CN1222609C - 产锰依赖过氧化物酶的脱色酵母菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及的产锰依赖过氧化物酶的脱色酵母菌，包括从自然环境中分离选育得到，并于2002年10月11日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》的保藏号分别为CGMCC NO.0813和CGMCC NO.0814的多型德巴利酵母Debaryomyces polymorphus酵母菌和热带假丝酵母Candida tropicalis酵母菌；其生物学特征为：在马铃薯葡萄糖培养基上为乳白色圆形菌落，表面稍干燥，菌落厚，易挑起，有酒香味，呈现典型的酵母菌菌落；所产生的锰依赖过氧化物酶用于纺织废水、印染废水、染料生产废水以及与染料使用相关的工业废水的脱色；用于纸张的漂白以及与染料结构类似的化合物的降解。
Description
发明领域
本发明属于微生物学和环境保护技术领域，特别涉及两株产锰依赖过氧化物酶的脱色酵母菌及其应用
发明背景：
偶氮活性染料是目前使用量最大的一类化学合成染料，其分子结构中均含有偶氮键和苯环，并有多种不同的取代基团，可形成广泛的颜色变化。同时该类染料因为其高质量的染色特性而被广泛应用于纺织、造纸等行业。这些行业产生的大量含染料废水，具有毒性大、成分变化多、难生物降解的特点，传统的生物处理方法很难发挥作用。作为世界上染料的生产、消费和出口大国，我国的染料、印染行业废水的处理问题一直没有得到很好的解决，环境污染问题已经成为制约这些行业发展的主要因素之一。
多年来，海内外的许多研究者都致力于从菌种的角度寻找解决染料和印染废水处理的有效方法。人们发现厌氧菌产生的偶氮还原酶可以对偶氮染料脱色，但厌氧条件下形成的中间产物芳香胺具有更高的毒性，并可以转化为能与DNA共价结合的高活性亲电子基团，其危害性更大(Tarpley et al.，1980)。因此，那些能在好氧条件下降解偶氮染料的特殊微生物类群受到了较多的关注。在细菌中Bacillussubtilis，Aeromonas hydroplila，Pseudomonas cepacia，Flavobacterium sp.和Stenotrophmonas maltophilia等都可以在有氧的情况下将偶氮染料氧化脱色(Chungea al.，1993 & Zissi ea al.，2001)。但是，上述好氧细菌都存在如下缺点：1.不能将染料彻底矿化；2.只能作用于少数几种结构简单的染料分子(例如p-aminoazobenzene)(Chung and Cerniglia，1992)；3.脱色酶专一性较强，一种菌只能作用于一种染料分子；4.脱色基因一般在质粒中，容易丢失。因此，这些菌种在应用上遇到了很大的问题。
近年来，利用能够产生木质素降解酶的白腐真菌进行染料脱色的研究受到了许多研究者的高度关注。报道最多的两种白腐真菌分别为Phanerochaete chrysosporium和Trametes versicolor，它们能够产生包括lignin peroxidases(Lip)，laccases和manganese-dependent peroxidases(MnP)在内的非特异性胞外木质素降解酶。这些酶的最大优点是其作用底物的结构非专一性，且能将染料彻底矿化，能够适应于染料、染色行业废水中染料品种多、杂、易变化的特点。目前报道的能产生此类酶的微生物仅见于一些白腐真菌和少数其它丝状真菌。然而这些丝状真菌通常生长缓慢，产酶历程较长，直接应用于染料废水处理很容易受快速生长的细菌的污染，用上述提纯酶类处理废水又成本过高，因而限制了这类微生物和酶类在废水处理中的应用。
酵母菌作为单细胞真菌在自然界分布广泛，具有一些其他微生物类群所不能比的优势：在生理和遗传特性上与丝状真菌相似，能够耐受高渗透压，能够产生一些特殊的酶类，遗传稳定性好；在菌体生长和反应动力学上与细菌相似，具有反应速度和增殖速度快的优点。K.wasniewska(1985)，Kakuta et a1.(1992 and 1998)，Trindade & Angelis(1995)，以及Meehan et al.(2000)报道了几株酵母菌可以对一些染料进行吸附脱色。而目前为止还未见有关于酵母菌产生木质素降解酶类，并对染料进行降解脱色的报道。
发明内容
本发明的目的在于：为了解决上述问题从自然环境中取样并筛选到两株能够对偶氮活性染料活性黑(Reactive Black 5)以及其它与此染料结构类似的染料或化合物进行降解或脱色的产锰依赖过氧化物酶的脱色酵母菌及其应用。经鉴定该两株酵母菌为多型德巴利酵母Debaryomyces polymorphus和热带假丝酵母Candidatropicalis。该两株酵母菌在接种量为0.2g湿细胞/50ml培养液或更大接种量的情况下对含活性黑5浓度为1000mg/L以下的培养液可以有效脱色，对活性黑5浓度为200mg/L以下的培养液16小时内达到100％脱色。这两株酵母菌均可在培养液pH为3到10的范围内发挥有效脱色作用。
本发明的技术方案如下：
本发明提供的产锰依赖过氧化物酶的脱色酵母菌，包括于2002年10月11日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》的多型德巴利酵母Debaryomyces polymorphus，其保藏号分别为CGMCC NO.0813；
