CN1216281C - 吸收光度检测的微分析芯片及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种吸收光度检测的微分析芯片及其使用方法，该芯片的特征是由常规微分析芯片通道与液芯波导管耦合构成。本发明的优点是能在微分析芯片系统中实现高灵敏度的吸收光度检测。

Description

吸收光度检测的微分析芯片及其使用方法

                                   技术领域

本发明涉及的领域为微流控芯片分析，特别是涉及一种进行吸收光度检测的微分析芯片及其使用方法。

                                   背景技术

微流控芯片分析以分析化学和分析生物化学为基础，以微机电加工技术为依托，以微管道网络为结构特征，把试样的采集、预处理、分离、反应、检测等部分集成在几平方厘米的面积内，从而高效、快速地完成试样的分离、分析及检测。自九十年代初提出微全分析系统以来，微流控芯片分析(Microfluidic Analysis)一直处于最活跃的发展前沿，代表着21世纪分析仪器走向微型化、集成化的发展方向。通常，微流控芯片由上下两层或多层芯片构成，芯片的材料为单晶硅、或石英、或玻璃、或高分子聚合物等。芯片的面积约为几平方厘米，微管道宽度和深度为微米级，一般为封闭式微通道网络，通过垂直于芯片与微通道相连的孔进出样品。

本发明涉及的领域是有关微流控芯片上的检测系统的研究。检测系统是一个分析系统的重要组成部分。微流控芯片因其芯片体积小，进样量仅为皮、纳升级，检测处的反应通道一般为几十微米宽，因此对其检测手段和装置的要求有其特殊性。

吸收光谱分析法(亦称吸收光度检测法)是一种适用性广泛的检测方法，在分析化学中占有重要地位，也是最早用于微分析系统的检测方法之一。光度检测的波长范围约为185～1100纳米。但由于微流控芯片通道吸收池内的检测体积小，吸收光程短，导致采用吸光光度法检测灵敏度比常规宏观系统低2-4个数量级，因而目前在微流控芯片分析系统中的应用受到很大限制。近年有很多研究致力于增加微流控芯片上光度检测系统的吸收光程，以提高光度检测灵敏度。

目前已发表的技术可以分为以下两类：一是采用微加工的方法增加吸收池的光程，具体包括：制作高深宽比通道的芯片，垂直于通道直接检测，通道的深度一般小于100微米，通过这种方法提高光程，其效果有限(Laura Ceriotti，Jan Lichtenberg，et al.，Micro Total Analysis Systems 2001，339-340)在芯片上制作U形(Liang Z H，Chiem N，Ocvik G，Tong T，Fluri K，Harrison D J.Anal.Chem.1996，68：1040)或Z形结构的流通吸收池，沿通道方向引入光及检测，可以得到更长的光程，但是这种结构难以制造和调准，任何偏差都会造成分析信号的损耗和灵敏度的下降，受入射光的散射效应限制，检测光程不宜大于150微米(H.S.Moosavi，Y.Jiang，et al.，Electrophoresis，vol.21，pp.1291-1299，2000)；三层夹心式芯片，在中间层制作垂直通道吸收池，其检测光程达毫米级，但是这种芯片中间垂直通道制作困难，封接三层夹心式芯片比较困难，成本高(Jeffrey Wolk，MichaelSpaid，Morten Jensen，Richard MacReynolds，Knute Stevenson，and Ring-Ling Chien，Micro TotalAnalysis Systems 2001，367-368)。另一类采用平面波导技术，在芯片的上下面制作光全反射面，光以一定角度从上方入射口入射，在上下反射面之间反射，可多次经过通道，这种方法对入射光窗精度要求很高，需要非常精确入射光才能保证在微小的检测窗检测到信号，报道的检测光程为50-272微米(Moosav H S，Jiang Y，Lester L，McKinnon G，Harrison D J.Electrophoresis，2000，21：1291)。还有在吸收池内部集成镜面反射器件，采用硅MEMS刻蚀等制作高反射率镜面或反射通道(Verpoorte E，Manz A，Luedi H，Bruno A E，Maystre F，Krattiger B，Widmer H M，Van der Schoot B H，De Rooij N F.Sens.Actuators.B.1992，B6：66)(Tiggelaar R M，Veenstra T T，Sanders R G P，Gardeniers J G E，Elwenspoek M C，Van den Berg A.Talanta.2002，56：331)(Hidekuni Takao，Toshihiko Noda，MitsuakiAshiki，Kazuhiro Miyamura，Kazuaki Sawada，Makoto Ishida，Micro Total Analysis Systems 2001，363-364)，基于多重平面反射结构，反射光程为毫米级，由于平面反射对光路要求苛刻，在芯片吸收池内集成反射镜面技术要求较高。

