CN1202246A - 荧光检测器 - Google Patents

Abstract

一种荧光检测方法和装置,用于检测一种诸如血液、尿液或唾液等的液态试样之中的生物活性,其中此试样和一种培养基被送入可密封容器之中并被暴露在使之能够在样本中存在微生物的情况下发生许许多多代谢、物理和化学变化的条件之下。在操作中,此检测方法和装置,以按照一对称方波周期性地打开和关掉的激发光线,照射一种在可密封的容器之中的化学敏感物质;分离测得的荧光光电流成为代表对称方波信号不同谐波的两个分量;测定两个分量的幅度;生成两个分量的比值;以及利用这一比值作为传感输出信号以表明生物活性。

Description

荧光检测器

本发明涉及广为多样的、基于荧光寿命变化的化学传感器。作为一项实例，本发明适用于无侵染性的、用于检测在诸如血液、尿液或唾液等液态试样之中的生物活性的装置和方法，其中此试样和一种培养基被送入可密封的容器中并被暴露在在样品中存在微生物的情况下能够发生许许多多代谢、物理和化学变化的条件之下。生物活性是基于荧光寿命方面的变化由一种化学传感器予以检测的。

通常，诸如细菌或霉菌等微生物在一种病人体液特别是血液之中的存在是利用培养玻璃瓶来予以确定的。少量的体液通过一密封橡胶隔膜注入一盛有某种培养基的无菌小瓶。此小瓶在一有助于细菌生长的温度下，比如37℃，予以培育并针对细菌生长接受监测。

各种已知的可起作用的方法可检测培养瓶之中CO₂含量的变化，CO₂是细菌生长的一种代谢副产品。近来，已经研制出一些自动的血液培养系统，它们利用设置在一玻璃瓶之内的各传感器。这种传感器往往通过改变它们的颜色或通过改变它们的荧光强度(请见比如美国专利第4945060号)来反映CO₂浓度的变化。出自这种传感器的输出基于光强度测定结果。

在各种已知的自动无侵染性血液培养系统中，各个光源、各个谱状激励和发射滤清器，以及各个光电检测器配置得靠近每一玻璃瓶。这些配置可导致从一瓶到下一瓶的某种测点灵敏度差异。由于大多数血液培养传感器只生成在细菌生长期间测得的光电流之中的一中度反差比值，所以需要多方和耗时的标定过程和精细的检测算法以运作这些系统。再有，必须采用具有极为狭窄的技术要求容差的光源、光谱过滤器，以及光电检测器。还可能在每一光源处使用所谓光源监测光二极管，但每一这种测定都导致成本增高。不过，即使如果确有可能均衡所有的玻璃瓶测点，也会保留某些在传感器组成方面的批量对批量的差异和某些瓶对瓶的几何差异。

这种以强度为基准的传感装置的缺点以通过采用可以改变自身荧光寿命的荧光传感器来予以克服，其中强度测定由时间参数测定来代替，而强度变化对于传感输出信号无任何影响。已知有许多化学传感物质，其荧光寿命随着改变氧浓度、pH值、二氧化碳浓度、或者其他一些化学参数而改变(请见比如英国专利第2132348)。

传感荧光寿命的变化通常通过应用一种熟知的相移方法(请见比如美国专利第5030420号)予以监测，其中激发光线是经过正弦型强度调制的。此方法可造成一种经过正弦型强度调制的荧光辐射，相对于激发相位是经过相移的。相移角θ按照方程：

tanθ＝ωτ    (1)依赖于荧光寿命τ，方程中ω＝2πf，是光调制角频率。

从方程(1)可见，相移法的缺点是显然的。如果乘积ωτ很小，则得出的相移θ也很小。这就限制了化学传感装置对于必须测定的被分析物的分辨率。为了克服这种分辨问题，人们或许可以增大调制频率。这样做会导致另一局限，即所得出的相移角受到紧缩，因为它们趋近70-90度范围。对于一单独的指数衰减型荧光团来说，最大可能的相移角是90度，甚至对于一无限长的荧光寿命也是如此。由于这些局限，一种基于相移方法的化学传感器的效能范围是有限的。

