CN1262566C - 低氧亲合力突变型血红蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明提供非天然突变型血红蛋白rHb(βN108Q)和rHb(βL105W)，它们的氧亲合力低于天然血红蛋白，但氧结合协同性很高。rHb(βN108Q)还具有更高的抗自动氧化稳定性。本发明突变型血红蛋白的制备优选重组DNA方法。本发明的突变型血红蛋白可用作血液代用品和血红蛋白类药物的组分。
Description
致谢
本发明得到了政府的第HL-24525和HL-58249号资助。因而，政府对本发明享有当然的权利。
技术领域
总的说来，本发明涉及新的突变型血红蛋白，更具体地说是关于重组突变型血红蛋白“rHb(βN108Q)”(即“rHb(β108Asn→Gln”)和rHb(βL105W)”(即“rHb(β105Leu→Trp”)，它们的氧亲合力低而氧结合协同性高。特别是rHb(βN108Q)，与其他已知低氧亲合性突变型血红蛋白相比，它具有更高的抗自动氧化性。本发明还涉及通过DNA重组技术制备突变型血红蛋白的方法，用它们替代红细胞和用于基于血红蛋白的治疗。
技术背景
由于人血制品中的红细胞易被HIV和肝炎等传染性病原污染，再加上来自合适供血者的血液储备短缺，人们对开发红细胞代用品，尤其是人血红蛋白(Hb)及其衍生物给予了极大关注。
基于血红蛋白的氧载体可作为急救中的血源。参考例如Winslow，R.M.等，“基于血红蛋白的红细胞代用品”，Johns Hopkins University Press，Baltimore(1992)(下文简称“Winslow等(1992)”。
血红蛋白是血液中的载氧组分，通过红细胞内的血流进行循环。人的正常成熟血红蛋白(HbA)是一种四聚体蛋白，分子量约为64,500，具有两条相同的α链和两条相同的β链，各长141和146个氨基酸残基，各链各自带有称为血红素的辅基(prosthetic group)。红细胞帮助血红蛋白保持于还原态亦即功能态。血红素-铁原子很容易被红细胞内两种系统之一氧化并可再度还原，所述系统即细胞色素b5系统和谷胱甘肽还原系统。有关血红蛋白，可参考Dickerson，R.E.等，
血红蛋白： 结构、功能、进化和病理学，Benjamin/Cummings，Menlo Park，CA(1983)(下文简称“Dickerson，R.E.等(1983)”)。
HbA的氧合是一个协同过程，即，第一个氧分子的结合增强了第二、第三和第四个氧分子的结合。该氧合过程还受到各氨基酸残基与异向变构效应物之类溶质之间相互作用的调控。此类效应物包括铁或诸如氢离子、氯化物、二氧化碳、无机磷酸盐和有机聚阴离子(例如2，3-二磷酸甘油酸(酯)(2，3-BPG))和肌醇六磷酸酯/盐(IHP)等分子。
血红蛋白由于其对变构效应物2，3-BPG的依赖性能够改变自身的氧亲合力，从而提高体内的氧转运效率。2，3-BPG在红细胞内的浓度令血红蛋白将所结合的氧释放给组织。缺乏2，3-BPG时，血红蛋白与氧的结合非常紧密，不易释放。如果单纯将HbA分子引入一受主，由于血浆中缺少降低Hb氧亲合力的2，3-BPG，它将不能将氧传递给机体组织。参考Winslow等(1992)。任何欲具有基于Hb的氧载体或血红蛋白类药物功能的Hb都必须能够有效的递送出氧，即，它们必须象HbA在红细胞中那样进行协同性的加载和卸载。
人们研究用血红蛋白的无细胞溶液作为潜在的载氧红细胞代用品已有相当长的时间。参考例如Mulder，A.G.等，
细胞组分生理学，5：383(1934)。然而，除了前文所述的易受污染和来源有限之外，使用自红细胞纯化所得的无修饰无细胞人血红蛋白还存在多方面的限制，即，因缺少2，3-BPG之类变构效应物所致的氧亲合力升高，以及Hb四聚体解离为αβ二聚体被肾过滤清除并可能造成慢性肾损伤。参考例如Bunn，H.F.等，实验医学杂志，129：909(1969)。
目前，已在以下系统中表达了人的珠蛋白和血红蛋白：转基因小鼠，参考例如Chaka，K.等，
自然(London)，314：377(1985)和Townes，T.M.等，
EMBO J.4：1715(1985)；转基因猪，Swanson，M.E.等，
生物/技术10：577(1992)；昆虫细胞培养物，Groebe，D.R.等，
蛋白质表达与纯化3：134(1992)；酵母，Wagenback，M.等，
生物/技术9：57(1991)和DeLiano，J.J.等，
美国科学院院报90：918(1993)；和大肠杆菌(E.coli)，Hoffman，S.J.等，
美国科学院院报87：8521(1990)，Hernan，R.A.等，
生物活性31：8619(1992)和Shen，T.J.等，
美国科学院院报90：8108(1993)(下文简称“Shen等(1993)”)。在许多方面，大肠杆菌是实现所述表达的最佳选择，因为其表达效率高，定点诱变容易。
已知，HbA的天然N末端缬氨酸对于调节氧亲和力具有重要作用即Bohr效应，而且，据Bunn，H.F.等编撰的
血红蛋白的分子、基因和临床研究(W.B.Saunders，Co.，Philadelphia，PA)pp.37-60(1986)(下文简称“Bunn，等(1986)”)，它与变构效应物和阴离子之间存在相互作用。据Kavanaugh，J.S.等报道(
生物活性31：8640(1992))，额外的甲硫氨酸可改变Hb分子的N末端构象。可见，Hb的氧合特性取决于N末端残基的完备性，因此，可以通过保留和去除大肠杆菌表达的Hb的α和β两珠蛋白N末端的外部甲硫氨酸残基来制造所需的非修饰Hbs和突变Hbs。
以hill系数(nmax)表征的Hb协同氧合作用是衡量其氧合特性的简便指标。参考Dickerson等)(1993)。HbA在常用试验条件下与O2结合的nmax约为3。通常，与HbA相比，α1β2(或α2β1)亚基界面包含氨基酸取代的异常人Hb其氧亲合力提高而O2结合协同性降低。参考例如Dickerson等(1993)；Bunn等(1986)和Pertuz，M.F.等，
蛋白质协同性和变构调节作用的机制，Cambridege UniversityPress(1990)。
氧合HbA(携有氧分子的HbA)在α1β2亚基界面内的α94Asp和β102Asn之间具有特征性的氢键(Shaanan，B.等，
分子生物学杂志171：31(1983)，下文简称“Shaanan 等(1983)”)。α94Asp 被取代，例如HbTitusville(α94Asp→Asn)(Schneider，R.G.等，
生物化学与生物物理学学报400：365(1975))或β102Asn被取代，例如Hb Kansa(β102Asn→Thr)(Bonaventura等，
生 物化学杂志243：980(1968))，或α1β2亚基界面内发生其他突变的人Hb都表现出很低的氧亲合力。然而，直接破坏了α94Asp和β102Asn之间氢键的这些突变Hb都表现出氧结合中的协同性显著下降，而且容易在连接状态(ligated state)下解离成二聚体。
还发现，在由脱氧状态转化为氧合状态的过程中，HbA的α1β2亚基发生了滑移，而α1β1亚基界面则几乎不变(参考，Pertuz，M.F.，
自然228：726(1970)(Pertuz(1970))；Baldwin，J.M.等
分子生物学杂志129：175(1979)；Baldwin，J.M.等
分子生物学杂志136：103(1980)；Shaanan等(1983)；和Fermi，G.等
分子生物学杂志175：159(1984)(Fermi等(1984)。以上两个亚基界面都具有各自特征性的氢键、盐桥和非共价相互作用。而且，Hb分子脱氧四级(T结构)状态下的氧亲合力低于其氧合四级结构(R结构)，参考Dickerson等(1983)。
与α94Asp和β102Asn无关的低氧亲合力人突变Hb也是存在的。例如，HbPresbyterian(β108Asn→Lys)(Moo-Penn，W.F.等，
FEBS Lett.92：53(1978)和O′Donnell J.K.等，
生物化学杂志269：27692(1994)(下文简称“O′Donnelld等(1994)”)；Hb Yoshizuka(β108Asn→Asp)，O′Donnelld等(1994)和重组HbMequon(β41Phe→Tyr)(Baudin，V.等，
生物化学和生物物理学学报1159：223(1992)的氧亲合力都低于HbA，但根据Hill系数，它们都表现出了不同的协同性，其n值从1.8至2.9不等。Tsai，C.-H.等，
生物化学38：8751(1999)(下文简称“Tsai等(1999)”)报道的Hb(α96Val→Trp，β108Asn→Lys)，其氧亲合力很低，但明显更倾向于转变为T四级结构。Jeong，S.T.等，
生物化学38：13433(1999)(下文简称“Jeong等(1999)”)报道：Hb(α29Leu→Phe，α96Val→Trp，β108Asn→Lys)的氧亲合力低，协同性高，而且可抗自动氧化。
Shen等(1993)和美国专利5,753,465描述了一种大肠杆菌表达质粒(pHE2)，其中，在分离的tac启动子调控下，合成的人α和β珠蛋白基因与大肠杆菌的甲硫氨酸氨基肽酶基因共表达。以该质粒转化的大肠杆菌表达的重组HbA(“rHbA”)的N末端甲硫氨酸已被共表达的甲硫氨酸氨基肽酶切除。所得无N末端甲硫氨酸的rHbA在许多结构和功能特性方面与天然HbA相同。
Kim，H.-W.等，
