CN1318451C - 硫酸酯化多糖及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种硫酸酯化多糖及其制备方法和其在体外具有抗艾滋病病毒活性上的应用。该多糖硫含量(重量)为1.01～16.60%，每个单糖单位的硫酸根取代度为0.05～1.78，重均分子量为3.9×103～10.6×104。该多糖可以为硫酸酯化枸杞多糖，硫酸酯化姬松茸多糖，硫酸酯化苦瓜多糖，硫酸酯化云芝多糖和硫酸酯化茶树菇多糖。其制备方法是将多糖溶解或悬浮在10～90倍重量比的溶剂中，加入与多糖残基的摩尔比为1∶2～30的氯磺酸吡啶混合物，于微波合成仪中进行酯化反应，微波功率为20～150W，反应温度为35～100℃，反应时间为3～30min。该方法所用时间短、溶剂用量较小、高温下降解较小。该硫酸酯化多糖在体外具有抗艾滋病病毒活性，具有广阔的应用前景。

Description

硫酸酯化多糖及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种硫酸酯化多糖及其制备方法和应用。
背景技术
目前，许多经硫酸酯化的多糖，如香菇多糖、地衣多糖、右旋糖酐、裂褶多糖、木聚糖等的硫酸酯具有明显的体外抑制艾滋病病毒(HIV-1)的作用。Yoshida等报导了不同硫含量和分子量的curdlan sulfate的抑制效果，当硫含量小于5.6％时，硫酸酯化产物无抑制HIV活性，而硫含量为12.1-147％的产物在浓度为3.3μg/mL时，即可抑制HIV活性(Yoshida T.等，Macromolecules，1990，23卷，第3712-3722页)。Wirvrouw M等报导了硫酸酯化多糖的抗病毒作用不仅与硫酸根含量相关，而且与分子量(Mr)也有很大的关系，如硫酸葡聚糖的抗HIV-1活性随分子量的增加而增加，在Mr＝10000时达到最大(Wirvrouw M等，Antiviral Chem Chemother，1994，5(6)，第345-359页)。而非硫酸酯化葡聚糖、木糖呋喃聚糖、核糖呋喃聚糖、凝胶聚果糖等，在硫酸酯化前无抗HIV活性的多糖，在硫酸酯化以后抑制HIV对细胞的感染，这说明硫酸基对于抗病毒活性起重要作用。
硫酸酯化反应是多糖中引入硫酸酯基的常用方法。目前常用的硫酸酯化多糖的方法主要有三氧化硫-吡啶法、浓硫酸法、氯磺酸-吡啶法、三氧化硫-二甲基甲酰胺法，其中氯磺酸-吡啶法是最常用的一种方法，这些硫酸酯化方法均是在常规条件下进行反应的，存在所需反应时间长、溶剂用量较大、高温下降解较剧烈的缺点。Jianhong Yang等报导的生漆多糖的硫酸酯化条件为162mg多糖悬浮于16.2mL二甲亚砜中，60℃或70℃下反应1-5小时，在较高温度下降解较剧烈(Jianhong Yang等，Biological Macromolecules，2002，31，第55-62页)。
发明内容
本发明的目的是提供一种硫酸酯化多糖以及提供一种所用时间短、溶剂用量较小、高温下降解较小的硫酸酯化多糖的制备方法和其在体外具有抗艾滋病病毒活性上的应用。
本发明提供的硫酸酯化多糖硫的重量百分含量为1.01～16.60％，每个单糖单位的硫酸根取代度DS为0.05～1.78，重均分子量Mw为3.9×103～10.6×104。
上述硫酸酯化多糖为硫酸酯化枸杞多糖，硫酸酯化姬松茸多糖，硫酸酯化苦瓜多糖，硫酸酯化云芝多糖和硫酸酯化茶树菇多糖。
本发明还提供了硫酸酯化多糖的制备方法：在冰盐浴中，将氯磺酸滴入1～10倍体积的吡啶中，得到氯磺酸吡啶混合物；称取一定量的多糖，将其溶解或悬浮在10～90倍重量比的溶剂中，接着加入与多糖残基的摩尔比为1∶2～30的上述氯磺酸吡啶混合物，于微波合成仪中进行酯化反应，微波功率为20～150W，反应温度为35～100℃，反应时间为3～30min；反应结束后，冷却，用1～4mol/L NaOH中和，透析，透析内液经冷冻干燥即得硫酸酯化多糖。