相移法的第二项缺点相关于以下事实，即电子电路会引入一依赖于光调制频率的附加相移。因而，通常的作法是，使用一种非荧光散射介质，以便确定电子相移，并且把此值从监测荧光时所观测到的值中减去。遗憾的是，电子相移可随时间改变。因而，散射测定必须予以重复，或者系统周期性地在荧光与散射测定之间切换。不过，这会导致传感装置更为复杂。

相移法的另一缺点是由以下事实造成的，即激发光线的相位可以相对于调制激励信号表现出某种偏移。这种人为现象发现于内部调制的激光，并且也发现于发光二极管、声  光调制器和发现于电光调制器。后果是，用于激发调制的相位信息不能从电子激励信号中推衍出来，而必须经由一辅助光电检测器予以测定。同样，这表示传感装置的复杂性增加。

相移法的又一缺点会出现在如果采用会经由寿命猝熄而发生反应的荧光团的情况之下。在此情况下，测得的相移与被分析物浓度之间的关系是一种非线性关系。换言之，一种低被分析物浓度的传感分辨率很高，但却随着被分析物浓度的增大而降低。这就限制了传感器的效能范围，并对于许多应用场合是不能接受的。

还可能通过测定由荧光团发出的荧光的调制程度来监测荧光寿命。在此情况下，与相移法之中一样，激发光线是经过正弦型调制的。这会造成一种经过正弦型调制的荧光发射，其中调制程度m_F取决于符合方程 $m_F=\frac{m_{\mathrm{EX}}}{\sqrt{1+{\left(\mathrm{\ω\τ}\right)}^2}}---\left(2\right)$ 的寿命，在方程(2)中，m_Ex是激发光源的调制程度。

一经过正弦型调制的信号的调制程度m定义为 $m=\frac{\mathrm{AC}}{\mathrm{DC}}---\left(3\right)$ 其中AC指的是随时间变化分量的峰对峰幅度的一半，而DC指的是由在至少一个正弦周期内取均值所获得的分量。实际上，这两个分量是通过分解光电检测器信号成为两个通道而被分离开来的。一个通道包括一高通滤清器并可测定AC分量。另一通道包括一低通过滤器并只测定DC分量。一比值器用以生成一传感输出信号AC/DC＝m。

这样一种调制方法在荧光传感装置中尚未找到实际应用，因为在光电检测器暗电流方面的任何变化或任何昼光漏入传感装置都会造成在测得的DC分量方面的某种变化。这当然会在传感输出信息方面生成某种误差。已经有人建议克服这一问题的办法是，把激发光源周期性地打开和关掉并从光源打开时测得的信号DC中减去光源关掉时测得的信号D_dark，以便算出校正过的信号D_corr，此信号随后用以算出真正的调制程度。这一校正过程需要附加的诸如一种同步式放大器等电子模块，并导致装置的复杂性增大。

一种可能的调制方法的第二项缺点是，方程(2)是高度非线性的。最佳传感分辨率只在一较窄的所谓频率寿命乘积ωτ的范围内获得。已经有人建议克服这一问题的办法是，以频率寿命乘积ωτ在τ正在变化时保持不变的方式来自动地调谐ω。不过，这样也导致复杂性显著增大。因而，有必要来克服已知各种传感方法的缺点。

本发明的目的是要克服先前技术的上述各种问题，方式是，提供一种基于荧光寿命变化的荧光检测器的配置和操作原理，其中达到关于被分析物的很高的效能范围，其中传感分辨率几乎不依赖于被分析物浓度，其中光电检测器暗电流方面的变化或漏入装置的光强度方面的变化对于传感输出信号无任何影响，而结构简单以致可以低成本生产。

