CN119613552B - 一组抗人gpc3纳米抗体突变体及嵌合抗原受体和应用 - Google Patents

一组抗人gpc3纳米抗体突变体及嵌合抗原受体和应用

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Abstract

本发明公开了一组抗人GPC3纳米抗体突变体及嵌合抗原受体和应用，属于免疫技术领域。本发明提供了一组抗GPC3的纳米抗体突变体，对现有的抗CPG3纳米抗体(NH3)进行突变，从而提高抗体的亲和力。本发明还基于所述纳米抗体突变体构建了嵌合抗原受体，同时合成了所述纳米抗体突变体的双链DNA作为体外转录生产mRNA的模板，再利用所述mRNA对NK细胞进行基因工程改造，从而得到CAR‑NK细胞。本发明所述CAR‑NK细胞中，mRNA均可以在NK细胞上有效表达CAR分子，并具有更强烈的体外杀伤能力，表现出更好的抗肝癌效果。

Description

一组抗人GPC3纳米抗体突变体及嵌合抗原受体和应用
技术领域
本发明属于免疫技术领域，具体涉及一组抗人GPC3纳米抗体突变体及嵌合抗原受体和应用。
背景技术
Glypian-3(GPC3)是一种硫酸肝素蛋白聚糖(HSPG)，由580个氨基酸组成的65kD蛋白质。GPC3蛋白通过glycosylphosphatidylinositol(GPI)锚连接到细胞膜，14个保守半胱氨酸残基，最后50个残基由硫酸肝素(HS)侧链修饰。这种蛋白质在健康胎儿的肝脏和肾脏中表达，但在成人中除了胎盘组织其它组织几乎不表达。有研究表明GPC3在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)、卵巢透明细胞癌、黑色素瘤、肺鳞状细胞癌、肝母细胞瘤、肾母细胞瘤(Wilms瘤)、卵黄囊瘤和一些儿科癌症中特异性表达。尽管GPC3的确切功能尚不清楚，但已强烈暗示其与HCC的恶变有关。因此，GPC3被确定为癌症免疫治疗的有希望的靶点。
1989年，著名科学家Gross G、Waks T和EshharZ在一项研究中，将表达特定抗体的基因序列赋予细胞毒性T细胞，这使得T细胞实现了抗原特异性的、非MHC限制的活化及其效应的增强。他们认为：“赋予T细胞一个嵌合的抗原受体，将是未来人类对抗肿瘤的一种重要途径。”这便是人类历史上，首次提出CAR这一概念。CAR-T治疗又称嵌合抗原受体(CAR)T细胞治疗，是将人的T细胞经过基因工程手段体外修饰改造后，回输患者体内，用于治疗疾病。
然而随着研究的深入和临床应用的不断增多，CAR-T治疗过程中所产生的弊端也逐渐被认识和关注，如移植物抗宿主反应、细胞因子风暴和神经毒性、对实体肿瘤的耐受性与抗性、工艺复杂性、个性化定制和较长的生产周期以及昂贵的治疗费用等。自然杀伤(natural killer，NK)是机体固有的免疫系统组成部分，在机体抗肿瘤免疫监视过程中发挥着重要作用。Dario Campana等人在2005年首次建立了PB-NK细胞平台，并首次成功将CAR结构导入原代NK细胞中。
CAR-NK细胞比CAR-T细胞具有多个优势：与CAR-T细胞不同，CAR-NK细胞保留了通过其天然受体识别和靶向肿瘤细胞的内在能力，从而通过CAR-NK靶向治疗时，肿瘤细胞能够逃脱杀伤的可能性降低；CAR-NK细胞在数天至数周内不会发生免疫排斥反应。因此，它们在许多临床试验中均未表现出CAR-T的安全问题，例如没有细胞因子释放综合征的困扰；NK细胞不需要严格的HLA匹配，并且没有引起移植物抗宿主病的潜力，这却是CAR-T细胞免疫疗法一种重要的风险。
何苗壮等人在CN 105968209A中公开了一种抗GPC3的纳米抗体，但其亲和力较低，后续应用受限。
发明内容
本发明提供了一组抗人GPC3纳米抗体突变体及嵌合抗原受体和应用，所述纳米抗体突变体与靶标具有更强的结合能力，更适合CAR-NK技术的应用。
