CN1229472A - 用于体外测定红细胞生成素生物活性的方法 - Google Patents
用于体外测定红细胞生成素生物活性的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1229472A CN1229472A CN 96180436 CN96180436A CN1229472A CN 1229472 A CN1229472 A CN 1229472A CN 96180436 CN96180436 CN 96180436 CN 96180436 A CN96180436 A CN 96180436A CN 1229472 A CN1229472 A CN 1229472A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- epo
- cell
- sample
- propagation
- activity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及含有EPO样品体内EPO活性的体外测定方法。更具体地说,本方法包括在去除脱唾液酸EPO的条件下处理含有EPO的样品和测定所得处理样品的体外EPO活性。在优选的实施方案中,通过将此样品与人肝癌细胞系HepG2的细胞孵育而将脱唾液酸EPO从该样品中去除,并且通过将此处理过的样品与EPO反应性细胞系的细胞孵育并测定此EPO反应性细胞的增殖或活力以测定体外的EPO活性。例如,本发明对定量多种样品类型中的生物学活性EPO是有用的。
Description
发明领域
红细胞生成素(EPO)是一种刺激哺乳动物红细胞类前体细胞成熟且因此调节红细胞产生的糖蛋白激素。人EPO(hEPO)的纯化和该EPO基因的克隆导致重组人EPO的商业化生产，其已成功用于对具有由于肾衰竭所致贫血病人的治疗，并且在临床上对治疗其它贫血也是有用的。目前定量样品，例如大量药物制剂中生物活性EPO的方法笨拙、昂贵且耗时。本发明提供了测定EPO体内生物活性安全、快速和相对廉价的方法和用于测定EPO生物活性的试剂盒。
发明背景
EPO是一种刺激红细胞类前体细胞增殖、分化和成熟至成熟红血细胞的糖蛋白激素。EPO已被纯化(Miyake等，(1977)
生物化学杂志
252：5558)并被分子克隆(Lin等，(1985)
美国自然科学院院报
82：7580)，并且重组hEPO已成功用于由晚期肾病所致贫血的治疗。在与AIDS、类风湿性关节炎、血癌和早熟有关的贫血的治疗中以及为了增加术前收集自身血液的产量中也已有报导EPO的临床使用。
重组hEPO具有30.4KD的分子量，其40％为碳水化合物。对EPO糖基化性质和功能的研究表明hEPO的大部分寡糖链为含有岩藻糖、唾液酸化(sialylated)的四天线型寡糖。人尿中EPO和在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞和人B-淋巴母细胞中制备的重组EPO的糖基化结构类似但不相同。
糖基化以乎在EPO溶解性、生物合成和分泌以及EPO的体内代谢中发挥作用。对糖基化在体内的代谢作用且特别是唾液酸的存在已进行了研究。已证实尿液和重组脱唾液酸EPO由于肝脏的快速清除而在体内丧失活性。从这些及类似研究表明唾液酸掩盖了倒数第二位的半乳糖残基且因此保护EPO免受肝脏脱唾液酸糖蛋白(半乳糖基)受体的清除。因此，EPO寡糖末端唾液酸残基的丢失暴露出半乳糖残基，导致脱唾液酸(desialylated)(也称作去唾液酸(asialylated))EPO由于结合至肝脏受体而从血浆中快速清除。
虽然脱唾液酸EPO由于其快速消除而在体内基本上无生物活性，但在已建立的体外测定中可维持其生物活性。用于体外测定EPO生物活性的标准测定法包括测定苯肼处理贫血小鼠脾成红血细胞(Krystal(1983)
实验血液学.
20：649)或人多能白血病细胞系(Lewis等.，(1989)
实验血液学.
