CN1260486A - 酵母浓度(生物量浓度)的检测方法和仪器 - Google Patents

Abstract

本发明以Maxwell-Wagner效应为基础,通过测量发酵液在无线电频率范围内的电容率分布,实现了对酵母浓度的在线实时检测。仪器用参照电极技术克服了发酵条件变化对测量结果的影响。电极直接插入发酵液中并能用蒸汽灭菌,电极寿命长且不感染和污染发酵物。仪器测得的是活酵母的浓度。本仪器既可单独使用,也能与其他部件组成反馈控制系统,实现对发酵过程的自动控制。

Description

酵母浓度(生物量浓度)的检测方法和仪器

本发明提出了对酵母浓度(生物量浓度)进行在线实时检测的新方法并制造出了基于这种方法的仪器。本发明基于Maxwell-Wagner效应，即微生物的存在会影响或改变发酵液的电容率这一客观事实。仪器用参照电极技术克服了发酵条件变化对测量结果的影响；电极(传感器)直接插入发酵物中且能承受高温蒸汽灭菌条件。本仪器的优点是不用取样就能对发酵器中的酵母浓度进行连续的测量，而且测得的是活的酵母数。本仪器既可单独使用，也可以与其他部件结合组成反馈控制系统。本仪器在生化制药，食品发酵，啤酒酿造，污水检测处理等工业领域里有很好的推广应用前景。

近年来，现代高新生物技术有了飞速的发展，人们有目的的去培育新的菌种，以生产新的对人类有用的物质，例如抗生素，氧基酸，维生素和具有生物活性的蛋白质等。制药(如青霉素，链霉素等)，酿酒(如葡萄酒，啤酒等)都要经过发酵过程。影响发酵过程的因素很多，如发酵液的成分和浓度，溶解氧含量，温度，PH值，搅拌速度，酵母的种类，活性和浓度等等。在上述因素中，酵母浓度是最重要的工艺参数，因为在一定条件下，发酵的得率与酵母浓度密切相关[1]。因此酵母浓度的实时在线检测，对了解和控制发酵进程，提高产品的质量具有重要的意义。但是直到现在人们还没有研制出符合要求的仪器，这种仪器应能对生物量进行准确的在线实时检测，而不改变或破坏原微生物系统的工作状态。我们这里所说的实时检测，意思是仪器的读数应该是此时此刻的生物量浓度，而不是几十分钟或几个小时之前的数值。

通过微生物的繁殖生长过程，在生物反应器中生产有用物质的过程，与在化学反应釜中通过催化作用生产化学物质的过程有很大的不同。因为在生物反应器中酵母的数目每时每刻都在发生变化。生物量浓度的检测对任何发酵过程都是非常重要的[2]，也是科学家和工程师们非常感兴趣的研究课题。但是直到今天，人们还没有研制出满足工业现场要求的测量仪器[3]。

生物量的传统测量方法是高线的，主要有干重法，光密度法和亚甲基蓝染色法等。

目前人们把干重法看成是一种参照方法，因为用其他方法测得的生物量一般都要与干重法测得的数值相对照。但是Jens Nielsen教授认为，把干重法作为参照方法(或基准方法)是不适宜的[3]。因为干重法是基于地球引力(重力)的方法，它有很多缺点。首先，工业发酵物中一般含有多种颗粒状的有机物和无机物，他们跟微生物混在一起，很难把它与微生物分开。其次，活的酵母和死的酵母对测量结果都有贡献，而我们希望得到活酵母的数目，因为只有活的酵母具有繁殖能力。虽然干重法有这些缺点，但由于找不到其他好的参照方法，所以目前人们把干重法作为参照方法。用本发明提出的方法测得的结果也与用干重法测得的结果作了对比。但是必须指出：用本发明的方法和其他方法所得的结果有时更准确的表征了酵母浓度，尽管这些结果与干重法的数值有较大差异，特别是在批量发酵过程中更是如此[3]

