中连续的至少10个，优选的至少20个核苷酸，更优选的至少50个核苷酸。

本发明进一步涉及能与上述序列杂交的多核苷酸，这两个序列间至少有70％，优选至少90％，更优选至少95％的同源性。本发明特别涉及在严格条件下能与上述多核苷酸杂交的多核苷酸。这里所用的术语“严格条件”意味着两序列之间有95％，优选至少97％同源性才能发生杂交。在一优选的实施方案中，与上述多核苷酸杂交的多核苷酸编码的多肽基本保持了与SEQ ID No．2所示多肽相同的生物功能或活性。

另一选择是，与本发明的多核苷酸杂交的多核苷酸至少含20个碱基，优选至少30个碱基，更优选至少50个碱基并且具有上面所描述的同源性，其可以保留或不保留活性。例如，这样的多核苷酸可以用作为检测SEQ ID No．1所示多核苷酸或其同源序列的探针；又如，其可以用于本发明多核苷酸的回收或者作为一种诊断探针或PCR引物。

本发明的DNA序列可用多种方法获得。例如，用本领域熟知的杂交技术分离DNA。这些技术包括但不局限于：1)用探针与基因组或cDNA文库杂交以检出同源性多核苷酸序列，和2)表达文库的抗体筛选以检出具有共同结构特征的克隆的DNA片段。

编码Fe65L2-2的特异DNA片段序列也能用下列方法获得：1)从基因组DNA分离双链DNA序列；2)化学合成DNA序列以获得所需多肽的双链DNA。

分离感兴趣的cDNA的标准方法是从高表达该基因的供体细胞中分离mRNA并进行逆转录，形成质粒或噬菌体cDNA文库。提取mRNA的方法已有多种成熟的技术，试剂盒也可从商业途径获得(Qiagene)。而构建cDNA文库也是本领域技术人员周知的方法(Sambrook，等人，分子克隆实验室手册(Molecular Cloning，aLaboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory．New York，1989)。还可得到商业供应的cDNA文库，如Clontech公司的不同cDNA文库。当结合使用聚合酶反应技术时，即使极少的表达产物也能克隆。

可用常规方法从这些cDNA文库中筛选本发明的多核苷酸序列。这些方法包括但不限于：(1)DNA-DNA或DNA-RNA杂交；(2)标志基因的功能出现或丧失；(3)测定Fe65L2-2的转录本的水平；(4)应用免疫学技术或测定生物学活性检测基因表达的蛋白产物。上述方法可单独使用，也可多种方法联合应用。

在第(1)种方法中，杂交所用的探针可与本发明多核苷酸的任何一部分具有相同性，其长度至少是15个核苷酸，优选是20-30个核苷酸，更优选是50-60个核苷酸，最优选是100个核苷酸以上。此处所用的探针通常是在本发明的基因DNA序列信息的基础上化学合成的DNA序列。本发明的基因本身或者片段当然可以用做探针。DNA探针可用放射性同位素、荧光素或酶(如碱性磷酸酶)等标记。第(4)种方法中，检测Fe65L2-2基因表达的蛋白产物可用免疫学技术如Western印迹、放射免疫沉淀法、酶联免疫吸附法(ELISA)等。

由于本申请提供了Fe65L2-2的全长cDNA序列，应用PCR技术扩增DNA／RNA的方法(Saiki，等人，科学1985；230：1350-1354)优先用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE：cDNA末端快速扩增法)，在上述PCR方面所用的引物根据本文所公开的本发明的序列信息可适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA／RNA片段。

如上所述得到的本发明的基因，或者各种DNA片段的核苷酸序列的测定可用常规方法如双脱氧链终止法(Sanger等人，美国国家科学院院报，1977，74：5463-5467)。这类核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒等。为了获得全长的cDNA序列，测序需反复进行。有时需要测定多个克隆的cDNA序列，以拼接成全长的cDNA序列。

本发明的多核苷酸序列的全部或部分也可通过本领域周知的化学方法合成(Caruthers，M．H．等人，(1980)Nucl．Acids Res．Symp．Ser．215-223；Horn，T．等人，(1980)Nucl．Acid Res．Symp．Ser． 225-232)。

本发明进一步涉及具有SEQ ID No．2所示推定氨基酸序列的多肽及其活性片段、类似物和衍生物。SEQ ID No．2所示推定氨基酸序列为含491个氨基酸残基的成熟多肽。

SEQ ID No．2所示多肽的“片段”、“衍生物”和“类似物”指能基本保留该多肽的生物学功能或活性的多肽。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然存在的多肽或合成的多肽，优选为重组多肽。SEQ ID No．2所示的多肽的片段、衍生物和类似物可以是：(ⅰ)一个或多个氨基酸残基被保守性或非保守性氨基酸残基所取代(优选是保守性氨基酸残基)的多肽，取代的氨基酸残基是或不是由遗传密码所编码的氨基酸。例如，可以通过氨基酸残基的插入、取代和／或删除，得到Fe65L2-2的沉默突变体或功能等同物。可基于氨基酸残基之间在极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和／或两亲性等方面的相似性进行保守性氨基酸取代，只要保留Fe65L2-20的活性；或(ⅱ)一个或多个氨基酸残基带有取代基团的多肽；或(ⅲ)成熟多肽与其它功能性化合物，如提高多肽半寿期的化合物(例如聚乙二醇)融合在一起的多肽；或(ⅳ)成熟多肽与其它氨基酸序列相融合的多肽，其中所述其它氨基酸序列包括诸如帮助纯化成熟蛋白的氨基酸序列或蛋白原序列等。这些帮助纯化的结构域包括但不限于：金属鳌合肽，如用于在固定化金属上纯化的组氨酸-色氨酸模块；用于在固定化免疫球蛋白上纯化的蛋白A结构域以及用于FLAGS延伸／亲和纯化系统的结构域(IMMUNEX公司，Seattle，Wash．)。特异于因子XA或肠激酶的断裂接头序列也可用于帮助目的蛋白质的纯化(Porath，J．等人(1992)，Prot．Exp．Purif．3：263-281)。从这些公开内容看，这样的片段、衍生物和类似物的应处于本领域技术人员的知识范围内。

