CN1231290A - 高比活性重组人干扰素αm及其制作方法 - Google Patents
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Abstract
本发明在研究IFNα1c和IFNα1c/86D的实验基础上,将噬菌体显示技术构建的肽库用于α干扰素受体结合区的研究,研制出了一种新型的基于IFNα1c/86D的突变体IFNαm,比活性高达1.1×108IU/mg,比国内外制订的α1型干扰素比活性标准高10倍。IFNαm具有高比活性的优点,可望降低长期使用干扰素治疗的毒副反应,可作为第二代干扰素产品的候选生产菌种。
Description
本发明涉及一种重组人干扰素αm的制作方法，特别涉及一种高比活性重组人干扰素αm的制作方法。
在现有的技术中，已知基因工程人干扰素α1是我国第一批被批准投产的高技术生物技术新药。目前，它是治疗乙、丙型肝炎和恶性肿瘤的重要药物，但其临床疗效也有待进一步提高。此外，大剂量长期使用干扰素的毒副反应也是一个严重问题。干扰素的作用机制是通过与受体结合引发复杂的信号传导而发挥抗病毒和抗肿瘤作用，因此高受体亲合性蛋白质突变体具有提高的生物学活性。
IFNα1c是从我国正常胎肝DNA库中克隆的一种人干扰素α1新变异株，是我国人群的优势亚型。采用定点突变技术构建成的IFNα1c/86D，其比活性与IFNα1c相当，此外将IFNα1c的86C改变为86D后，减少了IFNα1c二聚体的形成，提高了IFNα1c的热稳定性。
本发明的目的在于提供一种高比活性重组人干扰素αm，其比活性高达1.1×108IU/mg。本发明的另一个目的是提供此高比活性重组人干扰素αm的制作方法。
本发明的实施方案如下：
本发明高比活性重组人干扰素αm(pBV220/IFNαm/Jm103，菌种号0390)的组成：
1高效原核表达载体pBV220，用于温控表达外源基因。
2人干扰素αm的DNA作为待表达外源基因。
3表达外源基因的宿主菌为JM103。
本发明高比活性重组人干扰素αm的制作方法分为下列五个步骤：
1噬菌体6肽库的构建、筛选及克隆的鉴定。
2合成肽的免疫反应性和对α1干扰素诱导的抗病毒、抗增殖活性的影响。
3合成肽与α1干扰素受体结合域AB环序列的同源性比较。
4干扰素突变体IFNαm的构建。
5干扰素突变体IFNαm的表达，纯化。
本发明高比活性重组人干扰素αm的优点是：
高比活性重组人干扰素αm的比活性高达1.1×108IU/mg，比国内外制订的α1型干扰素比活性标准高10倍。高比活性重组人干扰素αm用于长期治疗乙、丙型肝炎和恶性肿瘤毒副反应较小。
本发明高比活性重组人干扰素αm的制作方法优选例如下：
1.1噬菌体6肽库的构建按以下序列合成编码6肽的DNA及PCR引物。编码6肽的DNA片段为5′-CTATTCTCACTCGGCCGAGGGGGCT(NNK)6GGGGCCGCTGGGGCCGAAACTGTTGAA-3′其中N代表A,C,G,T四种碱基，K代表G,T两种碱基，共合成72mer。用于扩增编码6肽的DNA的5′端PCR引物为CTATTCTCACTCGGCCGACG,3′端引物为GACCCCGGCTTTGACAACTT。以上合成片段纯化后，用于PCR扩增反应，纯化的扩增产物再经BglⅠ酶切与SfilⅠ酶切的载体FUSE5连接。电转化MC1061宿主菌，获得噬菌体6肽库。
1.2噬菌体6肽库的竞争性筛选：在96孔酶标板上包被干扰素中和抗体4C1，以IFNα1b作为竞争剂，混合噬菌体文库，经充分洗脱后，在96孔板中感染对数中期K91，部分用于转导单位计算，其余涂四环素平板。用聚乙二醇沉淀回收第一轮筛选后的噬菌体。三轮筛选后，重组噬菌体的回收率从10-7提高到10-2。
1.3噬菌体阳性克隆的鉴定：用ELISA检测单克隆扩增的噬菌体与4C1结合。包被4C1抗体，以HRP标记的抗M13多抗作为二抗，邻苯二胺(OPD)作为显色底物，并在OD492nm下比色，选择阳性克隆PH1。点杂交和West-blotting进一步证明重组噬菌体PH1与IFNα的中和抗体4C1有作用。DNA序列测定并推导出插入6肽的序列为WLDPRH。
2.1合成肽的免疫反应性：用ABI公司431A型多肽合成仪合成WLDPRH短肽，经HPLC反相柱层析纯化定量，用于随后的竞争性ELISA。包被IFNα1b，分别用WLDPRH和阴性对照肽竞争4C1与IFNα1b的结合。结果表明合成肽WLDPRH可特异抑制抗体与抗原(IFNα1b)的结合。
2.2合成肽对亚浓度人干扰素α1b抗病毒活性的影响：将WISH细胞接种到96孔板，每孔加入梯度稀释亚保护浓度的IFNα1b(含和不含WLDPRH)，处理24小时，加入104Pfu VSV培养24小时，细胞用95％乙醇固定，结晶紫染色，用酶标仪测定570nm吸收值抗病毒结果活性显示合成肽能将IFNα1b的抗病毒百分保护率从40％提高到86％。
