CN121136890A - L-异亮氨酸生产能力得到提高的埃希菌属微生物及利用其的l-异亮氨酸的生产方法 - Google Patents

L-异亮氨酸生产能力得到提高的埃希菌属微生物及利用其的l-异亮氨酸的生产方法

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Abstract

本发明涉及L‑异亮氨酸生产能力得到提高的埃希菌属微生物及利用其的L‑异亮氨酸的生产方法，上述埃希菌属微生物通过乙酰羟酸合成酶Ⅰ和Ⅲ的活性弱化或失活或者与此同时乙酰羟酸合成酶Ⅱ的活性增强，从而L‑异亮氨酸的生物合成途径增强，同时副产物的生成弱化，与亲本菌株相比，L‑异亮氨酸的生产收率可以得到提高。

Description

L-异亮氨酸生产能力得到提高的埃希菌属微生物及利用其的 L-异亮氨酸的生产方法
技术领域
本发明涉及L-异亮氨酸生产能力得到提高的埃希菌属微生物及利用其的L-异亮氨酸的生产方法。
背景技术
L-异亮氨酸是人体或动物体内不能合成的必要氨基酸，必须从外部供给，一般情况下，是通过利用了细菌或酵母之类的微生物的发酵而生产的。
L-异亮氨酸与作为支链氨基酸(branched-chain amino acid)的L-缬氨酸、L-亮氨酸共享主要的生物合成途径。特别是，L-异亮氨酸和L-缬氨酸的化学结构和等电点、以及溶解度等化学特性非常相似，因此为了生产高纯度的单一氨基酸例如L-异亮氨酸则需要许多工序步骤和费用，因此难以高收率回收。为了降低L-异亮氨酸的生产费用，发掘或开发大量生产L-异亮氨酸的同时少量生产L-缬氨酸的菌株是重要的。
L-异亮氨酸的生产可以利用在自然状态下获得的野生型菌株或为了提高其L-异亮氨酸生产能力而修饰的变异株。利用了微生物的L-异亮氨酸的生物合成以丙酮酸(pyruvic acid)和草酰乙酸(oxaloacetic acid)为前体而生产L-苏氨酸，接着依次合成L-异亮氨酸。
近年来，为了改善L-异亮氨酸的生产效率，以多用于L-氨基酸和其它有用物质生产的埃希菌属、棒状杆菌属、短杆菌属等微生物为对象适用基因重组技术，从而开发了具有优异的L-异亮氨酸生产能力的多种重组菌株或变异株及利用其的L-异亮氨酸的生产方法。特别是，进行了如下尝试：对参与L-异亮氨酸的生物合成途径的酶、转录因子、转运蛋白等的基因直接引起变异、或者对调控它们的表达的启动子诱导变异，从而扩大L-异亮氨酸的生产量。但是，与L-异亮氨酸的生产直接或间接相关的酶、转录因子、转运蛋白等蛋白质的种类多种多样，因此关于根据这样的蛋白质的活性变化的L-异亮氨酸生产能力是否增加，事实上仍需要大量的研究。
现有技术文献
专利文献
韩国授权专利第10-1747542号
发明内容
本发明的目的在于提供L-异亮氨酸生产能力得到提高的埃希菌属微生物。
另外，本发明的目的在于提供利用了上述埃希菌属微生物的L-异亮氨酸的生产方法。
本发明的一个方式提供一种埃希菌属微生物，其乙酰羟酸合成酶(acetohydroxyacid synthase)Ⅲ的活性弱化或失活或者乙酰羟酸合成酶Ⅰ和Ⅲ的活性弱化或失活，从而L-异亮氨酸生产能力得到提高。
本发明中所使用的“乙酰羟酸合成酶(acetohydroxy acid synthase，AHAS)”是第一个共同参与L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸等的生物合成过程的酶，使用丙酮酸和α-丁酮酸(alpha-ketobutyric acid)作为底物。当乙酰羟酸合成酶对丙酮酸具有高的底物特异性时，参与丙酮酸的聚合而生产作为L-缬氨酸和L-亮氨酸的前体的2-乙酰乳酸(2-acetolactate)，而对α-丁酮酸具有高的底物特异性时，参与丙酮酸和α-丁酮酸的聚合而生产作为L-异亮氨酸的前体的2-乙酰-2-羟基-丁酸酯(2-aceto-chydroxy-butyrate)。
作为乙酰羟酸合成酶，已知存在乙酰羟酸合成酶Ⅰ(AHASⅠ)、乙酰羟酸合成酶Ⅱ(AHASⅡ)和乙酰羟酸合成酶Ⅲ(AHASⅢ)，各乙酰羟酸合成酶由大亚单位(large subunit)和小亚单位(small unit)组成。本发明中的乙酰羟酸合成酶Ⅰ可以为通过编码大亚单位的ilvB基因和编码小亚单位的ilvN基因而具有乙酰羟酸合成酶活性的多肽，乙酰羟酸合成酶Ⅱ可以为通过编码大亚单位的ilvG基因和编码小亚单位的ilvM基因而具有乙酰羟酸合成酶活性的多肽，以及乙酰羟酸合成酶Ⅲ可以为通过编码大亚单位的ilvH基因和ilvI基因而具有乙酰羟酸合成酶活性的多肽，但并不限定于此。
上述3种乙酰羟酸合成酶的核酸序列和蛋白质序列信息可以通过公知的序列数据库(例如，GenBank、UniProt)得到。
