CN1285609C - 猪传染性胃肠炎重组n蛋白抗原及纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供的是一种猪传染性胃肠炎重组N蛋白抗原及纯化方法。从纯化后的TGEV病毒液中进行病毒核酸提取，以TGEV N基因的上游引物Li01进行病毒基因组cDNA的合成，再使用TGEV N基因的上、下游引物，进行N基因的扩增，将扩增后的TGEV N基因克隆到原核表达载体质粒pProEXHTb中，并在大肠杆菌DH5α菌株中进行表达得到的猪传染性胃肠炎重组N蛋白抗原。该抗原可以克服猪传染性胃肠炎传统诊断方法中的抗原所存在的排毒、散毒的潜在危险，可作为一种疾病监测的诊断抗原。

Description

猪传染性胃肠炎重组N蛋白抗原及纯化方法

(一)技术领域

本发明涉及的是一种生物制剂，本发明还涉及这种生物制剂的制备方法。具体地说是一种猪传染性胃肠炎重组N蛋白抗原及制备方法。

(二)背景技术

猪传染性胃肠炎是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissiblegastroenteritis virus，TGEV)引起的猪的一种急性、高度接触性传染病，临床症状为严重腹泻、呕吐和脱水。不同年龄和品种的猪均易感，尤以2周龄以内仔猪病死率高达100％。

猪传染性胃肠炎的传统诊断方法常根据流行病学和临床表现作为初步诊断的依据。但由于猪的轮状病毒和猪流行性腹泻病毒也能引起类似的疾病，且在流行病学和症状上很难区别，因此必须依靠病毒分离和血清学实验才能最后确诊。

自从1946年Doyle和Hutchings首次报道猪传染性胃肠炎以来，世界各国对TGEV诊断技术进行了大量研究，已建立了病毒分离(Isolation of Virus IV)、荧光抗体技术(Fluorescent Antibody TestFAT)、免疫电子显微镜技术(Immune electron microscopy IEM)、病毒中和试验(Virus Neutralization VN)、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay ELISA)、核酸探针(Nucleic acidprod)和多聚酶链式反应(Poly Chain Reaction PCR)等方法。根据流行病学、临床症状和病理变化可对TGE进行初步诊断，若与猪轮状病毒(PRV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的肠道疾病相区分，还需实验室确诊。

快速准确的疫病诊断是防治猪传染性胃肠炎的重要前提。而目前我国还没有一套行之有效的防治办法。在临床诊断上对可疑病料进行病毒分离与鉴定是本病最为直观的诊断方法，但分离病毒需一定的条件和相当长的时间，因此，这种诊断方法存在着费时、费力又不能快速诊断的弊端；本病的快速诊断方法最常应用的是血清学试验，如中和试验、荧光抗体试验和酶联免疫吸附试验等。而血清学方法诊断的准确性依赖于诊断抗原及抗体的特异性。

(三)发明内容

本发明的目的在于提供一种可以克服猪传染性胃肠炎传统诊断方法中的抗原所存在的排毒、散毒的潜在危险，可作为一种疾病监测的诊断抗原的猪传染性胃肠炎重组N蛋白抗原；本发明的目的还在于提供一种

猪传染性胃肠炎重组N蛋白抗原的纯化方法。

本发明的目的是这样实现的：它是从纯化后的TGEV病毒液中进行病毒核酸(RNA)提取，以TGEV N基因的上游引物LiO1进行病毒基因组cDNA的合成，再使用TGEV N基因的上、下游引物，进行N基因的扩增，将扩增后的TGEV N基因克隆到原核表达载体质粒pProEXHTb中，并在大肠杆菌DH5α菌株中进行表达得到猪传染性胃肠炎重组N蛋白抗原，其命名为Escherichia coli DH5 a with recombinant plasmid of transmissiblegastroenteritis virus necleoprotein gene。

上、下游引物序列分别为：

LiO1  5’AAC TTC GAA ATG GCC AAC C 3’19-mer；

LiO2  5’AGC TCG AGC ATC TCG TTT AG 3’20-mer.