2.3合成肽对人干扰素α1b抗增殖活性的影响：将Hela细胞接种到96孔板，加梯度稀释的IFNα1b(含和不含WLDPRH),37℃培养96小时后，每孔加含5mg/ml的MTT,4小时后每孔加酸化异丙醇溶解所有结晶，酶标仪测定570nm光吸收值。结果表明合成肽对IFNα1b的抗增殖作用无明显影响。
3.合成肽与α1干扰素受体结合域AB环序列的同源性比较：PROSIS软件的分析表明合成肽WLDPRH保留了相应母体30位亮氨酸(L),33位精氨酸(R),34位组氨酸(H)与受体结合至关重要的氨基酸，与相应母体AB环的29,31,32位氨基酸存在差异。因此，WLDPRH是人α1干扰素受体结合区AB环的类似区。
4干扰素突变体IFNαm的构建：在IFNα1C/86DAB环内通过点突变技术引入两个独立酶切位点EcoRV和BstEⅡ，便于盒式突变。用PCR技术选择性地将母体干扰素受体结合区域AB环的31位甲硫氨酸替换成天冬氨酸(M-＞D),32位天冬氨酸替换成脯氨酸(D-＞p)，获得重组突变体pCANTAB5E/IFNαm，经DNA序列测定证实，参阅图1：人重组干扰素αm的DNA序列和图2：推导的人重组干扰素αm的蛋白质序列。
5.1干扰素突变体IFNαm的表达：以pCANTAB5E/IFNαm突变质粒为模板，经PCR扩增，获得IFNαm突变基因，用EcoRⅠ和SalⅠ酶切，插入经EcoRⅠ,SalⅠ双切的pBV220原核表达载体中，获得重组质粒pBV220/IFNαm，参阅图3：人重组干扰素αm的构建。pBV220/IFNαm转化大肠杆菌JM103，获得人IFNαm工程菌(pBV220/IFNαm/Jm103)。将工程菌30℃过夜活化后，转接含Amp的LB培养液中，30℃振荡培养至OD=0.4-0.6，转42℃继续培养6小时，收集菌体，加入7mol/L盐酸胍裂解，透析过夜，离心去沉淀，上清加80％饱和度的硫酸铵沉淀即为粗制IFNαm。
5.2干扰素突变体IFNαm的纯化：IFNαm的粗制品透析过夜，离心取上清。经CM-Sepharose FF层析柱纯化，将0.4mol/L NaAC-HAC和0.6mol/LNaAC-HAC洗脱峰透析过夜，离心取上清。经IFN McAb层析柱纯化，收集0.1mol/LGly/HCl(pH2.5)洗脱峰，即得高度纯化的重组人IFNαm。该产品经SDS/PAGE电泳，考马斯亮蓝染色和银染法染色均呈单一条带，大小约为19KD。以Lowry法测定蛋白含量。在VSV-WISH系统上采用细胞病变抑制法，测定重组IFNαm的活性单位，以标准干扰素校正其效价，重复三次，确定比活为1.1×108IU/mg蛋白。
Claims (2)
1，一种高比活性重组人干扰素αm，其特征在于：其如下组成：
(1.1)高效原核表达载体pBV220，用于温控表达外源基因，
(1.2)人干扰素αm的DNA作为待表达外源基因，
(1.3)表达外源基因的宿主菌为JM103。
2，一种高比活性重组人干扰素αm的制作方法，其特征在于：分为下列五个步骤：
(1)噬菌体6肽库的构建、筛选及克隆的鉴定，
(1.1)噬菌体6肽库的构建：按以下序列合成编码6肽的DNA及PCR引物，编码6肽的DNA片段为5′-CTATTCTCACTCGGCCGAGGGGGCT(NNK)6GGGGCCGCTGGGGCCGAAACTGTTGAA-3′其中N代表A,C,G,T四种碱基，K代表G,T两种碱基，共合成72mer，用于扩增编码6肽的DNA的5′端PCR引物为CTATTCTCACTCGGCCGACG,3′端引物为GACCCCGGCTTTGACAACTT，以上合成片段纯化后，用于PCR扩增反应，纯化的扩增产物再经BglⅠ酶切与SfilⅠ酶切的载体FUSE5连接，电转化MC1061宿主菌，获得噬菌体6肽库，(1.2)噬菌体6肽库的竞争性筛选：在96孔酶标板上包被干扰素中和抗体4C1，以IFNα1b作为竞争剂，混合噬菌体文库，经充分洗脱后，在96孔板中感染对数中期K91，部分用于转导单位计算，其余涂四环素平板，用聚乙二醇沉淀回收第一轮筛选后的噬菌体，三轮筛选后，重组噬菌体的回收率从10-7提高到10-2，(13)噬菌体阳性克隆的鉴定：用ELISA检测单克隆扩增的噬菌体与4C1结合，包被4C1抗体，以HRP标记的抗M13多抗作为二抗，邻苯二胺(OPD)作为显色底物，并在OD492nm下比色，选择阳性克隆PH1，点杂交和West-blotting进一步证明重组噬菌体PH1与IFNα的中和抗体4Cl有作用，DNA序列测定并推导出插入6肽的序列为WLDPRH，
(2)合成肽的免疫反应性和对α1干扰素诱导的抗病毒、抗增殖活性的影响，
