CN1310191A - 液相色谱用脲醛树脂及衍生物就地聚合柱和制备 - Google Patents
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Abstract
本发明属于液相色谱技术和高分子合成。应用在空管中合成脲醛树脂,制备了脲醛树脂就地聚合柱。它具有两种孔径分布,并有很好的流通性。将脲醛树脂就地聚合柱与甲醛反应,制备了羟甲基脲醛树脂就地聚合柱,可用作反相色谱柱。将脲醛树脂就地聚合柱与Cibacron兰反应,制备了Cibacron兰脲醛树脂就地聚合柱,可用作亲和色谱柱。先将尿素和Cibacron兰反应,然后再与甲醛在空管中进行缩聚反应,也能合成Cibacron兰脲醛树脂就地聚合柱,该柱具有较高的染料结合量,也可用作亲和色谱柱。
Description
本发明所属领域为液相色谱技术和高分子合成。
高分子聚合物微球已在生物大分子的色谱分离和纯化过程中发挥越来越重要的作用。目前常用的高聚物微球填充柱死体积大，溶质在分离介质孔结构中扩散传质速度缓慢，造成了色谱峰的展宽。1992年以来出现了一类新型的聚合物分离介质--连续棒状介质，它是由单体、溶剂和引发剂等混合物在密闭条件下聚合而成的一个棒状整体。它与微球填料相比，这种介质不仅克服了小于3微米的微球制备和装填方面的困难，还具有较快的溶质传质速度、高的柱空间利用率、操作压力很低等优点。目前已在反相、离子交换、疏水色谱、亲和及沉淀-溶解色谱中获得了成功应用，可用于蛋白质、烷基苯、肽和高分子等物质的分离(F.Svec,J.M.J.Frechet,Science 273(1996)205)。现在用于就地聚合的材料主要有交联聚甲基丙烯酸酯类和交联聚苯乙烯等有机高分子，另外无机硅胶柱也得到了发展。由于这些高分子材料都具有一定的疏水性能，硅胶表面含有许多硅羟基，这些都对生物大分子具有较强的非特异性吸附作用，易导致生物大分子的变性，从而限制了它们在生物工程技术中的应用。
本发明的目的是提出采用就地聚合的方法在空管中合成出脲醛树脂就地聚合柱。并提出制备三种脲醛树脂衍生柱的方法。开发新型液相色谱柱。
本发明的原理是利用尿素和甲醛易在酸性条件下发生缩合聚合反应得到脲醛树脂，它是由许多微米级多孔颗粒堆积成的一个整体(图1)。利用空的色谱柱作为模子，在空管内进行反应，这样可以控制产物的最终宏观形态，即为一圆柱形的脲醛树脂棒，可用作液相色谱柱。并利用脲醛树脂含有大量的亚胺基进行衍生化反应，进一步得到脲醛树脂衍生物就地聚合柱。或利用尿素含有的胺基先进行衍生化，然后再与甲醛进行缩合反应得到脲醛树脂衍生物就地聚合柱。
制备脲醛树脂就地聚合柱的过程是：(1)首先按一定比例配置适当浓度的尿素溶液和甲醛溶液。(2)调节两溶液的pH值，控制温度，将两溶液迅速混合，搅匀，注入一头已封端的空色谱柱中，几分钟后固化得到白色的棒状柱，封住另一端，然后放到烘箱中加热使反应完全。(3)换上色谱柱接头，接到色谱泵上，用水淋洗，洗去柱中未反应的物质。本发明中尿素与甲醛的克分子比为1∶1-1∶2。聚合脲醛树脂的pH条件是pH=1-4，用于调节pH的无机酸为盐酸、硝酸、硫酸和磷酸，当量浓度为2-10N。聚合反应温度为10-40℃，后处理温度为40-80℃。
制备羟甲基脲醛树脂就地聚合柱的过程是：配置一定浓度的甲醛水溶液，再加入无机酸水溶液，使用色谱泵将此溶液循环注入脲醛树脂就地聚合柱中，控制温度，使脲醛树脂柱与甲醛反应。然后分别用水和乙腈进行淋洗。反应所用的甲醛水溶液的浓度是0.02-0.2克/毫升。所用的无机酸为盐酸、硝酸、硫酸、磷酸。酸水溶液的浓度为0.05-0.5克/毫升。酸水溶液与甲醛水溶液的体积比为0.1∶1-1∶1。反应温度40-80℃。