本发明提供了一组抗GPC3的纳米抗体突变体，所述纳米抗体突变体较所述抗GPC3的纳米抗体具有更高的GPC3亲和力；
所述抗GPC3的纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示。
优选的，所述纳米抗体突变体包括以下任一种：氨基酸序列依次如SEQ IDNo.1～SEQ ID No.4所示的突变体1-2、突变体2-2、突变体3-2和突变体4-2。
优选的，所述纳米抗体突变体的核苷酸序列依次如SEQ ID No.5～SEQ IDNo.8所示。
本发明还提供了基于上述纳米抗体突变体的靶向GPC3的嵌合抗原受体。
优选的，所述嵌合抗原受体的结构，包括依次连接的信号肽、抗体区、铰链区、跨膜区和胞内区。
优选的于，所述信号肽的来源包括人CD8a信号肽；
所述抗体区包括一条突变体序列或利用柔性连接肽连接的两条突变体序列；
所述铰链区的来源包括人IgG4或人CD8a；
所述跨膜区的来源包括人CD28或人CD8a；
所述胞内区的来源包括人41BB或CD3。
本发明还提供了利用上述嵌合抗原受体的核苷酸扩增得到的线性双链基因，所述扩增用的引物包括核苷酸序列如SEQ ID No.11所示的上游引物和SEQ ID No.12所示的下游引物。
本发明还提供了利用上述线性双链基因为模板经体外转录得到的mRNA。
本发明还提供了一种基因工程改造的CAR-NK细胞，所述CAR-NK细胞由上述mRNA转化NK细胞后得到，并表达上述纳米抗体突变体。
本发明还提供了上述纳米抗体突变体或上述嵌合抗原受体或上述CAR-NK细胞在制备治疗患有表达GPC3的癌症的受试者的药物中的应用。
有益效果：本发明提供了一组抗GPC3的纳米抗体突变体，对现有的抗CPG3纳米抗体(NH3)进行突变，从而提高抗体的亲和力，实施例中利用4个突变后的抗GPC3抗体与NH3母本抗体(1-2、2-2、3-2、4-2和NH3母本抗体)进行比较，1-2、2-2、3-2三个抗体的EC50值均较母本抗体NH3低，表示具有更强的结合能力。
本发明还基于所述纳米抗体突变体构建了嵌合抗原受体，同时合成了所述纳米抗体突变体的双链DNA作为体外转录生产mRNA的模板，再利用所述mRNA对NK细胞进行基因工程改造，从而得到CAR-NK细胞。本发明所述CAR-NK细胞中，mRNA均可以在NK细胞上有效表达CAR分子，并具有更强烈的体外杀伤能力，表现出更好的抗肝癌效果。
附图说明
图1为用于制备突变抗体文库的引物设计原理图；
图2为抗GPC3的纳米抗体突变体的小量诱导表达结果图；
图3为ELISA检测抗GPC3抗体的亲和力测定结果图；
图4为GPC3蛋白与抗体NH3亲和力信号图；
图5为GPC3蛋白与抗体1-2亲和力信号图；
图6为GPC3蛋白与抗体2-2亲和力信号图；
图7为GPC3蛋白与抗体3-2亲和力信号图；
图8为GPC3蛋白与抗体4-2亲和力信号图；
图9为基于1-2抗体序列制备的CAR-NK细胞表达结果图；
图10为基于1-2抗体的CAR-NK体外杀伤能力检测结果图；
图11为本发明抗体文库氨基酸序列的结构图。
具体实施方式
本发明提供了一组抗GPC3的纳米抗体突变体，所述纳米抗体突变体较所述抗GPC3的纳米抗体具有更高的GPC3亲和力；
所述抗GPC3的纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示。
本发明所述抗GPC3的纳米抗体已公开在中国专利CN105968209A中，本发明优选基于所述抗GPC3的纳米抗体(母本NH3抗体)设计了突变文库并筛选获得了四种突变抗体，克隆号分别为：1-2、2-2、3-2和4-2，其序列分别如表1所示。
表1抗体的氨基酸序列和核苷酸序列
抗体代号 氨基酸序列 基因序列
NH3 SEQ ID No.9 SEQ ID No.10
1-2 SEQ ID No.1 SEQ ID No.5
2-2 SEQ ID No.2 SEQ ID No.6