本发明的多肽包括SEQ ID No．2所示的多肽，即成熟多肽，也包括与SEQ ID No．2多肽至少有70％相似性(优选是70％相同性)的多肽，优选至少有90％相似性(优选是90％的相同性)的多肽，更优选至少有95％相似性(优选是95％相同性)的多肽，也包括这些多肽的一些部分，通常这些多肽部分至少含有30个氨基酸、优选至少50个氨基酸。

本发明的多肽、其保守性变体和生物活性片段及衍生物可以用常规的肽合成的方法制备，例如固相肽合成(Merrifield J．(1963)，美国化学学会杂志(J．Am．Chem．Soc．)85：2149-2154；Roberge，J．Y．等人，(1995)科学，269：202-204)。蛋白质合成可以手工完成，也可利用肽自动合成仪如Applied Biosystems 431A肽合成仪进行(PerkinElmer)。本发明多肽也可以从天然生物材料中经分离纯化得到，但优选利用本发明提供的多核苷酸用重组DNA技术制备。根据重组生产方法中所用的宿主不同，本发明中的多肽可能被糖基化或不被糖基化。该多肽也可能具有起始的甲硫氨酸残基。

根据常规的重组DNA技术，利用本发明的多核苷酸序列可表达或制备重组的Fe65L2-2多肽(科学，1984；224：1431)。本发明因而涉及制备本发明Fe65L2-2多肽的方法，一般包括以下步骤：

(1)．用本发明编码Fe65L2-2的多核苷酸(或变体)或含有该多核苷酸的重组表达载体转化合适的宿主细胞；

(2)．在合适的培养基中及适当的培养条件下培养宿主细胞；

(3)．从培养基或细胞中分离、纯化目的蛋白质。

本发明也涉及包含本发明多核苷酸的重组载体、带有本发明重组载体的遗传工程化宿主细胞和通过重组技术制备本发明多肽的方法。

本发明的多核苷酸可以用来经重组技术产生多肽。例如，该多核苷酸可以存在于选自多种用于表达多肽的表达载体中的任一载体上，这些载体包括染色体的、非染色体的及合成的DNA序列，例如，SV40的衍生物、细菌质粒、噬菌体DNA、酵母质粒、衍生于质粒和噬菌体DNA结合的载体、病毒DNA、杆状病毒、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒及伪狂犬病毒，包括但不限于pQE系列(Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pBluescript SK、pBSKS、pNH系列(Stratagene)、pTRC99a、pKK223-3、pDR540、pRIT5 (Pharmacia)；pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。不过，只要是能在宿主中复制和存活，其它质粒或载体也可应用。

本发明也包括含有本发明多核苷酸的重组构建体。该构建体包括载体，如上述质粒或病毒载体，其中可正向或反向插入本发明的多核苷酸序列。构建体中还包含调节序列，例如，有效地连接到本发明多核苷酸序列上的启动子(包括组成型和诱导型启动子)，介导下游结构序列的转录。合适的启动子包括但不限于，λ噬菌体的PL启动子、杆状病毒多角体蛋白启动子；细菌启动子如；LacI、LacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL和trp；真核启动子如：CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、逆转录病毒的LTR和小鼠金属硫蛋白I启动子；还包括衍生自植物细胞基因组中的启动子，如热休克蛋白、RUBISCO启动子。

表达载体也包含翻译起始所需要的核糖体结合位点和转录终止子，其还可以具有增强表达的合适序列，如增强子。增强子是DNA的顺式作用因子，通常有大约10-300bp，作用于启动子，提高它的转录。例如，SV40中位于复制起点后侧100-270bp处的增强子，巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复制起点后侧的多形瘤增强子及腺病毒增强子。此外，表达载体优选还包含能提供表型特征的一种或多种选择性基因、抗性基因和／或标记基因，以便于转化宿主细胞的筛选。选择性基因如帮助细胞利用吲哚或组氨醇的trpB、hisD(Hartman，S．C．，和R．C．Mulligan(1988)美国国家科学院院报85：8047-51)，用于tk-或aprt-细胞的肝疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(Wigler，M．等人(1977)细胞11：223-32)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy，I．等人(1980)细胞22：817-23)；抗性基因如赋予氨甲蝶呤抗性的二氢叶酸还原酶DHFR(Wigler，M．等人(1989)，美国国家科学院院报，77：3567-70)或赋予新霉素和G-418抗性的npt(Colbere-Garapin，F．等人(1981)生物化学杂志(J．Mol．Biol．)，150：1-14)，以及四环素或氨苄青霉素抗性基因。哺乳类表达载体一般包括复制起点、适当的启动子、增强子及任何必需的核糖体结合位点、多腺苷化位点、拼接供体和受体位点、转录终止序列和5’侧翼非转录序列。衍生于SV40拼接序列的DNA序列和多腺苷化位点可用于提供所需要的非转录遗传元件。此外，包含编码本发明多肽的核苷酸序列的载体还可包含同源或异源的特定信号肽序列，以帮助目的蛋白质分泌到原核细胞或真核细胞膜外。本领域普通技术人员知晓，上述表达载体及构建体中含有的标记序列和信号肽序列也可通过重组方法或化学法添加在编码本发明多肽的多核苷酸上。