目前，光度检测的各种增加光程的方法，都没有突破芯片及其通道微小尺寸带来的固有局限，因而无法真正突破检测限的瓶颈，其检测灵敏度无法达到常规分光光度计的水平。而且大都需要一些要求很高的微加工手段，结构复杂，成本高，限制了光度法在芯片领域的应用。

液芯波导管是一种以液体为内芯的光导纤维，在液芯波导管内，光发生全反射波导，可进行几乎无损的传播。该技术已被用于宏观的光度检测领域。现有研究表明用液芯波导管作为吸收池，其检测吸光度正比于浓度，符合朗伯比尔定律，其显著特点是可以极大的提高分光光度法的灵敏度及测量的线性范围。但在微分析芯片领域，尚未有液芯波导管应用于光度检测的报道。

                                   发明内容

本发明的目的在于突破芯片及其通道微小尺寸带来的固有局限，提供一种进行吸收光度检测的微分析芯片及其使用方法，将光度检测的有效光程提高2-3个数量级以上，大幅提高芯片上的分光光度检测灵敏度。

本发明提供的吸收光度检测的微分析芯片，是一种基于液芯波导原理的用于长光程吸收光度检测的微分析芯片，根据本发明，微分析芯片的吸收池，由微分析芯片通道与外接的液芯波导管耦合构成。

根据本发明，所述的液芯波导管是一种管内有待检测流体流过，利用管壁的性质实现光线在管内部流体中连续全反射或反射传递的毛细管。液芯波导管内通道的横截面构型为圆形或椭圆形。液芯波导管内通道的内径在0.1微米-5毫米范围内，管壁厚度在1微米-1厘米范围内。液芯波导管的管长在5毫米-50米范围内。

根据本发明，为实现光在波导管内的波导，所使用的波导管的内壁、外壁、管壁本身三部分之中，至少有一部分具有对光线的反射或全反射功能。

根据本发明，所使用的一类波导管是利用折射率的差异实现的光的波导，其特征是，在波导管的内壁、外壁、管壁本身三者之中，至少一个采用折射率低于管内流体的材料制作。

根据本发明，所使用的另一类波导管是利用光反射的原理实现光的波导，其特征是，所述波导管的内壁、外壁、管壁本身三者之中，至少一个采用具有高效光反射性能的材料制作。

根据本发明的另一个特点，微分析芯片内通道与液芯波导管通道耦合接口采用小死体积的接口，有利于降低试样带在接口处的分散，同时，在接口处不易留存气泡，以免干扰正常的测定操作。

本发明的吸收光度检测的微分析芯片使用方法，实际测定时，检测系统光源发射的入射光线由波导管入口进入液芯波导管，通过管内流体，由波导管出口导出，被光检测器检测。光源发出的光被液芯波导管中流体吸收，从而发生吸光度的变化。更为有利的是，光源的入射光与波导管圆心同轴对准，以提高入射光能量，即提高测定的信噪比。由波导管出口导出的光，采用与波导管同轴对准的光纤收集，再导入光检测器，以提高收集光的效率。