17：102)对含氚胸苷的掺入、测定59Fe向培养骨髓细胞的掺入(Goldwasser等.(1975)
内分泌学
97：315)以及测定EPO-依赖性细胞系的生长(Kitamura等(1989)
血液
73：375)。
因为体外测定不能够区分唾液酸化和脱唾液酸化的EPO，故此测定在定量预期在体内有活性EPO的数量中是没有用的。例如，如果含有EPO的样品也含有显著量的脱唾液酸EPO，那么体外测定将提供该体内活性的过高估计。因此，体内测定用于测定EPO的体内活性。具体地说，通过将59Fe掺入到红细胞增多症小鼠(Cotes等(1961)
自然
191：1065)或饥饿大鼠(Gold wasser等(1975)
酶学 方法
37：109)的成红血细胞中测定EPO活性。
在当今所用的为Cotes等方法修饰的测定中，将雌性小鼠暴露于低压下14天。内源性红细胞形成受到经暴露至减压所产生红细胞增多症的抑制。由于低氧后红细胞增多症状态继续维持，任何新的红细胞形成可归就于外源性EPO的施用。然后将测试样品和EPO标准品皮下注射至条件小鼠。EPO注射48小时后，测定59Fe。再过48小时后取血样，并定量放射性活性。放射活性的量直接与注射的标准EPO剂量成比例；从标准曲线计算未知样品的体内活性。
该体内生物测定被广泛看作是体内生物学活性的唯一真正测定，因为其既测定EPO的循环寿命又测定其增殖活性。然而，该体内测定有明显的缺陷因为其费力、昂贵、耗时且易于有动物至动物变异。
本发明提供了克服背景技术方法缺陷的体外定量EPO体内活性的方法。
发明小结
本发明涉及用于体外测定含有EPO样品的体内EPO活性的方法。更为特别地，本发明包括在去除脱唾液酸EPO的条件下处理含有EPO的样品，和体外测定此得到处理样品的EPO活性。在优选的实施方案中，通过将样品与人肝癌细胞系HepG2的细胞孵育而从该样品中去除脱唾液酸EPO，并且通过将该处理过的样品与EPO-反应性细胞系的细胞孵育并测定该EPO-反应性细胞的增殖或存活而体外测定EPO的活性。
本发明的另一个方面提供包括2个容器的试剂盒，其中第一个容器中含有表达脱唾液酸糖蛋白受体的细胞，且第二个容器含有EPO-反应性细胞。在另一实施方案中，该试剂盒进一步包括第三个容器，其含有活力显示染料，如3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基溴化四唑鎓(MTT)。
发明详述
本发明涉及用于体外测定含有EPO样品的体内EPO活性的方法。更具体地说，本方法包括在去除脱唾液酸EPO的条件下处理含有EPO的样品、和体外测定此得到处理样品的EPO活性。本发明在测定欲用于临床用途EPO制剂的体内活性中特别有用。
体外EPO活性定义为在体外刺激表达有功能EPO-受体细胞，例如红细胞类前体细胞增殖或存活的能力。如下所述，唾液酸化和脱唾液酸EPO在体外均有活性。体内EPO活性定义为在体内刺激红细胞类前体细胞增殖的能力。在这里，由于快速的肝脏清除，故认为脱唾液酸EPO基本上无体内活性。
根据本发明，含有EPO的样品可以是颗粒状或液体，并且优选是血清或血浆、细胞培养基、纯化或部分纯化的重组EPO，或欲用于临床用途、稳定性或制剂研究的EPO制剂。
根据本发明，在去除脱唾液酸EPO的条件下处理含有EPO的样品。EPO的脱唾液酸导致EPO寡糖次末端半乳糖残基的暴露。因此，通过将该样品用对半乳糖具有亲和性的凝集素，例如AbrinA进行亲和层析或通过以对半乳糖特异性的固定抗体的亲和层析可将脱唾液酸EPO从含有EPO的样品中去除。用于进行凝集素亲和层析的方法对普通的技术人员来说是已知的。
