CN1275049A - 利用诱导型肌醇六磷酸基因控制发芽 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种含有肌醇六磷酸基因的植物,该基因只有需要时才在上述植物的种子中表达。本发明具有两个能被诱导或开关的特性。这两个特性是:(i)不能发芽的种子,(ii)低肌醇六磷酸或不产生肌醇六磷酸。

Description

利用诱导型肌醇六磷酸基因控制发芽
本发明是基于1997年8月11日申请的美国临时申请号60/055,323并得益于上述申请；上述申请的全部内容在本文中作为参考文献的形式引用。
                     发明领域
本发明提供了含有一种诱导型基因(肌醇六磷酸基因)的植物，该基因通过调节肌醇六磷酸的含量控制种子的萌发性；本发明还提供了生产和使用该植物、该植物的种子及其后代的方法。
                     发明背景
玉米的低肌醇六磷酸突变体是已知的。近来重组DNA技术的成熟在农艺工业中转化为经济上的成功。抗除草剂和抗昆虫的棉花、大豆和玉米已成功上市了。在农作物的转化之前一些作物由于突变已具有抗除草剂的特性。例如Garst Seed Company生产的ITTM玉米是抗除草剂(Imazethapyr)的HERBICIDE PURSUIT(American Cyanamid)突变植物。
突变植物还被用于在多种作物中产生有价值的特性。例如在玉米中利用蜡质化、直链淀粉伸长以及其它突变得到特定的淀粉特性，并且在甜玉米中利用了甜味突变。
低肌醇六磷酸突变，lpa1-R，已由Raboy(U.S.Patent No.1,689,054(其中描述了lpa1-1))得到。此lpa1突变的商业应用预期将在1999年出现。许多公司目前正在研究这种新的低肌醇六磷酸突变体。通过玉米育种的突变方法以及突变剂的应用在玉米中得到了多种不同突变以及具有这种低肌醇六磷酸特性的不同品种。
转座子标记是已知的基因鉴定和测序方法，该方法包括用可转座元件突变植物。这种方法的一个优点是它提供了与突变相关基因的鉴定和测序的一种手段。一旦一个基因已被克隆它就可在不同种之间转移。利用基因的鉴定测序和转化的方法将基因从一种植物转移到另一种植物中的方法在工业中是广为人知的。Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molecular Biology 1992，43：49-82中Virginia Walbot的题为“Strategies for Muatgenesis and Gene Cloning UsingTransposon Tagging and T-DNA Insertional Mutagenesis”的文章。在Plant Cell，Vol 5，pp.1555-1566(November 1993)中PhilipStinard等人的题为“Genetic Isolation，Cloning and Analysisof a Mutator-induced，Dominant Antimorph of the Maize AmyloseExtenderl Locus.”的文章报道了利用mu1元件转座子标记在玉米中进行遗传分离和克隆直链淀粉伸长基因的具体例子。文章报道了进行转座子标记的突变植物和突变基因的鉴定。该基因用本领域中已知的方法测序。测出序列的部分作为探针被用于鉴定突变基因，然后克隆了该基因。基因的克隆已有实践并作为一种技术已很好地得以建立。贯穿本发明的重组DNA技术对于本领域的技术人员是已知的并在Mantiatis等人的MOLECULAR CLONING：a Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold spring Harbor，N.Y.中有所描述。
可开关的或可诱导的转化构建体是已知的并可通过本领域中已知的手段制备。通常在基因被克隆之后将其置入用于转化植物的构建体中。该基因、或等位基因、或其截短的、置换的或缺失的变体，可被置入转化载体的有义或反义位置。普通技术人员可预期通过反义技术下调天然基因并不需要将整个基因插入反义方向，而只需插入能产生下调的序列。这就是说基因片段，如含30-100个核酸碱基，优选地45-65个核酸碱基的片段可用于下调基因的表达。
用于植物转化的转化载体可购自Clontech或其它供应商。载体的选择优选地应提供适应于植物种属和所应用的转化方法的恰当材料。例如如果植物容易进行农杆菌转化那么所选的载体应在载体中包括T-DNA部分。启动子、内含子、前导序列和选择标记的选择使得该基因编码的氨基酸序列在所需的植物中以所需的水平表达。进而，通过针对被转化宿主细胞的特定密码子使用优化可优化载体。
最近诱导型启动子已被用于激活与启动子可操作连接的基因。对激活因素应答后诱导型启动子激活或抑制基因。
对于本发明的目的而言启动子可以是被打开从而该基因或可操作连接的核酸序列表达(包括仅仅转录或转录加翻译)，或者启动子也可是被关闭从而该基因或可操作连接的核酸序列不表达(包括仅仅转录或转录加翻译)。也可使用与激活因素接触时改变表达水平的启动子。这样的启动子在本领域中是广为人知的并被命名为“可开关型”或“诱导型”。作为对激活因素如热、光、潮湿。化学试剂等等的反应，诱导型启动子激活基因。U.S Patent No.5,608,143描述了对作为激活剂的多种取代苯磺胺具有高应答性的核酸启动子的应用。诱导型启动子被应用于重组DNA构建体中使基因的表达可由作为激活剂的外界化学控制剂控制。
U.S Patent No.5,432,068描述了用于控制雄性生育力的可外部诱导启动子。WO90/08826描述了一种基因启动子序列(GSTII(谷胱甘肽-S-转移酶同工型II))，该序列对植物除草剂安全剂(N，N-二烯丙基-2，2-二氯乙酰胺)应答，上述除草剂安全剂被用作基因开关以从外部控制基因的表达。本领域中已知还有其它外部化学诱导型启动子。
转化双子叶和单子叶植物的方法是已知的。适用于待转化植物种属的构建体很容易购买到或由本领域的普通技术人员制备得到。然后这些构建体被转化入植物的细胞或组织或花粉。转化方法包括，但不限于，微粒轰击、触须导入(whiskering)、电穿孔、农杆菌等等。这些技术的效率各不相同，领域的普通技术人员可根据待转化的组织类型和植物种属选择方法。
所需特性的选择性育种，如产生可由商业途径获得的高油玉米Top Cross系，是已知的。一旦转化体得以再生(如果有必要的话)它就可和该种属的其它植物一起被用于育种方法。普通技术人员应知道育种实践依赖于所选择的种属。例如大豆是品种栽培培育而玉米则是通过品种杂交。由Dupont申请专利的一种玉米育种方法不是用杂交种子而是联合应用雄性不育杂交种子和雄性授粉株。农民种植的不是杂交种子而是雄性不育种子和一种带有高油含量特性的雄性授粉株(玉米的近亲交配种子)。杂交canola正在培育中。目前正在尝试使现在尚未进行杂交育种的谷物从品种栽培转向杂交种子以得到杂种优势，但更重要的是减小与能从种子复制自身的植物的生产相联系的种质风险(Germplasm risk)(杂交种子有性状分离现象而近亲交配种子没有)。
仍然存在对由于植物中产生的肌醇六磷酸减少而具有附加营养价值的谷物的需求。对使种子致死从而防止自发的植物发育的方法的需求也仍然存在。对很多植物的种子仍然存在可诱导的致死特性的需求。
                     发明概述
本发明的一个目的是使种子，尤其是玉米种子，具有很低的肌醇六磷酸含量。
本发明的另一个目的是使谷粒，优选非玉米谷粒，由于植物中产生的肌醇六磷酸减少而具有增加的营养价值。
本发明的另一目的是提供不能发芽的种子，这种种子含有至少一种遗传构建体，它与非天然的诱导型启动子或其它遗传元件可操作地连接并受其控制，其中至少一种遗传构建体受到诱导时产生可发芽的种子。根据本发明的上述种子具有不可发芽的特性或表型，同时含有一种受诱导型启动子控制的遗传构建体，从而当启动子被诱导时不发芽特性被校正或克服并且种子将发芽。
本发明的另一目的是提供能发芽的种子，这种种子含有至少一种遗传构建体，它与非天然的诱导型启动子或其它遗传元件可操作地连接并受其控制，其中至少一种遗传构建体受到诱导时产生不能发芽的种子。根据本发明的上述种子具有可发芽的特性或表型，同时含有一种受诱导型启动子控制的遗传构建体，从而当启动子被诱导时可发芽特性被破坏或克服并且种子将不发芽。
本发明的目的进而为提供编码参与肌醇六磷酸合成的蛋白的核酸分子(序列)和所编码的肌醇六磷酸及其抗体。
本发明的一个目的为提供载体(表达与克隆)，以及载体的使用方法，制备本发明的优选含有肌醇六磷酸编码核酸序列或其等位基因，或截短、替换、插入突变体，或其片段的种子。
本发明的目的进而为提供产生诱导型不发芽种子和诱导型发芽种子的方法。
本发明的目的进而为提供一种防止从落地的种子自生自长成植物的方法，该方法包括种植和生长本发明的成熟可发芽种子并对从它得到的植物使用激活剂以产生不能发芽的子代种子或胚。
根据本说明书和附图，还有其它的目的和优势将是显而见的。
                     附图简述