根据本发明的使用方法，采用较长的波导管有利于提高光吸收的有效光程。

根据本发明的使用方法，相对波导管内流体，利用管外壁实现波导，因存在光线在管壁内的传输而损失光度检测的有效光程；对于相同长度的波导管，利用管内壁实现波导比利用管外壁实现波导具有更长的有效光程。

根据本发明的使用方法，利用管外壁实现波导时，采用较薄的液芯波导管管壁，有利于提高吸收池的有效光程。

根据本发明的使用方法，对于采用透光材料制作管壁的波导管，采用在波导管的光进入口外壁，覆盖不透光的遮光材料，减少不经过流体的无用光线的进入，能显著提高光度检测的灵敏度。更为有利的是，在液芯波导管与芯片的耦合端外壁及端面都覆盖不透光的遮光材料，能进一步提高光度检测的灵敏度。

本发明的主要优点在于：在小体积的微分析芯片上可进行灵敏度高光度检测；所需的试样体积在低于1微升的数量级时，检测灵敏度完全可以达到和超过常规的紫外可见分光光度计；此外，波导管的长度不受芯片大小的限制，液芯波导管吸收池可长达厘米至分米级，甚至米级，达到很高的检测灵敏度；当液芯波导管很长时，可以采用盘成螺旋状的方法，减小系统体积。液芯波导管光的损耗极小，抗干扰能力强；检测系统结构简单，容易加工，性能稳定可靠，体积小，易于集成化。

本发明的另一个突出优点在于吸收池对光源要求比较简单，用小型激光器或者发光二极管即可作光源，而且不需要任何其他光源校准器件，即可得到较强的光检测信号；为了提高系统的集成性，可以使用光电二极管作光检测器件，以达到整体微型化的要求。

本发明的另一个优点是可以实现多样品连续进样检测。检测样品通过液芯波导管，即排出芯片体系，因此可以连续进样，可用于在线监控。

本发明可广泛应用于基于芯片的连续流动和流动注射分析。

                                   附图说明

图1.是根据本发明一个优选实施例的基于液芯波导原理的用于长光程吸收光度检测的微分析芯片。

图2.是图1芯片上液芯波导管与微流控芯片耦合接口的局部放大图。

图3.是根据本发明优选实施例中所用液芯波导管的一个实例。

图4.是图3实施例中所用液芯波导管的横截面透光图，对比了没有进行遮光处理和进行了遮光处理的不同的效果。

图5.是根据本发明优选实施例吸收池中液芯波导管信号检测端局部放大图。

图6.显示安装有图3实施例装置的微芯片分析系统对不同浓度铁(II)-邻菲啰啉配合物检测的结果记录图。

图7.显示安装有图3实施例装置的微芯片分析系统对不同浓度铁(II)-邻菲啰啉配合物检测的标准曲线以及在分光光度计平行测定的标准曲线图。

图8.是根据本发明优选实施例中所用液芯波导管的另一个实例。

图9.显示安装有图8实施例结构的全Teflon AF液芯波导管微芯片分析系统对不同浓度铁(II)-邻菲啰啉配合物检测的结果记录图。

图10.显示安装有图8实施例结构的内镀银液芯波导管微芯片分析系统对铁(II)-邻菲啰啉配合物检测的结果记录图。

                                 具体实施方式

参照附图，以下将详细描述根据本发明的一个优选实施例1。

图1是根据本发明一个优选实施例制得的耦合液芯波导管的微流控芯片构造图。微流控芯片由上(1)、下(2)两玻璃片组成，玻璃片厚度为1.7毫米。采用光掩膜和湿法刻蚀技术在上片(1)加工“工”字形通道，微通道(3)宽度为100微米，深度30微米。用1.7毫米的金刚石钻头分别在“工”字形通道的端部垂直于芯片钻孔(4)、(5)。采用经典的高温键合的方法实现上(1)、下(2)两片的永久封合。得到长度、宽度分别为30毫米、20毫米的微流控芯片。接近“工”字形上横通道2.5毫米位置处，用金刚石玻璃刀垂直于芯片、平行于横向通道，切割得到“T”形通道芯片。平行于横向通道的面用细砂纸研磨抛光，得到透明的平面(8)，以便光源直接照射。采用0.35毫米钻头在芯片上钻孔的方法，在T字形通道的出口通道得到直径约390微米的芯片接口(6)。所接的波导管(7)为5.5厘米长。将内径0.5mm聚四氟乙烯管粘接于微流控芯片的进出口(4)、(5)处，使芯片和外部进样设备相连。