美国科学院院报91：11547(1994)(下文称“Kim等(1994)”)和美国专利5,843,888描述了一种非天然突变型血红蛋白(rHb(α96Val→Trp)(又称“rHb(αV96W)”)，其氧亲合力低于天然血红蛋白，但氧结合协同性高。
然而，仍然需要更多的突变型血红蛋白来用作基于血红蛋白的血液代用品的组分或治疗药物。尤其值得关注的是氧亲合力低、氧结合协同性高及抗自动氧化稳定性高的突变型血红蛋白。而且，还需要能以重组技术和高效表达系统来实现此类血红蛋白生产的高产出，这对于用作血液代用品的组分或基于血红蛋白的治疗药物而言尤其必要。
发明概述
所以，本发明的主要目的是提供氧亲合力低、氧结合协同性高的突变人血红蛋白。
本发明目的还在于提供氧亲合力低、氧结合协同性高及抗自动氧化稳定性高的突变型血红蛋白。
本发明目的还在于提供氧亲合力低、氧结合协同性高的非天然突变人血红蛋白。
本发明目的还在于提供氧亲合力低、氧结合协同性高及抗自动氧化稳定性高的非天然突变人血红蛋白。
本发明目的还在于提供人工制造的，最好是利用重组技术制造的，具有正确血红素构象的氧亲合力低、氧结合协同性高、抗自动氧化稳定性高的非天然突变人血红蛋白。
本发明目的还在于提供在无细胞环境中的氧结合特性与红细胞内人正常成熟血红蛋白相似的突变型血红蛋白。
本发明目的还在于提供T结构被稳化而R结构不受影响的氧亲合力低、氧结合协同性高的突变型血红蛋白。
本发明目的还在于提供可用作基于血红蛋白的载体/血液代用品或治疗药物的人工血红蛋白。
本发明的目的还在于提供可用作基于血红蛋白的载体/血液代用品或治疗药物的包含本发明人工血红蛋白的无毒药物组合物。
以上目的是通过以下技术方案实现的。
本发明包括一种非天然突变人血红蛋白，其β链108位的天冬酰胺残基被谷氨酰胺残基取代。
在优选实施方式中，本发明血红蛋白的氧亲合力低于人正常成熟血红蛋白，氧结合协同性高，抗自动氧化稳定性高，而且是用重组技术制得的。
本发明还包括一种人工突变型血红蛋白，其在无细胞环境中的氧结合特性与红细胞内人正常成熟血红蛋白相似，该血红蛋白含有一处突变，使得β链108位的天冬酰胺残基被谷氨酰胺残基取代。
一种非天然氧亲合力低且抗自动氧化稳定性高的突变型血红蛋白，其在2，3-二磷酸甘油酸(酯)存在下的氧结合特性与人正常成熟血红蛋白的相似，该突变型血红蛋白β链108位的天冬酰胺残基被谷氨酰胺残基取代。
本发明还包括一种非天然突变人血红蛋白，其β链105位的亮氨酸残基被色氨酸残基取代。
优选实施方式中，本发明血红蛋白氧的亲合力低于人正常成熟血红蛋白，氧结合协同性高，而且是用重组技术制得的。
本发明还包括一种人工突变型血红蛋白，其在无细胞环境中的氧结合特性与红细胞内人正常成熟血红蛋白相似，所述突变型血红蛋白β链105位的亮氨酸残基被色氨酸残基取代。
一种非天然低氧亲合力突变型血红蛋白，其在在2，3-二磷酸甘油酸(酯)存在下的氧结合特性与人正常成熟血红蛋白的相似，该突变型血红蛋白β链105位的亮氨酸残基被色氨酸残基取代。
以下优选实施方式和权利要求将更清楚地展示本发明特征和优点。
附图说明
图1A：由质粒pHE7009获得的rHb(βN108Q)的α-和β珠蛋白基因的cDNA序列(SEQ ID NO：5)。
图1B：由质粒pHE7004获得的rHb(βL105W)的α-和β珠蛋白基因的cDNA序列(SEQ ID NO：7)。
图2A和2B：rHb(βN108Q)(b峰)和rHb(βL105W)(b峰)的FPLC谱。
图3A和3B：rHb(αL29F)(□)；rHb(βN108Q)(△)；rHb(αL29F，βN108Q)(×)；rHb(βL105W)(▲)和HbA(○)在29℃，0.1M磷酸钠缓冲液中氧亲合力(P50)和Hill系数(nmax)的pH依赖性。
图4：rHb(βN108Q)；rHb(αL29F，βN108Q)；rHb(βL105W)和HbA在29℃，pH7.4的0.1M磷酸盐缓冲液中，有和没有变构效应物即5mM 2，3-BPG存在下的氧结合曲线。
图5；HbA(○)；rHb(βN108Q)(▲)；rHb(βL105W)(△)；rHb(αV96W)()；rHb(αV96W，βN108Q)()；rHb(αL29F，βN108Q)(◇)和rHb(αL29F，αV96W，βN108K)(□)在PlasmaLyte缓冲液中，在5mM EDTA和5％D2O存在下，pH7.4，37℃条件下的自动氧化。所述自动氧化过程通过用300MHz1H-NMR监测DSS前2.34ppm处高磁场中氧合标记的消失速度来测定。
图6A和6B：CO状态的HbA；rHb(βN108Q)和rHb(αL29F，βN108Q)在pH7.0的0.1M磷酸钠缓冲液，29℃的可交换质子共振(图6A)和环电流-位移质子共振(图6B)的500MHz 1H-NMR谱。
图7A和7B：CO状态的HbA；rHb(αL29F)，rHb(βN108Q)和rHb(αL29F，βN108Q)在pH7.0的0.1M磷酸钠缓冲液，29℃的近侧组氨酸亚铁超精细-位移NδH共振和超精细-位移共振和可交换质子共振的300MHz 1H-NMR谱。
图8A和8B：不同温度(7℃，11℃，17℃，23℃，29℃)，CO状态的rHb(βN108Q)在pH7.0的0.1M磷酸钠缓冲液中，没有变构效应物(图8A)和有4mM肌醇六磷酸酯(IHP)(图8B)的500MHz可交换质子共振谱。
图9A和9B：不同温度(7℃，11℃，17℃，23℃，29℃)，CO状态的rHb(αL29F，βN108Q)在pH7.0的0.1M磷酸钠缓冲液中，没有(图9A)和有4mM IHP(图9B)的500MHz可交换质子共振谱。
图10A和10B：29℃，CO状态的HbA；rHb(βL105W)；rHb(αD94A，βL105W)和rHb(αD94A)以pH7.0、0.1M磷酸钠缓冲液配制的3-6％溶液的可交换质子共振(图10A)和环电流-位移质子共振(图10B)的600MHz 1H-NMR谱。
图11A和B：29℃，CO状态的15N标记的rHb(βL105W)(图11A)和HbA(图11B)以含90％H2O/10％D2O的pH7.0、0.1M磷酸钠缓冲液配制的5-8％溶液的600MHz 2D异核多量子相干(HMQC)谱。
图12A-D：29℃，CO状态的15N标记的rHb(βL105W)以含90％H2O/10％D2O的pH7.0、0.1M磷酸钠缓冲液配制的5％溶液的在不同混合时间：15ms(图12A)，30ms(图11B)，60ms(图12C)和100ms(图12D)记录的600MHz 2D NOESY-HMQC谱(“NOESY”即核欧沃豪斯增强波谱)。
图13A-C：29℃，脱氧状态的HbA；rHb(βL105W)；rHb(αD94A，βL105W)和rHb(αD94A)以pH7.0、0.1M磷酸钠缓冲液配制的3-6％溶液的300MHz1H-NMR谱。图13A：近侧组氨酸的300MHz超精细-位移NδH共振；图13B：300MHz超精细位移和可交换质子共振；图13C：300MHz可交换质子共振。由于rHb(αD94A，βL105W)和rHb(αD94A)在氧合过程中容易形成met-Hb，所以在NMR样品中添加了少量连二硫酸钠防止其形成。
图14：29℃，脱氧状态的15N标记的rHb(βL105W)以含90％H2O/10％D2O的pH7.0、0.1M磷酸钠缓冲液配制的5-8％溶液的600MHz 2D HMQC谱。
图15A-D：29℃，脱氧状态的15N标记的rHb(βL105W)以含90％H2O/10％D2O的pH7.0、0.1M磷酸钠缓冲液配制的5％溶液的在不同混合时间：15ms(图15A)，30ms(图15B)，60ms(图15C)和100ms(图15D)记录的600MHz 2D NOESY-HMQC谱。两交叉峰之间的实心连线表示β37Trp和β105Trp其中之一的1Hε1与另一残基的1Hδ1和1Hζ2之间的NOE效应。
图16A-B：CO状态的HbA；rHb(βL105W)；rHb(αD94A，βL105W)和rHb(αD94A)以pH7.0、0.1M磷酸钠缓冲液配制的3-6％溶液在11℃，20℃和29℃，在没有(图16A)和有(图16B)2mM IHP存在下的可交换质子共振600-MHz1H-NMR谱。
图17A-D：CO状态的15N标记的rHb(βL105W)以含90％H2O/10％D2O的pH7.0、0.1M磷酸钠缓冲液配制的5-8％溶液在不同温度，有和没有2mM IHP存在下的600MHz 2D异核单量子相干谱(HSQC)。图17A：29℃，没有IHP；图17B：29℃，2mM IHP存在下；图17C：20℃，2mM IHP存在下；图19D：11℃，2mMIHP存在下。
图18A-B：CO状态的HbA；rHb(βL105W)；rHb(αD94A，βL105W)和rHb(αD94A)以pH7.0、0.1M磷酸钠缓冲液配制的3-6％溶液在不同温度，没有(图18A)和有(图18B)2mM IHP存在下的环电流位移质子共振的600-MHz 1H-NMR谱。
本发明的详细描述
I.定义
本发明中，“HbA”或“天然HbA”都表示由人体获得的人正常成熟血红蛋白。
“重组人正常成熟血红蛋白”，“rHbA”和“非修饰rHbA”表示如Shen等(1993)和美国专利5,753,465所述，用重组技术制得，结构和功能与天然HbA基本相同的人正常成熟血红蛋白。
“rHb(βL105W)”指Hb分子两β链内第105位的亮氨酸残基都被色氨酸残基所取代的重组突变人血红蛋白。该血红蛋白的氧亲合力低于HbA，氧结合协同性高。rHb(βL105W)是为了通过在α94Asp与β105Trp之间消除氢键来稳化其脱氧四级结构，继而降低其氧亲合力。