所述的多型德巴利酵母的18S rDNA序列发表在Genebank，序列号为AF545629，其18S rDNA序列见附图1；
所述的多型德巴利酵母的26S rDNA序列发表在Genebank上，序列号为AF545634，其26S rDNA序列见附图2；
所述的多型德巴利酵母生物学特征为：在马铃薯葡萄糖培养基上为乳白色圆形菌落，表面稍干燥，菌落厚，易挑起，有酒香味，呈现典型的酵母菌菌落。
本发明提供的产锰依赖过氧化物酶的脱色酵母菌，还包括于2002年10月11日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》的热带假丝酵母Candida tropicalis，其保藏号分别为CGMCC NO.0814；
所述的热带假丝酵母的18S rDNA序列发表在Genebank上，序列号AF545630，其18S rDNA序列见附图3；
所述的热带假丝酵母的26S rDNA序列发表在Genebank上，序列号AF545635，其26S rDNA序列见附图4：
所述的热带假丝酵母生物学特征为：在马铃薯葡萄糖培养基上为乳白色圆形菌落，表面稍干燥，菌落厚，易挑起，有酒香味，呈现典型的酵母菌菌落。
本发明提供的产锰依赖过氧化物酶的脱色酵母菌的用途，其特征在于，所述的多型德巴利酵母所产生的锰依赖过氧化物酶用于纺织废水、印染废水、染料生产废水以及与染料使用相关的工业废水的脱色；用于纸张的漂白以及与染料结构类似的化合物的降解：
所述的热带假丝酵母所产生的锰依赖过氧化物酶用于纺织废水、印染废水、染料生产废水以及与染料使用相关的工业废水的脱色；用于纸张的漂白以及与染料结构类似的化合物的降解。
本发明提供的两株酵母菌的筛选过程为从城市污水处理厂和印染废水处理厂取得活性污泥样品，按照下述流程进行筛选：
污泥样品→富集培养基摇床培→染料培养基1摇床培→
养 养3天，28℃，140
染料培养基2摇床培→染料培养基3摇床培→选择性培养基平
养3天28℃，140转 养3天，28℃，140 板培养3天，28→挑取脱色菌→菌种纯化→染料培养基摇床培→获得高脱
养3天，28℃，140 色
所述的富集培养基组分为：葡萄糖5g，KH2PO4 1g，(NH4)2SO4 1g，MgSO4·7H2O 500mg，酵母粉200mg，自来水1000ml，pH 5.0-6.0。；
所述的染料培养基1组分为：葡萄糖5g，KH2PO4 1g，(NH4)2SO4 1g，MgSO4·7H2O 500mg，酵母粉200mg，自来水1000ml，pH 5.0-6.0，灭菌后加入10g/L的活性黑5，使其终浓度分别为30mg/L；
所述的染料培养基2组分为：葡萄糖5g，KH2PO4 1g，(NH4)2SO4 1g，MgSO4·7H2O 500mg，酵母粉200mg，自来水1000ml，pH 5.0-6.0，灭菌后加入10g/L的活性黑5，使其终浓度分别为60mg/L；
所述的染料培养基3组分为：葡萄糖5g，KH2PO4 1g，(NH4)2SO4 1g，MgSO4·7H2O 500mg，酵母粉200mg，自来水1000ml，pH 5.0-6.0，灭菌后加入10g/L的活性黑5，使其终浓度分别为100mg/L；
所述的选择性培养基组分为：葡萄糖5g，KH2PO4 1g，(NH4)2SO4 1g，MgSO4·7H2O 500mg，酵母粉200mg，自来水1000ml，pH 5.0-6.0，灭菌后加入10g/L的活性黑5，使其终浓度分别为100mg/L，加入链霉素使其终浓度为50U/L；
其具体筛选步骤如下：
取1克污泥样品放入盛有玻璃珠和100mL无菌水的三角瓶中充分混匀，取该混合液10mL接入100mL灭过菌的富基培养基中，并在2g℃摇床中140转培养5天。取该培养液10mL接种于含30mg/L活性黑5的染料培养基中同样条件下培养3天，从完全脱色的三角瓶中取10mL培养液接种于含60mg/L活性黑5的染料培养基中同样条件下培养3天，并将完全脱色的培养液以同样的方法转接于100mg/L的染料培养基中。将在100mg/L染料存在下能完全脱色的培养液进行梯度稀释后，取0.2mL不同稀释度的培养物涂布于选择性染料培养基平板上在28℃培养3天。挑取有明显脱色圈的菌落并在染料培养基平板上纯化三次。将挑取的脱色菌株接种于含100mg/L活性黑5的液体培养基中在28℃，140转培养，每隔6小时取样测定脱色率，挑取在液体培养基中能完全脱色并且菌体不吸附染料的菌株即为本专利所得到的菌株，并对其进行鉴定和保藏。
本发明得到的菌株经鉴定为多型德巴利酵母Debaryomyces polymorphus和热带假丝酵母Candida tropicalis，并分别保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，其保藏号分别为CGMCC NO.0813和保藏号分别为CGMCCNO.0814。
本发明提供的产锰依赖过氧化物酶的脱色酵母菌的用途为：该产锰依赖过氧化物酶的脱色酵母菌应用酶所产生的锰依赖过氧化物酶用于纺织废水、印染废水、染料生产废水以及与染料使用相关的工业废水的脱色；用于纸张的漂白以及与染料结构类似的化合物的降解。