图2是液芯波导管与微流控芯片耦合接口的局部放大图。采用Teflon AF1600液芯波导管(7)外径375微米，内径为50微米。用黑色油漆笔(ZEBRA，Japan)在洁净的玻璃表面挤出一小滴油漆液，将液芯波导管的一端接泵管泵气，防止中间通道进漆；另一端垂直在油漆小液滴中浸一下，快速拿起，泵气直至漆干为止。用较干的油漆笔在波导管侧壁涂上一薄层均匀的油漆(11)，油漆厚约5～10微米。得到的液芯波导管端部外径略小于390微米。将Teflon液芯波导管涂漆端小心的插入，液芯波导管端部与接口底部紧密接合。用环氧树脂胶(14)固定波导管。为了在芯片上集成发光二极管光源，如图2所示在接近微流控芯片通道与波导光接口处用金刚钻透(1)、(2)玻璃片，用锉刀研磨，然后用细砂纸抛光，得到一个方形框(15)用于嵌入集成发光二极管光源。

图3是一种外覆Teflon AF膜(9)的石英液芯波导管吸收池光路示意图。Teflon AF膜(9)的折射率为1.29，通道中水溶液(10)的折射率为1.3333，石英壁(8)折射率为1.51。波导管入口处用波导管的全反射条件均为入射角大于θ₀＝75.4°。沿通道轴向以小于15.6°入射角入射的光能在液芯波导管中全反射传播，当溶液中有吸光物质时，光被吸收，产生吸光度变化。从图3可以看出，当以15.6°入射角入射时，通过溶液的光程占总光程的三分之一左右。用纯Teflon AF毛细管或内壁全反射金属毛细管，可以使光程大于等于波导管的长度；采用石英壁很薄的波导管，以减少光在石英壁中传播光程的比例，也可以提高光程。

图4对比了图3的波导管在没有进行遮光处理和进行了遮光处理的不同的效果。A1、A2、B1、B2均为Teflon液芯波导管检测端CCD显微拍照实图。光源为505纳米的发光二极管。A1、A2为入射端面没有涂油漆的光分布图。B1、B2为入射端进行了图4所示的遮光处理的光分布图。其中A1、B1注射0.2mM邻菲啰啉-铁(II)显色溶液，A2、B2注射空白邻菲啰啉溶液。可以看到，没有进行遮光处理时，溶液变化对总光量的变化贡献不大，因为大部分光是通过石英壁中传播。进行遮光处理后，通道中心变化更加明显。证明遮光处理有助于降低背景，提高系统的检测灵敏度。

图5为液芯波导管检测端口设计。液芯波导管出口由一外径大于液芯波导管的单芯光纤(17)，由光纤将光导入光电倍增管检测。检测端口同时也是检测溶液出口，我们设计了一个稀释液池(16)，保持出口检测处的环境稳定。也可以采用其他方法进行检测，如采用光电二极管，对准液芯波导管出口直接检测，这样将大大简化系统，实现整体的小型化。

图6显示安装有图3实施例装置的微芯片分析系统对不同浓度铁(II)-邻菲啰啉配合物检测的结果记录图。采用以上图1微流控芯片耦合液芯波导管系统装置，及505纳米的发光二极管作光源，光电倍增管和微光测量仪作为检测器，检测邻菲啰啉-铁(II)混合显色溶液。T形通道芯片的两个通道分别交替注射Fe(II)标准系列溶液(一个数量级五个溶液)和空白液。