3-2 SEQ ID No.3 SEQ ID No.7
4-2 SEQ ID No.4 SEQ ID No.8
本发明还提供了基于上述纳米抗体突变体的靶向GPC3的嵌合抗原受体。
本发明所述嵌合抗原受体的结构，优选包括依次连接的信号肽、抗体区、铰链区、跨膜区和胞内区；其中，所述信号肽的来源优选包括人CD8a信号肽，氨基酸序列如SEQ IDNo.79所示，核苷酸序列如SEQ ID No.84所示；所述抗体区优选包括一条突变体序列或利用柔性连接肽连接的两条突变体序列；所述铰链区的来源优选包括人IgG4或人CD8a，其中IgG4的铰链区的氨基酸序列如SEQ ID No.80所示，核苷酸序列如SEQ ID No.85所示，CD8a的铰链区的氨基酸序列如SEQ ID No.81所示，核苷酸序列如SEQ ID No.86所示；所述跨膜区的来源优选包括人CD28或人CD8a，其中CD28的跨膜区的氨基酸序列如SEQ IDNo.82所示，核苷酸序利如SEQ ID No.87所示，CD8a的跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID No.83所示，核苷酸序列如SEQ ID No.88所示；所述胞内区的来源优选包括人41BB和人CD3，其中41BB的氨基酸序列如SEQ ID No.89所示：KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL；人CD3的氨基酸序列如SEQ ID No.90所示：RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQR RKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTY DALHMQALPPR；实施例中同时包括两者，氨基酸序列如SEQ ID No.91所示，核苷酸序列如SEQ ID No.92所示。
本发明实施例中经验证，发现突变体1-2具有最佳的亲和力，因此基于突变体1-2的靶向GPC3的嵌合抗原受体，其中抗体片段可以使用一次，也可以头尾相接使用两次，两个抗体片段直接以柔性连接肽进行连接，并将上述结构进行依次串联，即可得到本发明所述嵌合抗原受体。本发明实施例中基于突变体1-2的靶向GPC3的嵌合抗原受体的各结构的氨基酸序列和核苷酸序列如表2和表3所示，但不能仅将其认定为本发明得全部保护范围。
表2CAR-NK的结构序列(氨基酸)
表3CAR-NK的结构序列(核苷酸)
本发明还提供了利用上述嵌合抗原受体的核苷酸扩增得到的线性双链基因，所述扩增用的引物包括核苷酸序列如SEQ ID No.11所示的上游引物和SEQ ID No.12所示的下游引物。
本发明优选将表3中的序列串联后，委托金唯智生物进行4种结构的线性双链基因合成(minigene)，并通过上游引物和下游引物进行PCR扩增；PCR扩增后会产生含有T7启动子(SEQ ID No.93：TAATACGACTCACTATAA)和kozac序列(gccacc)以及多聚腺苷酸尾巴(85个腺苷酸重复)的双链DNA，可作为进一步体外转录生产mRNA的模板。
上游引物(SEQ ID No.11)：taatacgactcactataagccaccATGGCCCTGCCCGTGACC；
下游引物(SEQ ID No.12)：ttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttCCTTGGAGGCAGGGC CTGCATG。
本发明还提供了利用上述线性双链基因为模板经体外转录得到的mRNA。
本发明优选采用体外转录试剂盒将上述得到的线性双链基因反转录为mRNA。
本发明还提供了一种基因工程改造的CAR-NK细胞，所述CAR-NK细胞由上述mRNA转化NK细胞后得到，并表达上述纳米抗体突变体。
本发明将所述mRNA转化NK细胞，实施例中优选采用电转的方法完成所述转化。