“rHb(βN108Q)”指通过重组DNA技术生产的突变人血红蛋白，其中位于α1β1界面内且位于Hb分子中央沟槽内的β链第108位天冬酰胺被谷氨酰胺取代。与其他已知低氧亲合力重组突变型血红蛋白相比，此血红蛋白的氧亲合力低，氧结合协同性高，且抗氧化性高。
“自动氧化”指氧合血红蛋白(HbO2或OX-Hb)转变为高铁血红蛋白(met-Hb)。然而，在HbO2中，血红素铁原子处于还原的亚铁状态(Fe2+)，在met-Hb中，血红素铁原子处于氧化的铁状态(Fe3+)。
“脱氧”和“氧合”指HbA和rHb中血红素铁原子的氧合状态。氧合血红蛋白(oxy-Hb或HbO2)含有4个与血红素基团结合的氧分子；脱氧血红蛋白(脱氧-Hb)不含氧分子。在正常动脉血中，正常成熟血红蛋白A(HbA)呈氧合态(HbO2A或氧合HbA)。静脉血中，部分HbA呈脱氧态(“脱氧HbA)。
“一氧化碳-Hb”，“HbCO A”，“rHbCO”和“CO状态”都指与一氧化碳分子而非氧分子结合的血红蛋白。
“铁-血红蛋白”，“铁-Hb”，“铁状态”，“高铁血红蛋白”，“met-Hb”和“Fe3+状态”都指血红素铁原子被氧合成Fe3+态的血红蛋白。铁-Hb不结合氧。
“甲硫氨酸氨基肽酶”指特异性剪切肽序列氨基(N)末端甲硫氨酸的酶。
“氧亲合力”指氧分子与血红蛋白的结合强度。氧亲合力高表示血红蛋白不容易释放其结合的氧分子。P50是氧亲合力指标。
“协同性”指血红蛋白4个亚基进行的氧结合，由Hill系数(nmax)表征。HbA在29℃，pH7.4、0.1M磷酸钠缓冲液中的nmax约为3.2。
两种经典四级结构是：低亲和力脱氧Hb的T(紧张)四级D结构和高亲和力氧合Hb的R(松弛)四级结构。“R型”或“R样”等都指表现出特征性R四级结构标记的血红蛋白，例如1H-NMR谱中距DSS 10.7ppm处的质子共振。“T型”或“T样”等指表现出特征性T四级结构标记的血红蛋白，例如1H-NMR谱中距DSS约14.0ppm处的质子共振。
II.方法和结果
曾用Shen等(1993)；美国专利5,753,465和Kim等(1995)；美国专利5,843,888所述的大肠杆菌表达系统构建了保持氧结合高协同性但低氧亲合力的新非天然人工重组血红蛋白(rHbs)。其中之一rHb(βN108Q)还具有比某些其他已知低氧亲合力突变体更高的抗自动氧化性。更具体地说，本发明是关于：用重组法制造的突变HbA，分别被称为rHb(βN108Q)，其中，位于α1β1亚基界面内且位于Hb分子中央沟槽内的β链第108位上的天冬酰胺残基被谷氨酰胺取代；rHb(βL105W)，其中，两β链第105位上的酪氨酸都被色氨酸取代，而且，该分子在α1β2亚基界面内的β105Trp和β94Asp之间形成了新的氢键，由此通过稳化其脱氧四级结构来降低氧结合亲合力。
这些新的人工即完全非血液来源的血红蛋白具有氧亲合力低、氧结合协同性高的特点。此外，rHb(βN108Q)还具有比其他已知低氧亲合力突变体例如rHb(αV96W)和rHb(αV96W，βN108K)更高的抗自动氧化性。而且，这些新的人工血红蛋白在连接时没有无用亚基的解离。在无细胞环境中，本发明rHb具有与红细胞内HbA相似或比其更低的氧亲合力。所以，本发明rHb可望作为基于血红蛋白的氧载体即潜在的血液代用品或血红蛋白类治疗药物。
本发明还包括制备和使用具有其他合适突变的低氧亲合力血红蛋白。具体地说，本发明方法可用于制造具有其他优良特性的其他突变型血红蛋白。下文将讲述如何评价具有氧亲合力低、协同性高和抗自动氧化性高等特性以便用于血液代用品或治疗的其他有用突变蛋白的方法。下文参考实施例将给出制备rHb(βN108Q)和rHb(βL105W)的优选材料和方法。虽然本发明的rHb优选以重组法来制备，但显然也可用非重组法来制备。
添加变构效应物IHP和/或降低温度时，优选的本发明突变rHb：rHb(βL105W)和rHb(βN108Q)在连接态会由R四级结构转变为T四级结构。本发明的重组血红蛋白因此可用来获取有关α1β2和α1β1界面内亚基间相互作用的性质和有关血红蛋白变构的分子基础的新的信息。
从下文可以看出，本发明的rHb(βN108Q)氧亲合力低，Bohr效应高，但协同性与HbA相似，而且，自动氧化为高铁血红蛋白(met-Hb)的速度慢于其他已知低氧亲合力重组血红蛋白例如rHb(α96Val→Trp)和rHb(α96Val→Trp，β108Asn→Lys)(Kim，H.W.等，
生物化学35：6620-6627(1996)(下文简称“Kim等(1996)”；Ho，C.等，
血液代用品：血液代用品的现在和未来(Tsuchida，E.编撰)，Elsevier Science SA，Lausanne，瑞士，pp.281-296(1998)(下文简称“Ho等(1998)”)；Jeong等(1999)；和Tsai等(1999))。所以，rHb(βN108Q)可用作基于血红蛋白的氧载体和血红蛋白类治疗药物。
质子核磁共振(1H-NMR)研究显示：rHb(βN108Q)具有与HbA相似的血红素袋周围三级结构和α1β2和α1β1亚基界面内四级结构。1H-NMR研究还显示：添加变构效应物IHP和/或降低温度时，rHb(βN108Q)会从R四级结构转变为T四级结构，但不改变其连接状态。这表明：rHb(βN108Q)的T四级结构比HbA的更稳定。这符合在rHb(αV96W)(Kim，H.-W.等，
分子生物学杂志248：867(1995)(下文简称“Kin等(1995)”)，美国专利5,843,888和rHb(αV96W，βN108Q)(Ho等(1998)；Tsai等(1999))内发现的低氧亲合力分子机制。
Carver，T.E.等(
生物化学杂志267：14443(1992))；Brantley，R.E.Jr等，
生物化 学杂志268：6995(1993)(下文简称“Brantley等(1993)”)和Eich，R.F.等，
生物化 学35：6976(1996))报道：B10位的Leu取代Phe可抑制肌红蛋白内的自动氧化，α链B10位的上述取代则可降低与脱氧和氧合HbA之间的NO反应。相应突变即αL29F在远端血红素袋内用脱氧HbA降低NO反应减弱与体内高血压效应减弱相关(Doherty，D.H.等，
自然生物学技术16：672(1998))。因此，如下文所述，本发明将这一突变也引入βN108Q从而得到双突变rHb(αL29F，βN108Q)。结果发现，该双突变蛋白比rHb(βN108Q)具有更高的抗自动氧化稳定性，但其2mM变构效应物2，3-BPG存在下的氧结合特性则与HbA相似。
突变蛋白rHb(βL105W)被设计成在α1β2界面内的β105Trp与α94Asp之间形成一个新的氢键，由此通过稳定其脱氧四级结构来降低氧亲合力。结果发现，与HbA相比，rHb(βL105W)的氧亲合力低，但保持了较高的协同性，rHb(βL105W)：29℃，pH7.4、0.1M磷酸钠缓冲液中，P50＝28.2mmHg，nmax＝2.6，HbA：29℃，pH7.4、0.1M磷酸钠缓冲液中，P50＝9.9mmHg，nmax＝3.2。用突变蛋白rHb(αD94A，βL105W)和rHb(αD94A)来证明rHb(βL105W)的脱氧四级结构的α1β2界面内的β105Trp与α94Asp之间形成了一个新的氢键。在15N标记的rHb(βL105W)内进行的本发明多核、多维核磁共振(NMR)研究检测到rHb(βL105W)内β105Trp的吲哚氮所结合质子的共振。用HbA和突变rHb的1H-NMR来研究rHb(βL105W)氧亲合力低的结构基础。NMR结果显示：rHb(βL105W)脱氧四级结构的α1β2界面内的β105Trp与α94Asp之间形成了一个新的氢键。本发明认为：rHb(βL105W)的低氧亲合力是因为其脱氧四级结构内的β105Trp与α94Asp之间形成了一个新的氢键。
用质子核磁共振(NMR)谱来研究溶液中Hb的三级结构和四级结构(Ho等(1992))。距2，2-二甲基-2-硅戊烷-5-磺酸盐(DSS)的甲基质子共振约15至9ppm处检测到数个可交换质子共振，将其认定为氧合和脱氧HbA的α1β1和α1β2亚基界面内亚基间氢键。这些借助NMR发现的氢键质子可用作功能研究中的结构标记。具体地说，已将距DSS约14ppm的质子共振认定为脱氧HbA的α1β2界面内α42Trp与β99Asp之间亚基间氢键，是HbA T结构的特征之一(Fung.L.W.-M.等，
生物化 学14：2526(1975)(下文简称“Fung等(1975)”，Russu，I.M.等，
生物化学和生物 物理学学报914：40(1987)(下文简称“Russu，等(1987)”)。通过观察脱氧和CO态Hb在不同条件下的该T结构特征标记，就可以评价T构象的稳定性，并监测由T结构向R结构的转变。
本发明中，设计氧亲合力低、协同性高的rHb的方法是稳定T结构，同时不影响R结构。(参考Ho等(1998)；Tsai等(1999))。该方法曾设计出了具有低氧亲合力和正常协同性的rHb(αV96W)(Kim等(1995)；美国专利5,843,888)。设计的这一突变位于α1β2亚基界面内，且位于Hb分子的中央沟槽内。根据1H-NMR研究，当降低温度和/或加入变构效应物IHP时，rHbCO(αV96W)会由R结构转变为T结构，但不改变其连接态。晶体结构的T态rHb(αV96W)显示其在α1β2亚基界面内的α96Trp Nε1与β101 Nε2之间具有新的水介导的氢键(Puius，T.A.等，