本发明中所使用的“活性弱化”是指编码作为目标的酶、转录因子、转运蛋白等蛋白质的基因的表达量与原始微生物即野生型菌株或修饰前的菌株相比减少。这样的目标蛋白质的活性弱化包括以下情况：通过编码目标蛋白质的内在的基因内核苷酸修饰(例如，目的基因内一部分核苷酸的置换、插入、缺失或者它们的组合)，蛋白质自身的活性与原始微生物具有的蛋白质的活性相比减少的情况，以及由于对启动子(promoter)之类的非编码区域的修饰(例如，启动子序列内全部或一部分核苷酸的修饰、用弱启动子(weak promoter)替换)，阻碍目的基因的表达或者阻碍翻译等，细胞内的整体蛋白质活性程度与野生型菌株或修饰前的菌株相比低的情况，此外也包括它们组合的情况。
上述核苷酸修饰是指因核苷酸序列的全部或部分被置换、插入、缺失或它们的组合而与原始的核苷酸序列不同。上述启动子修饰是指因启动子序列的全部或部分核苷酸被置换、插入、缺失或它们的组合而与原本的启动子序列不同，由此导致对目的基因的表达水平减少或活性弱化。此外，上述启动子修饰包括替换为与原本基因的启动子相比对目的基因的表达水平或活性弱的启动子。其中，置换是指碱基、核苷酸、多核苷酸或核酸被替换为其它的碱基、核苷酸、多核苷酸或核酸的变更。插入是指增加其它的碱基、核苷酸、多核苷酸或核酸的变更。缺失是指碱基、核苷酸、多核苷酸或核酸被去除的变更。
根据本发明的一具体例，上述乙酰羟酸合成酶Ⅰ的活性弱化可以是编码乙酰羟酸合成酶Ⅰ的基因(ilvB和/或ilvN)的核苷酸修饰、启动子修饰、或者它们的组合。
另外，根据本发明的一具体例，上述乙酰羟酸合成酶Ⅲ的活性弱化可以是编码乙酰羟酸合成酶Ⅲ的基因(ilvH和/或ilvI)的核苷酸修饰、启动子修饰、或者它们的组合。
本发明中所使用的“失活”是指以下情况：编码酶、转录因子、转运蛋白等蛋白质的基因的表达与原始微生物即野生型菌株或修饰前的菌株相比完全不表达的情况，或者即使表达也没有活性的情况。
根据本发明的一具体例，上述乙酰羟酸合成酶Ⅰ和Ⅲ可以是大肠埃希菌(Escherichia coli)所固有的。
上述乙酰羟酸合成酶Ⅰ的大亚单位可以由SEQ ID NO:1的碱基序列编码或由SEQID NO:2的氨基酸序列组成，乙酰羟酸合成酶Ⅰ的小亚单位可以由SEQ ID NO:3的碱基序列编码或由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成，但并不限定于此。
上述乙酰羟酸合成酶Ⅲ的大亚单位可以由SEQ ID NO:9的碱基序列编码或由SEQID NO:10的氨基酸序列组成，乙酰羟酸合成酶Ⅲ的小亚单位可以由SEQ ID NO:11的碱基序列编码或由SEQ ID NO:12的氨基酸序列组成，但并不限定于此。
根据本发明的埃希菌属微生物通过乙酰羟酸合成酶Ⅲ的活性弱化或失活或者乙酰羟酸合成酶Ⅰ和Ⅲ的活性弱化或失活，从而丙酮酸的亲和力相对低，L-缬氨酸的生成减少，维持对于乙酰羟酸合成酶Ⅱ的活性，因此可以维持和增加L-异亮氨酸的生产。
因此，本发明的埃希菌属微生物可以包含对于乙酰羟酸合成酶Ⅱ的活性。
另外，为了提高L-异亮氨酸的生产，根据本发明的埃希菌属微生物可以是乙酰羟酸合成酶Ⅰ和Ⅲ的活性弱化或失活，同时乙酰羟酸合成酶Ⅱ的活性增强。
根据本发明的一具体例，上述埃希菌属微生物可以被进一步增强乙酰羟酸合成酶Ⅱ的活性。
本发明中所使用的“活性增强”是指编码作为目标的酶、转录因子、转运蛋白等蛋白质的基因的表达量与原始微生物即野生型菌株或修饰前的菌株相比增加。这样的目标蛋白质的活性增强包括以下情况：通过编码目标蛋白质的内在的基因内核苷酸的修饰(例如，目的基因内一部分核苷酸的置换、插入缺失或它们的组合)，蛋白质自身的活性与原始微生物具有的蛋白质的活性相比增加的情况，基因的拷贝数(copy number)增加的情况，由于对启动子(promoter)之类的非编码区域的修饰(例如，启动子序列内全部或一部分核苷酸的修饰、用强启动子(strong promoter)替换)，增加目的基因的表达或者增加翻译等，细胞内的整体蛋白质活性程度与野生型菌株或修饰前的菌株相比高的情况，此外也包括它们的组合的情况。
上述核苷酸修饰是指因核苷酸序列的全部或部分被置换、插入、缺失或它们的组合而与原始的核苷酸序列不同。上述启动子修饰是指因启动子序列的全部或部分核苷酸被置换、插入、缺失或它们的组合而与原本的启动子序列不同，由此导致对目的基因的表达水平增加或活性增强。此外，上述启动子修饰包括替换为与原本基因的启动子相比对目的基因的表达水平或活性强的启动子。其中，置换是指碱基、核苷酸、多核苷酸或核酸被替换为其它的碱基、核苷酸、多核苷酸或核酸的变更。插入是指增加其它的碱基、核苷酸、多核苷酸或核酸的变更。缺失是指碱基、核苷酸、多核苷酸或核酸被去除的变更。