图7显示安装有图3实施例装置的微芯片分析系统对不同浓度铁(II)-邻菲啰啉配合物检测的标准曲线以及在分光光度计平行测定的标准曲线图。检测范围2.0～10微摩尔/升标准溶液。曲线方程为y＝0.0184x+0.0056，R2＝0.9991；在分光光度计上平行实验测得的曲线方程为y＝0.011x-0.0028，R2＝0.9994。检测吸光度超过分光光度计，但没有达到理论计算的最低值。检测灵敏度同时受到光源单色性，遮光层的遮光不完全等的影响。

图8为一种通过内部全反射进行液芯波导的吸收池光路示意图。全反射管壁可以是低折射率透明物质或者高反射率的非透明物质表面。

图9为采用图8结构的一个实施例，全Teflon AF液芯波导管吸收池，管长6.3厘米，对铁(II)-邻菲啰啉配合物检测的标准曲线以及在分光光度计平行测定的标准曲线图。检测范围2.0～10微摩尔/升标准溶液。曲线方程为y＝0.0514x+0.0135，R²＝0.9995，在分光光度计上平行实验测得的曲线方程为y＝0.0117x-0.0123，R²＝0.9992。

图10为采用图8结构的另一个实施例，内镀银液芯波导管的吸收池，对铁(II)-邻菲啰啉配合物检测的结果记录图。采用3cm吸收池，其吸光度可达到分光光度计的3.7～4倍。

Claims (9)

1.一种吸收光度检测的微分析芯片，其特征在于，该芯片的吸收池由微分析芯片通道与外接的液芯波导管耦合构成。

2.根据权利要求1所述吸收光度检测的微分析芯片，其特征在于：所述的液芯波导管，(a)是一种管内有待检测流体流过，利用管壁的性质实现光线在管内部流体中连续全反射或反射传递的毛细管；(b)液芯波导管内通道的横截面构型为圆形或椭圆形；(c)液芯波导管内通道的内径在0.1微米-5毫米范围内；(d)管壁厚度在1微米-1厘米范围内；(e)液芯波导管的管长在5毫米-50米范围内；(f)波导管内壁、外壁、管壁本身三部分之中，至少有一部分具有对光线的反射或者全反射功能。

3.根据权利要求1或2所述吸收光度检测的微分析芯片，其特征在于，所述波导管的内壁、外壁、管壁本身三者之中，至少有一个采用折射率低于管内流体的材料或者具有高效光反射性能的材料制作。

4.根据权利要求1或2所述吸收光度检测的微分析芯片，其特征在于，在所述波导管采用透光材料，在波导管的光进入口外壁覆盖不透光的遮光材料。

5.根据权利要求1所述吸收光度检测的微分析芯片，其特征在于，所述微分析芯片通道与液芯波导管通道耦合的接口具有最小的死体积。

6.权利要求1所述吸收光度检测的微分析芯片的使用方法，其特征在于，检测系统光源发射的入射光线由波导管入口进入液芯波导管，液芯波导管中流体吸收光源发出的光，从而发生吸光度的变化，由波导管出口导出，光检测器检测。

7.根据权利要求6所述吸收光度检测的微分析芯片的使用方法，其特征在于，光源的入射光与波导管圆心同轴对准，以提高入射光能量，由波导管出口导出的光，经与波导管同轴对准的光纤收集后，再导入光检测器，以提高收集光的效率。

8.根据权利要求6所述吸收光度检测的微分析芯片的使用方法，其特征在于，利用增加波导管长度，或者降低利用管外壁实现波导的波导管的管壁厚度，提高吸收池的有效光程。

9.根据权利要求6所述吸收光度检测的微分析芯片的使用方法，其特征在于，相对相同长度和内径的依靠管外壁实现波导的波导管，使用依靠管内壁实现波导的波导管，可获得更长的光度检测有效光程。

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