生物化学 37：9258(1998)(下文简称“Puius等(1998)”))。1H-NMR和晶体结构都显示，该rHb的T结构得到了稳化。本发明中，NMR研究还显示：rHbCO(βN108Q)和rHbCO(βN105W)能够转变为T四级结构，同时保持连接态不变。以上结果表明，这两种rHb的T结构比HbA的稳定。
如上所述，本发明方法还可用于制造具有不同特性的其他突变人工血红蛋白和具有对天然突变进行补偿的突变的血红蛋白。以下参考实施例给出了制取rHb(βN108Q)和rHb(βN105W)优选材料和方法。
参考实施例
rHb(βN108Q)和rHb (βN105W)表达质粒的构建
大肠杆菌HbA表达质粒pHE2和pHE7分别含有人α珠蛋白和β珠蛋白的基因和cDNA，用它们作为表达本发明突变型血红蛋白的起始质粒。有关质粒pHE2和pHE7的构建以及由其所得rHbA特性的详细论述可参考Shen等(1993)，美国专利5,753,465和Shen，T.J.等，
蛋白质工程10：1085(1997)(下文简称“Shen等(1997)”)，Kim等(1994)和美国专利5,843,888。
如下所示，用合成珠蛋白基因构建表达rHb(βN108Q)的质粒pHE2009。用质粒pHE2作为起始质粒，用购自DNA Iternational，Inc.(Lake Oswego，Oregon)的寡核苷酸序列5′CGTCTGCTGGGT
CAGGTACTAGTTTGCG-3′(SEQ ID NO：1)作为引物将βN10gQ引入pHE2。寡核苷酸的合成技术是业内熟知的，本发明不局限于特定的方法。按照“改变位点II体外诱变系统”试剂盒(Promega Corporation，Madison，WI)的说明进行定点诱变，所得质粒pHE2009含有预期的βN108Q突变。
用合成珠蛋白基因构建质粒pHE2020(突变rHb(αD94A))和pHE2004(突变rHb βL105W)的方法与构建pHE2009相似，所不同的是所用突变寡核苷酸为5′-CTGCGTGTT
GCTCCGGTCAACTTCAAACTG-3′(SEQ ID NO：2，下划线表示突变密码子αD94A)和5′-GGAAAACTTCCGA
TGGCTGGGTAACGTAC-3′(SEQ IDNO：3，下划线表示突变密码子βL105W)。两寡核苷酸都购自DNA InternationalInc.(Lake Osweg，Oregon)。
将pHE2002的0.51kb的SmaI-PstI片段与pHE2004的6.43kb PstI-SmaI片段连接，构建成质粒pHE2017(突变rHb(αD94A，βL105W))。将pHE2009的6.06kb的PstI-SmaI片段与pHE284的0.79kb的BamHI-PstI片段连接，构建成表达rHb(αL29F，βN108Q)的pHE2018。Jeong等(1999)曾报道过从pHE2构建含αL29F突变的质粒pHE284。
如下所述，用人珠蛋白cDNA构建表达突变rHb(βN108Q)的质粒pHE7009：采用常规方法将pHE7中人α和β珠蛋白的cDNA编码序列插入pTZ18U(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA)。按照Kunkel，T.M.等，
美国科学院院报82：488(1985)和Shen等(1993)所述进行定点诱变。用购自DNA International Inc.(Lake Oswege，Oregon)的寡核苷酸5′-ACAGACCAGTAC
TTGTCCCAGGAGCCT-3′(SEQ IDNO：4)(下划线为突变密码子Asn→Gln)作为诱变引物。然后，用诱变后的cDNA置换pHE7中的人正常β珠蛋白cDNA，制得质粒pHE7009。图1A显示了pHE7009中的α和β珠蛋白的cDNA序列(SEQ ID NO：5)。宿主细胞大肠杆菌JM109内的质粒pHE7009名为pHE7009/JM109，已于2000年4月27日保藏于美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)，保藏号为PTA-1768。
参照pHE7009，用人珠蛋白cDNA构建表达突变rHb(βL105W)的质粒pHE7004，所不同的是用购自DNA International Inc.(Lake Osweg，Oregon)的寡核苷酸5′-CCTGAGAACTTCAGG
TGGCTAGGCAACGTGCTGGTC-3′(SEQ IDNO：6)(下划线为突变密码子Leu→Trp)作为诱变引物。图1B显示了pHE7004内的α和β珠蛋白的cDNA序列(SEQ ID NO：7)。宿主细胞大肠杆菌JM109内的质粒pHE7004名为pHE7004/JM109，已于2000年4月27日保藏于美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)，保藏号为PTA-1769。
细胞的培养
用已知方法分别将质粒pHE7009和pHE7004转化到大肠杆菌JM109(Promega，Madison，WI)中。将大肠杆菌细胞培养在含Terrific Broth(“TB”)培养基加100μg/ml氨苄青霉素的微发酵罐(New Brunswick Scientific，ModelBioFlo 3000)中，32℃，直至600nm的光密度达到10。TB培养基含有1.2％细菌用胰蛋白胨，2.4％细菌用酵母提取物，0.17M KH2PO4，0.072M K2HPO4和1％葡萄糖溶液。加入异丙基β-吡喃半乳糖硫苷(Sigma，St.Louis，MO)至0.1-0.4mM诱导rHb的表达。然后，在培养物中补充氯高铁血红素(Sigma)，继续培养至少4小时。离心收获细胞，纯化前保存于-80℃。有关细节可参考Shen等(1993)和Shen等(1997)。
虽然本发明优选大肠杆菌细胞来表达和生产本发明的重组突变型血红蛋白，但本发明并不局限于使用大肠杆菌细胞。其他合适的表达系统，例如酵母、昆虫细胞和猪、羊、牛等转基因动物也适合用来表达突变型血红蛋白。质粒pHE7009和pHE7004最适合大肠杆菌细胞，但也适用于其他表达系统。也可以用人基因来构建质粒。
rHb的分离和纯化
基本上按照Shen等(1993)和Shen等(1997)所述纯化pHE7009和pHE7004转化的细胞产生的重组血红蛋白。将冷冻保藏的细胞浆倒入裂解缓冲液(40mMTrisbase/lmM苄脒)(Sigma)，3ml/g细胞浆。细胞裂解为：将细胞浆三次通过高压匀浆仪(EmulsiFlex-C5型，Avestin)。然后，裂解液于4℃用Beckman离心机(Beckman JA14转子)以13,000rpm离心2.5小时。按照Tsai等(1999)所述，用CO气体饱和上清液，30℃放置过夜。然后，将上清液通过Millipore的Minitan丙烯酸类超滤系统以浓缩蛋白质。加入聚乙烯亚胺(Sigma)至终浓度0.5％，用以沉淀核酸。离心，然后用pH8.3的20mM Tris-HCl/0.5mM三亚乙基四胺(TETA)(Sigma)透析样品过夜，期间更换一至二次缓冲液。以上过程中，样品保持于4℃和CO气氛中。按照Shen等(1993)和Shen等(1997)所述的方法，通过Q-Sepharose快流层析柱(Pharmacia阴离子交换柱)收集rHb流份，然后氧化和还原，并转化成CO态。然后，通过快速蛋白质液相层析(FPLC)单S层析柱(Pharmacia阳离子交换柱，HR16/10)，用pH6.8的10mM磷酸钠缓冲液中0.1-0.5mM的乙二胺四乙酸(EDTA)梯度(洗脱液A)和pH8.3的20mM磷酸钠缓冲液中0.1-0.5mM EDTA梯度(洗脱液B)纯化该Hb溶液。
分别洗出两个rHb(βN108Q)主峰。图2A显示了rHb(βN108Q)的a峰和b峰。图2B显示，rHb(L105W)洗出三个主峰，a、b和c峰。两种情况下，由b峰收集的rHb中氨基末端甲硫氨酸含量都低于2％，而且具有正确的分子量。
质谱
进行质谱分析的Hb样品先用蒸馏水彻底透析，然后冷冻保藏。临分析前将样品溶于水中，至125pmol Hb/μl H2O(7.8mg/ml)。将所得溶液分成等份，将各份稀释成每微升含0.2％甲酸的50∶50水/乙腈中含10pmol Hb。取10μl一份的终溶液，以5μl/min的速度引入电喷射离子源。
按照Shen等(1993)所述，在VG Quattro-BQ(Fisons Instruments，VG Biotech，Altrincham，U.K.)上进行电喷射离子化分析。用配备有在线乙内酰苯硫脲氨基酸分析仪(120A型)的Applied Biosystems气相/液相测序仪(470/900A型)进行自动Edman降解循环。以上两项分析用于评价rHb的质量。本项研究所用的全部rHb都具有正确的分子量，且氨基末端甲硫氨酸含量都低于2％。
rHb的氧结合特性
在29℃，用Hemox-分析仪(TCS Medical Products，Huntington Valley，PA)测定rHb氧解离随pH变化的曲线。所用的Hb浓度约为每亚铁血红素0.1mM。如果需要减少样品中的met-Hb，则可采用Hayashi，A.等
生物化学生物物理学学报 310：309(1973)所述的高铁血红蛋白还原酶系统。在氧平衡测定后立即记录各样品的可见光吸收谱，并用Antonini，E.