另外，目标蛋白质的活性增强包括导入原始微生物不具有的外来的基因的情况，此时，外来的基因的核苷酸可以被修饰。
根据本发明的一具体例，上述乙酰羟酸合成酶Ⅱ的活性增强可以是编码乙酰羟酸合成酶Ⅱ的基因(ilvG和/或ilvM)的核苷酸修饰、拷贝数增加、启动子修饰、导入、或者它们的组合。
根据本发明的一具体例，上述乙酰羟酸合成酶Ⅱ可以来源于大肠埃希菌(Escherichia coli)。
上述乙酰羟酸合成酶Ⅱ的大亚单位可以由SEQ ID NO:5的碱基序列编码或由SEQID NO:6的氨基酸序列组成，乙酰羟酸合成酶Ⅱ的小亚单位可以由SEQ ID NO:7的碱基序列编码或由SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成，但并不限定于此。
根据本发明的3种乙酰羟酸合成酶的各碱基序列或氨基酸序列可以由与SEQ IDNO:1至12的碱基序列或氨基酸序列相比具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同源性或同一性的序列组成或者必须包含它，并且可以具有原始的功能。在这里，“同源性”或“同一性”是指在将成为基准的碱基序列或氨基酸序列与任意的其它碱基序列或氨基酸序列以最大程度对应的方式对齐而进行分析时，两序列之间的一致率(％)。
本发明中所使用的“生产能力得到提高”是指与变异对象(亲本菌株)相比，L-异亮氨酸的生产率增加。上述亲本菌株是指成为变异的对象的野生型或变异株，包括直接成为变异的对象或通过重组载体等转化的对象。在本发明中，亲本菌株可以是没有L-异亮氨酸生产能力或具有L-异亮氨酸生产能力的、野生型埃希菌属的微生物或菌株或者由野生型变异的埃希菌属微生物或菌株。
根据本发明的一具体例，上述埃希菌属可以为大肠埃希菌(Escherichia coli)、艾伯特埃希菌(Escherichia albertii)、蟑螂埃希菌(Escherichia blattae)、弗格森埃希菌(Escherichia fergusonii)、赫氏埃希菌(Escherichia hermannii)或伤口埃希菌(Escherichia vulneris)等，但并不限定于此。
作为一个例子，上述埃希菌属可以为大肠埃希菌(Escherichia coli)。
根据本发明的埃希菌属微生物可以由于乙酰羟酸合成酶Ⅲ的活性/失活、乙酰羟酸合成酶Ⅰ和Ⅲ的活性弱化/失活、或者乙酰羟酸合成酶Ⅰ和Ⅲ的活性弱化/失活，同时乙酰羟酸合成酶Ⅱ的活性增强，从而L-异亮氨酸生产能力得到提高。
具体而言，L-异亮氨酸生产能力得到提高的埃希菌属微生物显示出与亲本菌株相比增加的L-异亮氨酸生产能力，特别是，与亲本菌株相比，L-异亮氨酸生产量可以增加至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％，或者可以增加1.1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，但并不限定于此。作为一个例子，上述乙酰羟酸合成酶Ⅲ或乙酰羟酸合成酶Ⅰ和Ⅲ的活性弱化或失活、或者与此同时乙酰羟酸合成酶Ⅱ的活性增强的埃希菌属微生物，与亲本菌株相比，L-异亮氨酸生产量可以增加5％以上，具体可以增加5至50％(优选为10至40％)。
包含根据本发明的埃希菌属微生物的组合物可以用作L-异亮氨酸生产用组合物。
根据本发明的一具体例的埃希菌属微生物为了以亲本菌株为对象使编码乙酰羟酸合成酶Ⅲ或乙酰羟酸合成酶Ⅰ和Ⅲ的基因缺失或者导入编码乙酰羟酸合成酶Ⅱ的基因，可以通过基因失活方法或重组载体实现。
上述基因失活方法可以通过公知的方法实施。例如，有CaCl2方法(Cohen,S.N.etal.,Proc.Natl.Acac.Sci.USA,9:2110-2114(1973))、哈纳汉方法(Cohen,S.N.et al.,Proc.Natl.Acac.Sci.USA,9:2110-2114(1973)；和Hanahan,D.,J.Mol.Biol.,166:557-580(1983))以及电穿孔方法(Dower,W.J.et al.,Nucleic.Acids Res.,16:6127-6145(1988))等，但并不限定于此。
本发明中所使用的“载体(vector)”是指作为用于向变异对象(宿主细胞)传递、表达目的基因的手段而使用的所有类型的核酸序列转运结构体。除非另有说明，否则上述载体可以表示使担载的核酸序列插入宿主细胞基因内进行表达和/或独立进行表达。这样的载体为了表达基因插入物而包括可操作地连接的必需的调控元件，“可操作地连接的(operably linked)”是指目的基因与其调控序列彼此功能性地结合并以能够进行基因表达的方式连接，“调控元件”包括用于实施转录的启动子、用于调控转录的任意的操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列、以及调控转录和翻译的终止的序列。
