CN1256420A - 血红蛋白在临床和环境分析中的应用及其方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了血红蛋白(Hb)的一种新用途,即Hb替代过氧化物酶用于临床和环境样品中过氧化氢含量及其检测方法。通过血红蛋白催化过氧化氢和底物的氧化还原反应来测定过氧化氢,解决了过氧化物酶价格昂贵,易失活,反应条件苛刻等难题,而且催化活性也高于HRP及一些模拟酶和具有催化活性的小分子。该方法成本低廉、操作快速简单、灵敏度高、重现性好,可作为标记酶用于免疫试剂盒中,如胆固醇、血糖的测定,也可用于过氧化氢试纸的开发。
Description
本发明涉及血红蛋白(Hb)一种新用途及其方法，具体地说就是血红蛋白(Hb)作为辣根过氧化物酶(HRP)替代物，在临床和环境分析中的应用及其检测方法。
HRP是商品化较早，应用最为广泛的一种过氧化物酶试剂。利用其催化特性，HRP可用于测定临床化学和环境分析中重要的物质-过氧化氢(H2O2)，进而与其他酶试剂偶联测定葡萄糖、胆固醇、尿酸等多种人体内的重要物质。但是，作为一种天然酶，HRP价格昂贵，容易失活，不易保存且反应条件苛刻，因此寻找一种HRP的替代物成为当前研究的热点。然而，目前人工合成的模拟酶及一些具有催化活性的小分子，由于缺乏天然酶的蛋白结构等特点，在催化特性方面远不如天然酶。
血红蛋白(Hb)分子是由四条肽链(亚基)借非共价连接聚集而成，每一条链与一个亚铁血红素结合，血红素位于肽链折叠所形成的介电常数较低的疏水环境中。Hb在生物体内至少起四种与氧和产生能量有关的重要作用：(1)把氧运送到组织中；(2)催化有机物的氧化；(3)分解过氧化物；(4)传递电子。长期以来，对于血红蛋白的研究主要集中在结构、输氧功能及电子转移上，而Hb所具有的酶特性至今还未见报道。
本发明的目的是在发现Hb具有的过氧化物酶特性基础上，拟用Hb作为HRP的替代物，并用于临床和环境分析用于过氧化氢及多种生物活性物质的测定。这种替代物用于临床和环境分析不仅能够克服HRP的缺点，具有价格低廉，相对更稳定等特点，而且在催化活性方面优于HRP及其他模拟酶和具有催化活性的天然小分子。测定分析方法灵敏度高，重现性好。
本发明的申请人考虑到血红蛋白具有和天然过氧化物酶HRP相同的铁卟啉辅基，与天然过氧化物酶的催化活性中心相同，应具有过氧化物酶的特性，通过运用动态分子学光谱的方法跟踪反应过程，从动态光谱上观察到反应中间体和产物的特征吸收，并对其在不同介质中的动力学行为进行了研究，研究结果证实了血红蛋白确实具有典型的过氧化物酶特性。而且Hb对氢受体(H2O2)有特异性，对氢供体(底物)缺乏特异性；同时，由于其独特的空间及化学结构，Hb在催化活性方面又优于HRP，可广泛地催化体内的还原底物与H2O2的氧化还原反应，不需要在机体中加入特异底物，即可生成发色产物。通过检测产物吸光度或荧光强度等特征参数的变化，可对不同浓度的过氧化氢进行分析，进而可对其他能产生过氧化氢的生物活性物质进行测定。
因此，本发明提出了血红蛋白Hb的一种新用途，用廉价、易得的血红蛋白Hb替代昂贵的辣根过氧化物酶(HRP)，用于临床及环境样品中的过氧化物及多种生物活性物质的测定，还可用作抗原、抗体的标记物用于免疫试剂盒中，如胆固醇、血糖的测定；另外，由于采用Hb后的分析方法灵敏度高、重现好，Hb可催化无色底物为发色产物，因此为过氧化氢试纸的开发提供了可能性。
用Hb替代天然过氧化物酶用于催化检测监床及环境样品中过氧化氢含量的具体方法如下：
取环境样品或临床样品，以邻苯二胺(OPDA)作为氢供体底物，以血红蛋白作为催化剂，在PH5.0的NaH2PO4-柠檬酸缓冲液中进行催化反应，反应室温为～48℃左右，监测产物2，3-二氨基吩嗪(DAP)在波长425nm处吸光度的变化，绘制A-T动力学曲线，计算出反应最初0.2min内的初始速率，从而计算出过氧化氢的含量。
表1给出了血红蛋白(Hb)、天然过氧化物酶(HRP)、β-环糊精-氯化血红素(βCDHemim)及天然小分子氯化血红素(Hemim)的催化性能比较，表2为Hb的特征催化参数。从表中数据可以看出，Hb具有极高的催化活性，而且其性能要明显地优于其它几种酶。
在进行环境样品分析时，大气中的SO2及一些氮氧化物，如SO4 2-、NO3 -等均不干拢测定，方法快速、简便，成本低廉，用于雨水中的痕量H2O2的测定，其结果非常理想，灵敏度高，重现性好。
本发明首次提出了以Hb替代HRP用于临床及环境样品中的过氧化氢含量的分析测定，与HRP及其它几种酶相比，Hb的这种新用途具有以下几个显著的优点：
(1)Hb来源丰富，容易提取(在普通实验室即可进行)，价格低廉，Hb的
价格约为HRP价格的1/500；
(2)Hb稳定性优于HRP，相对耐高温，不易失活，反应条件较宽，方法操