图1为根据本发明的构建体的二元(binary)示意图，该构建体是设计用于双子叶植物和能为农杆菌所转化的单子叶植物。该构建体含有右侧T-DNA边界、NOS启动子、NPTII标记基因和NOS终止子、诱导型启动子，此例中为GSTII启动子序列，和有义取向的肌醇六磷酸基因、NOS终止子和左侧T-DNA边界。
图2为根据本发明的构建体的二元示意图，该构建体是设计用于双子叶植物和能为农杆菌所转化的单子叶植物。该构建体含有右侧T-DNA边界、NOS启动子、NPTII标记基因和NOS终止子、诱导型启动子，此例中为来自编码U.S.Patent No.5,608,143中所描述的cDNA克隆5-2的基团和图5中所示序列(该克隆5-2保藏于美国典型培养物保藏中心，ATCC，Manassas VA，保藏号.67804)(该专利以参考文献的形式引用)的启动子区域，和反义取向的肌醇六磷酸基因、NOS终止子和左侧T-DNA边界。
图3示明带启动子的构建体，在此例中启动子区域源自编码U.S.Patent No.5,608,143中所描述的cDNA克隆5-2的基因和图5中所示序列(其中该克隆保藏于美国典型培养物保藏中心，ATCC，Manassas VA，保藏号.67804)，本发明中的肌醇六磷酸基因和NOS终止子。肌醇六磷酸基因处于有义取向。
图4示明带GSTII启动子序列的构建体，根据本发明的肌醇六磷酸基因和NOS终止子。肌醇六磷酸基因处于反义取向。
图5示明现有技术中源自U.S.Patent No.5,608,143中命名为52.411的基因的5-2基因启动子的核苷酸序列。
图6示明从3个近亲交配系的肌醇六磷酸测试得到的数据的一个例子，以频率分布曲线的形式作图。
图7示明从低肌醇六磷酸突变体分离低肌醇六磷酸(高磷酸)含量得到的数据。
图8示明肌醇-1-磷酸合成酶，的核酸序列和氨基酸序列，登记号AF056326。
图9示明发表的Zea肌醇-1-磷酸合成酶的从碱基86到碱基1620的序列的线型图谱。
                   发明详述
在玉米中EMS(乙基甲烷磺酸盐，Ethyl Methane Sulfonate)已被用于诱导突变的肌醇六磷酸基因以得到低肌醇六磷酸种子。例如低肌醇六磷酸玉米突变体，lpa1已由Raboy得到(U.S Patent No.5,608,143)。在一些情况下种子的肌醇六磷酸含量可能足够低从而阻止种子发芽。在另外的情况下发现低肌醇六磷酸种子正常发芽。
根据本发明的基因被从这些突变植物中重复分离和克隆。克隆的基因编码一种影响种子中肌醇六磷酸产生的酶。根据本发明的基因包括被克隆基因的等位基因、截短、缺失或替换突变体以及有用的片段，如那些可以以反义的方式下调该基因的片段。本发明提供了转化载体，含有与一诱导型启动子可操作连接的新基因从而使该基因的致死效应能被操作、应用或控制。
该载体对于不能杂交的作物如大豆、小麦、大麦、玉米，canola和向日葵是有用的，因为该载体可以用于制备种子，该种子的肌醇六磷酸含量很低并且种子只能在诱导后严格控制的条件下发芽。本发明的载体在植物中具有以下优点：(i)它对农民是有用的因为它通过使种子不能发芽从而在下一个季节中消除了自发生长的植物。(ii)它对种子公司是有用的，因为它通过使种子不能再生用于育种而保证了种质安全性。(iii)进而它通过使种子在以后的年份不能再生而防止农民储存种子(iv)它对于饲料或谷类加工业是有用的因为它通过较低的肌醇六磷酸含量使饲料或谷类加工产品具有较高的营养价值。该发明对面粉谷粒和饲料谷粒特别有用。这些包括，但不限于，玉米、小麦、大豆、向日葵、燕麦、黑麦等等。
因此，本发明提供了种子安全的方法，包括提供低肌醇六磷酸，木发芽的子代种子或胚，该种子或胚被改变成包含与诱导型启动子有效连接并在其控制下的编码功能性肌醇6磷酸的基因。基因的定位和分离
本发明的基因可通过与具有能降低种子中肌醇六磷酸含量的遗传突变的玉米植物杂交而分离。可从此基因中鉴定野生型或天然基因与突变基因。天然肌醇六磷酸基因与突变肌醇六磷酸基因都能应用于本发明中。
在一个实施例中本发明提供了制备和应用种子的方法以及由该方法产生的种子和植物，其中通过插入在有义方向编码参与肌醇六磷酸合成的蛋白基因或其片段的反义构建体，使种子的肌醇六磷酸含量被完全消除或大大降低，上述基因纵然与弱启动子可操作连接也能预期其将至少大大降低种子的肌醇六磷酸水平。
在另一实施例中本发明提供了制备和应用种子以及源自上述种子的植物的方法，其中通过插入天然基因或其片段的有义构建体，使含有低肌醇六磷酸突变体的种子的肌醇六磷酸含量得以恢复，即被突变以产生低肌醇六磷酸表型的天然基因，纵然与与弱启动子可操作连接也能预期其将，或已知其将，提高种子的肌醇六磷酸水平。
分离本发明的肌醇六磷酸编码核酸序列的一种方法是通过应用根据本领域中已知的方法能克隆该基因的转座子标记突变体。可转座元件对该基因进行标记，换句话说，转座子插入位点侧序列是本发明感兴趣的基因的一部分。根据本发明，这里以玉米为例子进行说明，低肌醇六磷酸突变近亲交配系与含有mu1突变基因的品系杂交并且通过mu1元件插入本发明感兴趣的基因鉴定了低肌醇六磷酸突变基因。在本发明的举例说明的实施例中所用的mu1是都具有～20bp末端颠倒重复序列的mu1-9家族的一部分。在突变品系中含有转座子的多重拷贝，它们在玉米中是具有侵略性的突变原。大部分mu插入事件产生无效表型，因为可转座元件的插入并不导致改变的必须蛋白。在定位转座子标记中插入事件是针对已知的突变，如低肌醇六磷酸基因。插入事件发生的范围为每条测试染色体的每个位点～10-4到10-6次插入。当肌醇六磷酸基因具有DNA转位子插入时为了鉴定要求有从插入事件鉴定突变体表型的方法以及在配偶子中从切除事件恢复部分或全部功能。然后标记的突变体可与带有隐性低肌醇六磷酸基因的低肌醇六磷酸突变植物杂交。如果可转座元件着陆或插入到感兴趣的基因那么从杂交得到的谷粒就可被鉴定为低肌醇六磷酸谷粒或低肌醇六磷酸盐谷粒。该基因是隐性的，其性状只有在两个亲本都带有低肌醇六磷酸基因时才表现。等位性的测试是用类似的已知低肌醇六磷酸突变体以类似的杂交育种方式进行。
如果使用活性较低的元件的话为了发现可转座事件需要几十万的后裔。Mu1的应用大大减少了筛选该谷粒特性所需的后代的数量。与具有目的突变基因的近亲交配系回交也许是有用的，这依赖于所使用的可转座元件。因为使用mu1系，在此描述的本发明的例子进行了回交。通过监测在种子中产生紫色的花青素通路报告基因可鉴定在回交过程中失去增变基因活性的mu1系。因为拷贝数的大大减少，和标准玉米近亲交配系的回交大大简化了性状分离分析。等位性用类似的已知突变体测试。利用转座子元件作为探针克隆突变等位基因或替代地探测天然野生型基因，从而克隆了mu1元件。这种方法在种子中鉴定了低肌醇六磷酸的天然和突变基因，这些基因可以为本工艺中已知的方法所分离纯化和测序。
作为克隆功能性基因的一种有效方法，发现可突变等位基因的方法需要用插入元件标记的突变基因、该元件的克隆、确认该克隆复原的分析手段以及简单的遗传学测试。报告基因活性的丢失被用于显示增变基因活性的丢失。通常该过程包括一个名为共分离的过程。这需要选择和收获用于分子克隆的组织；从不同系的杂交后代制备DNA；从每种植物系的几种m/m(隐性突变基因纯合体)个体和几种M/M个体(野生型基因纯合体)制备样品。下一步，在用5-甲基胞嘧啶不敏感、不能消化标记突变体的mu1元件的酶消化后对从mu标记的材料得到的DNA进行Southern印迹杂交。定位和鉴定所有在m/m个体中出现而在M/M个体中不出现的条带。制备m/m个体的DNA库并制备三种不同系的样品。搜索和选择最深并且三系都共有的唯一双倍体片段。这个共分离过程将鉴定标记突变体基因的mu-元件。结果通过与分离实验的匹配进行确认。通过无共迁移迹象分离条带最少的植物系的定位从Southern印迹杂交中鉴定片段。通过该系大量m/m和M/M后代的样品的分析以评估条带和表型之间的统计学显著性。多种酶被用于此确认过程。用几种酶对此种群测试中的显著样品进行消化以筛选不消化该条带的酶。这是通过初始的限制性酶和对该条带消化很弱的酶的双酶解以及高分辨琼脂糖凝胶完成的。然后扩增未被消化DNA的m/m消化库，并且根据大小选择和克隆。
                     基因克隆
由上述方法克隆的基因是编码改变植物中肌醇六磷酸水平的蛋白氨基酸序列的基因。这些基因被命名为肌醇六磷酸(盐)基因(肌醇六磷酸基因)。
                    诱导型启动子
许多混合物在植物中具有控制基因表达的功能。基因表达的诱导剂必须安全并且对植物的农业特性无有害效应。
已知天然产物，如激素，以及其它化学物质影响植物基因表达。植物生长调节因子，包括AAA、乙烯、脱落酸、生长素、水杨酸和其它植物激素都影响基因表达。这些天然化学物质表现为诱导基因表达。影响基因表达的激素，不论是合成的或天然的，都可以用于本发明中。但是应注意避免由于植物内在系统的共激活而导致激活不希望发生的植物生长或避免植物中致死基因的激活。作为诱导剂的激素应是不会激活对终产物有害的代谢途径的激素。
调节外来基因的环境诱导剂包括光、热、低温和空气中不同的气体水平。根据本发明这些调节因素可以单独或联合使用。这些调节因素的实践性略差，因为目前还没有已知的方法可以控制这些众多的环境诱导剂。生长季节较为寒冷或较为多云从而使这些诱导剂不被强烈诱导或不在适当的时候被诱导，这并不是不可能的。所以虽然这些类型的诱导剂可能在本发明中发挥作用，但选择时应小心谨慎。