本发明中所使用的载体只要能够在宿主细胞中进行复制就没有特别限定，可以利用本领域中已知的任意的载体。作为上述载体的一个例子，可以举出天然状态或重组状态的质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，作为噬菌体载体或粘粒载体，有pWE15、M13、λMBL3、λMBL4、λIXII、λASHII、λAPII、λt10、λt11、Charon4A、Charon21A等，作为质粒载体，有pBR系、pUC系、pBluescriptII系、pGEM系、pTZ系、pCL系和pET系等，但并不限定于此。
上述载体可以代表性地构建为用于克隆的载体或用于表达的载体。用于表达的载体可以使用本领域中用于在植物、动物或微生物中表达外源基因或蛋白质的常规载体，并且可以通过本领域中公知的各种方法而构建。
本发明中所使用的“重组载体”可以以原核细胞或真核细胞为宿主进行构建，可以与宿主细胞的基因组无关地进行复制，或者可以缝合于基因组其本身。上述宿主细胞能够进行载体的复制，可以包括作为开始复制的特定碱基序列的复制起点。例如，在所使用的载体为表达载体且以原核细胞为宿主时，通常包括可以使转录进行的强启动子(例如，pLλ启动子、CMV启动子、trp启动子、lac启动子、tac启动子、T7启动子)、用于翻译的起始的核糖体结合位点、以及转录/翻译终止序列。在以真核细胞为宿主时，在载体所包含的真核细胞中启动的复制起点包括f1复制起点、SV40复制起点、pMB1复制起点、腺病毒复制起点、AAV复制起点和BBV复制起点等，但并不限定于此。此外，可以利用源于哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或者源于哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、巨细胞病毒启动子、HSV的tk启动子)，并且通常具有多腺苷酸化序列作为转录终止序列。
上述重组载体可以包括选择标记(selection marker)，上述选择标记用于筛选利用载体转化的转化体(宿主细胞)，在经上述选择标记处理的培养基中只有表达选择标记的细胞可以生存，因此能够筛选转化的细胞。作为代表性的例子，上述选择标记有氨苄青霉素、卡那霉素、链霉素、氯霉素等，但并不限定于此。
通过将上述重组载体插入宿主细胞，从而可以制作转化体，上述转化体可以通过将重组载体导入合适的宿主细胞而得到。宿主细胞是可以稳定且连续地克隆或表达上述表达载体的细胞，也可以利用本领域中公知的任何宿主细胞。
为了制作重组微生物而对原核细胞进行转化时，作为宿主细胞，可以利用E.coliJM109、E.coli BL21、E.coli RR1、E.coli LE392、E.coli B、E.coli X 1776、E.coliW3110、E.coli XL1-Blue之类的大肠杆菌；棒状杆菌(Corynebacterium)属；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)之类的芽孢杆菌属；鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)和假单胞菌(Pseudomonas)属之类的各种肠道细菌和菌株等，但并不限定于此。
在为了制作重组微生物而对真核细胞进行转化时，作为宿主细胞，可以利用酵母(例如，酿酒酵母)、昆虫细胞、植物细胞和动物细胞，例如，Sp2/0、CHO K1、CHO DG44、PER.C6、W138、BHK、COS7、293、HepG2、Huh7、3T3、RIN、MDCK细胞株等，但并不限定于此。
本发明中所使用的“转化(transformation)”是指将外源DNA导入宿主细胞内而人为引起遗传性的变化的现象，“转化体(transformant)”是指导入有外源DNA并稳定维持目的基因的表达的宿主细胞。
在上述转化中，根据宿主细胞而选择合适的载体导入技术，从而可以在宿主细胞内表达目的基因或包含其的重组载体。例如，载体导入可以通过电穿孔法(electroporation)、热冲击(heat-shock)、磷酸钙(CaPO4)沉淀、氯化钙(CaCl2)沉淀、显微注射法(microinjection)、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法、乙酸锂-DMSO法、或者它们的组合而实施，但并不限定于此。转化的基因只要可以在宿主细胞内表达，就可以被包括在内，而不限制于将其插入宿主细胞的染色体内或者位于染色体外。