在另一个实施方案中，通过与表达脱唾液酸糖蛋白受体细胞孵育从含有EPO的样品中去除脱唾液酸EPO。此细胞可天然表达脱唾液酸糖蛋白受体，或可重组加工成表达此受体。例如，以编码脱唾液酸糖蛋白受体HL-1和HL-2亚单位的cDNA转染的成纤维细胞表达有功能的受体。可根据Shia等(1989)方法
美国自然科学 院院报
86：1158获得表达该重组脱唾液酸糖蛋白受体的转染成纤维细胞。
在优选的实施方案中，通过与已知以高浓度天然表达有功能脱唾液酸糖蛋白受体的人肝癌细胞系HepG2(ATCC No.HB 8065)的细胞孵育从含有EPO的样品中去除脱唾液酸EPO(见，例如，Lodish，(1991)
生化科学进展
16：374)。HepG2细胞系由Knowles等(1980)
科学
209：497和Knowles等美国专利4,393,133中所描述。
用于孵育含有EPO的样品与表达脱唾液酸糖蛋白受体的细胞的合适条件可由熟练的技术人员加以测定并且可依细胞类型和样品来源而变化。在一个实施方案中，将细胞培养至亚-汇合，洗涤并将细胞悬液加入到组织培养板小孔中。含有附着细胞的每个孔以缓冲液洗几次，去除缓冲液，并将EPO标准品或测试样品加入到每个小孔中。将此细胞与含有EPO的样品于37℃ 5％CO2和95％空气的潮湿环境中孵育过夜(约15-20小时)。来自根据本发明称为“处理过的样品”并且脱唾液酸EPO被吸附到其中的孵育混合物的上清液随后转移至容器中用于EPO增殖活性的分析。
为了证实脱唾液酸EPO已通过亲和层析或与表达脱唾液酸糖蛋白受体细胞的孵育而被去除，可将EPO应用至脱唾液酸条件。用于脱唾液酸化的化学和酶学方法对普通的技术人员是已知的。简单地说，EPO可通过在0.1mol/L HCl中80℃加热60分钟而被化学脱去唾液酸。脱唾液酸也可通过将EPO与固定的唾液酸苷酶孵育加以完成。用于EPO脱唾液酸的具体条件由Spivak等，(1989)
血液
73：90所描述。例如，通过等电点聚焦对EPO脱唾液酸前后的分析可用于测定是否唾液酸已被去除。
在按上述处理含有EPO样品以吸附脱唾液酸的EPO之后，分析此处理过样品的EPO增殖活性。如上述，术语“处理过的样品”指被处理以去除脱唾液酸EPO的样品，例如，通过凝集素亲和层析或通过与表达有功能脱唾液酸糖蛋白受体的细胞孵育。例如，该处理过的样品可以是细胞培养上清液。
例如，可通过测定EPO-反应性细胞对与处理过样品孵育反应后细胞数目或DNA合成的变化而测定增殖活性。根据本发明，EPO反应性细胞定义为对EPO反应后增殖或维持存活的细胞。可用于测定EPO体外增殖活性的EPO反应性细胞包括从造血器官新鲜移出的红细胞类前体细胞、天然表达EPO受体的确立细胞系、和被加工成表达EPO报告基因的确立细胞系。天然表达EPO受体的细胞系一般来自具有肿瘤动物的恶性细胞。例如，从以Friend白血病病毒复合物或Rauscher白血病病毒复合物感染的红白血病小鼠建立的鼠类红细胞系(erythroid cell line)。从白血病病人中已建立了人细胞系。通过导入和表达EPO受体基因已将其它细胞系加工成产生大量EPO受体并且需要EPO用于存活。EPO反应性细胞系统对普通的技术人员是已知的并且已由Koury等(1992)
欧洲生化杂志
210：649综述过。
在优选的实施方案中，EPO反应性细胞为由Greenberger等(1983)美国自然科学院院报80：2931描述的多能造血前体细胞系B6SUtA的细胞。B6SUtA细胞系来自B6.S小鼠的长期骨髓培养物。
EPO反应性细胞的增殖可通过定量对EPO反应后增加的DNA合成而加以测定。增加的DNA合成一般通过测定氚标记的胸苷掺入在体外加以测定。适当的测定在本领域是已知的并已由，例如Krystal等(1983)
实验血液学.
11：649和Lewis等(1989)
实验血液学.