其它植物基因已为受伤或病原感染时出现的寡糖所诱导，例如，大豆中葡聚糖对丙氨酸氨基裂解酶和查耳酮的诱导，或者马铃薯中受伤类诱导型抑制基因(wound-like inducible inhibition gene)的诱导。这种诱导需要更多工作，因为需要在植物上制造伤口以诱导外源基因。
在大多数情况下，安全并对其所使用的植物没有影响或影响很小的诱导因素是最有用的。诱导剂的优选的外部调控是能在植物生长周期的任何时间、在任何组织中诱导所需基因表达的介质。这需要在使用激活物质如化学物质时被激活或去激活的启动子。在许多种属的植物中通过控制这种应答完成上述调节而只对植物生长产生很小的影响。理想的激活剂是可以用普通的田间设备与其它一些通常在田间施用的物质如除草剂联合使用的化学物质从而避免反复经过田间。替代地，该物质可通过作物撒粉型设备在空中施用。
本发明的至少一个实施例使用了一种已知在被激活剂激活时能容许(导致)保护植物的酶产生的启动子。其中上述的激活剂通常被称为化学安全剂，经常与除草剂一起使用。已经知道用安全剂较低毒性时植物能被更好地保护，使之不受除草剂的伤害。安全剂的一个例子是一种通过使除草剂与谷胱甘肽结合而发挥作用的物质。这是由于受安全剂保护的植物中GST的mRNA水平上升从而使谷胱甘肽-S-转移酶活性(GST)升高的结果。这样安全剂处理增加了基因产物而不对植物产生消极影响。
已知使用磺酰基尿素为除草剂时玉米能为多种试剂所安全化，包括，但不限于，萘甲酸酐、N，N-二烯丙基-2，2-二氯乙酰胺或cyometrinil。在使用安全剂的数小时内chlosulforon和metsulfuron methyl的代谢速率增高。在本发明中与本发明的肌醇六磷酸基因连接的是用作可开关启动子的GST酶启动子。
在本发明中有用的基因诱导剂可以为任何多种的诱导或激活介质。显然US Patent No.5,608,143(以参考的形式结合)和/或WO90/08826(在此参考结合)中名为“基因开关(Gene Switch)”中的诱导剂是有用的。使用一种诱导剂开关基因的方法在本领域中是已知的并可以根据本发明的指导执行。这些方法在WO93/09237中也有所描述。
本发明优选的启动子是这些对除草剂配方中所使用安全剂应答的启动子。在自然界中这些启动子和它们所相关的基因为除草剂中的安全剂所诱导从而保护植物，使之免除没有安全剂时可能产生的伤害。在本发明中这些启动子和异源基因优选地为安全剂所激活和打开或关闭。安全剂优选地加入到除草剂中并且如果植物不具有除草剂抗性的话标记基因可使该植物抗除草剂。作为替代途径化学物质，如除草剂，可以对植物单独施用。当除草剂的主要施用时间明显早于种子发育时这是有用的。
因此本发明提供了制备和应用种子以及源自上述种子的植物和种子的方法，其中通过插入在有义方向编码参与肌醇六磷酸合成的蛋白基因或其片段的反义构建体，种子的肌醇六磷酸含量被完全消除或大大降低。上述基因纵然与弱启动子可操作连接也能预期其将至少大大降低种子的肌醇六磷酸水平。其中构建体与由化学物质或环境因素所诱导，优选地由安全剂诱导的启动子或其它遗传元件可操作地连接，从而当对源自该种子的植物施用化学物质或环境因素后得到的种子与原始种子相比肌醇六磷酸的含量大大减小。
与产生接受诱导的植物的种子相比，优选地，从接受诱导的植物得到的种子肌醇六磷酸含量按重量计算小于对照的5％，优选地按重量计算肌醇六磷酸含量小于对照的2％，，优选地按重量计算肌醇六磷酸含量小于对照的1％。
本领域的普通技术人员会理解测量肌醇六磷酸含量的通常方法需要破坏种子从而使这些对比值经常为本文所述产生的种子样品的平均值。和相对于亲本种子肌醇六磷酸含量的下降无关，本发明的一个方面是提供在对亲本植物诱导后不能发育的种子。
在另一实施例中本发明提供了制备和应用种子以及源自上述种子的植物和种子的方法，其中通过插入天然基因或其片段的有义构建体，使含有低肌醇六磷酸突变体的种子的肌醇六磷酸含量得以恢复，即被突变以产生低肌醇六磷酸表型的天然基因，纵然与弱启动子可操作连接也能预期其将，或已知其将，提高种子的肌醇六磷酸水平。其中构建体与由化学物质或环境因素所诱导，优选地由安全剂诱导的启动子或其它遗传元件可操作地连接，从而当对源自该种子的植物施用化学物质或环境因素后得到的种子与原始种子相比肌醇六磷酸的含量增加。与产生接受诱导的植物的种子相比，优选地，从接受诱导的植物得到的种子肌醇六磷酸含量的增加按重量计算大于对照的5％，优选地按重量计算肌醇六磷酸含量增加大于对照的8％，，优选地按重量计算肌醇六磷酸含量的增加大于对照的10％。
本领域的普通技术人员会知道本发明的肌醇六磷酸含量低或减少的植物和种子可通过单独转化编码肌醇六磷酸酶的核酸分子，优选地与本发明的启动子可操作地连接，而实现，或与此处描述的肌醇六磷酸基因及其变体共同转化而实现。谷粒发育过程中这些肌醇六磷酸酶(降解肌醇六磷酸的酶)的表达可用于降解发育中的种子合成的肌醇六磷酸。肌醇六磷酸酶编码序列是已知的，如NCBI中或其它地方已发表的，登记号为：P34752gi|464382|sp|P34752|PHYA_ASPNG [464382]；P34753，gi|464381|sp|P34753|PHYA_ASPAW[464381]；2599490(AF029053)phyb13precursor[Bacillus subtilis]gi|2599490[2599490]；1IHPgi|2981783|pdb|1IHP|[2981783]；3150040(U85968)gi|3150040[3150040]；2943981(U92439)phytase[Enterobacter cloacae]gi|2943981[2943981]；P34754 gi|464385|sp|P34754|PHYB_ASPNG[464385]；P34755gi|464384|sp|P34755|PHYB_ASPAW[464384]；P07102gi|130735|sp|P07102|PPA_ECOLI[130735]；2108356(U59802)phytase[Talaromyces thermophilus]gi|2108356[2108356]；2108354(U59804)phytase[Aspergillus fumigatus]gi|2108354[2108354]；2108352(U59803)phytase[Emericella nidulans]gi|2108352[2108352]；2300890(A46793)gi|2300890|gnl|PID|e306401[2300890]；2300889(A46793)gi|2300889|gnl|PID|e306184[2300889]；2300887(A46791)gi|2300887|gnl|PID|e306400[2300887]；2300885(A46789)gi|2300885|gnl|PID|e306183[2300885]；2300883(A46787)gi|2300883|gnl|PID|e306182[2300883]；2300881(A46785)gi|2300881|gnl|PID|e306399[2300881]；2300879(A46783)gi|2300879|gnl|PID|e306181[2300879]；2148991(U60412)phytase[Aspergillus terreus]gi|2148991[2148991]；JN0715 3-phytase(EC 3.1.3.8)Bprecursor-Aspergillus ficuum gi|542378|pir||JN0715[542378]；JN0890 acidphosphatase(EC 3.1.3.2)precursor-Aspergillus awamorigi|542377|pir||JN0890[542377]；JN0889 3-phytase(EC 3.1.3.8)A precursor-Aspergillus awamori gi|542376|pir||JN0889[542376]；JN0656 3-phytase(EC 3.1.3.8)A precursor-Aspergillus niger gi|484414|pir||JN0656[484414]；JN0482 3-phytase(EC 3.1.3.8)A-Aspergillus ficuumgi|419906|pir||JN0482[419906]；PQ0641 3-phytase(EC 3.1.3.8)-Aspergillus ficuum(fragments)gi|542374|pir||PQ0641[542374]；S33278phytase P2-Escherichia coli(fragment)gi|421153|pir||S33278[421153]；B36733 acid phosphatase(EC 3.1.3.2)precursor-Escherichia coligi|96267|pir||B36733[96267]；S18408 alkaline phosphatase(EC 