上述转化体包括在生物体内或试管内利用根据本发明的重组载体转染、转化或感染的细胞，并且可以与重组宿主细胞、重组细胞或重组微生物作为相同的用语被使用。
插入到本发明的转化用重组载体内的基因可以由于同源重组交叉而被置换到埃希菌属微生物之类的宿主细胞内。
根据本发明的一具体例，上述宿主细胞可以为埃希菌属微生物。例如，可以为大肠埃希菌(Escherichia coli)，但并不限定于此。
本发明的另一方式提供L-异亮氨酸的生产方法，包括以下步骤：在培养基中培养上述埃希菌属微生物的步骤；以及从上述埃希菌属微生物或培养埃希菌属微生物的培养基中回收L-异亮氨酸的步骤。
上述培养可以根据本领域中已知的合适的培养基和培养条件而进行，只要是本领域技术人员就可以容易地调整培养基和培养条件来使用。具体而言，上述培养基可以是液体培养基，但并不限定于此。培养方法可以包括例如分批式培养(batch culture)、连续式培养(continuous culture)、补料分批式培养(fed-batch culture)或者它们的组合培养，但并不限定于此。
根据本发明的一具体例，上述培养基必须以合适的方式满足特定菌株的要求，可以由本领域技术人员适当地进行修饰。关于埃希菌属菌株的培养基，可以参考公知的文献(Manual of Methods for General Bacteriology.American Society forBacteriology.Washington D.C.,USA,1981)，但并不限定于此。
根据本发明的一具体例，培养基中可以包含各种碳源、氮源和微量元素成分。作为可以使用的碳源，包括葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉、纤维素之类的糖及碳水化合物；大豆油、葵花籽油、蓖麻籽油、椰子油等油及脂肪；棕榈酸、硬脂酸、亚油酸之类的脂肪酸；甘油、乙醇之类的醇；乙酸之类的有机酸。这些物质可以单独使用或以混合物的形式使用，但并不限定于此。作为可以使用的氮源，可以包括蛋白胨、酵母提取物、肉汤、麦芽提取物、玉米浆、豆粕和尿素或者无机化合物，例如，硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。氮源同样可以单独使用或以混合物的形式使用，但并不限定于此。作为可以使用的磷的供应源，可以包括磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠的盐，但并不限定于此。此外，培养基可以含有生长所需要的硫酸镁或硫酸亚铁之类的金属盐，但并不限定于此。除此以外，可以包含氨基酸和维生素之类的必要生长物质。此外，可以使用适合培养基的前体。上述培养基或单个成分可以在培养过程中通过适当的方式分批或连续添加到培养液中，但并不限定于此。
根据本发明的一具体例，在培养过程中，可以将氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸之类的化合物以适当的方式添加到微生物培养液中来调整培养液的pH。此外，在培养过程中，可以使用脂肪酸聚乙二醇酯之类的消泡剂来抑制气泡产生。进一步，为了维持培养液的有氧状态，可以向培养液内注入氧气或者含氧气的气体(例如空气)。培养液的温度通常可以为20℃至45℃，例如，可以为25℃至40℃。培养时间可以持续到有用物质获得期望的生产量为止，例如，可以为10至160小时。
根据本发明的一具体例，在上述从培养的转化体或培养转化体的培养基中回收L-异亮氨酸的步骤中，可以根据培养方法并利用本领域中公知的合适的方法，从培养基中收集或回收所生产的L-异亮氨酸。例如，可以使用离心分离、过滤、提取、喷雾、干燥、蒸发、沉淀、结晶化、电泳、分级溶解(例如，硫酸铵沉淀)、色谱法(例如，离子交换、亲和性、疏水性和尺寸排阻)等方法，但并不限定于此。
根据本发明的一具体例，在上述回收L-异亮氨酸的步骤中，将培养基低速离心分离而去除生物质，可以将得到的上清液通过离子交换色谱法而分离。
根据本发明的一具体例，在上述回收L-异亮氨酸的步骤中，可以包括纯化L-异亮氨酸的工序。
根据本发明的埃希菌属微生物通过乙酰羟酸合成酶Ⅲ或乙酰羟酸合成酶Ⅰ和Ⅲ的活性弱化或失活或者与此同时乙酰羟酸合成酶Ⅱ的活性增强，从而L-异亮氨酸的生物合成途径增强，同时副产物的生成弱化，与亲本菌株相比，L-异亮氨酸的生产收率可以得到提高。
具体实施方式
下面，对本发明更详细地进行说明。但是，这样的说明只是为了帮助理解本发明而例示性地提出的，本发明的范围并不限定于这样的例示性的说明。
实施例1.AHASⅠ的活性弱化的变异株制作