本发明提供的产锰依赖过氧化物酶的脱色酵母菌，可解决已有技术中存在的问题，在在接种量为0.2g湿细胞/50ml培养液或更大接种量的情况下对含活性黑5浓度为1000mg/L以下的培养液可以有效脱色，对活性黑5浓度为200mg/L以下的培养液16小时内达到100％脱色；均可在培养液pH为3到10的范围内发挥有效脱色作用。
附图说明
附图1为多型德巴利酵母Debaryomyces polymorphus的18S rDNA序列表；
附图2为多型德巴利酵母Debaryomyces polymorphus的26S rDNA序列表；
附图3为热带假丝酵母Candida tropicalis的18S rDNA序列表；
附图4为热带假丝酵母Candida tropicalis的26S rDNA序列表；
附图5为多型德巴利酵母在好氧的条件下对不同浓度的活性黑5的脱色
其中：
◇-100mg L-1 ■-200mg L-1 ▲-300mg L-1；
○-400mg L-1 ●-1000mg L-1
附图6为热带假丝酵母在好氧的条件下对不同浓度的活性黑5的脱色
其中：
◆-100mg L-1 ■-200mg L-1 ▲-300mg L-1；
○-400mg L-1 △-1000mg L-1
附图7为多型德巴利酵母在活性黑5存在和不存在两种情况MnP活性比较；
附图8为热带假丝酵母在活性黑5存在和不存在两种情况MnP活性比较；
附图9为多型德巴利酵母对不同染料的脱色；
附图10为热带假丝酵母对不同染料的脱色；
具体实施方式
实施例1：
本发明的两株酵母菌株对含100～1000mg/L活性黑5的染料培养液在24小时之内可有效脱色，对300mg/L以下的染料培养液可达100％脱色。(见附图5和6)。
该两株酵母菌均可在活性黑5存在的条件下产生锰依赖过氧化物酶(MnP)，该酶在培养液中的活性可达2000U/L或更高；见附图7和图8。
实施例2
本发明的两株酵母菌对具有偶氮键和苯环结构的其他偶氮活性染料以及对不具偶氮键的蒽醌染料同样具有明显的脱色作用。Debaryomyces polymorphus和Candida tropicalis在好氧培养的条件下对浓度为100mg/L如下几种染料：蒽醌染料活性蓝RB19，偶氮染料活性红(Reactive Red)M-3BE，偶氮染料活性黄(ReactiveYellow)M-3RE，偶氮染料活性艳红(Reactive Brilliant Red)K-2BF，偶氮染料Procion Scharlach H-E3G，偶氮染料Procion MarineH-EXL在24和48小时内的脱色率分别如图9和10。然而本发明对化合物的脱色和降解不仅限于此。
SEQUENCE LISTING
<110>中国科学院生态环境研究中心
<120>产锰依赖过氧化物酶的脱色酵母菌及其应用
<130>PI023972
<160>4
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>519
<212>DNA
<213>Debaryomyces polymorphus
<400>1
ccatgcatgt ctaagtataa gcaatttata cagtgaaact gcgaatggct cattaaatca 60
gttatcgttt atttgatagt acctttacta cttggataac cgtggtaatt ctagagctaa 120
tacatgctaa aaatcccgac tgtttggaag ggatgtattt attagataaa aaatcaatgc 180
ttttcggagc tctttgatga ttcataataa cttttcgaat cgcatggcct tgtgctggcg 240
atggttcatt caaatttctg ccctatcaac tttcgatggt aggatagtgg cctaccatgg 300
tttcaacggg taacggggaa taagggttcg attccggaga gggagcctga gaaacggcta 360
ccacatccaa ggaaggcagc aggcgcgcaa attacccaat cccaatacgg ggaggtagtg 420
acaataaata acgatacagg gccctttcgg gtcttgtaat tggaatgagt acaatgtaaa 480
taccttaacg aggaacaatt ggagggcaag tctggtgcc 519
<210>2
<211>557
<212>DNA
<213>Debaryomyces polymorphus
<400>2
aacggcgagt gaagcggcaa aagctcaaat ttgaaatctg gcaccttcgg tgtccgagtt 60
gtaatttgaa gaaggtaact ttggagttgg ctcttgtcta tgttccttgg aacaggacgt 120
cacagagggt gagaatcccg tgcgatgaga tgcccaactc tatgtaaagt gctttcgaag 180
agtcgagttg tttgggaatg cagctctaag tgggtggtaa attccatcta aagctaaata 240