(2.1)合成肽的免疫反应性：用ABI公司431A型多肽合成仪合成WLDPRH短肽，经HPLC反相柱层析纯化定量，用于随后的竞争性ELISA，包被IFNα1b，分别用WLDPRH和阴性对照肽竞争4C1与IFNα1b的结合，结果表明合成肽WLDPRH可特异抑制抗体与抗原(IFNα1b)的结合，
(2.2)合成肽对亚浓度人干扰素α1b抗病毒活性的影响：将WISH细胞接种到96孔板，每孔加入梯度稀释亚保护浓度的IFNα1b(含和不含WLDPRH)，处理24小时，加入104Pfu VSV培养24小时，细胞用95％乙醇固定，结晶紫染色，用酶标仪测定570nm吸收值，抗病毒结果活性显示合成肽能将IFNα1b的抗病毒百分保护率从40％提高到86％，
(2.3)合成肽对人干扰素α1b抗增殖活性的影响：将Hela细胞接种到96孔板，加梯度稀释的IFNα1b(含和不含WLDPRH),37℃培养96小时后，每孔加含5mg/ml的MTT,4小时后每孔加酸化异丙醇溶解所有结晶，酶标仪测定570nm光吸收值，结果表明合成肽对IFNα1b的抗增殖作用无明显影响，
(3)合成肽与α1干扰素受体结合域AB环序列的同源性比较，PROSIS软件的分析表明合成肽WLDPRH保留了相应母体30位亮氨酸(L),33位精氨酸(R),34位组氨酸(H)与受体结合至关重要的氨基酸，与相应母体AB环的29,31,32位氨基酸存在差异，因此，WLDPRH是人α1干扰素受体结合区AB环的类似区，
(4)干扰素突变体IFNαm的构建，
在IFNα1C/86DAB环内通过点突变技术引入两个独立酶切位点EcoRV和BstEⅡ,便于盒式突变，用PCR技术选择性地将母体干扰素受体结合区域AB环的31位甲硫氨酸替换成天冬氨酸(M-＞D),32位天冬氨酸替换成脯氨酸(D-＞p)，获得重组突变体pCANTAB5E/IFNαm，经DNA序列测定证实，参阅图1：人重组干扰素αm的DNA序列和图2：推导的人重组干扰素αm的蛋白质序列，
(5)干扰素突变体IFNαm的表达，纯化，
5.1干扰素突变体IFNαm的表达：以pCANTAB5E/IFNαm突变质粒为模板，经PCR扩增，获得IFNαm突变基因，用EcoRⅠ和SalⅠ酶切，插入经EcoRⅠ,SalⅠ双切的pBV220原核表达载体中，获得重组质粒pBV220/IFNαm，参阅图3：人重组干扰素αm的构建，pBV220/IFNαm转化大肠杆菌JM103，获得人IFNαm工程菌(pBV220/IFNαm/Jm103)，将工程菌30℃过夜活化后，转接含Amp的LB培养液中，30℃振荡培养至OD=0.4-0.6，转42℃继续培养6小时，收集菌体，加入7mol/L盐酸胍裂解，透析过夜，离心去沉淀，上清加80％饱和度的硫酸铵沉淀即为粗制IFNαm，
(5.2)干扰素突变体IFNαm的纯化：IFNαm的粗制品透析过夜，离心取上清，经CM-Sepharose FF层析柱纯化，将0.4 mol/L NaAC-HAC和0.6 mol/LNaAC-HAC洗脱峰透析过夜，离心取上清，经IFN McAb层析柱纯化，收集0.1mol/LGly/HCl(pH2.5)洗脱峰，即得高度纯化的重组人IFNαm，该产品经SDS/PAGE电泳，考马斯亮蓝染色和银染法染色均呈单一条带，大小约为19KD，以Lowry法测定蛋白含量，在VSV-WISH系统上采用细胞病变抑制法，测定重组IFNαm的活性单位，以标准干扰素校正其效价，重复三次，确定比活为1.1×108IU/mg蛋白。
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| CN 99105695 CN1231290A (zh) | 1999-04-23 | 1999-04-23 | 高比活性重组人干扰素αm及其制作方法 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110172451A (zh) * | 2019-05-05 | 2019-08-27 | 昆明理工大学 | 一种高通量分离噬菌体的方法 |
-
1999
- 1999-04-23 CN CN 99105695 patent/CN1231290A/zh active Pending
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|---|---|---|---|---|
| CN110172451A (zh) * | 2019-05-05 | 2019-08-27 | 昆明理工大学 | 一种高通量分离噬菌体的方法 |
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