为了制作AHASⅠ的活性弱化的菌株，使用生产L-异亮氨酸的大肠埃希菌(又称大肠杆菌，Escherichia coli)DS44(保藏号KCTC11602BP)并通过一步失活方法(one stepinactivation；Warner et al.,PNAS,6:6640-6645(2000)使编码AHASⅠ的ilvBN基因(SEQID NO:1和3)缺失。
首先，利用lvBN_F和ilvBN_R的引物对并以pKD13质粒(GenBank AY048744)为模板进行PCR反应，获得了片段。向E.coli DS44导入红色重组酶(red recombinase)质粒pKD46(GenBank AY048746)后，通过电穿孔法注入制作的PCR片段，筛选了具有卡那霉素(kanamycin)抗性的菌落。筛选的转化体利用ilvBN_CF和ilvBN_CR的引物对实施PCR反应，确认了ilvBN基因的缺失与否。插入有破坏用DNA的DS44ΔilvBN与预期一样生成了约2.6kb的产物，而DS44则生成了约3.5kb的产物。
利用经确认缺失了ilvBN基因的菌株，实施了将抗生素抗性标识基因剔除的过程。在此过程中，对ilvBN基因缺失菌株导入pCP20质粒(Cherepanov and Wackerneagel,1995；Datsenko and Wanner,2000)，诱导了FLP重组。然后，在添加或未添加抗生素的LB平板中培养ilvBN基因缺失菌株，确认了抗生素抗性标识基因被剔除。
在这里，PCR反应是如下进行的：总反应体积为50μl，以94℃1分钟循环1次后，以94℃30秒、55℃30秒、以及72℃2分钟循环共30次，然后72℃2分钟。
其中使用的引物序列如下述表1所示。
【表1】
实施例2.AHASⅡ的活性弱化的变异株制作
为了制作AHASⅡ的活性弱化的菌株，使用生产L-异亮氨酸的大肠埃希菌(Escherichia coli)DS44(保藏号KCTC11602BP)并通过一步失活方法(one stepinactivation；Warner et al.,PNAS,6:6640-6645(2000)使编码AHASⅡ的ilvGM基因(SEQID NO:5和7)缺失。
首先，利用ilvGM_F和ilvGM_R的引物对并以pKD13质粒(GenBank AY048744)为模板实施PCR反应，获得了片段。向E.coli DS44导入红色重组酶(red recombinase)质粒pKD46(GenBank AY048746)后，通过电穿孔法注入制作的PCR片段，筛选了具有卡那霉素(kanamycin)抗性的菌落。筛选的转化体利用ilvGM_CF和ilvGM_CR的引物对实施PCR反应，确认了ilvGM基因的缺失与否。插入有破坏用DNA的DS44ΔilvGM与预期一样生成了约2.6kb的产物，而DS44则生成了约3.3kb的产物。
利用经确认缺失了ilvGM基因的菌株，实施了将抗生素抗性标识基因剔除的过程。在此过程中，对ilvGM基因缺失菌株导入pCP20质粒，诱导了FLP重组。然后，在添加或未添加抗生素的LB平板中培养ilvGM基因缺失菌株，确认了抗生素抗性标识基因被剔除。
在这里，PCR反应是如下进行的：总反应体积为50μl，以94℃1分钟循环1次后，以94℃30秒、55℃30秒、以及72℃2分钟循环共30次，然后72℃2分钟。
其中使用的引物序列如下述表2所示。
【表2】
实施例3.AHASⅢ的活性弱化的变异株制作
为了制作AHASⅢ的活性弱化的菌株，使用生产L-异亮氨酸的大肠埃希菌(Escherichia coli)DS44(保藏号KCTC11602BP)并通过一步失活方法(one stepinactivation；Warner et al.,PNAS,6:6640-6645(2000)使编码AHASⅢ的ilvIH基因(SEQID NO:9和11)缺失。
首先，利用ilvIH_F和ilvIH_R的引物对并以pKD13质粒(GenBank AY048744)为模板进行PCR反应，获得了片段。向E.coli DS44导入红色重组酶(red recombinase)质粒pKD46(GenBank AY048746)后，通过电穿孔法注入制作的PCR片段，筛选了具有卡那霉素(kanamycin)抗性的菌落。筛选的转化体利用ilvIH_CF和ilvIH_CR的引物对实施PCR反应，确认了ilvIH基因的缺失与否。插入有破坏用DNA的DS44ΔilvIH与预期一样生成了约2.5kb的产物，而DS44则生成了约3.6kb的产物。
利用经确认缺失了ilvIH基因的菌株，实施了将抗生素抗性标识基因剔除的过程。在此过程中，对ilvIH基因缺失菌株导入pCP20质粒，诱导了FLP重组。然后，在添加或未添加抗生素的LB平板中培养ilvIH基因缺失菌株，确认了抗生素抗性标识基因被剔除。