合适载体和启动子的选择为本领域普通技术人员周知。细菌适用的有效表达载体可以这样来构建：将编码目的蛋白的结构DNA序列随同适当的翻译起始和终止信号被插入到带有一个功能启动子的可操纵的阅读框中。本领域普通技术人员周知用于构建含有本发明核苷酸序列以及合适的转录及翻译调控元件的方法。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术以及体内遗传重组技术(Sambrook，J．(1989)，分子克隆实验室手册，Cold Spring Harbor Press；Plainview，N．Y．；Ausubel，F．M．(1989)当代分子生物学方法(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley & Sons，N．Y．)。

包含上述合适的DNA序列、合适的启动子或控制序列的载体可以用于转化合适的宿主，让宿主表达该蛋白。

本领域技术人员知晓，根据本发明DNA序列所插入的表达载体或构建体的种类和特性选择合适的宿主以表达目的蛋白质。适于表达本发明的多肽的宿主包括但不限于：原核宿主，诸如大肠杆菌、芽孢杆菌属、链霉菌属等；真核宿主，诸如：酵母属、曲霉属、昆虫细胞，诸如果蝇S2和草地夜蛾Sf9；动物细胞，如CHO、COS(猴肾成纤维细胞系，Gluzman(细胞23：175，1981)及其它的能表达相容载体的细胞系，例如C127、3T3、CHO、HeLa、BHK、Bowes黑素瘤细胞；植物细胞以及腺病毒等等。各种哺乳动物细胞的培养系统也能用于表达重组蛋白。从这些讲授看，合适宿主的选择应该在本领域技术人员的知识范围内。

带有如上所述的含有本发明核苷酸序列之载体或构建体能够通过传统的方法导入合适的宿主细胞中以产生重组产物。将构建体导入上述宿主细胞的方法为本领域技术人员周知，包括但不限于：氯化钙介导的转化、磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、电穿孔、显微注射、粒子轰击法或基因枪方法(Sambrook，J．(1989)，分子克隆实验室手册，Cold Spring Harbor Press；Plainview，N．Y．；Ausubel，F．M．(1989)当代分子生物学方法，John Wiley & Sons，N．Y．；Hobbs，S．等人，McGraw Hill Yearbook of Science and Technology(1992)，McGraw Hill，N．Y．191-196；Engelhard，E．K．等人，美国国家科学院院报，91：3224-3227；Logan，J．等人，美国国家科学院院报，81：3655-3659)。

在适当的培养条件与培养基中培养经转化的宿主菌株或细胞，使其生长到恰当的细胞密度之后，用适当的方法(例如温度转变或化学药品诱导)诱导所选择的启动子，并将细胞再培养一段时间。针对不同的宿主菌株或细胞选择以及所表达的目的蛋白质的性质相应的培养条件和培养基在本领域技术人员知识范围之内。

在合适的启动子控制下可以在哺乳类细胞、酵母、细菌或其它细胞中表达成熟蛋白。利用由本发明的DNA构建体衍生的RNA，也可以用无细胞翻译体系产生这种蛋白质(Sambrook，J．(1989)，分子克隆实验室手册，第18章第4节，Cold Spring Harbor Press；Plainview，N．Y．)。

通常用离心的方法收获细胞或培养液。对于目的蛋白质保留在胞内的情况，一般可用任何便捷的物理、化学方法或酶法，包括冻融循环、超声波、机械破碎，或使用细胞溶解剂或特定的酶破碎细胞，将所得粗提物保留以进一步纯化。对于对于目的蛋白质分泌到胞外的情况，可直接从培养上清液中利用常规方法回收目的蛋白质。这些方法都是本领域的技术人员熟知的。

将多肽从重组细胞培养物中回收和纯化的方法有硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、体积排阻层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和植物凝集素层析。形成成熟蛋白的完整构象还需要蛋白质的重折叠步骤。通常高效液相层析(HPLC)或毛细管电泳可应用于最后的纯化步骤。

本发明中的多核苷酸和多肽可用作研究试剂和材料，以发现由于淀粉样沉淀的产生引起的神经退行性疾病的诊断、治疗和／或预防方法。这种多核苷酸和其编码的多肽也可用于体外的相关科学研究，以筛选调节本发明的多肽与APP相互作用的蛋白质或化合物分子，还用于设计治疗、诊断和／或预防由于淀粉样沉淀的产生引起的神经退行性疾病的方法。

本发明涉及利用本发明全长Fe65L2-2基因的片段作为cDNA文库的杂交探针，从而分离出全长基因和与之有高度序列相似性或相似生物学活性的其它基因。这种类型的探针一般至少有20个碱基。但是，这些探针优选至少有30个碱基并且一般不超过50个碱基，尽管它们可以具有更多的碱基。该探针也可以用于鉴定相应于全长转录物的cDNA克隆或具有完整基因，包括调节和启动子区域、外显子及内含子的基因组克隆。筛选的一种方法是，利用已知的DNA序列合成一个寡核苷酸探针，用它去分离出基因的编码区域。与本发明的多核苷酸序列互补的经标记的寡核苷酸可用于筛选人类cDNA文库、基因组文库、mRNA文库，以确定文库中哪些成员与探针杂交。

本发明还涉及利用Fe65L2-2基因产物检测与Fe65L2-2的多核苷酸序列突变相关的疾病或对疾病的易感性的诊断方法。这些疾病与本发明的Fe65L2-2基因的mRNA及编码的蛋白质表达过量或活性升高有关，例如阿尔茨海默症和痴呆。