光密度法(Optical Density，即O D)是又一种参照方法。当用一定波长的光线照射发酵液时，酵母和颗粒状悬浮物对光有反射和散射作用。反射光和散色光与生物量之间有一定的对应关系，根据这个原理可以制成生物量检测仪。但此类仪器的读数易受发酵流的颜色，浊度，颗粒状悬浮物的影响，也不能排除死酵母的影响，这类仪器难以用来测量淤泥状发酵物。此外还有基于荧光原理的仪器，此类仪器不能用来测量盘尼西林等发酵物，因为盘尼西林是荧光携带者[3]。

为了检测活酵母的数目和酵母的活性，人们通常用细胞计数器或用亚甲基蓝染色，然后用显微镜观察计数[4]。但这种方法要做多次稀释，会产生很大的误差。用这种方法得到的不是此时此刻的生物量，而是几十分钟或几个小时之前的数值。而有些菌体繁殖很快，在一个小时内会增加一倍以上。对于杆状细菌或丝状细菌，有时他们会缠在一起。在这种情况下，光密度法和亚甲基蓝染色法就显得无能为力。

当超声波通过发酵液时，基幅度被衰减，其传播速度会有所改变，据此原理可制成生物量测量仪。但此类仪器易受发酵液成分变化，汽泡，温度变化，粘稠度的影响[5]。

酵母的存在会影响发酵液的电特征，有些学者试图通过阻抗(或导纳)测量法测量生物量浓度和研究酵母生理状态的变化[6]。虽然人们作了很多工作，但此法的研究还远远没有达到能做实际应用的程度。因为即便在实验室条件下，发酵液的阻抗也会出现复杂的变化。我们发现：当发酵液的成分发生较大变化时，特别是发酵液中离子的浓度发生较大变化时，阻抗测量法的准确度是很差的[7]。

上述方法都是高线测量法，都要从发酵罐中抽取样品，在取样过程中极易带进杂菌而使实验半途而废。采用高线方法的另一个缺点是，人们不能用这种方法来对发酵过程进行自动控制。

综上所述，Jens Nielsen，B.H.Junker等世界知名学者认为，直到现在人们还没有制造出满足要求的在线检测仪器，该仪器能对发酵过程中的生物量浓度进行准确的实时测量[3]。

本发明的目的是提出一种新方法，制造一种新仪器，用该仪器能对生物量浓度进行在线实时测量和控制，而不改变或破坏生物反应器的工作状态。

本发明提出的方法和制作的仪器，主要用于对发酵液中的酵母浓度进行在线实时测量。本仪器可以单独使用，也能与其他部件一起组成反馈控制系统，对发酵过程进行自动控制。

本发明的理论依据是Maxwell-Wagner效应(或称为Maxwell-Wagner分布)，即发酵液的电容率对于酵母浓度和测量频率的依赖性。

微生物的存在会影响发酵液的电特性，这个现象上个世纪末人们就认识到了[8]。本世纪初Fricke通过测量红血细胞在声频和无线电频率下的介电特性，算出了细胞膜的厚度为分子数量级[9]，而Clarke及其同事实现了一种装置，该装置通过测量含微生物溶液的导磁性来确定发酵液中的生物量浓度[10]。

从电学的角度来说，一切物质(包括发酵液)的电特性都可以用电导率和电容率来表征。发酵液的电导率可定义为其传导电荷的能力；而发酵液的电容率可定义为其储存电荷的能力。

设酵母的形状是球形的，用r表示酵母的平均半径(单位为m)；C_m为细胞膜单位面积的电容(单位为F/m²)；ε₀是真空中的电容率(单位为F/m)，其值大约等于8.85×10^-12 F/m)；P是体积系数，它是所有酵母菌的体积与发酵液体积的比，P是一个远远小于1的数，无量纲；ε_∞是发酵液在很高频率下(相对于测量频率而言)的相对电容率(无量纲)；ε_f是发酵液在测量频率下的相对电容率(无量纲)。则在一定测量频率范围内(o＜f＜f_∞)，发酵液的相对电容率可表示为：

ε_f＝9prc_m/4ε₀+ε_∞    (1)