在这里，PCR反应是如下进行的：总反应体积为50μl，以94℃1分钟循环1次后，以94℃30秒、55℃30秒、以及72℃2分钟循环共30次，然后72℃2分钟。
其中使用的引物序列如下述表3所示。
【表3】
实验例1.L-异亮氨酸生产能力评价
与亲本菌株进行比较，评价了实施例1至3中制作的大肠埃希菌变异株的L-异亮氨酸生产能力。
在5L的发酵槽中使用下述表4的用于异亮氨酸生产的注入培养基( )2L和追加培养基342mL，在培养温度30℃、搅拌速度500rpm、通气量1vvm的条件下进行培养。培养结束后，使用HPLC(Agilent)测定了培养基内与L-异亮氨酸一起的作为副产物生成的L-缬氨酸(L-valine)和AABA(L-α-aminobutyric acid，L-α-氨基丁酸)的浓度，将其结果示于下述表5。
【表4】
注入培养基 追加培养基
葡萄糖 80g/l 550g/l
玉米浸泡液 20g/l -
硫酸铵 20g/l 1g/l
磷酸 15g/l 1g/l
富马酸 1g/l -
谷氨酸钠 7g/l -
柠檬酸钠 1g/l -
胆碱-HCl 1g/l -
硫胺素-HCl 5㎎/l -
吡哆醇-HCl 10㎎/e -
烟酸 5㎎/l -
生物素 5㎎/l -
氯化钙 5㎎/l -
氯化钴 5㎎/l -
硫酸亚铁 20㎎/l -
硫酸锰 5㎎/l -
硫酸锌 5㎎/l -
硫酸铜 5㎎/l -
氢氧化钠 10g/l -
【表5】
如上述表5所示，AHASⅡ的活性弱化时(DS44ΔilvGM)，与亲本菌株相比，显示出L-异亮氨酸生产能力减少约44.2％，反而L-缬氨酸和AABA生产能力增加约两倍。
相反，AHASⅠ的活性弱化(DS44ΔilvBN)或AHASⅢ的活性弱化(DS44ΔilvIH)时，与亲本菌株相比，显示出L-异亮氨酸生产能力增加，同时L-缬氨酸和AABA的生产能力减少。具体而言，相较于DS44，DS44ΔilvBN和DS44ΔilvIH的L-异亮氨酸生产能力增加约11.9％和7.9％，L-缬氨酸/L-异亮氨酸(V/I)比率减少约41.6％和29.8％，AABA/L-异亮氨酸(AABA/I)比率减少约19％和20.6％。
这样的结果表明在L-异亮氨酸生物合成途径中，AHASⅠ或AHASⅢ的活性弱化诱导了L-异亮氨酸生产能力提高。
实施例4.AHASⅡ和Ⅲ的活性弱化的变异株制作
为了制作AHASⅡ和Ⅲ的活性弱化的菌株，使用实施例2的DS44ΔilvGM代替E.coliDS44，除此以外，通过与实施例3相同的方法进行。最终制作了ilvGM和ilvIH基因缺失的DS44ΔilvGMΔilvIH。
实施例5.AHASⅠ和Ⅲ的活性弱化的变异株制作
为了制作AHASⅠ和Ⅲ的活性弱化的菌株，使用实施例1的DS44ΔilvBN代替E.coliDS44，除此以外，通过与实施例3相同的方法进行。最终制作了ilvBN和ilvIH基因缺失的DS44ΔilvBNΔilvIH。
实施例6.AHASⅠ和Ⅱ的活性弱化的变异株制作
为了制作AHASⅠ和Ⅱ的活性弱化的菌株，使用实施例1的DS44ΔilvBN代替E.coliDS44，除此以外，通过与实施例2相同的方法进行。最终制作了ilvBN和ilvGM基因缺失的DS44ΔilvBNΔilvGM。
实验例2.L-异亮氨酸生产能力评价
与亲本菌株进行比较，评价了实施例4至6中制作的大肠埃希菌变异株的L-异亮氨酸生产能力。
用与上述实验例1相同的方法培养亲本菌株或变异株并测定了培养基内L-异亮氨酸、L-缬氨酸和AABA的浓度，将其结果示于下述表6。
【表6】
如上述表6所示，与亲本菌株相比，显示出AHASⅡ和Ⅲ的活性弱化(DS44ΔilvGMΔilvIH)或AHASⅠ和Ⅱ的活性弱化时(DS44ΔilvBNΔilvGM)，L-异亮氨酸生产能力减少，但相反，AHASⅠ和Ⅲ的活性弱化时(DS44ΔilvBNΔilvIH)，L-异亮氨酸生产能力提高，同时L-缬氨酸和AABA的生产能力减少。具体而言，相较于DS44，DS44ΔilvBNΔilvIH的L-异亮氨酸生产量增加了约14.9％，L-缬氨酸/L-异亮氨酸(V/I)比率减少了约75.5％，AABA/L-异亮氨酸(AABA/I)比率减少了约69.9％。
这样的结果表明AHASⅡ与AHASⅠ或AHASⅢ相比，对于L-异亮氨酸生物合成具有最优异的适合性。
实施例7.AHASⅠ和Ⅲ的活性弱化且AHASⅡ的活性增强的变异株制作