本发明的猪传染性胃肠炎重组N蛋白是采用这样的方法纯化的：

1融合蛋白的大量表达

(1)接种已表达融合蛋白的大肠杆菌DH5α菌株于10ml LB/氨苄青霉素液体培养基，于37℃摇荡培养过夜；

(2)转接10ml过夜培养物于500ml LB/氨苄青霉素液体培养基，于37℃摇荡培养至OD₅₉₀值达0.5左右，取出1ml样品供电泳分析；

(3)加入0.5ml 1mol/L IPTG至终浓度为0.6mmol/L，于37℃继续培养至OD值达1.0，终止培养，取出lml样品供电泳分析。

2融合蛋白的纯化

(1)向1.5cm×7.5cm层析柱中加入lmlNi²⁺-NTA凝胶介质，20ml去离子水洗柱后，再用20ml Buffer A溶液洗柱；

(2)将菌液经10000g/min离心20min，去上清，沉淀的菌体用BufferA溶液10ml进行裂解菌体，溶解沉淀，室温搅拌1h后，4℃继续搅拌过夜；

(3)将溶解物移至30ml离心管中，4℃条件下，以20000g/min离心40min，取上清留待上柱用；

(4)将上清以0.5ml/min的流速加入到Ni-NTA柱中；收集流出液，进行SDS-PAGE分析；

(5)依次使用20ml Buffer A、20ml Buffer B以0.5ml/min的流速洗涤，并收集流出液，SDS-PAGE分析；

(6)用含有80mmol/L咪唑的Buffer C 10ml进行洗涤，收集洗脱液，在280nm的紫外线波长下，检测蛋白的吸收峰值，保存含有重组蛋白的洗脱液，短期保存的保存温度为4℃，长期保存的保存温度为-20℃。

随着现代分子免疫学和分子生物学等先进技术的开发利用，为新一代生物工程诊断试剂的研制开发开辟了新途径。以基因工程、细胞工程等先进的技术手段获得的诊断抗原或抗体，其突出特点在于均一性好，纯度高，特异性强，性能稳定，并易于保存和批量生产，由此建立的诊断程序和方法易于国际标准化，是今后疫病诊断发展的主要方向。同时，以生物技术生产的诊断抗原，可避免烦琐的细胞培养来制备大量的抗原物质.这对在细胞上繁殖较难的病毒极为有用。

TGEV N蛋白是极为保守的磷酸化蛋白，分子质量为47ku，是TGEV的一种优势结构蛋白，并能激发较强的免疫应答，因此对TGEV的核衣壳(N)基因进行克隆、表达及其表达产物纯化。其纯化的核蛋白产物，无论是作为一种疾病监测的诊断抗原，还是作为一种激发机体应答的免疫制剂，均是极为有用的新型生物制剂。该制剂的进一步应用，将对TGE的诊断与防治提供重要的物质基础。TGE的诊断在防治该病的流行上具有重要作用，因此进一步完善这些检测方法，使之具有高度的特异性、敏感性，更加快速、简便，更适用于常规大量样品的检测，将具有更重要的实际意义。

利用分子生物学技术制备的重组TGEV N蛋白具有与天然的N蛋白相近的免疫生物学特性，而且可以规模化生产，该项技术避免了采用体外培养全病毒抗原、差速离心和密度梯度离心纯化病毒、用生化试剂处理暴露病毒N蛋白的烦琐的抗原生产方法，提高了工作效率，减少了非特异性反应。以此法生产的抗原，可避免以活病毒作抗原散播病毒的危险。