水的相对电容率在60到85之间，其典型值是78。随着温度和电导率的不同，ε_f会有所变化。如果测量电压比较低，水的电容率几乎与测量信号频率无关。如果把水放入发酵器中，其电容率受其中溶解的气体和非细胞物质的影响较小，当测量含有酵母的发酵液的电容率以确定生物量时，水的电容率可作为参照信号。

图1画出了放了啤酒酵母的麦芽汁在100KHz～10MHz频率范围内电容率的分布曲线。从图中可以明显地看出：a。对于酵母浓度一定的麦芽汁，当测量频率由低到高逐渐增加时，电容率逐渐减小，最后趋向于纯麦芽汁(基质)的值。我们说发酵液的电容率具有频率依赖性，即电容率是频率的函数；b。如果测量信号频率不变，发酵液中酵母的数目越多，测得的电容率越大，这就是说发酵液的电容率具有酵母浓度的依赖性或电容率是酵母浓度的函数。如果同时考虑测量频率和酵母浓度两个变量，则发酵液的电容率是这两个变量的二元函数：

ε_f＝F(f，D)    (2)式中f是测量信号频率，D是酵母浓度。

当培养基中加入酵母后，其电容率会显著增加。当测量频率由高到低变化时，发酵液的电容率会在培养基电容率的基础上逐渐增加(培养基的电容率可作为参照信号或基准信号)我们把电容率随测量频率变化而变化的现象叫作电容率分布，电容率的频率特性或电容率频谱。发酵液的电容率分布可划分为三个主要区域：α-分布，β-分布和γ-分布。α-分布发生在音频范围内，主要是由于带电离子在细胞膜表面作切向运动引起的。β-分布又称为Maxwell-Wagner效应或Maxwell-Wagner分布[11]。β-分布发生在无线电频率范围内，主要是由于活的酵母细胞具有粒子不能透过的细胞膜引起的。γ-分布发生在比β-分布更高的频率范围内(甚高频或射频)，它主要是由于偶极子(例如水偶极子)的旋转引起的。γ-分布不是活的微生物细胞特征的表现形式。

Maxwell-Wagner-分布，即β-分布是本发明的理论基础，因为β-分布是具有完整细胞膜的微生物细胞特征的表现形式[12]。关于Maxwell-Wagner分布产生的机理，一般解释为：活的微生物细胞都具有完整的细胞膜，完整的细胞膜是良好的绝缘体。在一般情况下，细胞内的带电离子很难穿过细胞膜到达细胞的外部；细胞外的带电离子也很难渗透到细胞的内部。如果将发酵液置于电场内，在细胞膜的内，外表面上会有大小相等，符号相反的电荷堆积，每个细胞很像一个小电容器。在一定条件下，单位体积内的酵母细胞所束缚的正电荷(或负电荷)的数量与酵母数目成正比。酵母浓度越大，它们所束缚的电荷越多，发酵液的电容率越大，这就意味着我们可以通过测量发酵液的电容率来测量生物量浓度。由于细胞膜很薄，它所呈现出的细胞膜电容是很大的，单位面积上的细胞膜电容C_m一般在0.6μF/cm²～1。0μF/cm²之间。

发酵液的电容率和电导率是两个独立的参数，但要把它们准确地测量出来并非易事，特别是当发酵液的电容率比较高的时候更是如此。即便在高频情况下，电极上也会存在极化电压，电极和引线会引入分布电阻和电容[13]。发酵液成份的变化，温度的变化等都可能引起电容率的改变。

一般说来，物质(特别是发酵液)的电容率和电导率不能直接测得，但是我们可以通过测量电容的方法来确定两电极间发酵物的电容率。如果在发酵液中放置一对电极(实际上构成了一个电容器)，设电极的表面积为A，距离为d，则发酵液的电容率ε_f，电极电容C之间有如下关系：

ε_f＝dC/Aε₀    (3)或  ε_f＝KC(K＝d/Aε₀)    (4)