按照本发明，以上目的的达到借助于一种装置和方法，用于以按照一对称方波周期性地予以打开和关掉的激发光照射一种化学传感物质；把测得的荧光光电流分解成为两个代表方波信号不同谐波的AC分量；测定两个分量的幅度；生成两个分量的比值；以及使用这一比值作为传感输出信号。

通过采用基于荧光寿命变化的化学传感器，在传感器组成方面的与生产有关的批量与批量之间的差异、传感器位置上的微小变化、光源强度方面的变化、光学过滤器特性方面的变化，以及光电检测器方面的灵敏度变化，都对传感输出信号没有影响。因而，本发明为简化的传感算法和仪器的优良长期稳定性创造了条件。最后，为操作传感器所需要的光学和电子零部件的数量被减至最低限度，与已知的基于荧光寿命的传感装置相比，这一点具有降低成本的效用。

本发明的这些和其他一些特点、目的、益处和优点，在结合各图连同所附各项权利要求一起阅读各项优先实施例的以下详细说明之后，会变得更为明显，各图中的各附图标记标明相应的各零部件。

图1表明一种符合本发明的荧光检测器结构；

图2是一曲线图，表明对于一荧光团的第三和第一谐波的比值与氧浓度的相互关系，此荧光团以一方波调制光强予以照射并按照一种斯特恩-活默(Stern-Volmer)关系予以猝熄；

图3是一曲线图，表明一100kHz方波的第一、第三和第五谐波的各相对幅度和可能的各带通滤光器传输曲线；

图4是一曲线图，表明第五和第一谐波的比值与氧浓度的相互关系；

图5是一曲线图，表明第一和第五谐波的比值与氧浓度的相互关系；以及

图6是一曲线图，表明一荧光团的第一和第五谐波(harmonic)的比值与荧光寿命的相互关系，此荧光团以一方波调制光强予以照射并具有取决于任何传感输入的一种荧光寿命。

一种体现本发明的各项原理和概念的荧光检测装置示意性地画在图1之中。在此装置中，试样和一培养基4被送入一透光容器1，容器由一器盖2密封起来。一种荧光化学传感材料3配置在容器1的内壁或内部底面并由一种激发光源5，最好是由一蓝或绿光发射二极管(“LED”)，予以照射。光源5连接于一电子信号源6，此电信号源可提供一种对称的方波信号，这种信号在断开“零(ZERO)”和接通“高(HIGH)”两种状态之间转换。

从传感材料3重新射出的荧光借助于诸如一种光电倍增器等光检测器予以检测。一发射过滤器(emission filter)7配置在传感材料3与光检测器8之间，以便剔除反向散射的(back-scattered)激发光线。光检测器8的信号输出被馈送至一功率分配器9。功率分配器9的一个输出连接于一第一带通滤光器(bandpass filter)10的输入。过滤器10的输出经由一第一高频伏特计11连接于一A/B比值器(ratio unit)12的B输入。第一带通滤光器10调谐到由信号源6发送的方波频率的一谐波。功率分配器9的另一输出连接于一第二带通滤光器13的输入。过滤器13的输出经由一第二高频伏特计14连接于A/B比值器12的A输入。第二带通滤光器13调谐到由信号源6发送的方波频率的另一谐波。最后，比值器12的输出通道连接于一信号记录器15。

在操作中，光源5以具有一时间相关性激发光强E(t)的方波调制激发光线照射化学传感材料3，E(t)状为 $E\left(t\right)=\frac{2\mathrm{\α}}{\mathrm{\π}}[\frac{c}{2}+\underset{k=1}{\overset{\∞}{\mathrm{\Σ}}}\frac{\sin \left(\mathrm{kc}\right)}{k}\cos \left(\mathrm{k\ωt}\right)]---\left(4\right)$ 其中t是时间，a是方波幅度，c描述占空比，而ω是方波频率。如果我们采用一对称的方波，c＝π/2，所有的偶次谐波等于零，而方程(4)写为 $E\left(t\right)=a[\frac{1}{2}+\frac{2}{\mathrm{\π}}\cos \left(\mathrm{\ωt}\right)-\frac{2}{3\mathrm{\π}}\cos \left(3\mathrm{\ωt}\right)+\frac{2}{5\mathrm{\π}}\cos \left(5\mathrm{\ωt}\right)-\…]---\left(5\right)$

