CN1216918A - 脂质体和生物细胞在向温性相变过程中防止渗漏的方法 - Google Patents

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Abstract

脂质体或生物细胞在冷却通过向温性相变温度时所发生的渗漏,可通过在该脂质体或细胞结构中掺入热滞蛋白而减少或消除。优选的热滞蛋白是来自极地鱼种的抗冻蛋白和抗冻糖蛋白,并发现抗冻糖蛋白的No.8层析片段特别有效。

Description

脂质体和生物细胞在向温性相变 过程中防止渗漏的方法
本发明是关于脂质领域中某些脂质从液晶相到胶相的相变过程。本发明特别着重于生物细胞和脂质体当经过相变温度时其内部物质通过膜而渗漏的问题。
发明背景
各种类型的生物物质当其被冷却到接近于但并不等于或低于冰点时，会经历一个胶相和液晶相之间的向温性的相变过程。这些物质包括植物和动物细胞、细菌和脂质体。因此，将这些物质冷却到这样的相变区是为贮存和运输等目的而保存它们的一种实际和有用的手段，因为冷冻会破坏细胞结构，而脱水在许多情形下不是实际可行的。
当植物细胞和脂质体达到和经过相变时，可以观察到它们内容物的渗漏。在细胞中，这种渗漏破坏其生存力和结构；而在脂质体中则失去其功能(尤其当渗漏物是脂质体内部的作用物时)。脂质体是由包含水相的磷脂双分子层构成的呈同心圆排列的泡囊。通过掺合功能性分子(例如药物、成像剂、皮肤保护剂和其它作为水相中溶质的有用物质)，研究者们已研制出作为这些物质有用载体的脂质体。因此，脂质体的一些制剂对于诸如化妆品及医药工业是很有用的，而渗漏问题是它们在贮存、运输、处理过程中关系到稳定性的一个潜在障碍。
本发明的概述
已经发现，脂质体和生物细胞(包括植物和动物细胞在内)，当通过向温性相变温度进行冷却时渗漏会明显降低，并在某些情况下用抗冻蛋白或抗冻糖蛋白处理该脂质体和生物细胞后该渗漏现象可完全消除。可以通过不同途径达到这种处理目的，包括把脂质体或细胞混悬于一溶有蛋白的液体中。已发现全蛋白要比它们的各个组成成分更有效，这些成分包括主要出现在蛋白质结构里的单个氨基酸、蛋白的多个(氨基酸)片段、以及在该蛋白结构内的糖基化氨基酸，同样也包括其它天然蛋白质和一般的低温保持剂。同时也发现抗冻糖蛋白的某些片段明显超过其它片段。因此本发明方法的用途在于保存那些既作为食物的来源，也作为药品、化妆品以及其它治疗和一般有益目的物来源的动物组织、水果、蔬菜和其它有用的植物，并且也可用于保存脂质体内有用的功能性物质。
本发明的这些及其它特征及优点将在下面作更清楚的阐述。
附图简述
图1表示当温度被降至低于向温性相变温度时，标记化合物从脂质体内的渗漏量。用本发明方法处理的脂质体与未处理的脂质体作比较。
图2类似于图1，但另外又显示了改变处理脂质体用的处理剂的剂量而产生的效果。
图3类似于图1，但另外又显示了使用热变性处理剂同未经变性的处理剂的结果比较。
图4表示两条测温扫描图线，一条是用本发明方法处理的脂质体，另一个是未经处理的脂质体。
图5表示在通过加热至向温性相变温度以及冷却回到初始低温状态的两种情况下不同类型脂质体中标记化合物的渗漏量。
图6显示当温度升高(而不是降低)通过向温性相变温度时，与图1-4相同的脂质体内标记化合物的渗漏量。
发明的详细说明和优选的实施方案
自然界存在的称之谓“抗冻蛋白”、“热滞蛋白”、“抗冻糖蛋白”、和“抗冻多肽”是众所周知的，在文献中已有广泛报导。例如抗冻糖蛋白的发现首先由Devries,A.L.等人报导，“某些南极鱼类的抗冷冻作用”(KreezingResistance in Some Antarctic Fishes),《科学》(Science)163:1073-1075(1969年3月7日)。Devries观察到各种不同种类的鱼在全年平均温度为-1.87℃的水中存活，尽管其血液中没有足够量的氯化钠和其它低分子量物质通过常规冰点降低法来降低其冰点。Devries等人将这些物种的生存归因于存在某些糖基化蛋白，其分子量范围大约2500至大约34000，称为抗冻糖蛋白或“AFGPs”。进一步的调查揭示：北温带和北极鱼的很多物种其血液中携带有抗冻物质，其中一些化合物是糖蛋白而其它一些则没有糖基，因而被称为抗冻多肽或抗冻蛋白(“AFPs”)分子量范围大约3300至大约12000。进一步说，尽管这些化合物降低了冰点，但熔点不受影响，因此称为“热滞蛋白”。