生理学评论45：123(1965)报道的Hb消光系数来估测met-Hb的浓度。利用非线性最小二乘方法将Adair方程与各平衡氧结合曲线拟合，由此推导出氧平衡参数。在50％饱和度时测定P50，即氧亲合力指标。用线性回归法，根据Hill曲线的最大斜率测定Hill系数(nmax)，即协同性指标。在60％和65％饱和度之间得出nmax。以mmHg为单位的P50的测量精度为±5％，nmax的为±7％。
rHb的1H-NMR谱
用Bruker AVANCE DRX-300，AVANCE DRX-500和AVANCE DRX-600NMR分光仪，分别在300，500和600MHz，10-36℃，测定各rHb的1H-NMR谱。全部Hb样品均以pH7.0的0.1M磷酸钠缓冲液(100％水)配制。Hb浓度约为5％(约3mM亚铁血红素)。按照Plateau，P.等
美国化学协会杂志 104：7310(1982)所述(下文简称“Plateau等(1982)”)，用“跳跃和返回”脉冲程序来降低水的信号。用29℃下出现于距DSS 4.76ppm低磁场处的水信号作为内部参照，间接地以2，2-二甲基-2-硅戊烷-5-磺酸盐(DSS)的钠盐的甲基质子共振作为质子化学位移的参照。
rHb的自动氧化
通过监测含氧标记(距DSS-2.34ppm)从Bruker AVANCEDRX-300 1H-NMR谱上消失的速度来记录rHb的自动氧化。自动氧化反应在含5Mm EDTA的PlasmaLyte缓冲液(Baxter)(5％D2O)中，pH7.4，37℃下进行。HbO2的浓度为5％(约3mM亚铁血红素)。
功能研究
rHb的氧结合特性
图3A和3B显示29℃、0.1M磷酸钠缓冲液中，rHb(αL29F)，rHb(βN108Q)，rHb(αL29F，βN108Q)，rHb(βL105W)和HbA随pH而变化的氧结合测定值。rHb(βN108Q)在pH6.79-8.09范围之间的氧亲合力明显低于HbA。rHb(βN108Q)氧结合过程的协同性很高，根据不同的pH其nmax约为2.7-3.1不等，HbA的约为3.2(图3B)。另一方面，α链B10位的突变即αL29F提高了氧亲合力，降低了协同性。pH＜7.4时，rHb(αL29F，βN108Q)的P50略高于HbA，这表明突变对于氧亲合力的影响具有累积性。rHb(αL29F，βN108Q)保留了氧结合协同性，nmax约为2.4-2.8(图3B)。pH7.0-8.0之间，rHb(βL105W)的氧亲合力很低(比HbA低约2-3倍)，但协同性保持正常。
图4显示，无2，3-BPG存在下测得的rHb(βN108Q)和rHb(βL105W)的氧亲合力低于5mM 2，3-BPG存在下测得的HbA的氧亲合力，因此，它们可望称谓血液代用品系统中的氧载体。图3A和3B还显示：rHb(βN108Q)和rHb(αL29F，βN108Q)的Bohr碱效应(HbA的氧亲合力随pH的降低而降低)强于HbA。
以下表1将根据连接方程ΔH+＝-1ogP50/pH算得的每个血红素分子氧合后所释放的Bohr质子数量进行了比较(Wyman，J.，
高级蛋白质化学4：407(1948)和
高级蛋白质化学19：233(1964)(下文简称“Wyman，J.(1948)和(1964)”))。rHb(βN108Q)和rHb(αL29F，βN108Q)释放的Bohr质子都多余HbA。
表1
29℃，0.1M磷酸钠缓冲液中，HbA，rHb(βN108Q)，
rHb(αL29F，βN108Q)，和rHb(βL105W)的Bohr效应
| 血红蛋白 | 0.1M磷酸盐缓冲液中的logP50/pH |
| HbArHb(βN108Q)rHb(αL29F，βN108Q)rHb(βL105W) | 0.48(pH6.79-8.00)0.56(pH6.79-8.09)0.67(pH6.79-7.97)0.55(pH7.00-8.00) |
自动氧化
用300MHz NMR分光仪监测含氧HbA，含氧rHb(βN108Q)，含氧rHb(αL29F，βN108Q)，含氧rHb(βL105W)及另外三种已知低氧亲合力突变蛋白含氧rHb(αV96W)，含氧rHb(αV96W，βN108K)和含氧rHb(αL29F，αV96W，βN108K)的自动氧化过程。DSS前-2.34ppm高磁场处的共振已被认定为代表HbA含氧态的E11Val的γ2-CH3(Dalvit，C.等，
生物化学24：3398(1985))。监测该含氧标记(距DSS-2.34ppm)消失速度随时间的变化，从而确定Hb样品的自动氧化速度。结果见图5。亚铁-Hb的百分比随时间(t)单指数性地改变，可用以下公式算得自动氧化速度常数：[亚铁-Hb]t＝[亚铁-b]t＝0×exp(k自动×t)，其中k自动即自动氧化速度常数。HbA和rHb的自动氧化速度常数已列于表2。在pH7.4，37℃的PlasmaLyte缓冲液中，rHb(βN108Q)，rHb(βL105W)，rHb(αV96W)和rHb(αV96W，βN108K)的自动氧化比HbA分别快2.8倍，8倍，4.4倍和8倍。rHb(βN108Q)的抗自动氧化稳定性比实验室制得的其他已知低氧亲合力突变蛋白即rHb(αV96W)、rHb(βL105W)和rHb(αV96W，βN108K)更高。在rHb(βN108Q)和rHb(αV96W，βN108K)中引入αL29F突变降低了自动氧化速度。rHb(αL29F，βN108Q)和rHb(αL29F，αV96W，βN108K)的自动氧化速度分别比rHb(βN108Q)和rHb(αV96W，βN108K)慢2.5倍和2.8倍。因此，根据肌红蛋白的结果，αL29F突变对于减缓自动氧化非常有效(Brantley等(1993))。在研究的全部低氧亲合力rHb中，只在rHb(αL29F，αV96W，βN108K)的自动氧化过程中观察到了高铁血色原样的谱。当met-Hb从亚铁高自旋形式转变为亚铁低自旋形式即远端咪唑基取代H2O配体时就形成了高铁血色原形式(Levy等，
生物化学29：9311(1990)；Levy等，
生物物理学杂志61：750(1992)；Blumberg等，
高级化学系列100：271(1991))。这与Jeong等(1999)的结果相符，所述结果中，rHb(αL29F，αV96W，βN108K)的氧化态表现出高铁血色原样的谱，因而被认为不适合作为氧载体。
表2
低氧亲合力突变蛋白的自动氧化速度常数、氧亲合力和协同性
| 血红蛋白 | k自动(h1-)a | P50(mmHg)b | Nmax b |
| HbArHb(βN108Q)rHb(αL29F，βN108Q)rHb(βL105W)rHb(αV96W)rHb(αV96W，βN108K)rHb(αL29F，αV96W，βN108K) | 0.0158±0.00020.0449±0.00070.0181±0.00060.123±0.00480.0689±0.00080.125±0.00510.0499±0.0014 | 9.6417.4612.0628.216.3850.6521.97c | 3.283.102.772.602.942.361.81c |
a：[含氧Hb]3mM血红素，PlamaLyte缓冲液，pH7.4，37℃条件下测得的HbA和rHb的自动氧化速度常数k自动
b：0.1M磷酸钠缓冲液，29℃，pH7.4，蛋白质浓度为0.1mM血红素条件下测得的氧亲合力和协同性
c：根据Jeong等(1999)
rHb(βN108Q)和rHb(αL29F，βN108Q)的结构研究
1H-NMR研究
1H-NMR质谱是研究HbA及其变异体三级结构和四级结构改变的极好工具(参考例如Shen等(1993)；Kim等(1994)；Kim等(1995)；Kim等(1996)和Barrick，D.等
自然结构生物学4：78(1997))。图6A和图6B分别显示了500MHz测得的CO态HbA、rHb(βN108Q)和rHb(αL29F，βN108Q)的可交换质子共振和环电流位移共振。环电流位移共振对血红素基团相对于血红素袋内氨基酸残基的取向和/或构象(即Hb分子的三级结构)敏感(参考Ho.C.，
高级蛋白质化学43：153(1992)，下文简称“Ho(1992)”)。已知，-1.8ppm和-1.7ppm左右的共振分别代表HbCOAβ链和α链上E11Val的γ2-CH3(Lindstrom等(1972)；Dalvit等(1985))。这两处共振在rHbCOβN108Q)中没有改变。然而，rHbCO(αL29F，βN108Q)的α-E11Val的γ2-CH3共振向高磁场(前)位移了2.0ppm，表明rHbCO(αL29F，βN108Q)的α-E11缬氨酸残基的γ2-CH3基团比在HbCOA中更靠近常态的血红素。αL29F离E11Val很近，估计是氨基酸取代αL29F改变了α链上远端血红素袋位点的构象。这些rHb的环电流位移共振还有其他一些改变。根据经验，环电流位移共振中强度和位置的细微变化是许多rHb突变蛋白的共同特征(参考例如Shen等(1993)；Kim等(1994)；Kim等(1995)；Kim等(1996)；Ho等(1998)；Sun，D.P.等，
生物化学36：6663(1997)，下文简称“Sun等(1997)”)。这些改变反映突变引起的血红素袋内的血红素和/或氨基酸残基构象的细微调整。