重新发射的荧光强度E(t)在时域内具有一相当复杂的历程。不过，通过把第一和第二带通滤光器调谐到方波信号的各不同谐波，可以生成两个AC光电流分量，它们是正弦式调制的，并且不含一DC偏流。如果第一带通滤光器调谐到第一谐波，而第二带通滤光器调谐到第三谐波，比值器12的输出信号R由以下方程(6)给出： $R(\mathrm{\ω},\mathrm{\τ})=\frac{1}{3}\sqrt{\frac{1+{\left(\mathrm{\ω\τ}\right)}^2}{1+{\left(3\mathrm{\ω\τ}\right)}^2}}---\left(6\right)$ 作为一项实例，我们假定一荧光团，具有按照斯特恩-活默定律取决于氧‘O’浓度的寿命τ $\mathrm{\τ}\left(O\right)=\frac{{\mathrm{\τ}}_o}{1+\mathrm{qO}}---\left(7\right)$ 其中q是一猝熄常数。

图2描绘了对于τ_o＝4.74微秒和q＝0.297％的荧光团第三和第一谐波的比值R31与氧浓度之间的关系，此荧光团用一方波调制光强予以照射并按照斯特恩-活默关系予以猝熄。三条曲线分别对应于30、100和300kHz的方波频率。从此图中可以看出，通过选定一最佳ω，可以建立R31与O之间的大致线性关系。

图3表明对于一100kHz对称方波信号的第一、第三和第五谐波的各相对幅度。此图表明，即使是第五谐波也具有一充分高的幅度。此图还表明，各带通滤光器不需要具有一高Q值，因为第二和第四谐波是不出现的。

图4描述了对于与图2中同样的荧光团第五和第一谐波的比值R51与氧浓度之间的关系。三条曲线分别对应于20、80和240kHz的方波频率。一如图2，通过选定一最佳ω，可以建立R51与O之间的大致线性关系。采用第五和第一谐波导致高与低氧浓度之间的一较高的反差。

如已经提及的那样，大多数已知血液培养系统检测各培养瓶的二氧化碳含量的变化，它是细菌生长的一种代谢副产物。由于历史原因，显示一种随时间增大的信号的生长曲线受到偏爱。另外，已经开发了许多适应于各种正(positive-going)生长曲线的精细检测算法。

如果氧消耗用来检测微生物的存在，则图4中的比值R51会在一高水平上开始，并会随后降至一低水平。因此，可能比较实用的是计算比值R15，作为耗氧的结果，此比值显示出随时间而增大。图5分别描绘了80、120和160kHz的方波频率的R15，采用与图2和4中同样的荧光传感器。

应当理解，本发明的范畴并不限于那些由一种被分析物按照示于方程(7)的斯特恩活默定律来予以猝熄的荧光团。图6描绘了对于一种以一方波调制光强予以照射并具有取决于任何传感输入(sensor input)的荧光团的第一和第五谐波的比值R15与荧光寿命的相互关系。三条曲线分别对应于10、40和200kHz的方波频率。不过，同样的各曲线会仍然适用，如果荧光寿命是在毫微秒范围之内。在此情况下，所指出的各方波频率会在兆赫的范围之内。如图2和4之中那样，在传感输出信号与输入之间可以建立大致线性的关系。在图6中，我们假定荧光寿命是线性依赖于被分析物的。