上面的式子中，d/A定义为电极常数，其单位为cm^-1。电极常数与电极的形状和电极结构有关。

设有酵母时发酵液的电容率为ε_f1，无酵母时发酵液的电容率为ε_f2，则由于酵母的存在引起的电容率的变化量Δε_f为：

Δε_f＝ε_f1-ε_f2＝d(C1-C2)/Aε₀＝K(C1-C2)    (5)

在本发明中，Δε_f，即电容率的增量经过标定后，用来指示酵母浓度。上式中，C₁为发酵液中存在酵母时两电极间的电容值；C₂为发酵液中不存在酵母时两电极间的电容值。

但是在被测物质是发酵液的情况下，我们甚至不能用普通的方法和仪器来测得发酵液的电容。

设有两个平行电极，其表面积为A，距离为d，如果把这个电极插入发酵液中，两电极间发酵液的电特性可用一个复数导纳Y来描述。设加在两电极的电压为V，流过电极的电流为I，则复数导纳Y定义为：

Y＝I/V-＝G+jωc   (6)

G＝I/V.cos      (7)

ωc＝I/V.sin    (8)

c＝I/ωV.sin    (9)为I，V之间的夹角。如果ω已知，测得了I，V，的值，就可以按照(9)式计算出C，进而计算出ε_f：

ε_f＝dC/Aε₀＝dIsin/Aε₀Vω＝K Isin/V (K＝d/Aε₀ω)    (10)

附图说明

图1.以酵母浓度为参变量，麦芽汁的电容率随测量频率的变化曲线(麦芽汁的Maxwell-Wagner分布)。

图2.电极(传感器)结构图。(a)A形电极-双四电极电极；(b)B形电极-单四电极电极。

图3.本发明仪器的电原理图。

图4.用本发明的仪器检测Saccharomyces Cerevisiae DGI342的生长全过程图中：■：用光密度法的测量结果(离线测量)。◆：用干重法测得的结果(离线测量)。△：用本发明的仪器测得的结果(在线测量)。

图5.光密度法和电容率法测量结果的对比。

本发明的内容及实现本发明的最好方式

1.本发明的内容：本发明以Maxwell-Wagner效应为依据，通过测量发酵液在无线电频率下的电容率分布实现了酵母浓度的实时在线检测。本发明使用参照电极技术，克服了发酵液成份变化，离子种类和浓度变化对测量结果的影响。为了克服电极极化对测量结果的影响，本发明采用了四电极技术。本发明的电极直接插入发酵罐中，电极能用高温蒸汽灭菌；电极寿命长且不感染发酵物。本发明不需要采样就能对发酵液中的酵母浓度进行连续地测量，避免了采样可能对发酵液造成的感染。用本发明测得的是活的酵母数。本发明不但能用来测量酵母菌，还能用来测量细菌，植物细胞和动物细胞，也适用于测量杆状细菌和丝状细菌。本发明的测量范围宽。本发明不但可用来测量酵母浓度的变化，还可用来研究酵母生理状态的变化。

2.下面我们将结合附图，说明实现本发明的最好方式和采用的有关技术。整个仪器可划分为电极(传感器)和主机两部分，下面分别加以说明。

(1)电极(传感器)描述：前已述及，发酵液中加入酵母后其电容率会有所增加，但要想把由于酵母的存在所引起的电容率的增加量准确地测量出来是很困难的，因为有很多因素会影响发酵液的电容率。发酵液电容率的变化可归结为以下原因：a.发酵液成分(例如葡萄糖浓度，酒精浓度，溶解氧浓度等)的改变。b.由于微生物的新陈代谢作用，pH值调节所引起的离子种类和浓度的变化。C.温度，搅拌速度等的变化。D.酵母浓度的变化。在一般情况下，由于温度传感器，速度传感器技术比较成熟，所以对于多数发酵设备，温度和搅拌速度都实现了自动控制。再者，即便这两个参数对测量结果有影响，也可以进行补偿或较正，因为温度和搅拌速度对测量结果的影响有一定的规律。经验说明这两个量对测量结果的影响较小。我们主要来考虑a，b两个因素。