本发明还提供了上述纳米抗体突变体或上述嵌合抗原受体或上述CAR-NK细胞在制备治疗患有表达GPC3的癌症的受试者的药物中的应用。
本发明实施例中，四种CAR结构设计的mRNA均可以在NK细胞上有效表达CAR分子，并增强体外杀伤能力，具有强烈的抗肝癌作用。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一组抗人GPC3纳米抗体突变体及嵌合抗原受体和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1、引物的合成和PCR拼接
根据中国专利CN105968209A中NH3抗体和其核苷酸序列，设计六组简并引物并进行混合(每条引物每反应10pM)，从而基于桥接PCR反应以拼接全长序列，拼接PCR策略如图1所示。
第一组1条引物(SEQ ID No.13)；
第二组28条引物(SEQ ID No.14～SEQ ID No.41)；
第三组15条引物(SEQ ID No.41～SEQ ID No.56)；
第四组1条引物(SEQ ID No.57)；
第五组15条引物(SEQ ID No.58～SEQ ID No.72)；
第六组1条引物(SEQ ID No.73)。
所有引物委托金唯智生物技术有限公司合成，合成后通过脱盐纯化规格交付，交付时溶解于水，浓度为10μM。
利用PCR酶试剂盒(品牌：东洋纺，聚合酶KOD MAX)，参考其说明书混合包括六组引物在内的各组分并扩增pUCG3载体，以获得线性化的片段。简言之，反应体系中包含了三步，第一步为98℃10秒的初始变性步骤；第二步进行35个循环扩增步骤，每个循环包括98℃10秒的变性，68℃45秒的退火，68℃1分钟的延伸；最后进行了1个68℃1分钟的最终延伸步骤。以琼脂糖凝胶电泳法分离核酸，并对切割的目标序列进行回收备用。
通过基因合成方法获得pUCG3质粒，并小量抽提备用(委托金唯智生物技术有限公司)。pUCG3质粒全序列为SEQ ID No.74；最终拼接后，文库基因序列为SEQ ID No.75，抗体文库氨基酸序列的结构图优选如图11所示。
2、突变抗体基因文库质粒构建
使用pUCG3vector-F(SEQ ID No.76：GGTGGCAGCGATTACAAGGATGACGATGACAAG)引物和pUCG3vector-R(SEQ ID No.77：GGCCATCGCCGGCTGGGCCGCGAG)引物，参考PCR酶试剂盒(东洋纺KOD MAX)的说明书扩增pUCG3载体，以获得线性化的片段。扩增程序设定为：98℃预变性10秒；35个扩增循环，每个循环包括98℃变性10秒，68℃退火45秒，68℃延伸1分钟；68℃再延伸1分钟。获得的片段序列为SEQ ID No.78。
同时，参考说明书，利用同源重组试剂盒(诺唯赞品牌，货号C112)将GPC3突变库片段与载体连接：向PCR管中加入了pUCG3线性载体(2000ng)、GPC3突变库(400ng)、5×CEbuffer、Exnase II酶，以水补足到最终体积400μl，置于37℃下反应15分钟。将反应后产物使用核酸纯化试剂盒(DP214)回收。全部核酸用于电转17支TG1感受态，除计算文库大小外，所有菌液平均分于17块平板，培养过夜。次日收集菌板上全部菌落，以每支1ml冻存为10支冻存管；
3、噬菌体展示与淘选
复苏冻存的菌液一支，取60μL加入30ml含有氨苄青霉素和葡萄糖的2×YT(2xYTAG)培养基中，200转/分钟，直至OD600＝0.75时，加入辅助噬菌体M13K07(临界点品牌，货号P006)至终浓度为1×109TU/ml，200转/分钟，37℃，1h；3500转/分钟离心得沉淀，重悬于30ml 2×YT+Amp+Kan培养基中(无糖)，震荡恒温过夜培养；