抗冻蛋白和糖蛋白已从很多不同来源中分离得到，而且文献中已广泛报导过这些来源和从中得到的各种蛋白质的结构。这些来源包括鱼类和非鱼类，列于下面的表Ⅰ和表Ⅱ。
表Ⅰ鱼类中的热滞蛋白质蛋白质类型，组成和大小      鱼类来源                 鱼种俗名抗冻糖蛋白(AFGPs)：         南极鱼科：含有丙氨酸，苏氨酸和     Pagothenia borchgrevinkiGal-GalNAC二糖           Trematomus borchgrevinki    南极鳕鱼M.W.:2,600-33,700        Trematomus bernachii
                     Dissostichus mawsoni
                     北方海洋鳕类鱼：
                     Gadus agac                  格陵兰鳕
                     Gadusmorhua                 大西洋鳕
                     Microgadus tomcod           大西洋小鳕
                     Boreogadus saida            北极鳕
                     Eligenus gracilis           远东宽突鳕抗冻多肽(AFPs),Ⅰ型：    右眼鲽富含丙氨酸；             Pseudopleuronectus          美洲拟鲽M.W.:3,300-6,000         americanus
                       Limanda ferruginea       美洲黄盖鲽
                       杜父鱼科：
                       Myoxycephalus scorpius   短角锯鲉
                       Myoxycephalus aenaeus    虻疮锯鲉
                       Myoxycephalus scorpiodes 北极锯鲉抗冻多肽(AFPs),Ⅱ型        杜父鱼科：富含半胱氨酸               Hemitripterus americanus 美洲绒杜父鱼同源于C型血凝素            Osmerus mordex           胡瓜鱼M.W.:14,000-16,000         Clupea harengus harengus 鲱抗冻多肽(AFPs),Ⅲ型        绵鳚：没有半胱氨酸且不富含丙氨酸 Macrozoarce americanus   海洋条鳕M.W.:5,000-6,700           Rhigophila dearborni     南极绵鳚
                       Lycodes polaris          北极绵鳚
表Ⅱ热滞蛋白质的非鱼类来源A．除甲虫之外的昆虫：
目                种
弹尾目           7 sPP.
襀翅目    Arcynopteryx compacta
直翅目    Parcoblata pennsylvanica(异翅木蠊)
半翅目    Oncopeltusfasciatus(美洲脊胸长蝽)
长翅目    Boreus westwoodi
鳞翅目    Choristoneura fumiferana(枞色卷蛾)B．鞘翅目(甲虫)：
科                       种
拟步甲科       Tenebrio molitor(黄粉虫)
               Meracantha contracta
               Uloma impressa
               Platydema sp.
叩头虫科       Ampedus lineatus
               Ampedus sp.