在有些情况下，由发酵液成分和离子浓度的改变所引起的电容率的变化比由于酵母数目的增加所引起的发酵液电容率的变化还要大，特别是当酵母浓度较低而发酵液的电导率又比较高的时候更是如此。

用Maxwell-Wagner-分布测量生物量浓度的关键，是同时测量有酵母的发酵液的电容率和无酵母的发酵液的电容率并加以对比。因为这样可得到仅由酵母浓度变化所导致的电容率增量Δε_f。

为体现上述指导思想，本发明设计制作了两种型号的电极(传感器)：A型电极-双四电极电极和B型电极-单四电极电极，如图2所示。下面分别加以介绍。

I.A型电极(双四电极电极)：A型电极的结构如图2(a)所示。该电极由上，下两个电极组成，每一个电极都是一个四电极电极。上面的电极称为参照电极，它由工业白金和耐高温的工程塑料制成。四个小电极排成一列。中间的两个小电极叫电压电极，两边的两个叫电流电极。参照电极封在过滤罩内。过滤罩用过滤薄膜制作(其小孔直径在0.2μm-10μm之间选择，视被测量的微生物的大小而定)。水.葡萄糖.离子等可以穿过过滤罩，但酵母等却不能进入过滤罩内。为了提高罩内，外介质的交换速度，参照电极上方留有小细管，将蠕动泵与此小细管连接，可加速罩内，外介质的循环。参照电极为我们提供了一个“自适应的参照信号”，该信号跟踪发酵液成分的变化。当主机电路与参照电极相连接时，仪器得到的是无酵母的介质的电容率。

下电极叫“信号电极”，它也是一个四电极电极并与参照电极有相同的结构，但在他周围没有过滤罩，它的四个电极直接与含有酵母的发酵液接触。当此电极与主机电路相连时，仪器得到的是含有酵母的发酵液的电容率。

参照电极和信号电极是在微处理器的控制下，轮流地接到主机上去的。电极通过电缆线与主机电路相连。电极直接插入发酵罐中并可以在现场与介质一起蒸汽灭菌，电极对发酵物无污染和感染作用。

II.B型电极(单四电极电极)：B型电极的结构如图2(b)所示。电极由工业白金和耐高温的工程塑料制造。它有四个小电极，这四个小电极排成一行，中间的两个叫电压电极，两边的两个叫电流电极。B型电极没有过滤罩，四个小电极直接与发酵液接触。

有些发酵液(例如麦芽汁等)的电导率较低，发酵又比较缓慢。在这种情况下发酵液的电导率和发酵液成分的变化对电容率影响较小，在此情况下可以使用B型电极，这样既降低了成本，又有足够的精度。当用B型电极时，仪器把接种前培养基的电容率作为参照信号去计算Δε_f。

(2).主机电路介绍：

实现上述设计意图的装置如图3所示。图中3是正弦波产生器，4是隔离变压器，5是模拟电子开关。由信号产生器产生的正弦波电压，通过隔离变压器和模拟开关加到电流电极A.D(或A′，D′)上。图中的IC₁.IC₂是两个具有高输入阻抗，高共模抑制比的集成运算放大器。电压电极B，C(或B′，C′)两端电压通过模拟开关5加到集成运放IC₁上。IC₁的输出给出了两电压电极B，C(或B′，C′)上瞬时电压的数值。图中的IC₃，IC₄是两个运算放大器。IC₁的输出经过IC₃进一步放大后加到检测器IC₅。IC₅的输出给出了两电压电极B，C(或B′，C′)间电压幅值的大小V。

流过发酵液的电流通过电阻R取出，这个信号被送到集成运算放大器IC₂的输入端。IC₂的输出给出了流过发酵液的瞬时电流的数值。IC₂的输出经过IC₄作进一步放大后加到检测器IC₆的输入端。IC₆的输出给出了流过发酵液的电流的大小I。