3.1.3.1)-ratgi|111353|pir||S18408 111353]；1943870(U59806)phytase[Thielaviaheterothallica]gi|1943870[1943870]；1943868(U59805)phytase  [Aspergillus terreus]gi|1943868[1943868]；1938256(U75531)phytase[Zeamays]gi|1938256[1938256]；all sequences and text of US patent5593963，including，gi|1831488|pat|US|5593963|20 1831488]；408990phytase{EC 3.1.3.26}[Aspergillus ficuum，Peptide，441 aa][Aspergillusficuum]gi|408990|bbs|130910[408990]；235916 gi|235916|bbs|58159[235916]；235915 gi|235915|bbs|58160[235915]；2393 gi|2393[2393]；allsequences and text of US-5436156，including gi|912286|pat|US|5436156|32[912286]；583196(A19452)gi|583196 [583196]；583194(A19451)gi|583194[583194]；166521(M94550)gi|166521[166521]；166519(L02421)phytase[Aspergillus niger]gi|166519[166519]；166482(L02420)acid phosphatase[Aspergillus niger]gi|166482[166482]；304097(L20567)phyB Aspergillusniger]gi|304097[304097].对本发明有用的方法和构建体也可在U.S.Patent No.s 5,770,413到5,593,963中找到。
如本领域中已知的那样，在进一步的实施例中构建体和启动子或其它遗传元件与标记基因可操作地连接。
在本发明的一个实施例中本发明的实施例中所描述的植物和种子为玉米、大豆、大米、燕麦、向日葵、小麦、大麦、饲料草、等等，中的一种。
                       构建体
本发明包括具有与肌醇六磷酸基因连接的启动子的构建体，该启动子受外来控制从而在被激活时使得种子中肌醇六磷酸的含量如此之低以至于种子不能发芽(即不能形成可成熟的植物)。该构建体可被转化入任何多种可转化的植物中。基因在构建体中的取向决定该基因是将被上调，有义取向，或被下调，反义取向。
图1为根据本发明的构建体的二元示意图。此构建体主要是为用于农杆菌转化而开发的。因此它主要是为在双子叶植物和能为农杆菌转化的单子叶植物中的应用而开发的。该构建体含有右侧T-DNA边界、NOS启动子、NPTII标记基因和NOS终止子、诱导型启动子，此例中为GSTII启动子序列，和有义取向的肌醇六磷酸盐基因、NOS终止子和左侧T-DNA边界。该构建体对于大豆和类似植物的育种是理想的。标记基因可选择除草剂抗性基因如增甘磷(glyphosate)抗性基因。
图2为根据本发明的为在双子叶植物和能为农杆菌转化的单子叶植物中的应用而开发的构建体的二元示意图。该构建体含有右侧T-DNA边界、NOS启动子、NPTII标记基因和NOS终止子、诱导型启动子，此例中为编码U.S.Patent No.5,608,143中所描述的编码cDNA克隆5-2的基因和图5中所示序列(储存于American TypeCulture Collection，ATCC，Manassas VA，索取号.67804)(该专利以参考的形式结合与此)的诱导型启动子区域，和反义取向的肌醇六磷酸基因、NOS终止子和左侧T-DNA边界。通过含安全剂的除草剂的施用或安全剂的单独施用激活该启动子从而表达上述基因所表达的蛋白。
图3示明带启动子的构建体，在此例中启动子区域源自编码U.S.Patent No.5,608,143中所描述的编码cDNA克隆5-2的基因和图5中所示序列(储存于American Type Culture Collection，ATCC，Manassas VA，索取号.67804)，本发明中的肌醇六磷酸基因和NOS终止子。肌醇六磷酸基因处于有义取向。施用激活剂时启动子被打开，基因表达其所编码的氨基酸序列。
图4示明带GSTII启动子的构建体，根据本发明的肌醇六磷酸基因和NOS终止子。肌醇六磷酸基因处于反义取向。
这些构建体的不同形式可被转化入玉米、大豆、水稻、燕麦、向日葵、小麦、大麦、饲料草、等等。本发明包括针对这些植物中的每一种进行优化的构建体，例如，密码子和启动子等等的优化，以及其它任何增强表达的过程和为产生活性酶或理想的反义或共抑制效应而优化的构建体。例如这些构建体可被用于制造已经存在的通过外部施用激活剂进行调节的低肌醇六磷酸突变体。构建体中的启动子可启动以诱导基因表达，或者激活剂可通过诱导启动子关闭而停止基因的表达。类似地，基因在构建体中的取向可以是有义取向或反义取向，有义取向上调基因表达而反义取向下调基因表达。这样可以通过启动子的诱导打开或诱导关闭或该变基因的取向达到同一效果。
                        转化
附图的前四幅示明了根据本发明的载体的示意图。前两幅图是适用于农杆菌转化的构建体。后二幅是用于其它转化技术，如微粒轰击(micro particle bombardment)，的质粒。这些转化技术在本领域中是广为人知的。另外，这些质粒可很好地应用于以参考形式结合于此的U.S.Patent No.5,302,523和U.S.Patent No.5,464,765中所描述的触须转化系统(whiskers transformation system)。例1
有四种方法制造本发明的低肌醇六磷酸种子材料。优选的方法给农民提供的种子产品是低肌醇六磷酸并且同时不能发芽的从而使种子不能产生成熟的植物。本发明的优选的种子在载培的品种不是杂种时防止农民保留种子。尽管开发小麦和canola杂种可能性的研究正在进行，目前大多数canola、小麦和大豆都不是以杂种出售的。如果植物不是以杂交种子商品化，而是象小麦和大豆一样形成种子，那么可以很容易生产根据本发明的材料。
              近亲交配材料的转化体育种
如果启动子的诱导使基因打开，并且基因处于反义取向，那么激活剂的施用将产生肌醇六磷酸水平很低的种子。这种种子将不会发芽。优选地激活剂在谷粒灌浆时或稍稍在灌浆之前施用。如果启动子是GSTII或其它安全剂诱导的启动子的话激活剂优选地为可加入到除草剂的安全剂。这样在扩增种子时不对种子喷激活剂，这使产生的种子具有正常水平的肌醇六磷酸。然而当种子被出售给农民以生产低肌醇六磷酸含量的谷粒时应对植物施用激活剂以生产低或无肌醇六磷酸的种子。由于种子的肌醇六磷酸含量低激活剂还将使种子不能发芽。这样大豆或其它植物种属的种子在随后的季节里不会成长为自发植物种子也不能被保留到以后的年份里用于种植。
在本实施例中本发明提供了一种含有肌醇六磷酸含量足够发芽的成熟种子；该种子含有基因构建体，该构建体含有与在有义方向编码肌醇六磷酸的核酸分子或其片段或其等位变体可操作地连接的启动子，上述核酸分子在构建体中相对于启动子被置于反义方向，从而当从成熟种子长成的植物中的启动子被激活剂激活时得到的种子将不会发芽。本发明提供了从成熟的种子得到的植物以及减少自发植物的生长和减少保留的种子中可发芽种子数量的方法，该方法包括对种子施用激活剂。
如果启动子的诱导使基因关闭，并且基因处于有义方向，那么该植物在没有含启动子和基因的构建体时必须含有在种子中产生的肌醇六磷酸水平很低的该基因的突变体，从而种子在没有含启动子和基因的构建体时不能发芽。对从含有本实施例的构建体的成熟种子产生的植物施用激活剂将产生肌醇六磷酸含量很低的不能发芽的种子或胚。如果启动子是或含有图5种所示的启动子片段的话那么激活剂优选地为加入到除草剂的安全剂。该激活剂优选地为取代苯磺胺。这样在扩增种子时，即种植本实施例的成熟种子的后代以增加本实施例的成熟种子的数量时，不对从本实施例的成熟种子得到的植物喷洒激活剂。但是当种植本实施例的中种子是为了给农民或最终用户提供种子或谷粒时应对从本发明本实施例的成熟种子得到的植物施用激活剂以产生低肌醇六磷酸、不能发芽的发育中的种子(胚或未成熟种子)。这将导致产生肌醇六磷酸含量很低并且不能发芽的种子。这样大豆或其它植物种属的种子在随后的季节理不会成长为自发植物种子也不能被保留到以后的年份里用于种植。
在本实施例中本发明提供了一种含有肌醇六磷酸含量足够发芽的成熟种子，其中充足含量的肌醇六磷酸中至少一部分是由含有与编码肌醇六磷酸的核酸分子可操作连接的启动子的遗传构建体提供，这样当对从成熟种子发育成的植物中的启动子被激活剂激活时将由植物产生不能发芽的不成熟种子或胚。本实施例的种子在没有构建体时不能产生充足的肌醇六磷酸以发芽。本发明提供了从成熟的种子得到的植物以及减少自发植物的生长和减少保留的种子中可发芽种子数量的方法，该方法包括对种子施用激活剂。