(四)附图说明

图1是TGEV核蛋白基因的RT-PCR结果，其中：

1.DNA Ladder

2-3.核蛋白基因PCR产物

4.PCR对照

5.DNA Marker DL15000

图2是TGEV N基因的酶切鉴定结果，其中：

1.DNA Ladder 100bp

2.N基因用Xba I酶切

3.N基因用Pst I酶切

4.N基因用HindIII酶切

图3是重组质粒PHN的酶切产物电泳图谱，其中：

1.DNA Marker DL15,000

2.载体质粒pProEXHTb

3.XhoI单酶切载体质粒

4.重组质粒PHN

5.XhoI单酶切重组质粒PHN

6.XhoI、NspV双酶切重组质粒PHN

图4是TGEV N基因在大肠杆菌表达的SDS-PAGE电泳图谱，其中：

1.标准蛋白质分子量20～90ku

2.未经IPTG诱导的含质粒pProEXHTb的菌体裂解物

3.经IPTG诱导的含质粒pProEXHTb的菌体裂解物

4.未经IPTG诱导的含重组质粒PHN的菌体裂解物

5.经IPTG诱导的含重组质粒PHN的菌体裂解物

图5是大肠杆菌中表达N蛋白的Western blot图谱，其中：

1、未经IPTG诱导的含质粒pProEXHTb的菌体裂解物

2、经IPTG诱导的含质粒pProEXHTb的菌体裂解物

3、未经IPTG诱导的含重组质粒PHN的菌体裂解物

4、经IPTG诱导的含重组质粒PHN的菌体裂解物

图6是融合蛋白纯化的电泳图谱，其中：

1、标准蛋白质分子量20～90ku

2、未经IPTG诱导的菌体蛋白

3、经IPTG诱导的菌体蛋白

4、经buffer A裂解的IPTG诱导的菌体蛋白

5、经亲和层析纯化的菌体蛋白

图7是纯化后的融合蛋白Western-blot图谱

图8是表达效率结果分布图

图9是融合蛋白表达效率分析的数据结果表。

(五)具体实施方案

从纯化后的TGEV病毒液中进行病毒核酸(RNA)提取，以TGEV N基因的上游引物Li01进行病毒基因组cDNA的合成，再使用TGEV N基因的上、下游引物，进行N基因的扩增，将扩增后的TGEV N基因克隆到原核表达载体质粒pProEXHTb中，并在大肠杆菌DH5α菌株中进行表达，根据载体的特点，本实验选用IPTG诱导融合蛋白的表达，表达产物在经SDS-PAGE分析和免疫印记(Western-blot)检测抗原活性之后，融合蛋白的纯化利用原核表达载体pProEXHT所表达的重组蛋白带有的6个连续组氨酸残基，可结合在Ni-NTA柱上，又因咪唑可竞争地结合在Ni²⁺-NTA柱上而将重组蛋白置换下来，为重组融合蛋白的提取纯化提供了一种有效方法。

本发明产品的具体制作方法为：

图1是TGEV核蛋白基因的RT-PCR结果，用RT-PCR方法，以逆转录合成的TGEV TH-98株cDNA为模板，用所设计的引物扩增出约1200bp的片段，扩增产物大小与预期设计(1174bp)相符。

图2是TGEV N基因的酶切鉴定结果，选用N基因酶切图谱上的限制性内切酶HindIII、Pst I、Xba I对PCR产物进行酶切分析，结果分别得到了约500bp和600bp、约350bp和700bp及约450bp和700bp片段，酶切鉴定结果与预期结果相一致。

图3是重组质粒PHN的酶切产物电泳图谱，将重组质粒用XhoI单酶切和XhoI及NspV双酶切，分别得到了与预计大小相符的片段。即用XhoI和NspV双酶切得到的两个片段为pProEXHTb载体质粒的4780bp片段和目的基因的1174bp片段，而用XhoI单酶切所的片段大小为二者之和，即约6000bp左右。表明获得了TGEV核蛋白基因的重组质粒。

图4是TGEV N基因在大肠杆菌表达的SDS-PAGE电泳图谱，结果表明重组菌体裂解物在66ku与43ku之间产生一条特异的蛋白带，与预期蛋白(47ku)的大小相一致。而非重组的pProEXHTb质粒菌培养物样品中，则无此带出现。其它非经IPTG诱导的质粒菌均未出现明显表达条带。