图中的IC₇是相位检测电路，IC₃，IC₄的输出送到IC₇的输入端。IC₇的输出给出了电流信号和电压信号之间相位差。

图中6是模拟开关，IC₈是采样保持电路，IC₁₀是微型计算机。在计算机的控制下模拟开关将IC₅，IC₆，IC₇的输出周期地送到采样保持电路IC₈。A/D转换器IC₉将采样保持电路IC₈送来的模拟信号变成数字信号，此信号被送到微型计算机IC₁₀。根据采集到的I，V，的值，微型计算机计算出发酵液的电容率。

参照电极和信号电极是轮流地接到主机电路上去的。当参照电极与主机电路相连结时，计算机给出不含酵母的发酵液的电容率ε_f1；当信号电极与主机电路相连时，计算机算出含有酵母的发酵液的电容率ε_f2，Δε_f＝(ε_f1-ε_f2)是仅由酵母存在而引起的电容率的变化量。在本发明中，Δε_f经过标定后用来指示酵母浓度。

如前所述，当发酵液的电导率较低且发酵过程比较缓慢时，可以使用B型电极(单四电极电极)，这时仪器把接种前培养基的电容率作为参照信号。

图3中9是显示器，10是打印机。计算机将测得的酵母浓度送到显示器显示或打印机打印。

与现有技术相比，本发明的方法和仪器具有如下优点：

1.本发明在Maxwell-Wagner效应的基础上，通过测量发酵液在无线电频率下的电容率分布实现了生物量浓度的在线实时测量。仪器给出的是此时此刻的酵母浓度而不是几十分钟或几个小时之前的数值，而用干重法，光密度法等离线方法测得的是过去某个时刻的数值。

2.本发明使用了参照电极技术，克服了发酵条件变化(特别是发酵液成分变化)对测量结果的影响，提高了仪器的精度。

3.本发明制作的电极直接插入发酵罐中，电极满足高温蒸汽灭菌条件。电极的寿命长，对发酵液无感染和污染。

4.与离线法不同，本发明不需要采样就能对发酵液中的生物量进行测量，从而避免了采样过程可能对发酵罐造成的感染。

5.本发明测得的是活的菌体数。不但能用来测量酵母菌，还能用来测量植物细胞和动物细胞(如血细胞)；不但能用来测量园形或椭圆形细菌，还能用来测量杆状细菌和丝状细菌。

6.本仪器的测量范围大，最高可达200mg/ml干重。

7.本仪器不但能测量生物量的变化，还能用来研究酵母生理状态的变化。

8.本装置既可单独使用，也可以与其他部件一起组成反馈控制系统，实现对发酵过程的自动控制。

因此我们相信，本发明提出的方法和制作的仪器在科学研究和工业发酵领域里会有广泛的应用，具有良好的推广应用前景。

应用实例：用本发明的方法和仪器，跟踪测量Saccharomyces Cerevisiae DGI 342 CBS介质中的生长过程。

1.实验场所：丹麦技术大学工业微生物研究中心(Center for Process Biotechnology，Technical Universityof Denmark，Building 223，DK-2800 Lyngby，Denmark)。

2.实验所用材料：(1)实验所用菌株为Saccharomyces Cerevisiae DGI 342。酵母取自该实验中心的菌种储藏库。原始酵母在标准的CBS介质[14]中在28℃的条件下培养20小时，然后在2500rpm下离心10分钟，分离出来的酵母放入新的CBS介质中，用灭过菌的蒸馏水进行酵母浓度调节。(2)实验所用介质为CBS介质[14]。它主要由Saline Solution，trace metal solution，antifoam，glucose等组成。

3.实验方法：

(1)在接种前，电极和介质在122℃的蒸汽中灭菌40分钟。灭菌后介质的pH值调至5.0。为了避免glucose和ammonium发生Maillard反应，glucose是单独灭菌的。灭菌后冷却至40℃再把它加入CBS介质。维生素是经过过滤除菌后加入的。

(2)发酵条件：批量发酵是在标准的5L发酵器内进行的，内盛4L介质.搅拌速度为700rpm，通气量为2L/分.发酵温度控制在30℃；通过加入NaOH或H₂SO₄，发酵液的pH值自动地控制在5.0左右。