Hb分子的可交换质子共振缘于亚基界面内的可交换质子。就本发明而言特别重要的是距DSS 14.2，12.9，12.1，11.2和10.7ppm处的可交换质子共振，已知它们代表着脱氧(T)HbA和/或含氧(R)HbA内α1β1和α1β2亚基界面内的亚基间氢键(Russu等(1987)；Fung等(1975)和Ho(1992))。距DSS 12.9ppm和12.1ppm处的共振分别代表α122His与β35Tyr之间和α103His与β131Glun之间的氢键(Russu等(1987)和Simplaceanu等，
生物物理学(在印)(2000)，下文简称“Simplaceanu等(2000)”)。在rHbCO(βN108Q)和rHbCO(αL29F，βN108Q)的质谱(图6A)中，对应于化学位移，出现了三个共振而非HbCOA在12.1ppm处的单峰。主峰位于12.0ppm，肩峰位于11.8ppm，12.3ppm处还有一额外共振。12.3ppm和11.8ppm处的共振强度甚至不及12.0ppm和12.9ppm处的1/10，表明这两处额外共振不可能代表其他质子。11.8、12.0和12.3ppm处共振峰的积分面积之和与12.9ppm处单峰的大致相同，表明rHbCO(βN108Q)中三种构象共存。
图7A和图7B分别显示29℃，pH7.0的0.1M磷酸盐缓冲液中各rHb和HbA的超精细位移和可交换质子共振。已知，距DDS 63ppm的共振代表脱氧HbA的α链近侧组氨酸残基(α87His)的发生了超精细位移的NδH-可交换质子，距DDS77ppm的共振代表脱氧HbA的β链上的相应残基(β92His)(Takahashi，S.等，
生物化 学19：5196(1980)和La Mar，G.N.等，
生物化学生物物理学研究通讯96：1172(1980))。rHb(βN108Q)内这两个近侧组氨酰基共振的化学位移位置与HbA的完全相同，表明该rHb的近侧组氨酸残基周围没有微扰。然而，rHb(αL29F)和rHb(αL29F，βN108Q)的距DSS 63ppm处共振向低磁场(后)位移了4ppm，现位于67ppm，表明αL29F突变改变了α链近侧血红素袋的环境。
10-25ppm的质谱是位于血红素袋附近的卟啉环和氨基酸残基的超精细位移共振和可交换质子共振产生的。脱氧HbA与脱氧rHb(βN108Q)的10-25ppm共振没有明显差异。然而，16-20ppm之外，rHb(αL29F)和rHb(αL29F，βN108Q)的质谱发生了改变，说明α链和β链上亚铁血红素袋的环境都被改变。已知，14.2ppm处的共振代表脱氧HbAα1β2界面内α42Tyr与β99Asp之间的氢键(Fung等(1975))，这是HbA脱氧(T)四级结构的特征之一(Perutz(1970))。rHb(αL29F)和rHb(αL29F，βN108Q)的该共振向前位移了0.5ppm，至13.7ppm处，表明αL29F突变对脱氧态的该α1β2内氢键有影响。
本发明低氧亲合力高协同性rHb的独特特征之一是降低温度和/或在这些CO态rHb中加入IHP后，在14.2ppm处出现一个T标记(Kim等(1995)；Ho等(1998)；Tsai等(1999))。可用CO态rHb可交换质子共振的温度依赖性研究来评价结构对氧亲合力的影响。图8A和8B，图9A和9B显示0.1M磷酸钠缓冲液中，没有(图8A和9A)和有(图8B和9B)4mM IHP存在下，CO态rHb(βN108Q)和rHb(αL29F，βN108Q)可交换质子共振随温度的变化。pH7.0的0.1M磷酸钠缓冲液中，4mM IHP存在下，自23℃起可观察到rHb(βN108Q)在14.2ppm处的共振(图8B)。4mM IHP存在下和低温下CO-连接态rHb(βN108Q)和rHb(αL29F，βN108Q)质谱中出现T标记说明rHb(βN108Q)和rHb(αL29F，βN108Q)的T状态比HbA的T状态更稳定。然而，低温(例如11℃)和4mM IHP存在下，rHb(αL29F，βN108Q)这一共振的强度比rHb(βN108Q)的小得多。
对rHb(βL105W)的结构研究
rHb(βL105W)被设计成α1β2界面内的α94Asp形成一个新的氢键，由此通过稳定脱氧四级结构来降低氧亲合力。构建了rHb(αD94A，βL105W)和rHb(αD94A)来证明rHb(βL105W)的β105Trp与脱氧四级结构α1β2界面内的α94Asp形成了一个新的氢键。对15N-标记的rHb(βL105W)的多核多维核磁共振(NMR)研究发现了rHb(βL105W)内β105Trp的吲哚单结合的质子共振。用1H-NNR来研究rHb(βL105W)的氧亲合力低的结构基础。
CO态rHb结构的1H-NNR研究
图10A显示CO态HbA，rHb(βL105W)，rHb(αD94A，βL105W)和rHb(αD94A)的可交换质子共振。可交换质子共振是由亚基界面内的可交换质子产生的。最近对15N-标记的HbA的多核多维NMR研究已发现，10.6、10.4和10.1ppm处的共振分别代表β37Trp，α14TIP和β15Trp(Simplaceanu等(2000))。含氧HbA的晶体结构(Shaanan(1983))表明，可能与α1β2亚基界面内β37Trp形成氢键的是α94Asp。CO态rHb(βL105W)的质谱显示在可交换质子共振区内另有一处质子共振(图10A)。由于β37和β105残基都在α1β2界面内，所以都接近R-四级结构(shaanan(1983))，在β105位用Trp取代Leu会使β37Trp的质子共振离开其原化学位移。估计，额外共振(11.0ppm或10.8ppm)来自β105Trp。因此，对15N-标记的rHb(βL105W)进行异核二维(“2D”)NMR研究，在rHb(βL105W)的质谱中确定这些共振的意义。CO态rHb(αD94A)的质谱显示：与HbA的相比，10.6ppm的共振(HbA的β37Trp)消失了，9.7ppm处出现一个新的共振(图10A)。这一结果表明，β37Trp从10.6ppm位移到9.7ppm(接近水的共振)是因为CO态的rHb(αD94A)内没有α94与β37之间的氢键。这一结果还证实了10.6ppm处的共振代表α94Asp与β37Trp之间的亚基间氢键。CO态rHb(αD94A，βL105W)的质谱显示，与(αD94A)的质谱相比，10.8ppm处有-额外共振。10.8ppm处的共振被认为代表rHb(αD94A，βL105W)和rHb(βL105W)的β105Trp的吲哚NH。
图10B显示CO态HbA，rHb(βL105W)，rHb(αD94A，βL105W)和rHb(αD94A)的环电流位移质子共振。环电流位移共振对血红素的构象和血红素袋的三级结构非常敏感(Ho(1992))。CO态rHb(βL105W)的环电流位移质子质谱与HbA的仅有细微差别，rHb(αD94A，βL105W)和rHb(αD94A)的则与HbA的显著不同。这些差异表明αD94A使血红素构象和/或血红素袋内氨基酸残基发生了某些调整。以前的研究已经证明环电流位移共振的细微差别是许多突变rHb的共同特征(Kim等(1994)；Kim等(1995)；Kim等(1996)；Sun等(1997))。
对15N标记的CO态rHb(βL105W)的异核2D NMR研究
为了指明rHb(βL105W)的1H-NMR质谱内11.0ppm和10.8ppm处质子共振的来源，对15N标记的CO态rHb(βL105W)进行了异核2D NMR研究。结果见图11A和11B，图12A-D。图11A和B显示15N标记的CO态rHb(βL105W)和rHbA的600MHz HMQC质谱。由于该质谱没有进行15N去偶合，所以在Trp残基的化学位移坐标上观察到了双峰(1Hε1，15Nε1)。通常，Trp残基的1Hε1共振一般出现在质子量纲中的约9-12ppm(Cavanagh等(1996)；BioMagResBank(1999)(www.bmrb.wisc.edu/ref_info/statsel.btm)，它们的15Nε1共振一般出现在15N量纲的约121-133ppm(BioMagResBank)。rHb(βL105W)的1H-NMR质谱中11.0ppm和10.8ppm处质子共振的15N化学位移分别位于134ppm和129ppm，表明这些共振源于Trp残基。由于质子的化学位移比氮的化学位移更容易受环境的影响，因此认定(11.0，134)ppm的共振代表β37Trp，(10.8，129)ppm的则代表β105Trp(图11A和B)。这也符合图10A的结果。HMQC质谱还将Trp15Nε1化学位移与碳结合的质子1Hδ1关联起来。如图11A和B所示，15N标记的CO态rHb(βL105W)和rHbA的质谱中都在(7.3，129)和(7.1，127)ppm处观察到了α14Trp和β15Trp的1Hδ1交叉峰(cross-peaks)。在15N标记的CO态rHbA的质谱中还观察到了(7.4，134)ppm处强度弱得多的β37Trp的1Hδ1交叉峰(通过两键偶合)(图11B未显示)。由于15N标记的CO态rHb(βL105W)的质谱无法显示β37Trp和β105Trp的1Hδ1交叉峰(图11A)，所以在不同混合时刻进行了NOESY-HMQC实验，为以上Trp鉴定提供更多证据。当混合时间为60或100ms时，这些交叉峰的强度变得较弱(图12C和D)。图12A-D还显示β37Trp和β105Trp的1Hζ2交叉峰的化学位移相互很接近。如图12A-D所示，即使在很短的混合时间仍能看到四个Trp残基的1Hδ1和1Hζ2交叉峰。这些结构都证明了以上的Trp残基鉴定。
对脱氧rHb结构的1H-NMR研究