可以用各种技术在DNA的水平上检测出Fe65L2-2基因突变的个体。用于诊断的核酸可以从病人的细胞中获得，例如血液、尿液、唾液、活组织检查和尸体解剖材料。基因组DNA可以直接用于检测，也可以在检测分析前用PCR进行酶法扩增(Saiki等人，自然324：163-166，1986)。RNA或cDNA也可用于同样目的。例如，与编码Fe65L2-2基因的核酸互补的PCR引物可用来鉴定和分析Fe65L2-2基因的突变。例如，从扩增产物的大小与正常基因型相比发生的变化中可以检出缺失和／或插入突变。将扩增的DNA与放射性标记的Fe65L2-2 RNA杂交可检测点突变，或者使用放射性标记Fe65L2-2反义DNA序列来进行杂交。用RNA酶A消化或从解链温度的不同或改变可以区分完全配对的序列与错配的双螺旋。

通过检测DNA片段在含有或不含有变性剂的凝胶中电泳迁移率的变化，可以进行基于DNA序列差异的遗传学测试。小序列的缺失和插入可以从高分辨率的凝胶电泳中看出。例如，不同大小的DNA片段可以在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)中区别出来。含有点突变的DNA序列与正常的DNA序列分别变性后在不含变性剂的聚丙烯酰胺凝胶中可因构象的不同(泳动速度不同)而区别开来。

核酸酶保护实验可以揭示特定位置的序列变化，比如RNA酶和S1酶保护法或者化学断裂法(Cotton等人，美国国家科学院院报85：4397-4401，1985)。

总之，特异DNA序列可以用下述方法检测：杂交、RNA酶保护、化学断裂、直接DNA测序或使用限制性内切酶(例如，限制片段长度的多态性RFLP)及基因组DNA的Southern印迹技术。

除了较传统的凝胶电泳和DNA测序方法外，突变还可用原位分析检测出来。

本发明也涉及用于检测各种组织中Fe65L2-2基因的mRNA表达异常的诊断方法。mRNA水平的变化可用逆转录PCR(RT-PCR)、Northern印迹、点杂交或RNA原位杂交等方法进行检测。这些方法对于本领域的技术人员来说是周知的。

本发明还涉及用于检测各种组织中Fe65L2-2基因蛋白水平改变的诊断方法，与正常对照组织样品相比，Fe65L2-2蛋白的增加可提示疾病或疾病易感性的存在(如阿尔茨海默症)。测定宿主样品中Fe65L2-2基因蛋白水平的方法是本领域技术人员熟知的，包括放射性免疫测定法、竞争性结合测定法、Western印迹分析、酶联免疫吸附法和夹心测定法。酶联免疫吸附法(ELISA)(Coligan等人，现代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)卷1，No．2，第6章，1991)要预先准备针对Fe65L2-2抗原的特异性抗体，优选是单克隆抗体。另外，还要准备抗单克隆抗体的报告抗体。报告抗体上连有一个可检测的试剂，诸如放射性同位素、荧光或辣根过氧化物酶等标记。例如，从宿主取得样品并在一个固相载体上温育，例如聚苯乙烯反应板，它能吸附样品中的蛋白。然后用一种非特异性蛋白如牛血清白蛋白(BSA)温育，覆盖板上任何游离的蛋白结合位点。第二步，加入单克隆抗体在板中温育，这时，单克隆抗体与附着在聚苯乙烯反应板上的Fe65L2-2基因蛋白结合。所有未结合上的单克隆抗体用缓冲液洗去。与辣根过氧化物酶相连的报告抗体此时加入板中，结果报告抗体就与结合在Fe65L2-2抗原上的单克隆抗体相结合。未结合上的报告抗体也被洗掉。然后加入过氧化物酶的底物，在一定的时间内所形成的颜色的深浅与标准曲线作比较，就能测出一定体积的病人样品中Fe65L2-2基因蛋白的含量。

竞争测定法也可用于这项检测。将Fe65L2-2抗原的特异性抗体连到一个固相载体上，然后让标记的Fe65L2-2和从宿主获得的样品一起通过固相载体并检测标记物的数量，例如用液相闪烁计数器。标记物的数量与样品中的Fe65L2-2的数量相关。夹心测定法类似于酶联免疫吸附法，包括双抗原夹心法和双抗体夹心法。在双抗体夹心测定法中，Fe65L2-2通过固体载体，与吸附在固相载体上的抗体结合。第二种抗体又结合到Fe65L2-2上。第三种抗体是被标记的并对第二种抗体有特异性，当它通过固相载体时就结合到第二种抗体上，然后检测它的数量。

本发明还涉及一种筛选可调节Fe65L2-2蛋白质与APP胞内结构域相互作用的分子，特别是两者之间相互作用的拮抗剂及抑制剂的方法，包括使用本发明的多肽或其片段筛选多肽库或药物候选物文库，用于寻找能降低、抑制Fe65L2-2蛋白含量或其与APP相互作用的活性的分子。Fe65L2-2与APP相互作用的结构域已有描述(生物化学杂志(J．Biol．Chem．)，1997，272(10)，6399-6405)。Fe65L2-2的两个串联的磷酸酪氨酸相互作用／磷酸酪氨酸结合结构域(PID／PTB)可与APP胞内区域相互作用。本发明多肽的拮抗剂以及抑制剂的筛选根据相互作用的测定以及待测候选药物的功效通过本领域普通技术人员周知的方法进行，如表面胞质基因组共振(surfaceplasmon resonance)、能量转移法、共沉淀法、酵母相互作用阱法或重叠杂交法等。本发明也提供了筛选药物以鉴定阻遏(拮抗剂)或抑制Fe65L2-2与APP胞内结构域相互作用的药物的方法。拮抗剂阻止和治疗由于淀粉样沉淀的形成引起的神经退行性疾病，包括但不限于阿尔茨海默症和痴呆。例如，可将同时表达Fe65L2-2和APP蛋白的哺乳动物细胞在候选药物的存在下进行培养，经过一段时间通过本领域普通技术人员周知的方法对Fe65L2-2和APP蛋白相互作用形成的复合物进行标记，然后与不存在候选药物时所形成的标记复合物的量加以比较。从而判断待测药物是否为Fe65L2-2和APP蛋白相互作用的拮抗剂或抑制剂。Fe65L2-2蛋白的拮抗剂可以与人Fe65L2-2蛋白结合并消除其与APP蛋白的相互作用功能，或是抑制人Fe65L2-2蛋白的产生，或是与多肽的活性位点结合使多肽不能发挥生物学功能。在筛选化合物作为拮抗剂时，可以将此种新的人Fe65L2-2蛋白加入生物分析测定中，通过测定此种新的人Fe65L2-2蛋白与APP蛋白之间的相互作用来确定化合物是否是拮抗剂。以上述筛选化合物的同样方法，可以筛选出起抑制物作用的分子。这些通过本发明方法获得的Fe65L2-2或其片段的拮抗剂及抑制剂可如上所述配制成药物组合物用于上述疾病的治疗。