符合本发明的一种荧光检测器比起先前技术中的常用装置来具有一些重要的优点。通过测定两个不同的AC分量，而不是测定一个AC分量和DC分量，消除了光检测器暗电流变化的影响以及昼光漏入到装置里面的影响。此外，通过选定一最佳方波频率，传感输出信号与被分析物浓度之间的关系可以“处理”成为一大致的线性关系，以致传感器分辨率变得不依赖于被分析物浓度。对于遵循典型的斯特恩-活默猝熄关系式的各种传感材料，这种线性化是可以达到的，但对于其他一些传感材料也是如此。

一种符合本发明的荧光检测器不受以下各种变化的影响，即：激发光源强度的变化，试样容器位置的微小变化，发射过滤器特性的变化，或者光检测器灵敏度的变化。这是由于，所有这些人为现象对于被选定并因而由比值器12予以删除的两个谐波具有同样的影响。

众所周知，荧光传感器生产过程中批量与批量之间的各种差异可能对于荧光强度具有主要的影响。传感材料之内的染料浓度方面的各种差异是一项主要原因。不过，关于荧光寿命就不是这种情况，因为寿命对于浓度差异要不敏感得多。于是，一种符合本发明的光学传感器为高可靠性、绝对校准和长期稳定性提供了绝好机会。如果此种传感器用以监测那些需要延及许多天的异常长期观测的肺结核(“TB”)试样，这一点尤其重要。甚至有可能在一些小型搁架上配置很大数量的试样容器。这些搁架的撤除和随后重新位置略有不同地置入一荧光读出器不会造成信号差异。

本发明的范畴也不限于对称的方波信号。其他一些c小于或小于π/2的非对称方波及各种周期性非方波信号也都可以适用。不过，对称方波信号是一优选方案，因为它表现出以下各项优点。

首先，一种方波信号可以最易生成而具有高精度且需要最少的电子线路。

其次，对于一种对称方波，所有偶次谐波等于零。这导致相邻谐波之间具有大的频率差并允许使用低Q值的带通滤光器，它们在长时间内是比较稳定的。

第三，激发光线的调制程度是界限分明的(well-defined)并且是不随时间变动的。因而，不需要光源监测器来确保激发光源仍然是经过良好调制的。这第二方面对于进行AC和DC测定的常用调制检测装置具有更大的重要性，在这种装置中，实际的光源调制对于传感输出信号具有直接的影响。如果一偏置正弦信号用来调制光源，则AC/DC比值的任何漂移将在传感输出信息方面造成误差。不过，一种符合本发明的荧光检测器可摆脱这种问题。

第四，一种对称方波在第五、第三和第一谐波之间形成一合理比值，同时代表一种无危险的驱动(driving)模态。假如人们使用一些较短的脉冲，则三个谐波之间的幅度比就会较好地得到均衡。不过，方程(4)中的一降低的c可导致所有各谐波的较低的信号幅度。信号幅度方面的降低可通过使一LED脉动到高得多的正向电流，亦即通过增大方程(4)中的量a，而予以补偿。这样做，损坏LED的危险迅速增大并对于整个检测装置的寿命期望值具有某种负面影响。

最后，本发明的范畴不限于使用LED。本发明也可在使用二极管激光(diode laser)、内部或外部调制的激光或其他光源时应用。

如果一种化学传感物质用按照一对称方波周期性予以打开和关掉的激发光线予以照射，则可给出本发明的一种改型，测得的荧光光电流在一计算机内进行分析，它以数字方式把接受到的信号分离成为两个代表方波信号的不同谐波的AC分量，计算两个分量的幅度，并生成两个分量的比值，从而这一比值用作传感输出信号。

应当理解，上述实施例是一种体现本发明的各项原理和概念的装置的简单例证。当然，其他一些适当的变更和修改也可对于上述装置和方法作出而依然保留在本发明的范畴之内。

Claims (14)

1.一种用于检测一容器内的微生物生长的装置，该容器具有一种培养基、一种试样和一种化学敏感物质，所述装置包括：

一激发光源，用于以按照在状态“零”和“高”之间的一方波进行强度调制的光照射化学敏感物质，以便使化学敏感物质响应由血样中的微生物生长所生成或消耗的气体发射一种荧光；