               Lepidotus discoideus
               Melanotussp.(梳爪叩头虫)
扁甲科         Cucujus clavipes(扁甲虫)
赤翅甲科       Dendroides canadensis
萤科           Photinus sp.(广额螳螂)
瓢虫科         Coccinella novemnotata(九星瓢虫)
棘胫小蠹科     Ips acuminatus(松六齿小蠹)
天牛科         Rhagium inquisitor(松皮天牛)C．非昆虫节肢动物：
动物               种
蜘蛛         Philodromus sp.(逍遥蛛属)
             Clubiona sp.(管巢蛛属)
        Bolyphantes index
蜈蚣    Lithobius forficatus
蜱螨    Alaskozetes antarcticusD．其它无脊椎动物：短齿蛤属    Mytilus edulis
被最为广泛研究，且被作为优选蛋白用于本发明的蛋白质是那些从鱼类分离出来的蛋白质。如表Ⅰ所表明的，这些蛋白质包括糖基化蛋白(AFGPs)和非糖基化蛋白(AFPs)，后者分为三个一般类型，命名为Ⅰ型，Ⅱ型，和Ⅲ型。
尽管存在着各种变化，一般情况下AFGPs由一系列的三肽重复单元丙氨酰-苏氨酰-丙氨酰组成。同时双糖β-D-半乳糖基-(1→3)-α-N-乙酰基-D-半乳糖胺与苏氨酸残基的羟基连接。例如较小分子量的AFGP含有分别用脯氨酸和精氨酸残基替代一些丙氨酸和苏氨酸残基。对有代表性鱼种的AFGPs色谱研究已揭示出八个主要组分(片段)的分子量，如表Ⅲ所示。
表Ⅲ
从Pagothenia borchgrevinki得到的AFGPs各片段的分子量
片段编号    分子量
 1          33,700
 2          28,800
 3          21,500
 4          17,000
 5          10,500
 6          7,900
 7          3,500
 8          2,600
用于本发明目的的AFGPs优选为第8片段。
与AFGPs相比，AFPs互相之间的差别更大。如表Ⅰ所示，三种类型AFPs其残基含量相互都不同。Ⅰ型AFPs富含丙氨酸残基(大约65％)，其余大部分由极性残基如天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸组成，分子量范围大约3,300至大约6,000。Ⅱ型AFPs被认为是富含半胱氨酸(实际上是半-半胱氨酸)残基，并且与C型植物凝血素同源。来自美洲绒杜父鱼的Ⅱ型AFPs含有7.6％半胱氨酸、14.4％丙氨酸、19％总量的天冬氨酸和谷氨酸、以及8％苏氨酸，分子量范围是大约14,000至大约16,000。Ⅲ型AFPs没有半胱氨酸残基，并且也不富含丙氨酸残基。任何特定的氨基酸显然都不存在明显的优势，氨基酸含量可在极性和非极性残基之间均匀分配。其分子量范围是大约5,000至大约6,700。此段中所有百分比均以摩尔为基础。
来自昆虫的抗冻蛋白主要是Ⅱ型AFPs，氨基酸残基的典型组成是那些来自鳞翅目(云杉芽虫)和拟步甲科(甲虫)的氨基酸残基。这些列于表Ⅳ，且Ⅳ也包括美洲绒杜父鱼的氨基酸组成作为比较。
表Ⅳ
Ⅱ型AFPs氨基酸成分的比较
氨基酸残基    云杉芽虫组分Ⅱ 甲虫  美洲绒杜父鱼
 Asx                 9.5     5.3    10.7
 Thr                 6.0     2.3     7.9
 Ser                 13.0    11.1    8.2
 Pro                 5.0     0.0     6.7