为了制作乙酰羟酸合成酶(AHAS)Ⅰ和Ⅲ的活性弱化且AHASⅡ的活性增强的菌株，使用生产L-异亮氨酸的大肠埃希菌(Escherichia coli)DS44(保藏号KCTC11602BP)并通过一步失活方法(one step inactivation；Warner et al.,PNAS,6:6640-6645(2000)使分别编码AHASⅠ和Ⅲ的ilvBN和ilvIH基因缺失，同时导入编码AHASⅡ的ilvGM基因。
首先，利用ilvIH_F和Ptrc+pKD13_R的引物对并以pKD13质粒(GenBank AY048744)为模板实施PCR反应，获得了片段。利用pTRC+ilvG_F和ilvIH+ilvM_R的引物对并以DS44genomic DNA为模板实施PCR反应，获得了片段。利用两个片段实施PCR反应，获得了一个DNA片段。对实施例1中制作的DS44ΔilvBN导入红色重组酶(red recombinase)质粒pKD46(GenBank AY048746)后，通过电穿孔法注入所制作的DNA片段，筛选了具有卡那霉素(kanamycin)抗性的菌落。筛选的转化体利用ilvIH_CF和ilvIH_CR的引物对实施PCR反应，确认了ilvIH基因的缺失与否以及ilvGM基因的导入与否。DS44ΔilvBNΔilvIH::Ptrc-ilvGM与预期一样生成了约4.5kb的产物，而DS44则生成了约3.6kb的产物。
利用经确认缺失了ilvBN和ilvIH基因并且导入了ilvGM基因的菌株实施了将抗生素抗性标识基因剔除的过程。在此过程中，对ilvBN和ilvIH基因缺失并且导入了ilvGM基因的菌株导入pCP20质粒，诱导了FLP重组。然后，在添加或未添加抗生素的LB平板中培养ilvBN和ilvIH基因缺失并且导入了ilvGM基因的菌株，确认了抗生素抗性标识基因被剔除。
在这里，PCR反应是如下进行的：总反应体积为50μl，以94℃1分钟循环1次后，以94℃30秒、55℃30秒、以及72℃2分钟循环共30次，然后72℃2分钟。
其中使用的引物序列如下述表7所示。
【表7】
实验例3.L-异亮氨酸生产能力评价
与亲本菌株进行比较，评价了实施例5和7中制作的大肠埃希菌变异株的L-异亮氨酸生产能力。
用与上述实验例1相同的方法培养亲本菌株或变异株并测定了培养基内L-异亮氨酸、L-缬氨酸和AABA的浓度，将其结果示于下述表8。
【表8】
如上述表8所示，在对ilvBN和ilvIH基因缺失而只表达AHASⅡ的菌株(DS44ΔilvBNΔilvIH)进一步增强AHASⅡ的表达时(DS44ΔilvBNΔilvIH::Ptrc-ilvGM)，与亲本菌株相比，表现出L-异亮氨酸生成能力进一步提高，L-缬氨酸和AABA的生成能力进一步减少。具体而言，相较于DS44ΔilvBNΔilvIH，DS44ΔilvBNΔilvIH::Ptrc-ilvGM的L-异亮氨酸生产量增加约20.7％，L-缬氨酸/L-异亮氨酸(V/I)比率减少77.2％。
到目前为止，对本发明围绕其优选的实施例进行了研究。本发明所属技术领域的技术人员可以理解本发明在不脱离本发明的本质性的特性的范围内可以以修饰的形态实现。因此，公开的实施例应从说明性的角度进行考虑而不是从限制性的角度进行考虑。本发明的范围显示在权利要求书中而不是上述的说明中，并且应被解释为在与其等同范围内的所有的差异包括在本发明中。
【保藏信息】
保藏机构名称：韩国典型培养物保藏中心(KCTC)
保藏号：KCTC11602BP
保藏日：20091120
生物材料的分类命名：大肠杆菌(Escherichia coli)。

Claims (6)

1.一种埃希菌属微生物，其乙酰羟酸合成酶Ⅲ的活性弱化或失活或者乙酰羟酸合成酶Ⅰ和Ⅲ的活性弱化或失活而L-异亮氨酸的生产能力得到提高。
2.根据权利要求1所述的埃希菌属微生物，其中，所述乙酰羟酸合成酶Ⅰ的活性弱化是通过编码乙酰羟酸合成酶Ⅰ的基因的核苷酸修饰、启动子修饰、或者它们的组合而实现的，
所述乙酰羟酸合成酶Ⅲ的活性弱化是通过编码乙酰羟酸合成酶Ⅲ的基因的核苷酸修饰、启动子修饰、或者它们的组合而实现的。
3.根据权利要求1所述的埃希菌属微生物，其中，所述埃希菌属微生物被进一步增强乙酰羟酸合成酶Ⅱ的活性。
4.根据权利要求3所述的埃希菌属微生物，其中，
所述乙酰羟酸合成酶Ⅱ的活性增强是通过编码乙酰羟酸合成酶Ⅱ的基因的核苷酸修饰、拷贝数增加、启动子修饰、导入、或者它们的组合而实现的。
5.根据权利要求1所述的埃希菌属微生物，其中，所述埃希菌属为大肠埃希菌(Escherichia coli)。
6.一种L-异亮氨酸的生产方法，其包括以下步骤：
在培养基中培养权利要求1所述的埃希菌属微生物的步骤；以及
从所述埃希菌属微生物或培养埃希菌属微生物的培养基中回收L-异亮氨酸的步骤。
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