图13A显示脱氧HbA、rHb(βL105W)、rHb(αD94A，βL105W)和rHb(αD94A)的300MHz1H-NMR谱中近侧组氨酸的超精细位移NδH共振。脱氧突变rHb的近侧组氨酸超精细位移NδH共振与HbA的非常相似。图13B显示脱氧HbA、rHb(βL105W)、rHb(αD94A，βL105W)和rHb(αD94A)的300MHz1H-NMR谱中的超精细位移和可交换质子共振。超精细位移质子共振是血红素基团上及其附近氨基酸残基的质子与血红素袋内Fe(II)的未配对电子之间的超精细相互作用产生的(Ho(1992))。rHb(βL105W)在+24至+16ppm之间的超精细位移质子共振与HbA的非常相似，但rHb(αD94A，βL105W)和rHb(αD94A)的则与之存在某些差异。图13显示显示脱氧HbA、rHb(βL105W)、rHb(αD94A，βL105W)和rHb(αD94A)的300MHz1H-NMR谱中的可交换质子共振。已知，14ppm左右的1H共振代表脱氧HbAα1β2界面内α42Tyr与β94Asp之间的氢键，这是HbA脱氧(T)四级结构的特征之一(Fung等(1975))。已知，12.2ppm左右的共振代表α1β2界面上α103His与β131Asp之间的氢键(未公开的结果)。11.1ppm左右的共振被假设为代表α1β2界面上α94Asp与β37Trp之间的氢键(Fung等(1975)；Ishimori等(1992))。最近对15N标记的rHbA的异核多维NMR研究认为13.0ppm左右的共振代表α122His，证实11.1ppm左右的共振代表β37Trp(未公开的结果)。脱氧rHb(βL105W)的质谱显示在可交换质子共振区内有一个其他质子共振(图13C)。这表明，12.7ppm的额外共振是β105Trp产生的。由于没有脱氧rHb(αD94A)的α94与β37之间的氢键，β37Trp的共振将离开其原化学位移，而更靠近水的共振(与CO态观察到的相似)。脱氧rHb(αD94A)的质谱显示约11.1ppm处的共振(在HbA中代表β37Trp)消失(图13C)。但是不清楚脱氧rHb(αD94A)中β37Trp新的化学位移。与rHb(αD94A)的相比脱氧rHb(αD94A，βL105W)的质谱在11.1ppm处多一个共振。这似乎表明该共振来自rHb(αD94A，βL105W)的β105Trp。当rHb(αD94A，βL105W)中的α94Asp被Ala取代时，β105Trp的NH共振的化学位移为向高磁场移动1.7ppm，更靠近水共振(图13C)。以上结果显示，脱氧rHb(βL105W)的β105Trp与α94Asp之间形成了一个新的氢键。
对15N标记的脱氧rHb(βL105W)的异核2D NMR研究
为了证实脱氧rHb(βL105W)的1H-NMR谱中的12.7ppm共振代表β105Trp，对15N标记的脱氧rHb(βL105W)进行了异核2D NMR研究(图14和图15A-D)。图14显示15N标记的脱氧rHb(βL105W)的600MHz HMQC谱。rHb(βL105W)的1H-NMR谱中12.7ppm的质子共振的15N化学位移位于134ppm，表明该共振来自色氨酸残基。在15N标记的脱氧rHb(βL105W)的HMQC谱中还观察到了(7.8，134)ppm、(7.6，135)ppm、(7.1，129)ppm和(7.0，127)ppm处β105Trp、β37Trp、α14Trp和β15Trp的Trp15Nε1的1Hδ1交叉峰。还观察到(8.3，163)和(7.1，163)ppm处α103His和(7.6，167)和(7.0，167)ppm处α122His的His15Nε2的1Hδ1和1Hζ2交叉峰。还在不同混合时间进行了NOESY-HMQC实验，用于为本发明的认定提供更多证据，并用于研究脱氧rHb(βL105W)的β105Trp的微环境。β105Trp(12.7ppm处)位于7.8和8.2ppm处的1Hδ1和1Hζ2交叉峰可出现在全部4个混合时间(图15A-D)。β37Trp(11.2ppm处)位于7.6和7.32ppm处的1Hδ1和1Hζ2交叉峰也可出现在全部4个混合时间(图15A-D)。此外，图15A-D所示15N标记的脱氧rHb(βL105W)的NOESY-HMQC谱中还可观察到β105Trp和β37Trp残基之间的NOE效应。
IHP和温度对CO态Hb质谱的影响
图16A和B显示11、20和29℃时，没有(图16A)和有(图16B)IHP存在下，HbA、rHb(βL105W)、rHb(αD94A，βL105W)和rHb(αD94A)的可交换质子共振。没有IHP时，只可在低温rHb(αD94A，βL105W)的质谱中观察到T标记。IHP存在下，三种突变rHb的质谱中都可观察到T标记。这表明：当降低温度和/或加入IHP时，这三种突变rHb都能由R结构转变为T结构，同时不改变其连接态。除了出现T标记之外，IHP存在下的CO态rHb(βL105W)的质谱与无IHP的质谱还有其他一些差异。IHP存在下，当温度降低时，由12.9和11.0(或10.8)ppm的共振逐渐形成13.1和11.2ppm处的新峰(图16B)。
为了跟踪这一变化，在没有或有IHP存在下对15N标记的rHb(βL105W)进行了更详细的HSQC实验。IHP存在下，HSQC实验仍在低温下进行(图17A-D)。29℃、IHP存在下，(11.0，134)ppm处β37Trp的(1Hε1，15Hε1)交叉峰消失。29℃、IHP存在下(10.8，129)ppm处β105Trp的(1Hε1，15Hε1)交叉峰比没有IHP时弱得多(图17A和B)。IHP存在下进一步降低温度时，(11.0，134)ppm处交叉峰重现，于是在(11.0，134)和(10.9，130)ppm处出现两个新交叉峰(图17C和D)。这似乎表明这两个新的交叉峰来自β37Trp和β105Trp。
图18A和B显示11、20和29℃，没有和有IHP存在下CO态HbA、rHb(βL105W)、rHb(αD94A，βL105W)和rHb(αD94A)的环电流位移质子共振。没有IHP时，CO态rHb(βL105W)的环电流位移质子共振仅与HbA的略有差别，IHP存在下则有显著差异。不论IHP是否存在，rHb(αD94A，βL105W)和rHb(αD94A)的环电流位移质子共振都与HbA的有显著差异，但IHP存在下，它们的质谱则非常相似。此外，降低温度时，IHP存在下CO态rHb(βL105W)的环电流位移质子共振与rHb(αD94A，βL105W)和rHb(αD94A)的非常相似(图18B)。本发明认为，IHP存在下CO态rHb(αD94A，βL105W)和rHb(αD94A)的环电流位移质子共振谱代表了具有稳定T结构的CO态rHb质谱。所以，根据可交换质子共振中的T标记，突变rHb与HbA的血红素袋构象差异表明这些突变rHb更容易由R结构变为T结构。已知-1.8和-1.9ppm的共振分别代表HbAα和β链的血红素袋远端缬氨酸(E11)(Dalvit，C.等，
生物化学24：3398(1985)和Craescu，C.T.等，
欧洲生物化 学杂志181：87(1989))。与HbA的质谱相比，在突变rHb的质谱中，β链的远端缬氨酸(E11)共振比α链的更容易受影响，IHP存在下尤其如此(图18A和B)。以上结果提示，IHP、温度或本发明所述突变引起的R向T结构转变可能主要发生在β链内。
可以按照已知方法，将适当交联的rHb(βN108Q)和/或rHb(βL105W)用于临床或兽医用的生理相容性的基于血红蛋白的血液代用品或治疗用血红蛋白中。参考例如R.M.Winslow等，
血液代用品效用的生理学基础(Birkhauser，Boston，Mass)(1995)。本发明的血红蛋白还可用于治疗诸如败血性休克，防止透析中的过敏性休克。
虽然，以上为了说明本发明而对其进行了详细的描述，但其中的细节只应认为是用于说明目的，根据本发明构思，本发明范围内的许多改变对本领域技术人员来说是显而易见的，本发明的范围仅由权利要求来限定。
序列表
<110>卡内基.梅隆大学
<120>低氧亲合力突变型血红蛋白
<130>027782
<150>US09/598,218
<151>2000-06-21
<160>8
<170>Patentln version 3.1
<210>1
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：用于将βN108Q突变引入质粒pHE2的引物
<400>1
cgtctgctgg gtcaggtact agtttgcg 28
<210>2
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：用于将突变αD94A引入质粒pHE2的引物
<400>2
ctgcgtgttg ctccggtcaa cttcaaactg 30
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<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：用于将突变βL105W引入质粒pHE2的引物
<400>3
ggaaaacttc cgatggctgg gtaacgtac 29
<210>4
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：用于将突变βN108Q引物质粒pHE7的引物
<400>4
acagaccagt acttgtccca ggagcct 27