作简单，重现性好；
(3)Hb催化活性高于HRP及其他模拟酶和具有催化活性的天然小分子，因
此方法灵敏度高，具有广泛推广应用价值。
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明：
实施例1：Hb用于环境样品中的H2O2测定
环境样品中的H2O2含量很低，急需建立一种快速、灵敏、简便的方法进行测定，为此我们建立了一种新方法：取雨水样品，过滤除去不溶物，以4×10-3mol/L邻苯二胺(OPDA)为氢供体底物，1.2×10-5mol/L血红蛋白为催化剂，在PH5.0的NaH2PO4-柠檬酸缓冲液中，室温～48℃下，监测产物2，3-二氨基吩嗪(DAP)在波长425nm处吸光度变化，绘制A-T动力学曲线，计算出反应最初0.2min内的初始速率，即可得到雨水样品中过氧化氢的含量。
实施例2：Hb用于血清样品中血糖量的测定
在磷酸盐缓冲溶液(PH7.0)中加入葡萄糖氧化酶和已处理好的血清样品，在25℃下放置5min，冷却到0℃，停止反应，然后用Hb代替HRP作催化剂，以4×10-3mol/L邻苯二胺(OPDA)为氢供体底物，1.2×10-5mol/L血红蛋白为催化剂，在PH5.0的NaH2PO4-柠檬酸缓冲液中，室温～48℃下，监测产物2，3-二氨基吩嗪(DAP)在波长425nm处吸光度变化，绘制C-T动力学曲线，测量出反应最初0.2min内的初始速率，计算H2O2的含量，则可算出血清样品中的葡萄糖含量。
对比例：
6×10-4mol/L的H2O2，以4×10-3mol/L邻苯二胺为底物，在pH＝5.0的NaH2PO4-柠檬酸缓冲溶液中，测得Hb、HRP、人工合成的模拟酶β-环糊精—氯化血红素(βCD-Hemin)和具有催化活性的天然小分子氯化血红素(Hemin)催化该体系的催化活性，用产物的初始生成速率表示，结果列于表1。可见，在相同的实验条件下，Hb具有很高的催化活性。
表1不同催化剂催化活性的比较(48℃)
| 催化剂 | 浓度mol/L | 产物最大吸收波长nm | 初始速率min-1 |
| Hb | 1×10-5 | 425 | 2.3045 |
| HRP | 1×10-5 | 410 | 1.8422 |
| βCD-Hemin | 1×10-5 | 416 | 0.2231 |
| Hemin | 1×10-5 | 424 | 0.0905 |
表2血红蛋白的特征催化参数
| 米氏常数 | 最大催化速率 | 催化剂初始浓度 | 转移数 | |
| Km(10-3mol/L) | Vmax(min-1) | [E]0(10-6mol/L) | Kcat(106L·mol-1·min-1) | |
| Hb | 8.75 | 1.60 | 0.250 | 6.40 |
表3Hb替代HRP用于H2O2检测的分析特性
| 线性范围mol/L | 相关系数r(n＝10) | 检测下限mol/L | 相对标准偏差RSD(n＝11) |
| 5.0×10-8～3.5×10-6 | 0.9994 | 9.2×10-9 | 2.08％ |
Claims (2)
1.血红蛋白用于催化测定临床样品或环境样品中的过氧化氢含量。
2.一种用血红蛋白催化测定临床样品或环境样品中的过氧化氢含量的方法，其特征在于：该方法以邻苯二胺作为氢供体底物，以血红蛋白作为催化剂，在PH5.0的NaH2PO4-柠檬酸缓冲液中进行催化反应，反应温度为～48℃，监测产物2，3-二氨基吩嗪在波长425nm处吸光度的变化，得到A-T动力学曲线，计算出反应最初0.2min内的初始速率，从而计算出过氧化氢的含量。
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|---|---|---|---|---|
| WO2016004551A1 (zh) * | 2014-07-11 | 2016-01-14 | 青岛千士医疗科技有限公司 | 一种支气管/肺上皮细胞线粒体损伤的检测方法 |
| CN112485246A (zh) * | 2020-11-19 | 2021-03-12 | 田博方 | 一种单项上皮组织肿瘤细胞渗液游离血红素显色液及制备方法 |
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1999
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| WO2016004551A1 (zh) * | 2014-07-11 | 2016-01-14 | 青岛千士医疗科技有限公司 | 一种支气管/肺上皮细胞线粒体损伤的检测方法 |
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