次日离心收集培养上清，取100μL噬菌体上清进行筛选(固相淘选)。首先加900ul含5％脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液于噬菌体上清，并孵育1小时。进一步将噬菌体上清与酶标板固定化的GPC3抗原孵育(每个孔包被0.5μg蛋白，每次使用8孔)2小时，未结合的噬菌体通过10次磷酸盐缓冲液清洗步骤去除。随后，用胰蛋白酶溶液(0.01％)洗脱特异性结合的噬菌体。将洗脱液完全加入10ml大肠杆菌TG1中进行侵染。所有菌液平均分于3块平板，培养过夜后分装冻存为2支冻存管。以上步骤循环操作，共3轮。
4、序列分析和Phage ELISA验证
利用Phage ELISA实验鉴定筛选后的抗体克隆。从GPC3文库各次筛选后过夜培养的平板上随机挑选96个单克隆，分别加入每孔，补足1ml 2×YTAG液体培养基，以37℃、200转/分钟培养5.5小时。随后，每孔加入109TU的辅助噬菌体，继续培养0.5小时。随后，将96深孔板以3500转/分钟离心5分钟后弃上清，然后每孔添加1ml 2×YT液体培养基，震荡培养过夜。
次日取出预先包被GPC3蛋白的酶标板(10ng/孔)，向每个孔中添加250μL的PBS封闭液(含5％的脱脂牛奶)，封闭1小时。同时，离心取昨天拯救的96深孔板中的噬菌体上清100μL，转移到新的96孔板中，每个孔添加等量封闭液处理1小时。ELISA板用TBST清洗3次，300μL/孔，间隔1min。加入50μL噬菌体/孔，室温孵育1h，再次用TBST清洗。每孔加50μL稀释1:10000的anti-M13-HRP，室温孵育1h，TBST清洗3次。每孔加50μL TMB显色液，避光20min，终止显色，读吸光度450nm。
取Phage ELISA阳性孔的对应单克隆菌液，送金唯智生物有限公司进行基因测序。针对第二轮和第三轮筛选的基因测序结果，进行交叉比对，选择出现频率最高的4个克隆(1-2、2-2、3-2、4-2)，参考试剂盒说明书((诺唯赞品牌，货号C112))通过同源重组技术分别克隆到原核表达质粒中。
5、抗GPC3抗体小量诱导表达纯化
取4个克隆(1-2、2-2、3-2、4-2)的对应表达质粒，并将其转化到表达感受态W3110(DE3)中，并涂布培养平板进行过夜培养。随后，在各抗体表达菌种的平板上挑取2个单克隆进行摇菌培养并检测浊度(通过紫外分光光度法监测600nm波长的吸光度，OD600)，直到OD600值在0.5～0.8之间时进行诱导表达(终浓度1mM IPTG)。随后，将菌液在37℃、150转/分钟的条件下进行过夜培养，离心收集过夜培养的菌液上清。
参考填料(Ni Sepharose excel)说明书进行菌液上清亲和纯化。表达上清中加入benzonase，并进行混匀。以PBS平衡填料。随后，将每个单克隆的上清取样备用，并将剩余的上清与平衡后的填料混合孵育1小时。孵育完成后，将填料加入重力柱空柱管，并收集流穿后的上清用于后续分析。在流穿完成后，利用500mM的咪唑洗脱蛋白。通过超滤管将洗脱后的蛋白置换到PBS中，并通过SDS-PAGE蛋白电泳考马斯亮蓝染色对蛋白质进行检测。将染色后的蛋白凝胶进行清洗，并进行拍照记录(图2)。纯化后的样品即可进行后续应用。
6、利用常见的间接ELISA法测定抗体突变体与GPC3蛋白间的相互结合
将5μg的GPC3蛋白溶解于5毫升PBS中，充分混匀后每个孔中加入50微升GPC3溶液，包被ELISA板，并将微孔板放置于水平摇床上室温振荡孵育12小时。随后，弃去上清，使用200微升PBST清洗孔板3次，以去除未结合的GPC3。加入3％的脱脂牛奶孵育于37℃培养箱30分钟，以封闭孔板。
选择1-2、2-2、3-2、4-2和NH3母本抗体进行梯度稀释，稀释液为3％的脱脂牛奶。稀释后的样品分别加入各孔，随后在37℃培养箱中孵育2小时。随后的步骤包括洗板、加入二抗、再次洗板、显色和终止，最终以450nm的波长进行读值。根据各抗体的读值，绘制浓度与吸光度之间的曲线，然后通过四次回归曲线拟合计算EC50值。结果如图3所示，1-2、2-2、3-2三个抗体的EC50值均较母本抗体NH3越低，表示抗体与靶标的亲和力更高，即具有更强的结合能力，而在ELISA方法中，4-2未显示出比母本抗体更强的亲和力。