本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(Microarray)或DNA芯片(又称为基因芯片)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。

作为Fe65家族蛋白一员的本发明Fe65L2-2蛋白，其含量增加或活性升高可能与由于淀粉样沉淀引起的神经退行性疾病有关。因此，给予受试者治疗有效剂量的Fe65L2-2拮抗剂或活性抑制剂，可治疗、缓解和／或预防由于淀粉样沉淀引起的神经退行性疾病如阿尔茨海默症和痴呆。

Fe65L2-2多肽及其具有生物活性的片段、类似物和衍生物可以与药学可接受载体一起在组合物中使用，这样的组合物中包括有效治疗剂量的多肽和药学可接受的载体或赋形剂。这样的载体有-但并不限制于-盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇及其组合。配制品应该适合给药方式。

本发明的药物组合物还包括利用本发明的多肽制备的疫苗，其包括本发明的多肽或其具有生物学活性或免疫学活性的片段，其中任选地还含有弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂以及其它药学可接受的载体。

本发明也提供了一种药物包装或试剂盒，包括一个或多个装有一种或多种本发明的药物组合物的成分的容器。另外，这些多肽及其具有生物活性的片段、类似物和衍生物也可与其它的治疗化合物组合使用。

这些药物组合物可用一种方便的方式给药，诸如表皮、静脉内、腹膜内、肌肉内、肿瘤内、皮下、鼻内或真皮内途径。这些药物组合物以治疗和／或预防具体适应症的有效剂量使用。

本发明的Fe65L2-2多核苷酸序列的公开为设计通过反义技术抑制Fe65L2-2基因的表达奠定了基础，从而达到治疗、缓解和／或预防与本发明多肽的含量增加或活性升高的疾病的目的。

利用反义技术是指根据本发明Fe65L2-2基因的编码区、控制或调节区依照碱基配对原理设计相应的反义分子(DNA、RNA、或肽核酸(PNA))。最近，文献中还报道了利用三螺旋DNA在治疗中的应用(Gee，J．E．等人，(1994)Huber，B．E．和B．I．Carr，分子与免疫方法(Molecular and Immunologic Approaches)，Futura PublishingCo．，Mt．Kisco，N．Y．，163-177页)。互补序列或反义分子也可通过防止转录本与核糖体的结合以阻止mRNA的翻译。

其中，“肽核酸”是指一种反义分子或反基因物，其包含与以赖氨酸结尾的氨基酸残基之肽骨架连接的寡核苷酸，寡核苷酸的长度至少为5个核苷酸。末端的赖氨酸赋予对组合物的溶解性。肽核酸优先结合互补性单链DNA或RNA，终止转录的延伸，也可延长其在细胞中的半寿期(Nielsen，P．E．等人，(1993)抗癌症药物研究(AnticancerDrug Res．)，8：53-63)。

将根据本发明多核苷酸设计的反义分子用于基因治疗方法例如包括，将病人的细胞在离体情况下通过特定载体导入治疗有效剂量的Fe65L2-2多核苷酸反义分子，再将处理的细胞供给待治疗的病人。导入这些以及其它的反义分子的方式对于本领域技术人员是很清楚的。例如除了逆转录病毒外，还有别的载体，例如腺病毒，把它与一个合适的运输载体结合后可在体内工程化细胞。

可以衍生出上述逆转录病毒质粒载体的逆转录病毒包括但不限于Moloney鼠白血病病毒、脾坏死病毒、劳斯氏肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽白血病病毒、长臂猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和哺乳动物肿瘤病毒。

上述载体中可包含一个或多个启动子。可使用的合适启动子包括但不限于逆转录病毒的LTR、SV40启动子、人巨细胞病毒(CMV)启动子(Miller：生物技术(Biotechniques)，卷7，No．9，980-990页，1989)或其它启动子(例如，真核细胞启动子包括但不限制于组蛋白、polⅢ、β-肌动蛋白启动子)。其它可用的病毒启动子包括但不限于腺病毒启动子、胸苷激酶(TK)启动子和B19细小病毒启动子。从这里的讲授，合适启动子的选择在本领域技术人员知识范围之内。

编码本发明多肽的多核苷酸序列应在合适启动子的控制之下。合适的启动子包括但不限于，腺病毒的启动子，比如腺病毒主要晚期启动子；或异源启动子，比如巨细胞病毒(CMV)启动子；呼吸道合胞体病毒(RSV)启动子；可诱导的启动子，比如MMT启动子、金属硫蛋白启动子；热休克启动子；白蛋白启动子；ApoAI启动子；人珠蛋白启动子；病毒胸苷激酶启动子，比如单纯性疱疹胸苷激酶启动子；逆转录病毒的LTR(包括上面所描述的修饰的逆转录病毒的LTR)；β-肌动蛋白启动子；及人生长激素启动子。也可以是控制编码该多肽的基因的自身启动子。