如果启动子的诱导使基因打开，并且基因处于有义方向，那么植物应含有在种子中产生的肌醇六磷酸水平极低的突变基因。这样的种子将不能发芽。在本实施例中激活剂的施用由于提高了产生的肌醇六磷酸水平而恢复种子的发芽性。如果启动子是或含有图5种所示的启动子片段的话那么激活剂优选地为加入到除草剂的安全剂。该激活剂优选地为取代苯磺胺。这样在扩增种子时，即种植本实施例的成熟种子的后代以增加本实施例的成熟种子的数量时，对从本实施例的成熟种子得到的植物喷洒激活剂。但是当种植本实施例中的种子是为了给农民或其它用户提供低肌醇六磷酸含量的种子或谷粒时应施用激活剂。这将导致产生肌醇六磷酸含量很低并且不能发芽的种子。这样大豆或其它植物种属的种子在随后的季节里不会成长为自发植物种子也不能被保留到以后的年份里用于种植。
在本实施例中本发明提供了一种含有肌醇六磷酸含量足够发芽的成熟种子，其中充足含量的肌醇六磷酸中至少一部分是由含有与编码肌醇六磷酸的核酸分子可操作连接的启动子的遗传构建体提供，这样当对从成熟种子发育成的植物中的启动子被激活剂激活时将由植物产生能发芽的种子或胚。本实施例的成熟种子在没有构建体时不能产生充足的肌醇六磷酸以发芽。本发明提供了从成熟的种子得到的植物以及减少自发植物的生长和减少保留的种子中可发芽种子数量的方法，该方法包括对植物施用激活剂。
如果启动子的诱导使基因关闭，并且基因处于反义取向，那么植物在启动子和可操作连接的基因之外应含有能在种子中产生正常水平肌醇六磷酸的正常或天然基因。这样的种子在带有启动子和可操作连接的基因时将不能发芽。激活剂的施用将恢复肌醇六磷酸的产生，从而带有本实施例中的启动子和可操作连接的基因的种子将正常发芽。如果启动子是或含有图5种所示的启动子片段的话那么激活剂优选地为加入到除草剂的安全剂。该激活剂优选地为取代苯磺胺。这样在扩增种子时，如上文所描述，对从本实施例的成熟种子得到的植物喷洒激活剂。但是种子是作为低肌醇六磷酸含量的种子提供给农民或其它最终用户时应施用激活剂。这将导致产生肌醇六磷酸含量很低的种子，低肌醇六磷酸和缺少激活剂将使种子不能发芽。这样大豆或其它植物种属的种子在随后的季节里不会成长为自发植物种子也不能被保留到以后的年份里用于种植。
在本实施例中本发明提供了一种含有肌醇六磷酸含量足够发芽的成熟种子；该种子含有基因构建体，该构建体含有与在有义方向编码肌醇六磷酸的核酸分子或其片段或其等位变体可操作地连接的启动子，上述核酸分子在构建体中相对于启动子被置于反义方向，从而当从成熟种子长成的植物中的启动子被激活剂激活时得到的种子或胚将会发育。本实施例的种子在没有构建体时能制造至少足够发芽的肌醇六磷酸。构建体中核酸分子的反义设置使肌醇六磷酸的含量降低得除非施用激活剂否则从成熟种子长成的植物得到的种子或胚不能发芽。本发明提供了从成熟的种子得到的植物以及减少自发植物的生长和减少保留的种子中可发芽种子数量的方法，该方法包括对种子施用激活剂。
其它基因取向和启动子诱导性的联用以及其它激活剂是已知的。作为安全剂或杀虫剂的激活剂是优选的，因为它减少了覆盖田野一次以上所需的时间和费用。换句话说它提供了作为安全剂或杀虫剂和基因诱导剂的双重用途。
                杂交材料的转化体育种
当植物是杂交植物时，在本发明中有用的基因取向、突变体和野生型组合的数量增加。杂交转化体育种的方法利用了两种近亲交配低肌醇六磷酸突变体形成的杂种，如上文所描述，至少一种突变体带有遗传构建体，该遗传构建体含转化基因或其能编码对产生肌醇六磷酸必须的氨基酸序列的等位基因、取代、缺失或截短变体，优选地该构建体含有在有义方向编码野生型肌醇六磷酸的基因。在种子生产过程中对带有转化的野生型基因的致死突变体进行诱导喷洒。这诱导了启动子，基因打开，产生对维持种子发芽性必须的肌醇六磷酸。这是作为种系的保护者和维持者起作用的。优选地，与最终用户或农民相对，种子的生产者施用激活剂。最终用户或农民只需种植成熟种子。当诱导型启动子是由安全剂激活时，如在优选的实施例中那样，技术人员应了解许多植物杀虫剂可能带有将诱导基因的激活剂，并且应注意在最终用户或农民生产杂交种子时限制或阻碍含安全剂杀虫剂的使用。替代地，可以配制不含本发明的激活剂的杀虫剂以在激活剂/安全剂之外独立使用。在这种情况下单独施用激活剂/安全剂是优选的。
本发明的另一实施例利用转化了野生型基因的野生型植物，上述野生型基因在处于有义方向时产生正常水平的肌醇六磷酸。但是，如这里所描述，在本发明的本实施例中野生型基因处于反义方向并且与诱导型启动子可操作地连接。该基因是处于反义方向的，以在植物受到激活剂化学物质作用时敲除植物中野生型基因的表达。这种反义基因是在田野中通过在谷粒生产之前或者在发育中的种子或胚的发育过程中施用诱导性化学物质而诱导的。
替代地，可使用具有致死肌醇六磷酸水平的天然突变体植物，并改造该植物使之含有在有义方向与诱导型载体可操作连接，如此处所描述，的野生型基因；上述野生型基因的插入使得当启动子在植物中被诱导时该植物过量表达此基因从而能产生将来可发芽的子代种子或胚。诱导型启动子为化学物质所关闭。最终用户或农民在植物开始衰老之前对植物施用，如喷洒，化学激活剂。通过这种方法成熟种子含有产生发芽过程中所需的肌醇六磷酸水平的基因，但该基因被关闭了，并且不施用化学物质，并且野生型基因不表达。
因此本发明提供了一种与编码产生肌醇六磷酸必须的氨基酸序列的核酸分子可操作连接的基因开关。根据待转化组织的遗传上和表型上的背景以及将生产的所需产品(子代种子或胚)，普通技术人员可以根据本发明选择构建体中基因的取向以及具体的启动子开关。实施例2
产生可用于转座子标记的低肌醇六磷酸突变体的方法是一种名为诱变的已知方法。该方法的概要见Neuffer的论文Maize GeneticNewsletter45：146。突变通过用溶于石蜡油中的乙基甲烷磺酸酯根据Neuffer(1974)描述的程序处理近亲交配系植物的花粉而进行。曾经对源自不同基因型的多种谷类植物的近亲交配系进行了这种处理。本例子将集中于通过此过程开发玉米的低肌醇六磷酸突变体。
本发明的过程的总体步骤包括用乙基甲烷磺酸酯，此后用“EMS”表示，处理近亲交配系的花粉(在此例中为玉米的花粉)。近亲交配系花粉被置于溶于油的EMS中45分钟。用画笔将上述花粉刷到受精玉米花穗的穗丝上。这形成突变体-1(M1)种子。这样的种子将生长并自花授粉形成突变体-2(M2)玉米粒。测试M2玉米粒的低肌醇六磷酸表型。
于1998年7月7日按布达佩斯条约保藏于ATCC(美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA)，保藏号为203034的玉米(Zea Mays)近亲交配系EX1965PY是可用作转位子标记和肌醇六磷酸基因分离的本发明的一个优选玉米突变体。替代地也可使用U.S.Patent No.5,689,054中所描述的玉米(Zea maize)lpa1(lpa1-1)和lpa2(lpa2-1)突变体纯合体的种子，它们按布达佩斯条约的要求保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，保藏号分别为97678和97679。本发明的优选肌醇六磷酸基因可从上述保藏材料中得到，优选地通过本领域中已知的转座子标记方法得到。本发明进一步优选的核酸序列包括SEQ ID NO：1，一个编码在SEQ ID NO：2和图8图9中显示的蛋白的序列，和NCBI(National Center for BiologicalInformation)中所发表的登记号为g3108052和g3108052的序列。编码SEQ ID NO：2和图8图9氨基酸序列的核酸序列能编码产生肌醇六磷酸所必须的氨基酸序列的等位基因、替代、缺失或截短变体也包括在内。实施例3
HVPE方法是低肌醇六磷酸突变体的常规测试(Raboy，Maydica35：383)。该方法依赖于磷化合物的差异迁移。在对化合物的电泳分离后一种色谱能相对与其它化合物对肌醇六磷酸半定量。一种替代方法包括在谷粒中筛选更高的无机磷含量。例如，谷粒样品可被碾磨(通过Whiley磨粉机的2mm筛子)然后在15ml 0.4M HCl，0.7 Na2SO4中加入50mg谷粒胚芽或1克胚乳。肌醇六磷酸以铁盐的形式沉淀。在肌醇六磷酸铁中的磷被沉淀并测定磷的含量。肌醇六磷酸磷(mg)乘一个转换系数3.5即得到肌醇六磷酸含量。
肌醇六磷酸测量的原理是已知的。在本发明所使用的方法中5-磺基水杨酸和FeCl3(Wade试剂)形成粉红色的色素。肌醇六磷酸结合此溶液中的铁从而减少粉红的程度。对此颜色的减弱可用于表示肌醇六磷酸的水平。由于空白不含有肌醇六磷酸，所有含肌醇六磷酸样品的读数都为负值。但是，当肌醇六磷酸含量太高时铁-肌醇六磷酸复合物形成白色乳状物质沉淀。在这种情形下粉红色不存在但是白色乳状物质会吸收光从而导致高读数的假象。因此一些肉眼观察是必须的。如果玉米品种具有很高的肌醇六磷酸含量那么有必要使用更少的样品(小于25微升)。
如下所描述的一种快速筛选方法可用于检测可能的低肌醇六磷酸种子。在此方法中用单面刀片恰好在黑色层后切去玉米粒顶端的罩。该切割应横切在或胚根顶端的角质鳞片。通常从每穗玉米上选取8个代表玉米粒。切除表面后玉米粒被置于表面用玻璃纸胶带(胶面向上)覆盖的小板上。在至少100组切割后完成染色步骤。