上述溶剂为二甲亚砜、二甲基甲酰胺、甲酰胺和吡啶中的任何一种。
上述方法中所用的透析袋截留分子量为3500Da。
本发明的硫酸酯化多糖在体外具有抗艾滋病病毒(HIV-1)活性。
硫酸酯化多糖分子参数的测试方法为：采用硫酸钡浊度法测定产物的硫的重量百分含量，并根据公式计算每个单糖单位的硫酸根取代度：DS＝(1.62×S％)/(32-1.02×S％)，采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定多糖的重均分子量Mw。
采用p24抗原检测的方法测定硫酸酯化多糖对HIV-1病毒的抑制作用。试验采用96孔板，将硫酸酯化多糖以RPMI-1640无血清培养液配制成2000μg/mL的溶液，并作4倍系列稀释，每孔100μL，每浓度设4个复孔，另设病毒对照、细胞毒对照和细胞对照孔。另配50万细胞(含1000 TCID50病毒液)，于上述96孔板加有药液的孔中，每孔加入100μL。37℃，5％CO2孵育1.5h，弃去游离的病毒，继续培养5天，其中在第3天换液。第5天取每孔上清，用p24试剂盒测定p24抗原量以表示硫酸酯化多糖对病毒的抑制作用。
具体实施方式
实施例1：在冰盐浴中，将2mL氯磺酸缓慢滴入到已预冷的4mL吡啶中制备氯磺酸吡啶混合物。然后，称取870.4mg枸杞多糖，溶解或悬浮于15mL N，N-二甲基甲酰胺中，加入上述氯磺酸吡啶混合物，微波功率为40W，50℃反应15min。反应结束后，冷却，加NaOH溶液中和，于蒸馏水中透析至透析液中无SO3 -存在，透析内液经冷冻干燥即得淡棕色固体粉末状硫酸酯化枸杞多糖。其分子参数及抗艾滋病病毒(HIV-1)的活性见表1。
实施例2：在冰盐浴中，将1mL氯磺酸缓慢滴入到已预冷的2mL吡啶中制备氯磺酸吡啶混合物。然后，称取867.1mg姬松茸多糖，溶解或悬浮于20mL二甲亚砜中，加入上述氯磺酸吡啶混合物，微波功率为45W，50℃反应10min。反应结束后，处理方法同实施例1，得棕色固体粉末状硫酸酯化姬松茸多糖。其分子参数及抗艾滋病病毒(HIV-1)的活性见表1。
实施例3：在冰盐浴中，将0.9mL氯磺酸缓慢滴入到已预冷的1.8mL吡啶中制备氯磺酸吡啶混合物。然后，称取802.7mg苦瓜多糖，溶解或悬浮于18mL二甲亚砜中，加入上述氯磺酸吡啶混合物，微波功率为45W，60℃反应8min。反应结束后，处理方法同实施例1，得红棕色固体粉末状硫酸酯化苦瓜多糖。其分子参数及抗艾滋病病毒(HIV-1)的活性见表1。
实施例4：在冰盐浴中，将0.8mL氯磺酸缓慢滴入到已预冷的1.6mL吡啶中制备氯磺酸吡啶混合物。然后，称取702.8mg云芝多糖，溶解或悬浮于16mL二甲亚砜中，加入上述氯磺酸吡啶混合物，微波功率为50W，70℃反应10min。反应结束后，处理方法同实施例1，得棕色固体粉末状硫酸酯化云芝多糖。其分子参数及抗艾滋病病毒(HIV-1)的活性见表1。
实施例5：在冰盐浴中，将0.8mL氯磺酸缓慢滴入到已预冷的1.6mL吡啶中制备氯磺酸吡啶混合物。然后，称取700.2mg茶树菇多糖，溶解或悬浮于15mL二甲亚砜中，加入上述氯磺酸吡啶混合物，微波功率为50W，70℃反应10min。反应结束后，处理方法同实施例1，得淡棕色固体粉末状硫酸酯化茶树菇多糖。其分子参数及抗艾滋病病毒(HIV-1)的活性见表1。
实施例6：在冰盐浴中，将1mL氯磺酸缓慢滴入到已预冷的2mL吡啶中制备氯磺酸吡啶混合物。然后，称取700.5mg茶树菇多糖，溶解或悬浮于15mL二甲亚砜中，加入上述氯磺酸吡啶混合物，微波功率为50W，70℃反应10min。反应结束后，处理方法同实施例1，得淡棕色固体粉末状硫酸酯化茶树菇多糖。其分子参数及抗艾滋病病毒(HIV-1)的活性见表1。