 Glx                 11.0    12.4    9.1
 Gly                 15.0    11.4    8.1
 Ala                 8.0     5.0     14.4
 1/2-Cys             6.0     28.0    7.6
 Val                 3.0     2.3     1.2
 Met                 0.0     0.0     5.4
 Ile                 1.2     1.0     1.7
 Leu                 6.5     2.2     6.2
 Tyr                 1.0     0.0     1.2
 Phe                 2.2     0.0     2.0
 Lys                 3.1    15.4     2.1
 His                 0.0     3.1     2.5
Trp          0.0       0.0       2.8
Arg          8.0       0.0       2.3
抗冻蛋白和糖蛋白可以通过常规方法从鱼或昆虫的血清或其它体液中提取。蛋白质的分离和纯化容易通过色谱法进行，并且通过吸附、沉淀和蒸发。文献中所公开的其它很多方法对本领域技术人员是显而易见的。
热滞蛋白也可以合成，或者通过常规化学合成手段，或者通过重组DNA的方法。形成这些蛋白质的基因其DNA编码序列已被阐明并已有广泛报导。例如参见Devries,A.L.等人的《生物化学》(J.Biol. chem.),246:305(1971)；Lin,Y.，等人的《生物化学与生物物理研究通讯》(Biochem.Biophys.Res.Commun.)46:87(1972)；Yang,D.S.C.，等人的《自然》(Nature)333:232(1988)；Lin,Y,《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)78:2825(1981)；Davies,P.L.，等《生物化学》79:335(1982)；Goarlie,B.，等《生物化学》259:14960(1984)；Scott,GK.，等的《加拿大鱼类水生动物科学杂志》(Can.J.Fish.Aguat.Sci.)43:1028(1986)；Scott,G.K.等《分子学进展》(J.Mol.Evol.)27:29(1988)。将AFP基因成功地微量注射到非本种的其它物种也已有报导。参见，例如Zhu,Z.，等Angew.Ichthyol.1:31(1985)；Chourrout,D.等《水培技术》(Aquaculture)51:143(1986)；Dumman,RA.，等的《美国鱼类科学学报》(Trans.Am.Fish.Soc.)116:87(1987)；Fletcher, G.L.，等的《加拿大鱼类水生动物科学杂志》45:352(1988)；Mac Lean,N.D.，等的《生物技术》(Bio Technology)5:257(1987)；Stuart,G.W.，等《发展》(Development)103:403(1988)；Mc Evoy,T.，等《水培技术》68:27(1988)；Ozato,K，等《细胞分化》(Cell Differ.)19:237(1986)。
如上所述，本发明的应用领域之一是在处理脂质体时，使用抗冻蛋白和糖蛋白。脂质体由标准的形成泡囊的脂质形成，该脂质一般包括带中性和负性电荷的磷脂及固醇(如胆固醇)。具体脂质的选择一般基于这样一些因素：如血流或其它要求的使用模式中最终希望得到的脂质体的大小和稳定性。