用重复吸液器将10微升的Wade试剂(如上文描述)滴到每个玉米粒的切割表面上。几分钟后由于角质鳞片中的肌醇六磷酸结合Wade试剂中的铁，颜色消失。观察相对其它组粉红色消失较慢的组(约总数的5％)。这些较慢的组用此处描述的定量方法重新分析。
肌醇六磷酸如下进行定量。单个玉米粒(每组7-10个)用Carverhand-pump press的钢板挤碎(钢板的孔与甘氨酸纸对齐并以1000lbs.的压力挤压时效果最好)并置于1.5ml小微量离心管中。加入1ml盐酸并过夜。第二天颠倒混匀混合物并静置5分钟。在微量离心管中加入15微升上清和100微升缓冲液A(如这里所描述)并混合。低肌醇六磷酸突变体由于种子中很高的磷含量变得很蓝。通常随后重新测试突变体。通过在3784ml水中加入216ml 12.1 N HCl制备0.65N HCl抽提溶液。试剂A当天新鲜配制并包含2份(体积)去离子水、1份(体积)维生素C溶液、1份(体积)钼酸铵溶液和1份H2SO4(体积)。钼酸铵溶液通过将25克(NH4)MO7O24×4H2O溶于1升水而配制。H2SO4溶液通过将167ml 36 N硫酸加入833ml水配制。维生素C溶液通过加入100克L-维生素C用水定容至1L配制。维生素C溶液冰冻保存在7星期内稳定，但未冰冻时只在约两小时内稳定。
肌醇六磷酸标准用本领域中已知的方法制备。
玉米粒(M2)自由磷酸根的肉眼筛选如下。筛选玉米粒，记录表型并置于多孔碾碎板中。用水压将多孔碾碎板中的玉米粒碾碎。碾碎的玉米被转移到1.5ml的微量离心管中。加入0.5ml试剂A。反应2小时后加入0.5ml试剂B。盖上管子并颠倒混合。1小时后根据目测的蓝色程度评测反应，如果有必要可使用光盒(light box)，选出蓝色最深的样品作为磷酸根含量最高的样品。经常选出每组(穗)最蓝的样品并比较以进行最终的选择。此实验的试剂A是由50ml DMSO和50ml试剂B配制成的。试剂B当天新鲜配制，由60ml蒸馏水：30ml10％维生素C溶液(10克维生素C加水至总体积100ml；维生素C溶液冻存并稳定1星期)：30ml 3.5％钼酸铵溶液(2.5克(NH4)6MO7×4H2O加水至总体积100ml)：30ml 6N硫酸溶液(170ml水加25ml浓硫酸，用水定容至200ml)配制而成。
肌醇六磷酸(红色实验)如下进行定量测试。在Carver hand-pump press的碾碎钢板中将12个成熟的种子碾碎。当钢板的孔与称量纸对齐时效果最好。用5000至10000lbs.的压力将玉米粒碾碎并转移到Eppendorf管中。往同一管中加入1ml 0.65N HCl，静置过夜并在第二天颠倒混合。测试时在微量滴定板的每个孔中加入200微升的Wade-A试剂(下文描述)和10微升上一步得到的玉米/HCl汁液抽提物。记录任何颜色变化并且保持红色的样品被记录为低肌醇六磷酸，因为肌醇六磷酸结合铁并使溶液变成无色。可通过分光光度计在490nm测量进行定量。此处的Wade-A试剂是通过将25.4克5-磺基水杨酸和350毫克FeCl3·6H2O加入1.5升蒸馏水而制备的。NaOH调pH值至3.05并定容至2L。此溶液在冻存时约稳定1个月。0.65NHCl是通过将216ml HCl(12.1N)加入到3784ml d.H2O中制备的。此实验能选择含所需等位基因的所需玉米植物。根据本发明的实施例和步骤的进一步细节见1998年7月7日申请的共同未决PCT申请号(未指定)，题为“Animal Feed with Low Phytic Acid，Oil Burdenedand Protein Laden Grain”。上述专利是基于1997年7月7日申请的美国临时申请号60/051,854和60/051,855。这些专利申请的全部内容以参考的形式在本文中引用。检测磷的其它方法是已知的且可用于选择植物。
扩增含所需肌醇六磷酸水平的种子。本发明中进行了此过程并选出了一系列带有低肌醇六磷酸突变的近亲交配系。这包括几种具有良好综合特性的低肌醇六磷酸近亲交配系，它们杂交形成产生根据本发明的谷粒的杂交品种。因此根据本发明开发的近亲交配系是从硬杆、Lancaster和其它通用杂交样式得到的，以使通过适当的杂交样式杂交得到的近亲交配系形成优良的杂交材料。本发明开发的许多突变体尽管肌醇六磷酸含量低，但是与U.S Patent No.5,689,054中分别描述为lpa1-1和lpa2-1的lpa1-R和lpa2-R突变体不是相同的突变体。另外通过常规种子发育实验筛选了这些种子的发芽性。发现一些低肌醇六磷酸突变体不能发芽而另一些正常发芽。只保留了具有良好的发芽特性的种子。
图6示明了从3系用于筛选肌醇六磷酸含量的近亲交配系得到的数据。通过频率分布曲线作图清楚地表明一些样品的肌醇六磷酸含量很低(低于0.5单位(重量百分比))但是大多数样品肌醇六磷酸含量较高。名为UO95的品系由于其较高的平均蛋白和油水平而被选作起始材料。这种种系产生的种子富含蛋白和油并正常发芽。UO95py保留了这些特性并且具有如上文所描述的低肌醇六磷酸水平。当与某些其它近亲交配系杂交时得到的杂交品种产生富含蛋白和油并且肌醇六磷酸水平低的玉米粒。
下表表示根据本发明的突变体玉米与野生型种子肌醇六磷酸含量(mg/g种子)的比较。
种子号 野生型品系 肌醇六磷酸 突变体品系 肌醇六磷酸 ％减少
 24  UU01  1.16  UU01-py  0.17  85.3
 12  UO95  1.85  UO95-py  0.14  92.4
 12  WD22  1.45  WD22-py  0.05  96.6
下边示明根据本发明的近亲交配系的一个例子。
 近亲交配系  蛋白  油  肌醇六磷酸盐
 野生型
 UO95  13.4  606  1.85
 UU01  12.7  2.9  1.16
 B73  11.3  4.4  ----
 WD22  ----  ----  1.45
 突变体  蛋白  油  肌醇六磷酸盐  ％肌醇六磷酸盐减少
 UO95py  14.4  5.3  0.14  85.3
 UU01py  12.2  3.1  0.17  92.4
 B73lpa1-R  13.2  3.2  ----  ----
 WD22py  ----  ----  0.05  96.6
蛋白和油含量的测量是通过用Dickey-John Reflectance Near InfraRed Spectrometer进行NIR分析。
如人们通常所做的那样，通过在配料和烘烤或加工中替代使用本发明的谷粒，本发明的谷粒也可用作制造玉米粉圆饼、玉米粉、和脆玉米片的面粉或玉米粒的替代来源。
通过代替使用根据本发明的谷粒，本发明的谷粒也可在玉米湿磨工业(corn wet milling industry)中用作替代原料以提高碾磨效率和可回收的淀粉含量。作为碾磨过程的副产品的动物饲料的肌醇六磷酸含量也显著降低。例4
选择低肌醇六磷酸的方法在上文已经有所描述。图7示明从分离出低肌醇六磷酸含量(高无机磷)性状的低肌醇六磷酸突变体得到的数据。孟德尔性状分离的证据是很明显的。例5
通过低肌醇六磷酸突变体与含突变因素(转座子标记)的种群杂交可能鉴定出稀有的突变因子标记基因。首先纯合的低肌醇六磷酸植物与转座子标记种群杂交。然后利用生化分析筛选产生的低肌醇六磷酸含量种子(此例中筛选的是磷酸根含量)。用这种方法可能鉴定转座子标记的肌醇六磷酸基因，确定产生低肌醇六磷酸突变的基因。生化筛选的结果在图7中列出。这里列出的是用于无机磷含量分析的转座子标记材料种子的频率分布数据。
发芽实验显示一些低肌醇六磷酸突变体具有可接受的发芽而另一些不发芽。普通技术人员使用此处描述的方法可得到类似的结果。
 事件(Event) 肌醇六磷酸突变体 S98发芽
 mUU01py292 低肌醇六磷酸盐 94
 mUO95 py 1656 低肌醇六磷酸盐 51％
 mUO95 py 1212 低肌醇六磷酸盐 50％
 mUO95 py 1672 低肌醇六磷酸盐 33％
 mUO95 py 2148 低肌醇六磷酸盐 77％
 mUO95 py 2236 低肌醇六磷酸盐 48％
 mWD22py 1104 低肌醇六磷酸盐 48％
 mWD22py 1857 低肌醇六磷酸盐 29％
 mWD22py 2016 低肌醇六磷酸盐 0％
mWD22py 1511 低肌醇六磷酸盐 78％
mTR306 py 510 低肌醇六磷酸盐 61％
TR335-E338 phy 低肌醇六磷酸盐 0％
TR335-E75 phy 低肌醇六磷酸盐 15％
UE95-E3645 phy 低肌醇六磷酸盐 90％
UE95-E3654 phy 低肌醇六磷酸盐 53％
UE95-E3746 phy 低肌醇六磷酸盐 0％
从这些优选的低肌醇六磷酸盐、不发芽材料可用已知的方法克隆测序和操作在本发明中有用的肌醇六磷酸突变体。
此处提及的参考文献的全文引入本申请以作参考。
                          序列表<110>KEELING，PETER L.
 Guan，Hanping
 Chang，Ming-Tang