制备Cibacron兰脲醛树脂就地聚合柱的过程是：配置Cibacron兰水溶液，加入碱水溶液，使用色谱泵将此溶液循环注入脲醛树脂就地聚合柱中，控制温度，使脲醛树脂柱与Cibacron兰反应。然后分别使用水、盐水溶液、尿素溶液和水进行淋洗。反应使用的Cibacron兰水溶液的浓度为0.001-0.01克/毫升。所用的碱为氢氧化钾或氢氧化钠，碱水溶液浓度为0.01-0.1克/毫升。碱水溶液与Cibacron兰水溶液的体积比为0.1∶1-1∶1。反应温度为20-80℃。淋洗使用的盐为氯化钠或氯化钾，盐水浓度为0.5-2M。淋洗使用的尿素溶液浓度为4-8N。
另一种制备Cibacron兰脲醛树脂就地聚合柱的过程是：(1)配置尿素和Cibacron兰的水溶液，加入盐水溶液和碱水溶液，控制反应温度使尿素和Cibacron兰反应。(2)将此兰色溶液和甲醛溶液混合，加入酸水溶液，迅速搅拌均匀，注入一头封端的空色谱柱中，控制反应温度，使衍生化的尿素和甲醛进行反应。(3)换上色谱柱接头，接到色谱泵上，分别用水、盐水溶液、尿素溶液和水淋洗。反应使用的尿素与Cibacron兰的重量比为1∶0.01-1∶0.1。所用的盐为氯化钠或氯化钾，盐水溶液浓度为0.1-0.5克/毫升。所用的碱为氢氧化钾或氢氧化钠，碱水溶液浓度为0.1-0.5克/毫升。盐水溶液与尿素和Cibacron兰水溶液的体积比为0.05∶1-0.2∶1。碱水溶液与尿素和Cibacron兰水溶液的体积比为0.05∶1-0.2∶1。尿素与Cibacron兰反应的温度为40-60℃。衍生化的尿素溶液和甲醛溶液的体积比为1∶1-1∶2。所用的无机酸为盐酸、硝酸、硫酸、磷酸。酸水溶液的浓度为2-5M。酸水溶液与尿素和甲醛水溶液的体积比为0.05∶1-0.1∶1。衍生化的尿素与甲醛反应的温度为20-60℃。
实施例1：取10克尿素溶解到10毫升水中，用盐酸溶液调节其pH值到2-3。再取20毫升甲醛溶液(37％)，也用盐酸溶液调节其pH值到2-3。然后将两种溶液混合，快速搅拌均匀，迅速将混合液注入到一头已封端的空色谱柱管中(Φ10×100毫米和Φ4×125毫米)。5-10分钟后色谱柱中溶液固化得到白色的脲醛树脂柱。然后封住另一端，将其放到60℃烘箱中加热8小时，使反应完全。最后换上色谱柱接头，将其接到色谱泵上，分别用400毫升和100毫升水淋洗，流速分别为1毫升/分和0.2毫升/分。对于Φ10×100毫米就地聚合柱，用水为淋洗液，窄分布的聚乙二醇和葡聚糖为标样，在1毫升/分流速、10公斤/厘米2柱压下测得凝胶渗透色谱校正曲线如图2。表明该就地聚合柱具有两种孔径分布。
实施例2：先配置200毫升浓度为0.1克/毫升的甲醛水溶液。再加入20毫升浓度为0.5克/毫升的磷酸水溶液。使用液相色谱泵循环地将此溶液泵入实施例1制备的脲醛树脂就地聚合柱(Φ4×125毫米)中。流速为0.2毫升/分。2小时后取下色谱柱，密封两端后放到50℃烘箱中加热6小时。反复操作4次，使脲醛树脂就地聚合柱和甲醛反应充分，得到羟甲基脲醛树脂就地聚合柱。然后用100毫升水以0.2毫升/分的流速淋洗色谱柱至中性。再用100毫升乙腈淋洗色谱柱，流速为0.2毫升/分。用乙腈水溶液作梯度淋洗，起始浓度10％，终结浓度40％乙腈。溶菌酶(1)和牛血清白蛋白(2)为标样，在0.4毫升/分流速、40公斤/厘米2柱压下测得色谱图如图3。表明该就地聚合柱可以用作蛋白质分离的反相色谱柱。
实施例3：先配置100毫升浓度为0.01克/毫升的Cibacron兰水溶液。再加入100毫升浓度为0.02克/毫升的氢氧化钠水溶液。在室温下使用液相色谱泵将此兰溶液循环泵入实施例1制备的脲醛树脂就地聚合柱(Φ10×100毫米)中。流速为0.5毫升/分。24小时后取下色谱柱，密封两端后放到60℃烘箱中加热6小时。得到Cibacron兰脲醛树脂就地聚合柱。然后分别用200毫升水、100毫升1M氯化钠、100毫升4N尿素水溶液和400毫升水以1毫升/分的流速淋洗色谱柱，直至洗出液为无色。采用分光光度法测得其染料结合量为0.43毫克/克树脂。采用前沿分析法测得其动态容量为1.02毫克溶菌酶/毫升。用pH=7的50mM Tris-HCl缓冲溶液淋洗，进样人血清，得到杂蛋白色谱峰(1)，再改用含有1M氯化钠的pH=7、50mM Tris-HCl缓冲溶液淋洗，人血清白蛋白(2)被淋洗出来。在1毫升/分流速、5公斤/厘米2柱压下测得色谱图如图4。表明该兰色就地聚合柱可以用作亲和色谱柱。