通常在脂质体内使用的脂质成分是磷脂酰胆碱。连接有不同长度和饱和度的各种不同酰基链的磷脂酰胆碱可以购得或通过已知技术分离或合成得到，最常用的磷脂酰胆碱是那些带有长度范围为C14至C22碳链的饱和脂肪酸，尽管磷脂酰胆碱由单个或双个不饱和脂肪酸形成，有时也使用饱和与不饱和脂肪酸的混合物。本发明亦扩展到由磷脂形成的脂质体，该磷脂中的脂肪酸通过醚键而不是酯键连接于甘油；还有由神经鞘磷脂或磷脂形成的脂质体，该磷脂头部基团不含胆碱，如乙醇胺，丙氨酸，甘油和肌醇；另外还有由胆固醇、甘油二酯、酰基硝氨醇、磷脂酰乙醇胺-聚氧乙烯共轭体和磷脂酸-聚氧乙烯的共轭体形成的脂质体。当某一固醇(如胆固醇)存在时，固醇与磷脂的克分子比一般约为0.1～1.0。脂质体组成的实例有甘油二硬脂酸酯-磷脂酰胆碱-胆固醇、二棕榈磷脂酰胆碱-胆固醇；以及(神经)鞘磷脂胆固醇。
脂质体可以通过文献中所述的各种方法制备，这种记述见于以下各文献：Szoka等，生物物理与生物工程综述，9:467(1980)；美国专利4,253,871；4,501,728和4,837,028；教科书“脂质体”,Marc J.ostro编，Marcel Dekker出版，纽约，1983,第一章；以及Hope等，脂质体的物理与化学性质，40:89(1986)，所有上述内容在此被引为参考。其中一种方法是把形成小泡的脂质溶渗在适当的有机溶剂或溶剂体系中，并在真空或惰性气体条件下干燥该溶液以形成一薄的脂质膜。用这种方法制备的脂质体是大小不均匀的多层囊泡。为了得到一个较均匀的脂质混合体，该脂质膜可被重新溶解于一适当的溶剂(如叔丁醇)中，接着冻干并用含水缓冲液覆盖使其水合。
脂质体可通过各种已知的技术做成各种大小。其中的一个方法是声处理，特别是浴式和探针式声处理，使其尺寸不断减小。另一匀化方法是用剪切力将大的脂质体片段化而变为小的；第三种方法是通过一种小孔聚碳酸酯膜或一种非对称陶瓷膜将脂质体挤出。
功能性的化合物如药物、化妆品、成像剂以及提供某种生物用途的其它许多物质均可通过常规方法掺入脂质体内部。最常用的方法是胶囊化和加跨膜电位。
可以这样得到用胶囊包裹药物或其它功能性成分：将脂质体及这些成分溶解于所有成分均可混溶的有机溶剂中，接着浓缩所得溶液并将溶液蒸发而得到一个干膜，然后在该膜上加缓冲液，形成的脂质体中含有结合到囊泡壁上的功能性成分。另一替代方法是将功能性成分溶于缓冲液中，接着加到一个只是由脂质体组分形成的干膜上。该缓冲液可以是任何生物相容性缓冲溶液，实例是等渗盐水、磷酸缓冲盐水及其它低离子强度缓冲液。这种缓冲液方法，使该功能性成分包在含水脂质体内部。在任一方法中，功能性成分的含量范围为约0.01m/gml到约50m/gml脂质体混悬液。然后对内部水溶液中或膜中有功能性成分的脂质体可视情况作如上所述的测定。
加跨膜电位的方法已在一些美国专利中详细阐述，专利号分别为4,885,172；5,059,421和5,171,578，这些内容已被引为参考。这种方法可用来加入任何溶解于适当的水相介质中时以带电状态存在的常规药物。通过产生不同的内外介质的脂质体，以致一个或更多带电物质(如Na+,K+和/或H+)浓度梯度在双层膜两侧建立，从而建立脂质体的双层膜跨膜电位。例如，为了装载一种在电离状态带负电荷的药物，要使用一种脂质体，该脂质体的内部电荷相对于外部电荷是正电位。
本发明可应用于生物细胞，该细胞包括许多经历向温性相变的活细胞，既包括动物细胞，又有植物细胞。在动物细胞中，对哺乳动物细胞尤其感兴趣，同时还有哺乳动物的组织、器官、和有机体。本发明可用的哺乳动物细胞的实例有哺乳动物的卵母细胞、肝细胞、红细胞和白细胞。组织和器官的实例为：肝脏、心脏、肾脏的组织及器官本身；有机体的实例有胚胎及自生动物体。
本发明可用的植物细胞包括许多不同植物的细胞。本发明有用的是那些在高于冰点的温度区域内经历一个向温性相变的细胞。从这些植物材料观察到的现象是冷休克或通过低分子量组分的膜而丧失。这些植物材料包括水果、蔬菜、谷物和其它作为食物原料的植物，而且表现这种行为的细胞类型及形成范围涉及从种子到发芽直到成熟的植物，包括植物的组成部分，如叶子、果实、蔬菜、茎和根。