ttggcgagag accgatagcg aacaagtaca gtgatggaaa gatgaaaaga actttgaaaa 300
gagagtgaaa aagtacgtga aattgttgaa agggaagggc ttgagatcag acttggtatt 360
ttgcaagcct taccttcgtg gtggggtccc ctgcagttta ctgggccagc atcggtttgg 420
atggtaggat aatgacttgg gaatgtgact ttgcttcggt aaagtgttat agcccttgtt 480
gatactgcct gtctagaccg aggactgcgt ctttgactag gatgctggca taatgatctt 540
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ggggtggcct ctacagttta tcgggccagc atcagtttgg gcggtaggag aattgcgttg 420
gaatgtggca cgactttggt tgtgtgttat agccttcgtc gatactgcca gcctagactg 480
aggactgcgg tttataccta ggatgttggc ataatgatct taagtcgccc gtcttga 537
Claims (4)
1、一种产锰依赖过氧化物酶的脱色酵母菌，其特征在于，该脱色酵母菌为于2002年10月11日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》的多型德巴利酵母Debaryomyces polymorphus，其保藏号为CGMCC NO.0813。
2、按权利要求1所述的产锰依赖过氧化物酶的脱色酵母菌，其特征在于，该多型德巴利酵母的18S rDNA序列发表在Genebank，序列号为AF545629，其18SrDNA序列为：CCATGCATGTCTAAGTATAAGCAATTTATACAGTGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAGTACCTTTACTACTTGGATAACCGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTAAAAATCCCGACTGTTTGGAAGGGATGTATTTATTAGATAAAAAATCAATGCTTTTCGGAGCTCTTTGATGATTCATAATAACTTTTCGAATCGCATGGCCTTGTGCTGGCGATGGTTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAGGATAGTGGCCTACCATGGTTTCAACGGGTAACGGGGAATAAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCAATACGGGGAGGTAGTGACAATAAATAACGATACAGGGCCCTTTCGGGTCTTGTAATTGGAATGAGTACAATGTAAATACCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC
该多型德巴利酵母的26S rDNA序列发表在Genebank上，序列号为AF545634，其26S rDNA序列为：CAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCTCTTTCAGAGTCCGAGTTGTAATTTGAAGAAGGTATCTTTGGGTCTGGCTCTTGTCTATGTTTCTTGGAACAGAACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGATGAGATGATCCAGGCCTATGTAAAGTTCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAA GAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCTTGAGATCAGACTTGGTATTTTGTATGTTACTTCTTCGGGGGTGGCCTCTACAGTTTATCGGGCCAGCATCAGTTTGGGCGGTAGGAGAATTGCGTTGGAATGTGGCACGACTTTGGTTGTGTGTTATAGCCTTCGTCGATACTGCCAGCCTAGACTGAGGACTGCGGTTTATACCTAGGATGTTGGCATAATGATCTTAAGTCGCCCGTCTTGA
3、按权利要求1所述的产锰依赖过氧化物酶的脱色酵母菌，其特征在于，所述的多型德巴利酵母生物学特征为：在马铃薯葡萄糖培养基上为乳白色圆形菌落，表面稍干燥，菌落厚，易挑起，有酒香味，呈现典型的酵母菌菌落。
4、一种权利要求1所述的产锰依赖过氧化物酶的脱色酵母菌的用途，其特征在于，它用于偶氮染料纺织废水的脱色和降解。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20051012 Termination date: 20121231 |