17：102描述过。简言之，将EPO反应性细胞制品在5％CO2和95％空气的潮湿环境中于37℃在微升平板孔中与含有EPO的测试样品一般孵22小时。加入氚标记的胸苷至约0.1μCi/孔的终浓度。再次孵育2小时后，将小孔内容物收集于玻璃纤维滤膜上并通过闪烁谱计数器测定回收的放射性。为了标准化，掺入到DNA中放射性的量对EPO活性(mU/ml)作图。
在避免使用放射性的优选实施方案中，通过使用染料MTT(3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基溴化四唑鎓)分光光度法测定EPO反应性细胞的增殖(Mossman，1983，
免疫学方法
65，55)。MTT在溶液中为浅黄色，并且由活细胞的线粒体脱氢酶变为蓝黑色(dark blue)/紫色水不溶性的MTTformazin。以酸性异丙醇溶解蓝色的此晶体并于570和690nm处比色测定强度。因此，转换成着色formazin的MTT的量为对细胞增殖指示剂的细胞数目的直接测量。未知对标准的光密度比较用于计算生物学活性。在优选的实施方案中，将该处理过的样品与EPO反应性细胞在微滴定板小孔中于潮湿5％CO2和95％空气的环境中于37℃孵育约46-50小时。然后将MTT加入到每个小孔中并于37℃孵育2小时。蓝色晶体溶解后，测定光密度并通过比较由未知样品产生的细胞数目与EPO标准曲线测定EPO的活性。MTT在商业上是可得到的，其为含有MTT染料和溶解溶液的试剂盒(MTT试剂盒，Promega公司)。除了MTT以外，其它指示剂染料如XTT(3，3’-(1-((苯氨基)羰基)-3，4-四唑鎓)-双(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸，钠盐)和MTS(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓，内盐)可用于相同的目的。
在本发明方法的优选实施方案中，将脱唾液酸EPO通过孵育该样品与人肝癌细胞系HepG2而从此样品中去除，并且体外EPO活性通过孵育该处理过的样品，即来自HepG2细胞的上清液与EPO依赖性的细胞系的细胞并测定此EPO-依赖性细胞的增殖或存活加以测定。在最为优选的下面的实施例1中举例的实施方案中，EPO-体赖性的细胞系为B6SUtA并且细胞增殖或存活经使用MTT用分光光度法加以测定。
根据本发明已发现HepG2细胞脱唾液酸糖蛋白受体对脱唾液酸EPO-的体外亲和性有效地模仿体内脱唾液酸EPO快速清除的功能。此外，已发现含有EPO的细胞培养介质可诱导EPO反应性细胞的增殖。
本发明的另一方面提供用于测定含有EPO样品体内EPO活性的试剂盒。在一个实施方案中，将试剂盒分割以接纳含有表达脱唾液酸糖蛋白受体细胞的第一只容器和含有EPO-依赖性细胞的第二只容器。在优选的实施方案中，表达脱唾液酸糖蛋白受体的细胞为HepG2细胞并且EPO-依赖性细胞为B6SUtA细胞。在另一实施方案中，该试剂盒进一步包括含有MTT的第三只容器。
下面的实施例进一步说明了本发明。本发明不应认为受这些实施例所限制，但仅受附属的权利要求所限定。
实施例1
将HepG2细胞培养于100mm组织培养平板中直至达到铺满。此时用磷酸盐缓冲盐水洗细胞并以胰蛋白酶处理从而将其从平板上分离并制备细胞培养基中0.25×106个细胞/ml的悬液。将1ml该悬液加入到24-孔组织培养平板的每个小孔中。三天后HepG2细胞即可备用于EPO测定。
含有HepG2细胞的每个小孔以磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗5次。完全去除PBS后，将100μl培养基(含有10％胎牛血清和谷氨酰胺的Dulbecco氏MEM)加入到每个小孔中。通过采用10U/ml的EPO参照标准并通过混合加入到每个小孔中的100μl每种溶液将此稀释2倍而开始EPO标准曲线。将此细胞加上EPO溶液于5％CO2的高湿度培养箱中于37℃孵育过夜。孵育后，通过在培养基中稀释HepG2-处理过的5U/ml标准5倍以达到1U/ml溶液而制备标准曲线。将每个处理过的样品在培养基中稀释10倍以达到估计为0.5U/ml的溶液。然后将此标准和样品备用于增殖测定。大约在此标准和样品加入到HepG2细胞中的同时，制备B6SUtA细胞用于第二天要开始的增殖测定。将这些细胞培养于培养基(按上述)中并且补充以20ng/ml的IL-3；以1∶20的稀释每周传代2次。以培养基洗一次制备该细胞并以无IL-3的培养基重新恢复至原先的体积。将此细胞于100mm平板中(37℃，5％CO2)孵育过夜。孵育后，将细胞再次在培养基中洗并且以1×106个细胞/ml的终浓度重悬。用96-孔组织培养平板，将50μl B6SUtA细胞与50μl每种EPO标准和样品混合。将平板在5％CO2培养箱中于37℃孵育48小时。
用Promega公司的MTT试剂盒测定细胞的增殖或存活。转变成着色formazin的MTT的量与细胞的数目直接相关。该方法简述如下。将20μlMTT染料(Promega公司)加入至每个小孔中并于37℃孵育2小时。然后将100μl溶解溶剂(Promega公司)加入至每孔并于室温孵育至所有的蓝黑/紫色沉淀物溶解，通常1-4小时。然后在平板读数器中于O.D.570nm和690nm处对该平板进行读数。通过比较由未知样品产生的细胞数目与EPO标准曲线来测定EPO活性。通过以计算的活性除以0.5U/ml并乘以100％计算效价。
表1列出了在上述条件下测定的代表性的光密度和计算出在0-1000mU/ml浓度范围内的EPO标准值。正如可从计算出的值所见到的，本发明方法提供了对EPO标准准确的测定。