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<212>DNA
<213>智人
<400>5
aaatgagctg ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtggaattgt gagcggataa 60
caatttcaca caggaaacag aattcgagct cggtacccgg gctacatgga gattaactca 120
atctagaggg tattaataat gtatcgctta aataaggagg aataacatat ggtgctgtct 180
cctgccgaca agaccaacgt caaggccgcc tggggtaagg tcggcgcgca cgctggcgag 240
tatggtgcgg aggccctgga gaggatgttc ctgtccttcc ccaccaccaa gacctacttc 300
ccgcacttcg atctgagcca cggctctgcc caggttaagg gccacggcaa gaaggtggcc 360
gacgcgctga ccaacgccgt ggcgcacgtg gacgacatgc ccaacgcgct gtccgccctg 420
agcgacctgc acgcgcacaa gcttcgggtg gacccggtca acttcaagct cctaagccac 480
tgcctgctgg tgaccctggc cgcccacctc cccgccgagt tcacccctgc ggtgcacgcc 540
tccctggaca agttcctggc ttctgtgagc accgtgctga cctccaaata ccgttaaact 600
agagggtatt aataatgtat cgcttaaata aggaggaata acatatggtg cacctgactc 660
ctgaggagaa gtctgccgtt actgccctgt ggggcaaggt gaacgtggat gaagttggtg 720
gtgaggccct gggcaggctg ctggtggtct acccttggac ccagaggttc tttgagtcct 780
ttggggatct gtccactcct gatgctgtta tgggcaaccc taaggtgaag gctcatggca 840
agaaagtgct cggtgccttt agtgatggcc tggctcacct ggacaacctc aagggcacct 900
ttgccacact gagtgagctg cactgtgaca agctgcacgt ggatcctgag aacttcaggc 960
tcctgggaca agtactggtc tgtgtgctgg cccatcactt tggcaaagaa ttcaccccac 1020
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<223>人工序列的描述：用于将突变βL105W引入质粒pHE7的引物
<400>6
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<212>DNA
<213>智人
<400>7
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caatttcaca caggaaacag aattcgagct cggtacccgg gctacatgga gattaactca 120
atctagaggg tattaataat gtatcgctta aataaggagg aataacatat ggtgctgtct 180
cctgccgaca agaccaacgt caaggccgcc tggggtaagg tcggcgcgca cgctggcgag 240
tatggtgcgg aggccctgga gaggatgttc ctgtccttcc ccaccaccaa gacctacttc 300
ccgcacttcg atctgagcca cggctctgcc caggttaagg gccacggcaa gaaggtggcc 360
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agcgacctgc acgcgcacaa gcttcgggtg gacccggtca acttcaagct cctaagccac 480
tgcctgctgg tgaccctggc cgcccacctc cccgccgagt tcacccctgc ggtgcacgcc 540
tccctggaca agttcctggc ttctgtgagc accgtgctga cctccaaata ccgttaaact 600
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ctgaggagaa gtctgccgtt actgccctgt ggggcaaggt gaacgtggat gaagttggtg 720
gtgaggccct gggcaggctg ctggtggtct acccttggac ccagaggttc tttgagtcct 780
ttggggatct gtccactcct gatgctgtta tgggcaaccc taaggtgaag gctcatggca 840
agaaagtgct cggtgccttt agtgatggcc tggctcacct ggacaacctc aagggcacct 900
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<210>8
<211>146
<212>PRT
<213>智人
<400>8
Val His Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser Ala Trp Thr Ala Leu Trp Gly
1 5 10 15
Lys Val Asn Val Asp Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly Arg Leu Leu
20 25 30
Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe Glu Ser Phe Gly Asp Leu
35 40 45
Ser Thr Pro Asp Ala Val Met Gly Asn Pro Lys Val Lys Ala His Gly
50 55 60
Lys Lys Val Leu Gly Ala Phe Ser Asp Gly Leu Ala His Leu Asp Asn
65 70 75 80
Leu Lys Gly Thr Phe Ala Thr Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys Leu
85 90 95
His Val Asp Pro Glu Asn Phe Arg Leu Leu Gly Asn Val Leu Val Cys
100 105 110
Val Leu Ala His His Phe Gly Lys Glu Phe Thr Pro Pro Val Gln Ala
115 120 125
Ala Tyr Gln Lys Val Val Ala Gly Val Ala Asn Ala Leu Ala His Lys
130 135 140
Tyr His
145
Claims (16)
1.非天然突变人血红蛋白，其β链第108位的天冬酰胺残基被谷氨酰胺取代。
2.如权利要求1所述的血红蛋白，由序列SEQ ID NO：5编码。
3.无毒药物组合物，包含权利要求1所述的非天然突变型血红蛋白。
4.如权利要求3所述的组合物，包含权利要求2所述的非天然突变型血红蛋白。
5.质粒pHE7009。
6.制造人工血红蛋白的方法，包括：
将表达质粒引入合适的非红细胞宿主并培养转化细胞，所述表达质粒含有编码人血红蛋白的DNA序列，所编码人血红蛋白的β链第108位天冬酰胺残基被谷氨酰胺取代；
表达所述DNA从而产生所述人工血红蛋白；
回收并纯化所述血红蛋白。
7.如权利要求6所述的方法，所述宿主细胞是大肠杆菌。
8.如权利要求7所述的方法，所述表达质粒是pHE7009。
9.非天然突变人血红蛋白，其β链第105位的亮氨酸被色氨酸取代。
10.如权利要求9所述的血红蛋白，由序列SEQ ID NO：7编码。
11.无毒药物组合物，包含如权利要求9所述的非天然突变型血红蛋白，所述突变型血红蛋白β链第105位的亮氨酸被色氨酸取代。
12.如权利要求27所述的组合物，包含如权利要求10所述的所述血红蛋白。
13.质粒pHE7004。
14.制造人工血红蛋白的方法，包括：
将表达质粒引入合适的非红细胞宿主并培养转化细胞，所述表达质粒含有编码人血红蛋白的DNA序列，所述人血红蛋白β链第105位的亮氨酸被色氨酸取代；
表达所述DNA从而产生所述人工血红蛋白；
回收并纯化所述血红蛋白。
15.如权利要求14所述的方法，所述宿主细胞是大肠杆菌。
16.如权利要求15所述的方法，所述表达质粒是pHE7004。
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