实施例4：在8毫升水中加入10克尿素和100毫克Cibacron兰染料，磁力搅拌，放在50℃水浴中加热。然后加入1毫升0.25克/毫升的氯化钠溶液。30分钟后再加入1毫升0.25克/毫升的氢氧化钠溶液。反应6小时后冷却。取7毫升上述兰色溶液，加入8毫升甲醛溶液(37％)和1毫升3M盐酸溶液，搅拌均匀后迅速注入一端封闭的空色谱柱(Φ4×125毫米)中。几分钟后反应体系固化。密封两端后放到60℃烘箱中加热6小时。得到Cibacron兰脲醛树脂就地聚合柱。然后分别用100毫升水、50毫升1M氯化钠、50毫升4N尿素水溶液和200毫升水以0.2毫升/分的流速淋洗色谱柱，直至洗出液为无色。采用分光光度法测得其染料结合量为5.46毫克/克树脂，采用这种方法可制得高染料结合量的Cibacron兰脲醛树脂就地聚合柱。
附图简要说明：图1：脲醛树脂就地聚合柱横截面的扫描电镜照片。图2：实施例1中测得的凝胶渗透色谱校正曲线。图3：实施例2中对混合蛋白样品的反相色谱分离谱图。图4：实施例3中对人血清的亲和色谱分离与纯化谱图。
Claims (8)
1．一种液相色谱用脲醛树脂就地聚合柱，由尿素、甲醛聚合而成。其特征在于尿素和甲醛的配比为克分子比1∶1-1∶2。
2．一种液相色谱用羟甲基脲醛树脂就地聚合柱，由权利要求1所述的脲醛树脂就地聚合柱制备。其特征在于羟甲基的含量为与脲醛树脂中亚胺基克分子比0.0001∶1-0.01∶1。
3．一种液相色谱用Cibacron兰脲醛树脂就地聚合柱，由权利要求1所述的脲醛树脂就地聚合柱制备。其特征在于Cibacron兰的含量为与脲醛树脂中亚胺基克分子比0.0001∶1-0.01∶1。
4．一种液相色谱用Cibacron兰脲醛树脂就地聚合柱，先由尿素与Cibacron兰反应，然后再与甲醛缩聚而成。其特征在于Cibacron兰和尿素的配比为克分子比0.0001∶1-0.01∶1，尿素和甲醛的配比为克分子比1∶1-1∶2。
5．一种权利要求1所述脲醛树脂就地聚合柱的制备方法，其特征在于：(1)反应生成的脲醛树脂骨架占柱体积的15％-50％，(2)所用酸为盐酸、硝酸、硫酸和磷酸，当量浓度为2-10N。
6．一种权利要求2所述羟甲基脲醛树脂就地聚合柱的制备方法，其特征在于(1)甲醛溶液的浓度为0.02-0.2克/毫升，(2)所用酸为盐酸、硝酸、硫酸和磷酸，浓度为0.05-0.5克/毫升，(3)酸水溶液与甲醛水溶液的体积比是0.1∶1-1∶1。
7．一种权利要求3所述Cibacron兰脲醛树脂就地聚合柱的制备方法，其特征在于：(1)Cibacron兰水溶液的浓度为0.001-0.01克/毫升，(2)所用的碱为氢氧化钠或氢氧化钾，浓度为0.01-0.1克/毫升，(3)碱水溶液与Cibacron兰水溶液的体积比是0.1∶1-1∶1。
8．一种权利要求4所述Cibacron兰脲醛树脂就地聚合柱的制备方法，其特征在于：(1)所用的碱是氢氧化钠或氢氧化钾，浓度为0.1-0.5克/毫升，(2)碱水溶液与尿素和Cibacron兰水溶液的体积比是0.05∶1-0.2∶1,(3)所用的酸为盐酸、硝酸、硫酸和磷酸，浓度为2-5M,(4)酸水溶液与尿素和甲醛水溶液的体积比为0.05∶1-0.1∶1。
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|---|---|---|---|---|
| CN106422415A (zh) * | 2016-09-12 | 2017-02-22 | 福州大学 | 一种粘多糖功能化亲水固相微萃取整体柱 |
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