根据本发明，细胞、组织或脂质体可用抗冻蛋白和糖蛋白通过不同方法处理。一个简便的办法是在所施用试剂的溶液中温育细胞或脂质体成为混悬液，组成此混悬液的细胞或脂质体浓度范围为约0.1m/gml到约1m/gml混悬液，抗冻蛋白或糖蛋白含量范围优选约0.3m/gml到约30m/gml，更优选的浓度范围约1m/gml到约20m/gml；最优选为约3m/gml到约10m/gml，温育是在高于相变温度下进行，细胞或脂质体可在混悬液中保存以备使用，或如果它们保存在一个防止其向外扩散抗冻蛋白或糖蛋白的环境中，则可从混悬液中浓缩或回收。另外一些用抗冻蛋白、糖蛋白来处理细胞或脂质体的方法对处理细胞、组织或脂质体技术熟练的专业人员来说是很清楚的。
以下的例子只是举例说明本发明，而不是用限制本发明。实施例1
本例描述了在相变期间，抗冻糖蛋白和抗冻蛋白在抑制二油磷脂酰胆碱脂质体渗漏中的作用效果。
除了羧基荧光素以200mM浓度包括在所形成的溶液中并由此截留在脂质体内部作为标记之外。脂质体是由DEPC囊泡(二油磷脂酰胆碱)通过常规的方法制备的。脂质体一旦形成，就将其挤出通过聚碳酸酯滤器加以测量，运用由Avestin公司生产的仪器(该公司位于ottawa(渥太华)，ontario，加拿大)，把脂质体通过葡聚糖凝胶即可把多余的未截留在脂质体内的羧基荧光素去除。最终的脂质体混悬液中的脂质体浓度为20mg/ml。
从Trematomus borchgrevinki鱼获得的抗冻蛋白包括合并的层析片段1-8，以及使用包括片段2-6、5-7和3-4的小组合并。在另外的实验中，使用了由Pseudopleuronectus americanus鱼得到的抗冻蛋白(Ⅰ型)。试验是将AFPs和AFGPs与一未经处理的脂质体的对照组作对比，并与其它有效的处理成分比较。这些成分包括丙氨酸、半乳糖、N-乙酰-半乳糖胺、甘油、脯氨酸、石鱼血浆和卵运铁蛋白。包括丙氨酸、半乳糖和N-乙酸半乳糖胺是因为它们是AFGPs的主要成分。
在每一实验中，用抗冻蛋白、抗冻糖蛋白或经一比较用的物质处理脂质体，将该处理剂加入到含水脂质体混悬液中达到如下所示的终浓度范围。为了达到相变，将对照的及经处理的脂质体放入荧光计中的温控小杯中，并从20℃至0℃以每分0.5℃的速率冷却。通过连续观察荧光的增加量表示漏至外部介质的羧基荧光素，由此来检查渗漏量。
结果列于以下表Ⅴ中，其中以渗漏百分率增加的次序排列实验顺序。
表Ⅴ在用各种成分处理的冷却相变过程中从二油磷脂酰胆碱泡囊中渗漏的羧基荧光素的百分率处理剂     浓度n    渗漏百分率AFGP 1-8* 4mg/ml    3AFGP 1-8   1mg/ml    5AFGP 2-6   1mg/ml    9AFGP 5-7   1mg/ml    10AFGP 8       4mg/ml    21AFP Ⅰ型     1mg/ml    23AFGP 3-4     1mg/ml    33AFGP 8       1mg/ml    35无                     55(对照)甘油          0.4M     58N乙酰半乳糖胺 1mg/ml   59脯氨酸        1mg/ml   62石鱼血清     2mlg/ml   70卵运铁蛋白   1mg/ml    81
*AFGP后的数字是指AFGP的各种片段。
这些实验表明：完整的AFGP可明显减少与相变有关的渗漏量，并且总是要比AFGP的各成分和片段及对照组更有效。有些处理剂事实上会增加而不是减少渗漏量。渗漏曲线见图1，其中，空心方块(□)代表1mg/ml AFGP1-8；空心三角形(△)代表1mg/ml AFP(Ⅰ型)；空心圆圈(○)代表对照组。每一曲线的走向是随着温度降低沿着从右向左的方向通过相变温度约为5℃。
实施例2
该实施例表示对羧基荧光素标记约PEPC脂质体的进一步试验结果，着重于AFGP的各片段、AFGPs亚单位组分及变性的AFGPs之间的区别。