图5是Western blot图谱，含重组质粒PHN的DH5α菌体裂解物，经SDS-PAGE和电转印后，表达的47ku重组蛋白能与TGEV抗血清发生特异性反应，表明重组核蛋白具有与天然TGEV N蛋白一样的抗原特异性。

图6是融合蛋白纯化的电泳图谱，从电泳图谱可看出，使用本纯化方法最终得到了纯度较高的融合蛋白。

图7是纯化后的融合蛋白Western-blot图谱，从图可以看出，纯化后的融合蛋白进行western-blot检测仍保持其抗原特异性。

图8是表达效率结果分布图，其中r7为重组N蛋白，分子量为47ku(图表9箭头所示)，其含量占菌体总蛋白的20.409％，结果表明，融合蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达。

序列表

GCCAACCAGGGACAGCGTATTAGTTGGGGGGATGAATCTACCAAAACACGTGGTCGTTCCAATTCCCGTGGTCGGAAGAATAATAACATACCTCTTTCATTCTTCAACCCCATAACCCTCCAACAAGGTTCAAAATTTTGGAACTTATGTCCGAGAGACTTTGTACCCAAAGGAATAGGTAACAGGGATCAACAGATTGGTTATTGGAATAGACAAACTCGCTATCGCATGGTGAAGGGCCAACGTAAAGAGCTTCCTGAAAGGTGGTTCTTCTACTACTTAGGTACTGGACCTCATGCAGATGCCAAATTTAAAGATAAATTAGATGGAGTTGTCTGGGTTGCCAAGGATGGCGCCATGAACAAACCAACCACGCTTGGTAGTCGTGGTGCTAATAATGAATCCAAAGCTTTGAAATTCGATGGTAAAGTGCCAGGCGAATTTCAACTTGAAGTTAATCAATCAAGAGACAATTCAAGGTCACGCTCTCAATCTAGATCTCGGTCTAGAAATAGATCTCAATCTAGAGGCAGGCAACAATTCAATAACAAGAAGGATGACAGTGTAGAACAAGCTGTTCTTGCCGCACTTAAAAAGTTAGGTGTTGACACAGAAAAACAACAGCAACGCTCTCGTTCTAAATCTAAAGAACGTAGTAACTCTAAGACAAGAGATACTACACCTAAGAATGAAAACAAACACACCTGGAAGAGAACTGCAGGTAAAGGTGATGTGACAAGATTTTATGGAGCTAGAAGCAGTTCAGCCAATTTTGGTGACACTGACCTCGTTGCCAATGGGAGCAGTGCCAAGCATTACCCACAACTGGCTGAATGTGTTCCATCTGTGTCTAGCATTCTGTTTGGAAGCTATTGGACTTCAAAGGAAGATGGCGACCAGATAGAAGTCACGTTCACACACAAATACCACTTGCCAAAGGATGATCCTAAGACTGGACAATTCCTTCAGCAGATTAATGCCTATGCTCGTCCATCAGAAGTGGCAAAAGAACAGAGAAAAAGAAAATCTCGTTCTAAATCTGCAGAAAGGTCAGAGCAAGATGTGGTACCTGATGCATTAATAGAAAATTATACAGATGTGTTTGATGACACACAGGTTGAGATGATTGACGAGGTAACGAAC

Claims (2)

1、一种猪传染性胃肠炎重组N蛋白抗原，其特征是：它是从纯化后的TGEV病毒液中进行病毒核酸提取，以TGEV N基因的上游引物Li0l进行病毒基因组cDNA的合成，再使用TGEV N基因的上、下游引物，进行N基因的扩增，将扩增后的TGEV N基因克隆到原核表达载体质粒pPr0EXHTb中，并在大肠杆菌DH5α菌株中进行表达得到的猪传染性胃肠炎重组N蛋白抗原，编码该抗原的基因序列为：