当在没有HepG2细胞预孵育时测定相同标准的增殖活性时，获得类似的结果，如表2中所列出的。这些结果显示HepG2细胞处理没有显著地影响EPO标准曲线。
通过本方法并且也在没有与HepG2细胞预孵育时测定具有已知和变化量脱唾液酸EPO的样品。如可从表3中所见到的，含有显著量脱唾液酸EPO的样品在与HepG2细胞(R2)孵育之前较与HepG2细胞孵育并且吸附脱唾液酸EPO(R1)之后诱导出更大的增殖反应。表3也提供了唾液酸化(完整)EPO的预期的量和从根据本发明方法获得的光密度计算出的值。如可从表3中所能见到的，本方法在定量样品中唾液酸化(即体内有活性的)EPO的量中是高度准确的。
本文参照一些优选的实施方案和实施例描述了本发明。由于明显的变化对于本领域的技术人员是显而易见的，故本发明不应认为受其限定，而仅应由下面的权利要求书所限定。
表1
与HEPG2细胞预孵育后标准的EPO活性标准 标准值 OD 平均值 标准差 CV 计算出的值STD00 1000 mU/ml. 1.304 1.336 0.029 2.151 942.9
1.359 1080
1.346 1044STD01 900.0 mU/ml. 1.244 1.271 0.057 4.494 824.6
1.233 805.6
1.337 - 1021STD02 800.0 mU/ml. 1.223 1.240 0.037 2.951 788.9
1.215 775.9
1.282 896.4STD03 700.0 mU/ml. 1.133 1.161 0.040 3.410 659.9
1.143 672.6
1.206 761.7STD04 600.0 mU/ml. 1.114 1.109 0.019 1.713 636.6
1.088 606.6
1.125 649.9STD05 500.0 mU/ml. 0.961 0.965 0.034 3.488 483.5
0.933 460.5
1.000 517.8STD06 400.0 mU/ml. 0.827 0.846 0.025 2.950 383.0
0.874 415.6
0.836 389.0STD07 300.0 mU/ml. 0.691 0.689 0.017 2.414 300.1
0.704 307.4
0.671 289.0STD08 200.0 mU/ml. 0.477 0.496 0.016 3.261 192.6
0.505 205.6
0.505 205.6STD09 100.0 mU/ml. 0.269 0.270 0.002 0.565 99.79
0.270 100.2
0.272 101.1STD10 0.000 mU/ml. 0.093 0.096 0.006 6.720 <<<<<
0.091 <<<<<
0.103 10.30
表 2
没有与HEPG2细胞预孵育后标准的EPO活性标准 标准值 OD 平均值 标准差 CV 计算出的值STD00 1000 mU/ml. 1.439 1.517 0.069 4.566 923.1
1.539 1141
1.572 1236STD01 900.0 mU/ml. 1.362 1.425 0.074 5.227 800.7
1.405 865.4
1.507 1062STD02 800.0 mU/ml. 1.264 1.364 0.097 7.122 679.2
1.371 813.5
1.458 958.4STD03 700.0 mU/ml. 1.251 1.278 0.054 4.240 665.2
1.242 655.7
1.340 770.6STD04 600.0 mU/ml. 1.177 1.185 0.007 0.599 592.8
1.186 601.0
1.191 605.6STD05 500.0 mU/ml. 1.071 1.083 0.011 1.028 505.9
1.085 516.4
1.093 522.6STD06 400.0 mU/ml. 0.917 0.902 0.019 2.061 403.7
0.907 397.8
0.881 382.8STD07 300.0 mU/ml. 0.724 0.744 0.035 4.732 300.8
0.785 331.1
0.724 300.8STD08 200.0 mU/ml. 0.435 0.455 0.017 3.813 173.6
0.464 185.7
0.466 186.5STD09 100.0 mU/ml. 0.271 0.281 0.009 3.225 104.6
0.288 112.0
0.285 110.7STD10 0.000 mU/ml. 0.096 0.097 0.003 2.728 <<<<<
0.095 <<<<<
0.100 4.484
表3
完整(唾液酸化)EPO的定量％脱唾 R1 w/ R2 w/o/ R2 /R1 K＝0.15 K＝0.15 预期完整 ％液酸 HepG-2 HepG-2 比率 计算出的 计算出的 的EPO 准确性EPO mU/ml mU/ml 完整EPO 完整EPO％ mU/ml