(3)酵母浓度的离线测量：a.干重的测量(Dry cell weight)。将样品用0.45μ的过滤纸过滤，用蒸馏水冲洗，然后放入微波炉中干燥20分钟，再放入干燥器中干燥20分钟，在电子天平上称量，连做三次，取平均值(14)。b.光密度的测量(Optical Density)测量：用日本产的带微电脑的光密度计，将样品作适当稀释，确保读数小于0.3，测量波长为525nm。

(4)酵母浓度的在线测量：用本发明的仪器，当发酵液的温度稳定在30℃，仪器上电40分钟后将仪器调零，将酵母接种到发酵器中，初始酵母浓度为0.1mg/ml，大约相当于10⁶个酵母/毫升。

4.实验结果及讨论：图4画出了Saccharomyces Cerevisiae DGI 342在CBS介质中的生长曲线。图中，■：用光密度法测得的结果；◆：用干重法测得的结果；▲：用本发明的方法测得的结果。图中曲线具有典型的酵母生长曲线的特征：它具有滞后期，指数生长期和平衡期三个阶段。用本发明的仪器对酵母浓度进行在线测量，所得结果与用离线方法测得结果是比较接近的。

从图中可以看出，发酵进行大约52小时后进入平衡期，在此阶段内用本发明测得的结果要比用干重法和光密度法所得的结果低一些。这一现象与我们所说的“用本方法测得的是活的酵母浓度”相吻合，这是本仪器的一个优点。这一现象的出现与酵母生理状态密切相关。在平衡期由于营养物的缺乏，酵母繁殖变得缓慢，有些细胞开始衰老或死亡，致使其体积收缩，细胞膜的绝缘程度下降或丧失，导致了所束缚的电荷的减少。所以本仪器可用来研究酵母生理状态的变化。

5.结论：我们用相同的介质，相同类型的酵母，相同的发酵罐和发酵条件进行了多次实验，所得的生长曲线基本相同，表明测量结果的再现性很好。我们在丹麦嘉士博啤酒研究所用啤酒酵母和麦芽汁做实验，也得到了良好的结果。一个理想的酵母浓度在线实时检测装置应满足以下基本要求[3]：

(1)能对酵母浓度进行在线实时检测，即仪器测得的是此时此刻的生物量浓度而不是过去某一时刻的数值，传感器直接插入发酵物中而不需要采样。

(2)长时间工作的稳定性和可靠性(在中间实验厂，要求能连续可靠地运行20天以上)。

(3)传感器可在工作现场高温灭菌，传感器不感染和污染发酵物。

(4)读数受颗粒状悬浮物和死酵母的影响要小。

(5)发酵条件发生变化时(如发酵液成分，pH值，溶解氧浓度，温度，搅拌速度，通气量等发生变化时)仪器的读数基本上不受影响。

本发明提出的方法和仪器满足了以上要求，传感器直接插入发酵液中并满足蒸气灭菌条件；传感器不感染发酵液；当介质成分，pH值，溶解氧浓度，温度等发生变化时，仪器的读数变化很小。因此我们相信，本发明在科学研究和工业发酵领域里会有广泛应用，本仪器的使用定会产生很好的经济效益和社会效益。