 Wilhelm，Edward P.<120>用诱导型肌醇六磷酸基因控制发芽<130>2461-16<140><141><160>2<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>1665<212>DNA<213>合成序列<400>1agcctccttc ctcctctcac tctcgctcgc gctgcctcgc tacctcgctt cgcattccat 60tcgaaaagag gggaggaaag gcaagatgtt catcgagagc ttccgcgtcg agagccccca 120cgtgcggtac ggcccgatgg agatcgagtc ggagtaccgg tacgacacga cggagctggt 180acacgagggc aaggacggcg cctcacgctg ggtcgtccgc cccaagtccg tcaagtacaa 240cttccggacc agaaccgccg tccccaagct cggggtgatg cttgtggggt ggggaggcaa 300caacgggtcc acgctgacgg ctggggtcat tgccaacagg gaggggatct catgggcgac 360caaggacaag gtgcagcaag ccaactacta cggctccctc acccaggcct ccaccatcag 420agtcggcagc tacaacgggg aggagatcta tgcgccgttc aagagcctcc ttcccatggt 480gaacccagac gacattgtgt tcggaggctg ggacattagc aacatgaacc tggccgactc 540catgaccagg gccaaggtgc tggatattga cctgcagaag cagctcaggc cctacatgga 600gtccatggtg ccacttcccg gtatctatga tccggacttc atcgcggcta accagggctc 660tcgcgccaac agtgtcatca agggcaccaa gaaagaacag gtggagcaga tcatcaagga 720tatcagggag tttaaggaga agaacaaagt ggacaagata gttgtgttgt ggactgcaaa 780cactgaaagg tatagcaatg tgtgcgctgg tctcaacgac acgatggaga atctactggc 840atctgtggac aagaacgagg cggaggtatc accatcaaca ctatatgcca ttgcctgtgt 900catggagggg gtgccgttca tcaatgggag cccccagaac acctttgtgc ctgggctgat 960tgatcttgct ataaaaaaca actgcttgat tggtggtgac gacttcaaga gtggacagac 1020caagatgaaa tctgtcttgg tcgatttcct tgttggtgct ggaataaagc ccacctcaat 1080cgtgagctac aaccacttgg gaaacaacga tggcatgaac ctgtctgccc ctcaagcatt 1140caggtccaag gagatctcca agagcaacgt ggtggatgac atggtctcga gcaatgccat 1200cctctatgag cccggcgagc atcccgatca tgtcgttgtc atcaagtatg tgccgtacgt 1260gggagacagc aagagggcta tggacgagta cacctcagag atcttcatgg gcggcaagaa 1320caccatcgtg ctgcacaaca cctgtgagga ctcgctcctc gccgcaccta tcatccttga 1380tctggtgctc ttggctgagc tcagcaccag gatccagctg aaagctgagg gagaggacaa 1440attccactcc ttccacccgg tggccaccat cctgagctac ctcaccaagg cacccctggt 1500tccccctggc acaccggtgg tgaacgctct ggccaagcag agggcgatgc tggagaacat 1560catgagggcc tgcgttgggc tggccccaga gaacaacatg atcctggagt acaagtgagc 1620caagtggcgt gccctgcagc gcgaggttag ctgctggaag ggaac                 1665<210>2<211>510<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的描述C：CDNA<400>2Met Phe Ile Glu Ser Phe Arg Val Glu Ser Pro His Val Arg Tyr Gly1               5                  10                  15Pro Met Glu Ile Glu Ser Glu Tyr Arg Tyr Asp Thr Thr Glu Leu Val
         20                  25                  30His Glu Gly Lys Asp Gly Ala Ser Arg Trp Val Val Arg Pro Lys Ser
     35                  40                  45Val Lys Tyr Asn Phe Arg Thr Arg Thr Ala Val Pro Lys Leu Gly Val
 50                  55                  60Met Leu Val Gly Trp Gly Gly Asn Asn Gly Ser Thr Leu Thr Ala Gly65                  70                  75                  80Val Ile Ala Asn Arg Glu Gly Ile Ser Trp Ala Thr Lys Asp Lys Val
             85                  90                  95Gln Gln Ala Asn Tyr Tyr Gly Ser Leu Thr Gln Ala Ser Thr Ile Arg
        100                 105                 110Val Gly Ser Tyr Asn Gly Glu Glu Ile Tyr Ala Pro Phe Lys Ser Leu
    115                 120                 125Leu Pro Met Val Asn Pro Asp Asp Ile Val Phe Gly Gly Trp Asp Ile
130                 135                 140Ser Asn Met Asn Leu Ala Asp Ser Met Thr Arg Ala Lys Val Leu Asp145                 150                 155                 160Ile Asp Leu Gln Lys Gln Leu Arg Pro Tyr Met Glu Ser Met Val Pro
            165                 170                 175Leu Pro Gly Ile Tyr Asp Pro Asp Phe Ile Ala Ala Asn Gln Gly Ser
        180                 185                 190Arg Ala Asn Ser Val Ile Lys Gly Thr Lys Lys Glu Gln Val Glu Gln
    195                 200                 205Ile Ile Lys Asp Ile Arg Glu Phe Lys Glu Lys Asn Lys Val Asp Lys
210                 215                 220Ile Val Val Leu Trp Thr Ala Asn Thr Glu Arg Tyr Ser Asn Val Cys225                 230                 235                 240Ala Gly Leu Asn Asp Thr Met Glu Asn Leu Leu Ala Ser Val Asp Lys