实施例7：在冰盐浴中，将1mL氯磺酸缓慢滴入到已预冷的2mL吡啶中制备氯磺酸吡啶混合物。然后，称取700.0mg枸杞多糖，溶解或悬浮于15mL二甲亚砜中，加入上述氯磺酸吡啶混合物，微波功率为40W，100℃反应6min。反应结束后，处理方法同实施例1，得淡棕色固体粉末状硫酸酯化枸杞多糖。其分子参数及抗艾滋病病毒(HIV-1)的活性见表1。
实施例8：在冰盐浴中，将1mL氯磺酸缓慢滴入到已预冷的2mL吡啶中制备氯磺酸吡啶混合物。然后，称取600.2mg枸杞多糖，溶解或悬浮于12.8mL甲酰胺中，加入上述氯磺酸吡啶混合物，微波功率为45W，70℃反应6min。反应结束后，处理方法同实施例1，得淡棕色固体粉末状硫酸酯化枸杞多糖。其分子参数及抗艾滋病病毒(HIV-1)的活性见表1。
表1硫酸酯化多糖的分子参数和对HIV-1感染MT4细胞的抑制作用
化合物  硫含量(重量％)  硫酸根取代度(DS)  重均分子量(×104)  剂量(μg/mL) 药毒  p24抗原抑制率(％)
实施例1 3.30 0.19 4.8  2000  +  -
 500  +  -
 125  -  94.57
实施例2 82.8 0.57 0.6  2000  -  963.1
 500  -  29.02
 125  -  -
实施例3 86.5 0.60 4.9  2000  -  68.67
 500  -  26.59
 125  -  -
实施例4 7.79 0.52 5.0  2000  +  -
 500  -  39.30
 125  -  -
实施例5 7.49 0.50 4.2  2000  -  98.77
 500  -  97.36
 125  -  78.25
实施例6 2.96 0.17 2.1  2000  -  94.38
 500  -  52.64
 125  -  24.38
实施例7 7.52 0.50 5.4  2000  -  84.69
 500  -  70.32
 125  -  36.56
实施例8 12.04 0.99 7.3  2000  +  -
 500  -  57.06
 125  -  20.03
注：表1中药毒“+”表示有毒性，“-”表示无毒性；p24抗原抑制率“-”表示无p24抑制作用。

Claims (6)

1.一种硫酸酯化多糖，其特征在于所述的硫酸酯化多糖为：硫酸酯化枸杞多糖，硫酸酯化姬松茸多糖，硫酸酯化苦瓜多糖，硫酸酯化云芝多糖或硫酸酯化茶树菇多糖，上述硫酸酯化多糖硫的重量百分含量为1.01～16.60％，每个单糖单位的硫酸根取代度为0.05～1.78，重均分子量为3.9×103～10.6×104。
2.根据权利要求1所述的硫酸酯化多糖，其特征在于具有体外抗艾滋病病毒活性。
3.根据权利要求1所述的硫酸酯化多糖的制备方法，其特征在于该方法的步骤为：
(1)在冰盐浴中，将氯磺酸滴入1～10倍体积的吡啶中，得到氯磺酸吡啶混合物；
(2)称取一定量的多糖，将其溶解或悬浮在10～90倍重量比的溶剂中，接着加入与多糖残基的摩尔比为1∶2～30的上述氯磺酸吡啶混合物，于微波合成仪中进行酯化反应，微波功率为20～150W，反应温度为35～100℃，反应时间为3～30min；
(3)反应结束后，冷却，用1～4mol/L NaOH中和，透析，透析内液经冷冻干燥即得硫酸酯化多糖。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述的溶剂为二甲亚砜、二甲基甲酰胺、甲酰胺和吡啶中的任何一种。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于微波功率为40～60W。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于反应时间为4～20min。
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