用于检测从化学敏感物质发出的荧光的装置；

用于生成一种代表由所述检测装置所检测的荧光的电输出信号的装置；

一第一带通滤光器，调谐到强度调制光的一个谐波，用于过滤输出信号成为一第一过滤信号B；

一第二带通滤光器，调谐到强度调制光的另一谐波，用于过滤输出信号成为一第二过滤信号A；

用于通过第二过滤信号A除以第一过滤信号B而算出A/B比值的装置；以及

用于生成一代表算出的A/B比值的传感输出信号的装置。

2.按照权利要求1所述的装置，其中，所述荧光检测装置是一光电检测器。

3.按照权利要求1所述的装置，还包括一发射过滤器，配置在化学敏感物质与所述荧光检测装置之间以剔除从容器反向散射的任何强度调制光。

4.按照权利要求1所述的装置，其中，所述第一带通滤光器所调谐到的所述谐波是强度调制光的一第一谐波，而所述第二带通滤光器所调谐到的所述谐波是强度调制光的一第三谐波。

5.按照权利要求1所述的装置，其中，所述第一带通滤光器所调谐到的所述谐波是强度调制光的一第一谐波，而所述第二带通滤光器所调谐到的所述谐波是强度调制光的一第五谐波。

6.按照权利要求1所述的装置，其中，所述第一带通滤光器所调谐到的所述谐波是强度调制光的一第三谐波，而所述第二带通滤光器所调谐到的所运谐波是强度调制光的一第一谐波。

7.按照权利要求1所述的装置，其中，所述第一带通滤光器所调谐到的所述谐波是强度调制光的一第五谐波，而所述第二带通滤光器所调谐到的所述谐波是强度调制光的一第一谐波。

8.按照权利要求1所述的装置，其中，所述方波是一关于时间的对称方波。

9.按照权利要求1所述的装置，其中，所述方波是一关于时间的非对称方波。

10.一种用于检测一容器内的微生物生长的方法，该容器具有一种培养基、一种试样和一种化学敏感物质，所述方法包括以下各步骤：

以按照在状态“零”和“高”之间的一方波进行强度调制的光照射一容器之中的一化学敏感物质，以便使化学敏感物质响应由血样中的微生物生长所生成或消耗的气体发射一种荧光；

检测化学敏感物质响应于激发光而发出的荧光；

生成一种基于测得的荧光的光电流；

将光电流分离成为代表强度调制光的不同谐波的一第AC分量和一第二AC分量；

测定出自第一AC分量的一第一幅度和出自第二AC分量的一第二幅度；以及

生成一代表第一和第二幅度分量的比值的传感输出信号。

11.按照权利要求10所述的方法，还包括过滤发自化学敏感物质的荧光以剔除从容器反向散射的任何强度调制光的步骤。

12.按照权利要求10所述的方法，其中，所述方波是一关于时间的对称方波。

13.按照权利要求10所述的方法，其中所述方波是一关于时间的非对称方波。

14.一种用于检测一容器内的微生物生长的装置，该容器具有一种培养基、一种试样和一种化学敏感物质，所述装置包括：

一激发光源，用于以一种经过周期性地强度调制的光照射化学敏感物质，以使化学敏感物质响应由血样中的微生物生长所生成或消耗的气体发射一种荧光；

用于检测从化学敏感物质发出的荧光的装置；

用于生成一种代表由所述检测装置所检测的荧光的电输出信号的装置；

一第一带通滤光器，调谐到强度调制光的一个谐波，用于过滤输出信号成为一第一过滤信号B；

一第二带通滤光器，调谐到强度调制光的另一谐波，用于过滤输出信号成为一第二过滤信号A；

用于通过第二过滤信号A除以第一过滤信号B而算出A/B比值的装置；以及

用于生成一代表算出的A/B比值的传感输出信号的装置。

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