用逆转录病毒质粒载体转导包装细胞系而形成生产细胞系。用于转染的包装细胞包括，但不限制于，PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、ψCRE、ψCRIP、GP+E-86、GP+envAM12和DNA细胞系，如Miller所描述(人类基因治疗(HumanGene Therapy)卷1，5-14页，1990)，此处全文引入作为参考。可用本领域的已知方法用载体转导包装细胞系。这些方法包括但不限于，电穿孔、使用脂质体和磷酸钙沉淀。一种可选择的方法是将逆转录质粒载体包裹进脂质体中或与脂类偶联，然后注入宿主中。

生产细胞系产生具感染性的逆转录病毒颗粒，此病毒颗粒中包含编码这些多肽的核酸序列。这样的逆转录病毒载体颗粒可用于体外或体内转染真核细胞。被转染的真核细胞将表达编码多肽的核酸序列。可用于转染的真核细胞包括但不限于，胚胎干细胞、胚胎癌细胞、造血干细胞、肝细胞、成纤维细胞、成肌细胞、角质细胞、内皮细胞和支气管上皮细胞。

利用本发明的多肽及其免疫原性片段、衍生物或类似物或表达它们的细胞可用作免疫原以产生其抗体。这些抗体可以是多克隆或单克隆抗体。本发明也包含了嵌和的、单链的和人源化的抗体以及Fab片段、或Fab表达文库的产物。本领域已知的各种方法可用于这样的抗体和片段的产生。

所产生的针对本发明多肽的抗体可通过直接将本发明的多肽或其免疫原性片段注射给动物或将其导入动物(最好不是人)而获得。所得到的抗体可与多肽本身结合。用这种方法，甚至用只编码本发明多肽的片段序列也能获得结合整个天然多肽的抗体。然后，抗体可用于检测或筛选可调节本发明多肽与APP蛋白相互作用的检测方法中。

制备单克隆抗体可以用连续细胞系培养产生抗体的技术。例如，用杂交瘤技术(Kohle & Milstein：自然256：495-497，1975)、Trioma技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等人，今日免疫学(Immunology Today)4：72，1983)和EBV-杂交瘤技术产生人的单克隆抗体(Cole等人，单克隆抗体与癌症治疗(MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy)，Alan R．Liss，Inc．，77-96页，1985)。

单链抗体产生技术(美国专利4，946，778)适用于产生本发明的免疫原性多肽产物的单链抗体。转基因动物也可用来表达本发明的免疫原性多肽产物的人源化抗体。

实施例

本发明将在下面的实施例中进一步描述。但是本发明并不局限于这些实施例。所有的份和量，除非另有说明都按重量计。

DNA的“消化”指用限制酶对DNA进行催化性切割，限制酶只作用于DNA序列的特定位点。这里所用的各种限制酶可从商业获得，它们的反应条件、辅助因子和其它的要求按照一般技术人员所知的应用。为了分析需要，通常在大约20μl的缓冲溶液中加入1μg质粒或DNA片段和大约2个单位的酶。为了分离DNA片段用于质粒构建，通常在一个较大的的体积中用20到250个单位的酶消化5到50μg的DNA。生产厂家会指明对特异限制酶合适的缓冲液和底物的量。通常所用的温育时间大约是37℃一个小时，但根据厂家的指示可以有所改变。限制性消化之后直接在聚丙烯酰胺胶上进行电泳，分离出想要的片段。

根据所切割成的片段大小进行分离可用8％的聚丙烯酰胺凝胶(Goedde等人，Nucleic Acids Research 8：4057，1980)。

“连接”指在两个双链核酸片段间形成磷酸二酯键的过程。除非提供了别的方法，连接可以在已知的缓冲液和条件下进行，即每0．5mg约等摩尔量的用于连接的DNA片段加10个单位的T4 DNA连接酶(“连接酶”)。

除非另有说明，转化均用Graham & Van der Eb：病毒学(Virology)52：456-457，1973中所描述的方法进行。实施例1：Fe65L2-2基因的重组表达及鉴定

把PBS-SK质粒中装有的Fe65L2-2基因用PCR(引物两端酶切位点分别为EcoR I和BamH I，SEQ．ID．No：1)方法扩增出来，再连接到pBV220表达载体并转化到DH5α宿主菌中。通过测定在LB板上的生长能力，鉴定转化体，并筛选出氨苄青霉素抗性菌落。质粒DNA通过限制性分析分离和确定，将含有所需构建物的克隆在补充有Amp(100μl／ml)的LB介质液体培养基中生长过夜。用过夜培养物以1∶100-1∶250的比率来接种大量的培养物，将细胞生长到光密度600(O．D．600)为0．4到0．6之间。42℃诱导表达3小时，12％SDS-PAGE胶鉴定表达产物。结果在分子量为58kD附近，出现了一条新的主条带。分子量大小与我们预期的Fe65L2-2的分子量吻合，经数次重复之后得到同样结果，将SDS-PAGE胶上的蛋白条带通过电转移转至PVDF膜上，切下膜的蛋白的相应条带，测定N端15个氨基酸序列，得到结果与通过DNA序列推导出的氨基酸顺序是一致的。由此判断Fe65L2-2基因用pBV220载体成功表达。实施例2：原核表达的Fe65L2-2蛋白的初步纯化

用前述方法大量发酵含有Fe65L2-2基因的基因工程菌，收集菌体后用超声波破菌20分钟，然后取上清和沉淀分别走SDS-PAGE胶，结果表达的蛋白条带主要出现在沉淀中。这表明表达的Fe65L2-2蛋白主要以包涵体形式存在。然后将沉淀用4M的尿素溶液洗涤4次，再用8M尿素溶液溶解剩余沉淀。将溶解液走SDS-PAGE，可发现经洗涤后已去除大多杂蛋白条带。将目的蛋白在SDS-PAGE角上相应的条带切下，置于透析袋之中，袋中在灌满电泳缓冲液。然后把透析袋放于电转印槽中用90V电洗涤6小时，将胶上蓝色条带洗脱至缓冲液中。收集透析袋中溶液，SDS-PAGE检测发现已得到单一条带的蛋白。实施例3：Fe65L2-2蛋白多克隆抗体制备：