mU/ml0.00 289.10 303.60 1.05 286.54 1.00 300.00 0.9610.00 268.60 352.80 1.31 253.74 0.89 270.00 0.9420.00 261.70 424.20 1.62 233.02 0.81 240.00 0.9730.00 254.70 494.20 1.94 212.44 0.74 210.00 1.0140.00 217.60 555.40 2.55 157.99 0.55 180.00 0.8850.00 214.60 628.30 2.93 141.59 0.49 150.00 0.9460.00 213.40 693.60 3.25 128.66 0.45 120.00 1.0770.00 192.30 755.50 3.93 92.91 0.32 90.00 1.0380.00 196.10 959.90 4.89 61.31 0.21 60.00 1.0290.00 178.60 999.20 5.59 33.79 0.12 30.00 1.13100.0 150.80 1029.00 6.82 -4.18 -0.01 0.00 #DIV/
O！
Claims (19)
1、用于体外测定含有EPO样品中体内红细胞生成素(EPO)活性的方法，包括在去除脱唾液酸EPO的体外条件下处理该样品，并测定此处理过样品的体外EPO活性。
2、权利要求1的方法，其中所述的去除脱唾液酸EPO的体外条件包括凝集素亲和层析。
3、权利要求1的方法，其中所述的去除脱唾液酸EPO的体外条件包括与表达脱唾液酸糖蛋白受体的细胞孵育。
4、权利要求3的方法，其中所述的细胞天然或重组表达所述的脱唾液酸糖蛋白受体。
5、权利要求3的方法，其中所述的细胞为HepG2细胞。
6、权利要求1的方法，其中所述的体外EPO活性通过孵育所述的具有EPO反应性细胞的处理样品并且测定所述EPO反应性细胞的增殖或存活而进行测定。
7、权利要求6的方法，其中所述的EPO-反应性细胞为B6SUtA细胞。
8、权利要求6的方法，其中所述EPO反应性细胞的增殖通过测定DNA合成的增加而进行测定。
9、权利要求8的方法，其中所述DNA合成的增加通过测定氚化胸苷的掺入而进行测定。
10、权利要求6的方法，其中所述的EPO反应性细胞的增殖通过分光光度法进行测定。
11、权利要求6的方法，其中所述的EPO反应性细胞的增殖通过将所述细胞与3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基溴化四唑鎓(MTT)孵育并测定MTT向MTT formazin的转换而加以测定。
12、用于体外测定含有EPO样品的体内红细胞生成素EPO活性的方法，包括：(a)将所述样品与HepG2细胞孵育；(b)从所述HepG2细胞中去除上清液；(c)将所述的上清液与B6SUtA细胞孵育；(d)测定所述B6SUtA细胞的增殖；和(e)计算EPO活性。
13、权利要求12的方法，其中所述的含有EPO的样品在5％CO2和95％空气的加湿气氛中于37℃与所述的HepG2细胞孵育约15到20个小时。
14、权利要求12的方法，其中所述的上清液于37℃与所述B6UtA细胞孵育约46至50个小时。
15、权利要求12的方法，其中所述的B6SUtA细胞的增殖通过将所述细胞与MTT孵育并测定MTT向MTT formazin的转换而加以测定。
16、权利要求12的方法，其中所述的EPO活性通过比较由含有EPO样品所产生的增殖与由EPO标准所产生的增殖而进行计算。
17、一种分区化的试剂盒，包括含有表达脱唾液酸糖蛋白受体细胞的第一容器和含有EPO-反应性细胞的第二容器。
18、权利要求17的分区化试剂盒，其中所述的表达脱唾液酸糖蛋白受体的细胞为HepG2细胞。
19、权利要求17的分区化试剂盒，其中所述的EPO反应性细胞为B6SUtA细胞。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 96180436 CN1107870C (zh) | 1996-09-20 | 1996-09-20 | 用于体外测定红细胞生成素生物活性的方法及其试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 96180436 CN1107870C (zh) | 1996-09-20 | 1996-09-20 | 用于体外测定红细胞生成素生物活性的方法及其试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1229472A true CN1229472A (zh) | 1999-09-22 |
| CN1107870C CN1107870C (zh) | 2003-05-07 |
Family
ID=5127880
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 96180436 Expired - Lifetime CN1107870C (zh) | 1996-09-20 | 1996-09-20 | 用于体外测定红细胞生成素生物活性的方法及其试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1107870C (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100397078C (zh) * | 2002-07-23 | 2008-06-25 | 塞诺菲-安万特德国有限公司 | 鉴定物质的方法 |
-
1996
- 1996-09-20 CN CN 96180436 patent/CN1107870C/zh not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100397078C (zh) * | 2002-07-23 | 2008-06-25 | 塞诺菲-安万特德国有限公司 | 鉴定物质的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1107870C (zh) | 2003-05-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Swift | The desoxyribose nucleic acid content of animal nuclei | |