7、抗体对抗原的动力学性能
利用蛋白相互作用仪(型号Octet RH16，厂家Sartorius)测定NH3抗体突变体与NH3母本抗体的亲和力，参考厂家推荐的操作方式执行。
使用pH5.0的醋酸钠溶液将市售重组GPC3蛋白(10088-H08H义翘神州)稀释到5μg/mL浓度。另外使用PBST将抗体NH3、1-2、2-2、3-2、4-2皆稀释到153.8nM、76.9nM、38.5nM、19.2nM、9.62nM和0nM浓度。用NHS/EDC试剂激活水中预湿的仪器配套探针(型号为AR2G)，然后使用AR2G探针捕获pH5.0的醋酸钠溶液稀释的GPC3蛋白，使用EZ溶液对固定后的AR2G探针进行封闭后，分别与PBST稀释的NH3、1-2、2-2、3-2、4-2抗体进行，充分反应后的固相结合物在PBST缓冲液中进行解离分析，最后以DataAnalysis12.0软件对结果分析，获得结合速率、解离速率及亲和力常数如表4和图4～8所示。
表4抗体对抗原的动力学性能
样本 结合力(M) 结合常数(1/Ms) 解离常数(1/s) 精密度R2
Nh3 3.11E-08 3.71E+05 1.15E-02 0.9901
1-2 2.38E-08 3.58E+05 8.53E-03 0.9868
2-2 3.05E-08 3.35E+05 1.02E-02 0.9897
3-2 2.72E-08 3.49E+05 9.50E-03 0.9866
4-2 2.95E-08 2.81E+05 8.28E-03 0.9831
实施例2
1、基于1-2抗体突变体序列构建CAR-NK细胞
通过基因合成制备4种基于1-2抗体的嵌合抗原受体序列到质粒，结果和序列如表2和表3所示。以上四种经串联后，委托金唯智生物进行4种结构的线性双链基因合成，并通过SEQ ID No.11所示的上游引物和SEQ ID No.12所示的下游引物进行PCR扩增。PCR扩增后会产生含有T7启动子和kozac序列以及多聚腺苷酸尾巴(85个腺苷酸重复)的双链DNA，可作为进一步体外转录生产mRNA的模板。
按照体外转录试剂盒(凯佧T7RNAPolymerase Kit货号T7P-EE102)的说明书进行体系配置，水浴37℃过夜反应生成mRNA。次日，加DNA酶(试剂盒包含)降解模板，1μL/体系，37℃，15分钟；每个反应体系补30μL无酶水，加入50μL/体系LiCl(赛默飞品牌AM9480)，混匀，-80℃冷冻2小时沉淀mRNA，4℃最大转速离心20分钟，弃上清，无酶水复溶沉淀，测定浓度，分装冻存于-80℃，随用随取。
使用人NK细胞富集试剂盒(Stemcell品牌货号:19055)参考说明书分离外周血(0126批次采集)内的NK细胞，向其中加入过表达IL-21和41BBL的K562滋养细胞(构建过程记载于专利CN201811520275)后，参考专利CN201811520275扩增NK 12天，调节NK密度为1*108个/毫升，使用Bio-red电转仪，参考说明书，利用2mm电击杯进行电转染。每个电击杯加入30μg mRNA和200μL/杯的细胞悬液，设置电压为300V后，进行2个脉冲的电转染，每个脉冲持续800us，间隔800ms，电击后将细胞转入完全培养基，2E6/ml密度培养。待12小时后即可检测CAR分子的表达，或进行靶细胞杀伤等功能实验。
2、基于1-2抗体序列制备的CAR-NK细胞表达率检测
取四种CAR结构制备的mRNA样品，电转RNA 12h后细胞，约1E6/样，100μL体系，biotin标记靶点蛋白GPC31μg/样(KACTUS GPC-HM431B-100μg)，室温孵育30min，1ml PBS400g，3min洗一次，PE Streptavidin 1：400稀释，100μL/样，室温避光孵育15-20min，1mlPBS 400g，3min洗一次，300μLPBS重悬，上机检测。