            245                 250                 255Asn Glu Ala Glu Val Ser Pro Ser Thr Leu Tyr Ala Ile Ala Cys Val
        260                 265                 270Met Glu Gly Val Pro Phe Ile Asn Gly Ser Pro Gln Asn Thr Phe Val
    275                 280                 285Pro Gly Leu Ile Asp Leu Ala Ile Lys Asn Asn Cys Leu Ile Gly Gly
290                 295                 300Asp Asp Phe Lys Ser Gly Gln Thr Lys Met Lys Ser Val Leu Val Asp305                 310                 315                 320Phe Leu Val Gly Ala Gly Ile Lys Pro Thr Ser Ile Val Ser Tyr Asn
            325                 330                 335His Leu Gly Asn Asn Asp Gly Met Asn Leu Ser Ala Pro Gln Ala Phe
        340                 345                 350Arg Ser Lys Glu Ile Ser Lys Ser Asn Val Val Asp Asp Met Val Ser
    355                 360                 365Ser Asn Ala Ile Leu Tyr Glu Pro Gly Glu His Pro Asp His Val Val
370                 375                 380Val Ile Lys Tyr Val Pro Tyr Val Gly Asp Ser Lys Arg Ala Met Asp385                 390                 395                 400Glu Tyr Thr Ser Glu Ile Phe Met Gly Gly Lys Asn Thr Ile Val Leu
            405                 410                 415His Asn Thr Cys Glu Asp Ser Leu Leu Ala Ala Pro Ile Ile Leu Asp
        420                 425                 430Leu Val Leu Leu Ala Glu Leu Ser Thr Arg Ile Gln Leu Lys Ala Glu
    435                 440                 445Gly Glu Asp Lys Phe His Ser Phe His Pro Val Ala Thr Ile Leu Ser
450                 455                 460Tyr Leu Thr Lys Ala Pro Leu Val Pro Pro Gly Thr Pro Val Val Asn465                 470                 475                 480Ala Leu Ala Lys Gln Arg Ala Met Leu Glu Asn Ile Met Arg Ala Cys
            485                 490                 495Val Gly Leu Ala Pro Glu Asn Asn Met Ile Leu Glu Tyr Lys
        500                 505                 510

Claims (32)

1.一种转基因植物，其含有包含编码调节所述植物产生肌醇六磷酸的所选择基因产物的异源核酸序列的遗传构建体。
2.根据权利要求1的转基因植物，其中所述的核酸序列与由激活剂诱导的启动子可操作地连接。
3.根据权利要求1的转基因植物，其中所述的植物还含有导致该植物形成低肌醇六磷酸水平的突变等位基因。
4.根据权利要求1的转基因植物，其中所述的植物还含有野生型肌醇六磷酸盐基因，它导致该植物形成充分的肌醇六磷酸水平使该植物在没有上述构建体时产生可发芽的子代种子。
5.根据权利要求3的转基因植物，其中所述的启动子是活跃的，直至激活剂施用到上述植物，并且所述的核酸序列以有义取向连接。
6.根据权利要求3的转基因植物，其中所述的启动子是不活跃的，直至激活剂施用到上述植物，并且所述的核酸序列以有义取向连接。
7.根据权利要求4的转基因植物，其中所述的启动子是不活跃的，直至激活剂施用到上述植物，并且所述的核酸序列以反义取向连接。
8.根据权利要求4的转基因植物，其中所述的启动子是活跃的，直至激活剂施用到上述植物，并且所述的核酸序列以反义取向连接。
9.根据权利要求3的转基因植物，其中的核酸序列编码肌醇六磷酸突变基因的产品，可从选自下列一组的玉米突变植物得到，该组植物包括UO95py、lpa1-1(ATCC保藏号97678)、lpa2-1(ATCC保藏号97679)，以及它们的等位、截短、替代和缺失变体。
10.根据权利要求9的转基因植物，其中所述的基因产物可由mu转座子标记的方法得到。
11.根据权利要求4的转基因植物，其中所述的野生型肌醇六磷酸基因可由mu转座子标记含肌醇六磷酸植物的方法得到。
12.根据权利要求4的转基因植物，其中所述的野生型肌醇六磷酸基因为编码SEQ ID NO：2的核酸序列。
13.根据权利要求4的转基因植物，其中所述的野生型肌醇六磷酸基因是SEQ ID NO：1。
14.根据权利要求1的转基因植物，其中所述的植物选自由玉米、大豆、水稻、燕麦、向日葵、小麦、大麦、黑麦和饲料草组成的一组植物。
15.根据权利要求2的转基因植物，其中所述的激活剂是选自下列一组化合物，该组化合物包括：2-氯-N-(甲基氨基羰基)苯磺酰胺、1-(正-丁基)-3-甲基磺酰脲、甲基2-〔(氨基羰基)氨基磺酰基〕苯甲酸酯、N-异丙基氨基甲酰苯磺酰胺、N-(氨基羰基)-2-氯苯磺酰胺和N’-〔2-(正-丁基氨基羰基)〕-6-氯-N，N-二甲基-1，2-苯二磺酰胺。
16.能转化植物的重组遗传构建体，包括一编码调节肌醇六磷酸产生的基因产物并且3’与核酸启动子序列可操作连接的核酸序列。
17.根据权利要求16的重组遗传构建体，其中所述的核酸启动子序列在图5中示明。
18.根据权利要求16的重组遗传构建体，其中所述的核酸启动子序列可通过施用N，N-二烯丙基-2，2-二氯乙酰胺诱导。
19.根据权利要求16的重组遗传构建体，其中所述的核酸启动子序列可由选自下列一组的化合物诱导，该组化合物包括：N，N-二烯丙基-2，2-二氯乙酰胺、苯基-2-氯-4-(三氟甲基)-5-噻唑-羧基酯、萘-1，8二羧基酐、2-二氯甲基-2-甲基-1，3-二氧戊环。
20.产生种子的一种方法包括以下步骤：
种植含可由激活剂活化、可外部诱导的重组DNA载体的成熟种子，所述重组DNA载体含至少一段编码所选基因产物的核酸序列，上述所选基因产物导致致死的低量肌醇六磷酸；
对从上述成熟种子产生的植物施用激活剂从而该核酸序列被诱导产生上述所选的基因产物。
在施用激活剂后收获从上述植物产生的子代种子。
21.产生种子的一种方法，包括以下步骤：
种植含可由激活剂去活化、可外部诱导的重组DNA载体的成熟种子，上述重组DNA载体含至少一段编码所选基因产物的核酸序列，上述所选基因产物导致致死的低量肌醇六磷酸；
对从上述成熟种子产生的植物施用激活剂从而该核酸序列被诱导停止编码上述所选的基因产物。
在施用激活剂后收获从上述植物产生的子代种子。
22.从根据权利要求5的转基因植物得到的子代种子。
23.从根据权利要求6的转基因植物得到的子代种子。
24.从根据权利要求7的转基因植物得到的子代种子。
25.从根据权利要求8的转基因植物得到的子代种子。
26.根据权利要求1的植物，它是双子叶植物。
27.根据权利要求1的植物，它是单子叶植物。
28.根据权利要求1的植物，它是禾本科(Gramineae)植物。
29.至少一个亲本为根据权利要求1的植物的杂交植物。
30.由根据权利要求1的植物产生的子代种子。
31.从根据权利要求1的植物产生的不发芽谷粒。
32.分离纯化的编码肌醇六磷酸的核酸序列，它由以下方法产生，包括：
将低肌醇六磷酸纯合突变体植物与含增变基因的植物种群杂交；
鉴定低肌醇六磷酸含量的增变基因标记的子代种子；
从上述子代种子克隆和分离所述的核酸序列。
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