GCCAACCAGGGACAGCGTATTAGTTGGGGGGATGA ATCTACCAAAACACGTGGTCGTTCCAATTCCCGTGGTCGGAAGAATAATAACATACCTCTTTCATTCTTCAACCCCATAACCCTCCAACAAGGTTCAAAATTTTGGAACTTATGTCCGAGAGACTTTGTACCCAAAGGAATAGGTAACAGGGATCAACAGATTGGTTATTGGAATAGACAAACTCGCTATCGCATGGTGAAGGGCCAACGTAAAGAGCTTCCTGAAAGGTGGTTCTTCTACTACTTAGGTACTGGACCTCATGCAGATGCCAAATTTAAAGATAAATTAGATGGAGTTGTCTGGGTTGCCAAGGATGGCGCCATGAACAAACCAACCACGCTTGGTAGTCGTGGTGCTAATAATGAATCCAAAGCTTTGAAATTCGATGGTAAAGTGCCAGGCGAATTTCAACTTGAAGTTAATCAATCAAGAGACAATTCAAGGTCACGCTCTCAATCTAGATCTCGGTCTAGAAATAGATCTCAATCTAGAGGCAGGCAACAATTCAATAACAAGAAGGATGACAGTGTAGAACAAGCTGTTCTTGCCGCACTTAAAAAGTTAGGTGTTGACACAGAAAAACAACAGCAACGCTCTCGTTCTAAATCTAAAGAACGTAGTAACTCTAAGACAAGAGATACTACACCTAAGAATGAAAACAAACACACCTGGAAGAGAACTGCAGGTAAAGGTGATGTGACAAGATTTTATGGAGCTAGAAGCAGTTCAGCCAATTTTGGTG ACACTGACCTCGTTGCCAATGGGAGCAGTGCCAAGCATTACCCACAACTGGCTGAATGTGTTCCATCTGTGTCTAGCATTCTGTTTGGAAGCTATTGGACTTCAAAGGAAGATGGCGACCAGATAGAAGTCACGTTCACACACAAATACCACTTGCCAAAGGATGATCCTAAGACTGGACAATTCCTTCAGCAGATTAATGCCTATGCTCGTCCATCAGAAGTGGCAAAAGAACAGAGAAAAAGAAAATCTCGTTCTAAATCTGCAGAAAGGTCAGAGCAAGATGTGGTACCTGATGCATTAATAGAAAATTATACAGATGTGTTTGATGACACACAGGTTGAGATGATTGACGAGGTAACGAAC

2、如权利要求1所述的猪传染性胃肠炎重组N蛋白抗原的纯化方法，其特征是：

2.1融合蛋白的大量表达

2.1.1接种已表达融合蛋白的大肠杆菌DH5α菌株于10ml LB/氨苄青霉素液体培养基，于37℃摇荡培养过夜；

2.1.2转接10ml过夜培养物于500ml LB/氨苄青霉素液体培养基，于37℃摇荡培养至OD590值达0.5左右，取出1ml样品供电泳分析；

2.1.3加入0.5ml 1mol/L IPTG至终浓度为0.6mmol/L，于37℃继续培养至OD值达1.0，终止培养，取出1ml样品供电泳分析；

2.2融合蛋白的纯化

2.2.1向1.5cm×7.5cm层析柱中加入1ml Ni²⁺-NTA凝胶介质，20ml去离子水洗柱后，再用20ml Buffer A溶液洗柱；

2.2.2将菌液经10 000g/min离心20min，去上清，沉淀的菌体用Buffer A溶液10ml进行裂解菌体，溶解沉淀，室温搅拌1h后，4℃继续搅拌过夜；

2.2.3将溶解物移至30ml离心管中，4℃条件下，以20 000g/min离心40min，取上清留待上柱用；

2.2.4将上清以0.5ml/min的流速加入到Ni-NTA柱中；收集流出液，进行SDS-PAGE分析；

2.2.5依次使用20ml Buffer A、20ml Buffer B以0.5ml/min的流速洗涤，并收集流出液，SDS-PAGE分析；

2.2.6用含有80mmol/L咪唑的Buffer C 10ml进行洗涤，收集洗脱液，在280nm的紫外线波长下，检测蛋白的吸收峰值，保存含有重组蛋白的洗脱液，短期保存的保存温度为4℃，长期保存的保存温度为-20℃。

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