结果如图9所示，四种CAR结构设计的mRNA均可以在NK细胞上有效表达CAR分子。GPC3蛋白可指示具有结合能力的CAR分子表达量，结构1的mRNA转染NK细胞后约91％的细胞可检测到CAR表达，比结构2、结构3和结构4(分别为48.8％、47.4％和37.7％)更为显著。
3、基于1-2抗体序列制备的CAR-NK体外特异杀伤
利用常见的肝癌靶细胞用以确定mRNA制备的CAR-NK的杀伤能力。96孔板每个孔中接种2×104个靶细胞(HepG2-luc，购自南京科佰生物)，悬于50μL的培养基。随后，每个孔加入50μL含4×104个CAR-NK的细胞悬液，以同过程制备的mRNA构建的靶向无关抗原(靶向CD33)的CAR-NK(标记为10HL)作为对照。共孵育4小时，培养温度为37℃。在此期间，CAR-NK细胞与靶细胞相互作用，评估CAR-NK细胞对靶细胞的杀伤效果。实验结束后向每个孔加入100μL配好的的荧光素底物(诺唯赞品牌DD1203，按说明书配制)，通过酶标仪检测化学发光的强度，记录实验组各孔的数据。额外单独向2×104个靶细胞的孔中加入100μL配好的的荧光素底物，记录最大发光强度。以各组的发光强度和最大发光强度的比值百分数，作为细胞杀伤率(killing percentage)绘制直方图，比值越大则表示杀伤作用越强。
结果如图10所示，基于1-2抗体的4种结构均有杀伤靶细胞HepG2的作用，比NK细胞修饰了无关抗体CAR(对照组标记为10HL)的杀伤作用更强。其中结构1和结构2的杀伤作用比起结构3和结构4更明显，但结构1具有最佳的CAR-NK杀伤作用，在体外实验中具有更好的抗肝癌作用。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (9)

1.一组抗GPC3的纳米抗体突变体，其特征在于，所述纳米抗体突变体选自以下任一种：氨基酸序列依次如SEQ ID No.1～SEQ ID No.4所示的突变体1-2、突变体2-2、突变体3-2和突变体4-2。
2.根据权利要求1所述纳米抗体突变体，其特征在于，所述纳米抗体突变体的核苷酸序列依次如SEQ ID No.5～SEQ ID No.8所示。
3.基于权利要求1或2所述纳米抗体突变体的靶向GPC3的嵌合抗原受体。
4.根据权利要求3所述嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的结构，包括依次连接的信号肽、抗体区、铰链区、跨膜区和胞内区。
5.根据权利要求4所述嵌合抗原受体，其特征在于，所述信号肽的来源包括人CD8a信号肽；
所述抗体区包括一条抗GPC3的纳米抗体突变体序列或利用柔性连接肽连接的两条抗GPC3的纳米抗体突变体序列；
所述铰链区的来源包括人IgG4或人CD8a；
所述跨膜区的来源包括人CD28或人CD8a；
所述胞内区的来源包括人41BB或CD3。
6.利用权利要求3～5任一项所述嵌合抗原受体的核苷酸扩增得到的线性双链基因，其特征在于，所述扩增用的引物包括核苷酸序列如SEQ ID No.11所示的上游引物和SEQ IDNo.12所示的下游引物。
7.利用权利要求6所述线性双链基因为模板经体外转录得到的mRNA。
8.一种基因工程改造的CAR-NK细胞，其特征在于，所述CAR-NK细胞由权利要求7所述mRNA转化NK细胞后得到，并表达权利要求1或2所述纳米抗体突变体。
9.权利要求1或2所述纳米抗体突变体或权利要求3～5任一项所述嵌合抗原受体或权利要求8所述CAR-NK细胞在制备治疗患有肝癌的受试者的药物中的应用。
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