| Arndt-Jovin et al. | Studies of cellular differentiation by automated cell separation. Two model systems: Friend virus-transformed cells and Hydra attenuata. | |
| Moritz et al. | Approaches for the quantification of protein concentration ratios | |
| JP2003504638A (ja) | 赤外分光法に応じたリアルタイムのインサイチュバイオマニュファクチャリングプロセスのモニタリングおよび制御 | |
| CN110041916A (zh) | 一种检测细菌内毒素的聚集诱导荧光多肽探针制备及应用 | |
| Villanueva et al. | Identification of the mineralization front: Comparison of a modified toluldine blue stain with tetracycline fluorescence | |
| CN112147335A (zh) | 一种基于点击化学的标记配体组合物、试剂盒及系统 | |
| Carpenter et al. | A biological assay for epidermal growth factor/urogastrone and related polypeptides | |
| CN1107870C (zh) | 用于体外测定红细胞生成素生物活性的方法及其试剂盒 | |
| Everitt et al. | Spectrophotometric quantitation of anchorage-dependent cell numbers using extraction of naphthol blue-black-stained cellular protein | |
| ES2430889T3 (es) | Método y uso de un aparato para análisis in vitro de células biológicas y/o microorganismos | |
| CN103168243A (zh) | 凝胶粒子测定试剂及使用其的测定方法 | |
| EP4299712A1 (en) | Cell processing system, cell processing method, and learning data creation method | |
| Heyduk | Luminescence resonance energy transfer analysis of RNA polymerase complexes | |
| Soini et al. | Two-photon fluorescence excitation in detection of biomolecules | |
| EP0641438A1 (en) | Fluorophore-assisted therapeutic drug monitoring | |
| Fukuda et al. | Combined protein and DNA measurements by the ninhydrin-Schiff and Feulgen techniques | |
| CN108491688B (zh) | 一种基于供体-受体浓度比预处理fret双杂交检测数据的方法 | |
| CN207992061U (zh) | 一种高通量药物筛选成像装置 | |
| RU2176793C2 (ru) | Способы определения in vitro биоактивности эритропоэтина | |
| JP3764487B2 (ja) | エリスロポエチンの生物活性のインビトロでの測定方法 | |
| RU2167410C2 (ru) | Способ количественного определения алифатических аминокислот | |
| ES2328172T3 (es) | Procedimiento para caracterizar la glicosilacion de sialoglicoproteinas mediante un numero de isoformas i. | |
| Loeb et al. | A colorimetric method for the determination of serum arginase activity | |
| Papkovsky et al. | O 2-sensitive probes based on phosphorescent metalloporphyrins |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CX01 | Expiry of patent term |
Granted publication date: 20030507 |
|
| EXPY | Termination of patent right or utility model |