经前述方法初步纯化的Fe65L2-2蛋白，先冷冻抽干浓缩至100mg／ml。取1mg的蛋白溶液，先用生理盐水稀释至1ml，再加入1ml完全弗氏佐剂，反复混匀制成白色乳浊状态。将混好的抗原皮下多点注射，免疫健康的新西兰大白兔。16天之后，取0．5mg的抗原溶液，加生理盐水稀释至0．5ml，再加入0．5ml弗氏不完全佐剂，进行第二次免疫。然后在间隔两周后，按第二次免疫的剂量进行第三次免疫。一周后取血，得到抗血清。经琼脂扩散实验测定效价，证明已得到了Fe65L2-2蛋白的多克隆抗体。实施例4：酵母双杂交实验

采用Clontech公司的lex A酵母双杂交系统，选用EcoR I和BamH I两个酶切位点，把Fe65L2-2cDNA克隆到含有DNA结合结构域的plex A载体上，同时根据APP基因C端序列设计引物从cDNA文库中PCR得到编码APP蛋白胞内区的序列。(两端加上酶切位点(EcoR I和Xho I)，将此序列克隆到含有活性结构域的pB42AD载体上。测序验证两个重组子序列正确之后，共转化酵母菌EGY48[p80P-lac Z]。用含X-gal的相应营养缺陷型的培养基筛选和鉴定。如果APP蛋白能与Fe65L2-2蛋白相结合，则能筛选到蓝色菌落；否则则不能。但同时也要把作为阴性对照和阳性对照的质粒分别转化到EGY48[p80P-lacZ]，用同样的培养基进行筛选和鉴定，如果出现相应的阴性或阳性结果，才可以确定前面的蛋白结合与否的结果并非假象。还可以采用ONPG来定量检测两种蛋白相互作用的强弱。

同时可将比Fe65L2-2cDNA编码区缺少21bp的那种剪接形式的Fe65L2cDNA也克隆到plex A载体上，定量检测它与APP蛋白结合的强弱，并与前面Fe65L2-2与APP结合强弱的结果相对比。以此就可知道21bp的剪接差异对Fe65L2蛋白与APP的结合究竟有何种影响了。

另一方案是将Fe65L2-2基因的PID1克隆到plex A载体(BD)中，与构建好的融合有AD的cDNA文库共转化EGY48酵母，用含X-gal的营养缺陷型培养基筛选鉴定，并作假阳性检测。这样可以筛选到与该基因PID1相互结合的蛋白。这将有助于进一步明确PID1在信号传导过程中的作用，及Fe65L2-2蛋白所多出的7个氨基酸对PID1功能的影响。