紧接着例1步骤，并用小牛血清白蛋白(BSA)和在80℃下变性30分钟的AFGPs的第6、7、8片段作为另外的比较性处理剂，结果列于以下表Ⅵ中。
表Ⅵ
在用各种成分处理的冷却相变过程中，从二油磷脂酰胆碱泡囊中渗漏的羧基荧光素的百分率。
处理剂    浓度n    渗漏百分率
AFGP 8*   10mg/ml    0
AFGP 8      1mg/ml    15
AFGP 2-6    1mg/ml    5
AFGP 5-7    2mg/ml    9
AFGP 15           1mg/ml     20
AFGP 6            1mg/ml     40
丙氨酸            1mg/ml     42
半乳糖            1mg/ml     45
BSA               1mg/ml     47
无                           50
(对照)
变性的AFGP 6-8    1mg/ml     55
N-乙酰半乳糖胺    1mg/ml     59
脯氨酸            1mg/ml     62
石鱼血清          2mlg/ml    70
*AFGP后的数字是指AFGP的各种片段。
这些数据表明片段8在高浓度时可完全抑制渗漏。片段2-6在很低浓度时可抑制95％的渗漏。另外，这些资料证实了实施例1的结果，即AFGPs的某些成分(丙氨酸、半乳糖及N-乙酰半乳糖胺)是无效的，并证明热变性损害了蛋白的效力。
AFGP片段8浓度的增加的效果见图2。再次表示，每一曲线的走向是随着温度降低、通过相变温度(约22℃)沿着从右向左的方向。实圆圈(●)代表没有使用处理剂的对照组；实方块(■)代表用浓度为1mg/mlAFGP8处理的样品；实倒三角()代表用浓度为2mg/ml的样品；实三角(▲)代表用浓度为10mg/ml的样品。
加热变性的结果见于图3，本图表明在数据中合并的AFGP片段是2-4合并的片段，圆圈代表在80℃下加热变性30分钟后使用的这些片段；而方块则代表未经加热变性的相同片段。
图4是脂质体的测热扫描，其数据见表Ⅱ及图2、3。它们列出两个扫描结果：较上的一个扫描是用由Dissostichus mawsoni鱼的AFGP片段2-6处理的脂质体，较下的一个扫描指未经任何处理剂处理的脂质体。在约12℃时所见到的峰是指当烃链熔化时的熔融吸热。两个扫描均有峰且出现在同一位置的事实可得出这样一个结论：AFGPs并不通过影响脂质体的相变而达到抑制渗漏的效果。
实施例3
这一例子说明本发明在脂质体相变相反方向，即随着温度增加出现的渗漏情况，并说明抗冻糖蛋白对该渗漏没有影响。
DEPC脂质体在本研究中被再次使用，这些脂质体是在约23℃(高于相变温度)条件下制备，接着被迅速地冷却相变；加入来自Trematomusbernachii鱼的AFGPs片段5-7(1mg/ml的浓度)，在4℃下温育脂质体1个小时，再以0.5℃的速率将温度重升至27℃左右。渗漏百分率用荧光计以每两度约间隔记录，又用未经AFGPs处理的脂质体对照组进行平行实验。在低温温育期间，渗漏量是微小的，但缓慢再加温时渗漏产生的速率同对照组差别不明显。接着脂质体再逐渐降温到相变温度。结果见于图5，其中，实心圆圈(●)代表升温方向所取的对照组数据；实心方块(■)代表升温方向所取的实验数据(AFGP处理的泡囊)；空心圆圈(○)代表降温方向所取的对照组数据；空心方块(□)代表在降温方向所取的实验数据。本图指出，AFGPs可抑制渗漏，但它们必须在高于相变温度时加用才可起到这一作用效果。实施例4
本例代表二肉豆寇磷脂酰胆碱(DMPC)脂质体的研究，显示在加热过程中出现的相变，同时比较有和无抗冻蛋白存在时所得结果。