                 参考文献1 Carleysmith，S.W.and Fox，R.L.(1984)“Fermenter Instrumentation and Control”，Advances inBiotechnological Processes，Vol.4，p1-512 Fung，D.Y-C. and Erickson，L.E.，eds(1988)Handbook of Anaerobic Fermentations，Marcel Dekker3 Lisbeth Olsson and Jens Nielson(1997)“On-line and In-situ Monitoring of Biomass in SubmergedCultivations”，Trends in Biotechnology，Vol.15，p517-5224 Jukker Kronlof(1994)“Immobilized yeast in continuous fermentation of beer”，Technical ResearchCentre of Finland，Espoo5 Zips，A.And Faust，U.(1989)Applied Environmental Microbiology，Vol.55，p1801-18076 Y. Ebina，M.Ekida，and H.Hashimoto(1989)Biotechnology and Bioengineering，Vol.33，p1290-12957 Yijun W.(1998)“On-line and In-situ Monitoring Of Cell Concentrations with Twin ProbeDevice，Proceedings of BEC’98，p335-338，Tallinn，Estonia8 Stewart，G.N.(1899)Journal of Physiology，Vol.24，p356-3739 Fricke，H.J.(1925) General Physiology，Vol.9，p137-15210 Clarke al.(1985) Biosensors，Vol.1，p213-32011 Schwan，H.P.“Electrical Properties of Tissue and Cell Suspensions”，p147，In Lawrence，J.H.and Tobias，C.A.，eds，Advances in Biological and Medical Physics，Vol.5. Academic Press Inc.，New york，195712 Pething“Dielectric and Electronic Properties of Biological Materials”，Wiley，197913 J.de Gier(1992)Bioelectrochemistry and Bioenergetics，Vol.27，p1-1014 Schulze，U.(1995)Anaerobic Physiology of Saccharomyces Cerevisiae，Ph.D thesis，Departmentof Biotechnology，Technical University of Denmark

Claims (8)

1.本发明以Maxwell-Wagner效应为基础，通过测量发酵液在无线电频率下的电容率分布，实现了酵母浓度的在线实时检测。本发明使用参照电极技术，克服了发酵液成分变化。离子种类和浓度改变对测量结果的影响。为了消除电极极化对测量结果的影响，本发明采用了四电极技术。本发明的电极直接插入发酵罐中，电极能够用高温蒸汽灭菌，电极寿命长且不感染和污染发酵物。本发明不经采样就能对发酵液中的酵母浓度进行连续的测量，避免了采样可能对发酵物造成的感染。本发明测得的是活酵母数。本发明不但可用来测量酵母菌，还可用来测量细菌。植物细胞和动物细胞(如血细胞)，也适用于测量杆状细菌和丝状细菌。用本发明不但能测量酵母浓度的变化，还可用来研究酵母生理状态的变化。本仪器既可以单独使用，也可以与其他部件一起构成反馈控制系统，实现对发酵过程的自动控制。

本发明所提出的以Maxwell-Wagner效应为基础，通过测量发酵液在无线电频率范围内(100KHZ-10MHZ)，发酵液的电容率(即介电系数)的变化来测量生物量浓度(包括酵母浓度。细菌浓度。植物细胞和动物细胞浓度)的方法。通过在发酵液中放置一对电极，然后测量这对电极间的电容来确定电容率的方法。通过测量流过电极的电流I，两电极间的电压V以及I、V间相位差来计算C的方法。

2.本发明所完成的，能够实现用电容率测量法测量生物量浓度的仪器，仪器的原理，设计和结构。

3.为了克服发酵液成分变化对测量结果的影响，本发明设计制作了A型电极，即双四电极电极。A型电极由上，下两个电极组成。上电极被封在由酵母不能透过的过滤膜做成的小室内，作为参照电极。参照电极提供了自适应的参照信号。下电极周围没有过滤罩，叫做信号电极。A型电极的结构，形状，材料，制作技术及方法。用蠕动泵提高参照电极过滤罩内，外介质交换速度的方法。

4.B型电极(单四电极电极)的形状，结构，材料及设计制作方法。

5.为了克服电极极化对测量结果的影响，本发明设计了四电极电极。四电极电极的结构.形状.材料及制作技术。

6.主机电路采用的如下技术：通过模拟开关和隔离变压器把交流信号加到电流电极上的方法和电路；产生正弦波的方法和电路；将电压电极上的电压取出并加以放大的方法和电路；将流过电极的电流取出并加以放大的方法和电路。

7.主机电路使用的如下技术：电压电极上电压幅度的检测方法和电路；电流电极中电流幅度的检测方法和电路。电流，电压间相位差的检测方法和电路。

8.主机电路采用的如下技术；在计算机的控制下，将参照电极和信号电极通过模拟开关轮流地接到主机电路上去的方法和电路。

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