序列表

(1)一般信息：

  (ⅰ)申请人：

    (A)姓名：上海博容基因技术有限公司

    (B)街道：中山北路1111号3号楼12层

    (C)城市：上海

    (E)国家：中国

    (F)邮政编码：200092

  (ⅲ)序列数：2

(2)SEQ ID NO：1的信息：

  (ⅰ)序列特征：

    (A)长度：1809个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑类型：线性

  (ⅱ)分子类型：cDNA

  (ⅸ)特性：

    (A)名称／关键词：CDS

    (B)位置：21．．1493

  (ⅹⅰ)SEQ ID NO：1的序列描述：

  1  catatggagc agccggggtt atgctgggca aggattacat gctggccatc

 51  attctggtca actgcgatga tgacttgtgg ggggaccaca gtctggaggt

101  ggaggctggc ctgcctcctg gctggaggaa gatccacgat gctgcaggta

151  cttactactg gcatgtaccc agcggtagca cccagtggca gcgcccaacc

201  tgggaactag gagatgcaga ggacccaggc acgggaacgg aggggatctg

251  gggactgcgg ccccccaaag ggagatcctt ctccagcctg gagagttcac

301  tggaccggag taactctctg tcctggtatg gtggggaatc ctacatccag

351  agcatggagc caggggctaa gtgctttgca gtccgctctc tgggctgggt

401  agaggtacct gaagaggacc tggcaccggg gaagagcagt attgcagtca

451  ataactgtat ccagcagctg gcccagaccc gcagccggag ccagcctcca

501  gatggtgcct ggggtgaggg ccagaacatg ctgatgatcc tgaagaagga

551  tgccatgagc ctagtgaatc ccctggacca cagtctgatc cactgccagc

601  ctctggtgca catccgtgtg tggggcgtgg ggagctccaa gggccgcccc

 651  atctctgcccc tgctagggac ttcgcttttg tggcaagtga caaagatag

 701  ctgtatgctca agtgccatgt gtttcgctgt gatgtccctg ccaaggcca

 751  ttgccagtgcc ctacatgggc tttgtgccca gatcttgtca gagcgagta

 801  gaggtcagtgg tgatgcctct tgctgctccc cagaccccat ctctcctga

 851  agacctgccac ggcaagtgga gctgctagat gcggtaagcc aagctgctc

 901  agaagtacgag gcactgtata tggggacact gccagtcacc aaggccatg

 951  ggcatggatgt gctgaacgag gccattggta ccctcactgc cagggggga

1001  ccggaatgcct gggtccccac catgctcagt gtgtctgact ctctcatga

1051  ctgcacatccc attcaggcag aggccagtac agaggaggag ccattgtgg

1101  cagtgccctgt gcgccttgtg acatttattg gtgttggccg cgacccaca

1151  cacctttggcc tcatcgctga cctgggccgt cagagcttcc agtgcgcag

1201  ccttctggtgc cagccccatg cagggggact ctctgaagct gtgcaggct

1251  gcctgtatggt tcagtaccag aagtgtcttg tggcctctgc agctcgagg

1301  caaggcctggg gtgcccaggc ccgtgcccgc ctgcggctca agcggacca

1351  gctccatggat tccccaggag gtcccctgcc cctccccctg ctcaaagga

1401  ggggttggcgg tgcaggggca acccctcgaa agcggggtgt cttctcttt

1451  tcttgatgcct tccggctgaa accctctctg ctccatatgc cctaaactt

1501  atctgggaagg ctggggaagt aggctctggg tccatgccta actctgtac

1551  cgttttattcc tcaaggccta tagcctgtca ctccttgaag ccttctctg

1601  cctgtccctcc gatccttgtc caccgtctat ttattgccca atttattgt

1651  ttatacggatg actgggaggc actgcgccac aacgtaggac cctggctcc

1701  cctttccttgg gtccttgtgt tccttgcccc tgtccaaccc tggacagtt

1751  ggctctacctc agtaacactt tatagcaaaa tcagtgcaaa taaaaatcc

1801  ctcagtgac

(2)SEQ ID NO：2的信息：

  (ⅰ)序列特征：

    (A)长度：491个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓扑类型：线性

  (ⅱ)分子类型：蛋白质

  (ⅹⅰ)SEQ ID NO：2的序列描述：

 1  MLGKDYMLAI  ILVNCDDDLW  GDHSLEVEAG  LPPGWRKIHD  AAGTYYWHVP

 51 SGSTQWQRPT  WELGDAEDPG  TGTEGIWGLR  PPKGRSFSSL  ESSLDRSNSL

101 SWYGGESYIQ  SMEPGAKCFA  VRSLGWVEVP  EEDLAPGKSS  IAVNNCIQQL

151 AQTRSRSQPP  DGAWGEGQNM  LMILKKDAMS  LVNPLDHSLI  HCQPLVHIRV

201 WGVGSSKGRP  ISAPARDFAF  VASDKDSCML  KCHVFRCDVP  AKAIASALHG

251 LCAQILSERV  EVSGDASCCS  PDPISPEDLP  RQVELLDAVS  QAAQKYEALY

301 MGTLPVTKAM  GMDVLNEAIG  TLTARGDRNA  WVPTMLSVSD  SLMTAHPIQA

351 EASTEEEPLW  QCPVRLVTFI  GVGRDPHTFG  LIADLGRQSF  QCAAFWCQPH

401 AGGLSEAVQA  ACMVQYQKCL  VASAARGKAW  GAQARARLRL  KRTSSMDSPG

451 GPLPLPLLKG  GVGGAGATPR  KRGVFSFLDA  FRLKPSLLHM  P

Claims (20)

1．一种分离的多肽，它包含具有SEQ ID No．2氨基酸序列的多肽、或其保守性变体或其活性片段或衍生物。

2．如权利要求1所述的多肽，其包含具有SEQ ID No．2氨基酸序列的多肽或其氨基酸变异不超过5％且含有SEQ ID No．2中210-216位氨基酸序列的衍生物。

3．如权利要求2所述的多肽，其包含具有SEQ ID No．2氨基酸序列的多肽。

4．一种分离的多核苷酸，其包含一种选自下组的核苷酸序列：

(a)编码如权利要求1、2或3所述多肽的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸；和

(c)与(a)或(b)的多核苷酸序列具有至少89％相同性并且包含SEQ ID No．1中647-667位序列的多核苷酸。

5．如权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸包含编码具有SEQ ID No．2所示氨基酸序列的多肽。

6．如权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列包含SEQ ID No．1中21-1493位的序列，或者SEQ ID No．1中1-1809位的序列。

7．一种含有权利要求4、5或6所述多核苷酸的重组载体。

8．如权利要求7所述的载体，它是质粒、粘粒或病毒载体。

9．一种含有权利要求4、5或6所述多核苷酸或者含有权利要求7或8所述载体的宿主细胞。

10．一种Fe65L2-2蛋白的制备方法，该方法包括：

(a)在适合表达Fe65L2-2蛋白的条件下，培养权利要求9所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出具有Fe65L2-2蛋白活性的多肽或其片段。

11．一种能与权利要求1所述的Fe65L2-2蛋白特异性结合的抗体。

12．一种筛选拮抗或抑制Fe65L2-2的活性或其表达或其与相关蛋白相互作用的化合物的方法，其包括利用权利要求1的多肽或其活性片段。

13．一种拮抗或抑制Fe65L2-2活性或其表达或其与相关蛋白相互作用的化合物。

14．一种体外检测与权利要求1、2或3所述多肽异常表达相关的疾病或疾病的易感性的方法，其包括检测生物样品中所述多肽或其编码多核苷酸序列的突变。

15．根据权利要求12的方法，其中所述多核苷酸是DNA或mRNA。

16．一种体外检测与权利要求1、2或3所述多肽异常表达相关的疾病或疾病的易感性的方法，包括检测生物样品中所述多肽的含量或其生物活性。

17．如权利要求4、5或6所述多核苷酸或其片段作为引物用于核酸扩增反应、作为探针用于杂交反应或者用于制造基因芯片或微阵列的用途。

18．一种药物组合物，它含有权利要求1、2或3所述的多肽的抗体或其免疫活性片段、或者权利要求1、2或3所述多肽的拮抗剂或抑制物或以上各个组分的组合，其还含有药学上可接受的载体。

19．一种药物组合物，其含有针对如权利要求4所述多核苷酸的反义分子以及药学上可接受的递送载体。

20．权利要求18或权利要求19的药物组合物在治疗由本发明Fe65L2-2与APP相互作用所引起的神经退行性疾病中的用途。