在约4℃时由DMPC用常规方法制备脂质体，用羧基荧光素作标记物，接着便是实施例1所述的过程，用于处理的抗冻蛋白是从DissostichususMaWsoni鱼得到的AFGPs 2-6片段，当脂质体仍处于低温时，将此AFGPs2-6片段以1mg/ml浓度加入到该脂质体中，泡囊一旦形成，便以0.5℃/分的速率将其加热到28℃，同时用荧光计以1或2度的间隔记录渗漏百分数。接下来的过程是再将泡囊以0.5℃/分的速度冷却到3℃，同时用荧光计记录渗漏量。结果见图6，其中，圆圈代表脂质体对照组，而方块代表AFGP处理的脂质体。
图6的数据表示AFGPs对在升温方向的相变期间的渗漏基本上没有影响。
以上所述主要是为了举例说明本发明，本领域技术人员很清楚，对于蛋白、比例、处理方法以及本发明所述的其它参数的选择，在不脱离本发明构思及范围的情况下可以进一步以各种方式作修改和替代。

Claims (14)

1．经过向温性相变的生物材料的一种处理方法，所述生物材料选自生物细胞、生物组织和脂质体，所述脂质体内部包含有生物活性的物质，该处理减少了向温性相变过程中物质从所述生物材料内部的渗漏，所述方法包括将所述生物材料与一种或多种能使渗漏量减少的热滞蛋白接触到足以产生减少渗漏量的程度。
2．根据权利要求1所述的方法，其中所述生物材料选自植物细胞、植物组织和脂质体，所述脂质体内部包含生物活性物质。
3．一种处理其内部包含有生物活性物质的脂质体的方法，以减少所述生物活性物质在向温性相变过程中的渗漏。所述方法包括将所述脂质体与能减少渗漏量的一种或多种热滞蛋白相接触，从而将所述热滞蛋白掺混到所述脂质体中。
4．根据权利要求3的方法，其中所述的一种或多种热滞蛋白的分子结构与从极地鱼种分离和纯化所得到的热滞蛋白的分子结构相一致。
5．根据权利要求4的方法，其中所述极地鱼种选自南极的类南极鱼科、北方海洋鳕类、右眼鲽、杜父鱼科、和绵鳚。
6．根据权利要求3的方法，其中一种或多种热滞蛋白选自：
(a)抗冻糖蛋白，从以下这些鱼类分离和纯化，该鱼选自Pagotheniaborchgrevinki、Trematomus borchgrevinki、Trematomus bernachii、和Dissostichus mawsoni；
(b)Ⅰ型抗冻多肽，从选自Pseudopleuronectus americanus和Limandaferruginea鱼中分离并纯化；
(c)Ⅱ型抗冻多肽，从Hemitripterus americanus鱼中分离和纯化；和
(d)Ⅲ型抗冻多肽，从选自Macrozoarces americanus、Rbigophiladearborni和Lycodespolaris鱼中分离和纯化。
7．权利要求3的方法，其中一种或几种热滞蛋白选自：
(a)抗冻糖蛋白，从选自Dissostichus mawsoni和Trematomus bernachii鱼中分离和纯化；
(b)Ⅰ型抗冻多肽，从Pseadopleuronectus americanus鱼中分离和纯化；
(c)Ⅱ型抗冻多肽，从Hemitripterus americanus鱼中分离和纯化；和
(d)Ⅲ型抗冻多肽，从Macrozoarces americanus中分离和纯化；
8．根据权利要求3的方法，其中一种或多种热滞蛋白是抗冻糖蛋白。
9．根据权利要求3的方法，其中所述的一种或多种的热滞蛋白是经层析法分出的片段8分子量的抗冻糖蛋白。
10．根据权利要求3的方法，其中所述的脂质体有磷脂酰胆碱的脂质成分。
11．根据权利要求3的方法，所述脂质体的脂质成分选自二油磷脂酰胆碱和二肉豆寇磷脂酰胆碱。
12．根据权利要求3的方法，该方法包括采用所述热滞蛋白的水溶液温育所述的脂质体，从而形成该脂质体的水混悬液。
13．根据权利要求12的方法，所述热滞蛋白的含量为所述混悬液的约0.3m/ml至约30m/ml。
14．根据权利要求12的方法，其中所述热滞蛋白的含量为所述混悬液的约1m/ml至约20m/ml。
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