CN1194009C - 人胎盘抗凝蛋白介导的抗凝蛋白 - Google Patents
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Abstract
一种人胎盘抗凝蛋白介导的新型抗凝蛋白：1.该类新型抗凝蛋白是将具有活化血小板亲和性及抗凝活性的人胎盘抗凝蛋白和具有抗纤维蛋白形成及有纤维蛋白导向性的多肽分子相融合；2.该类人胎盘抗凝蛋白介导的新型抗凝蛋白同时具有抗纤维蛋白形成和抗活化血小板的生物活性，对血栓具有高亲和性和选择性；3.该类新型抗凝蛋白可以通过蛋白质工程设计，基因工程方法生产制备；4.人胎盘抗凝蛋白介导的新型抗凝蛋白的应用是能够作为抗血栓形成的抗凝药物。作为该类新型抗凝蛋白之一的Gly-Pro-Arg-Pro-人胎盘抗凝蛋白-水蛭素C端结构域新型抗凝蛋白分子具有同时血小板亲和性和凝血酶抑制剂的生物活性，能够作为高效、安全的抗凝血药物。
Description
一、技术领域：
本发明属生物工程技术领域。
二、背景技术：
抗凝血及抗血小板药物在临床上对预防血栓形成及溶栓治疗后防止再栓塞发生具有重要的意义。阿匹斯林、肝素是最早用于临床的抗凝药物，而且至今肝素仍作为临床上最常用的抗凝药物使用(尽管肝素有明显的出血副作用)。目前国际上最新的抗血小板药物主要为抗GP IIb/IIIa单克隆抗体及其重组Fv片段，GP IIb/IIIa拮抗肽，处于临床开发研究的抗凝药物主要为水蛭素(Hirudin)及其衍生物Hirugen、Hirulog，还有其它凝血因子的抑制剂。尽管水蛭素具有很强的抗凝活性，但在临床试验时发现其出血并发症较为严重。究其根本原因，主要是由于水蛭素的血栓特异性不够好，从而导致引发出血。提高药物的血栓特异选择性是解决目前抗凝药物及纤溶药物共同面临的出血副作用难题的根本途径。
尽管近十年来，科学家们一直在做这方面的工作和努力，但迄今几乎所有的工作都集中在不是提高药物的纤维蛋白选择性就是提高其活化血小板的亲和性，结果不尽如人意。
三、发明内容：
为了突破现有方法和思路的局限，开辟一条研究新型、高效抗凝血蛋白质的创新思路，本发明的思路是：血栓是在破损血管内皮细胞表面由活化血小板和血纤维蛋白组成的，真正的血栓特异选择性应同时包括纤维蛋白选择性和活化血小板的亲和性。因此一个理想的抗凝剂应该是同时兼有纤维蛋白选择性和活化血小板的亲和性，既具有抗纤维蛋白形成又具有抗活化血小板的能力，才能真正达到高效抗凝和安全的目的。本发明的目的是通过计算机辅助的蛋白质工程设计，通过重组DNA技术即基因工程方法构建、表达和获得人胎盘抗凝蛋白变体；该类人胎盘抗凝蛋白介导的抗凝蛋白同时具有抗纤维蛋白形成和抗活化血小板的生物活性，具有对活化血小板的亲和性。
人胎盘抗凝蛋白最初是从人胎盘中纯化，因其抗凝活性，最初被称为人胎盘抗凝蛋白。它对暴露于活化血小板表面的磷脂酰丝氨酸具有高亲和性，人胎盘抗凝蛋白对人活化血小板的Kd＝7nm，对未活化的静止血小板亲和力极低。完全激活的血小板所含人胎盘抗凝蛋白结合位点，超过了抗糖蛋白IIb/IIIa抗体的结合位点数。在动物动脉栓塞模型中，放射性标记的人胎盘抗凝蛋白能选择性地聚集于动物模型的血栓处，浓集于动物模型血栓处的人胎盘抗凝蛋白比对照蛋白质高13倍。在体内，磷脂酰丝氨酸存在于活化血小板或活化内皮细胞的质膜外层，为凝血因子提供一个聚集进而促发凝集的表面。据推测，人胎盘抗凝蛋白能将凝血因子从膜上替换下来，使凝血反应被抑制至原有速度的5％。正常人血清中几乎没有人胎盘抗凝蛋白；血管损伤后，人胎盘抗凝蛋白从内皮细胞中释放出，抑制凝血反应。
本发明的目的可以通过以下措施来达到：
在计算机图形工作站上利用分子设计技术进行计算机辅助的蛋白质工程设计，设计构象合理的人胎盘抗凝蛋白-抗纤维蛋白多肽的嵌合分子，抗纤维蛋白的多肽分子(如水蛭素、Gly-Pro-Arg-Pro抗凝短肽等等)可以融合在人胎盘抗凝蛋白的N端或C端，或同时融合在人胎盘抗凝蛋白的N端和C端：
或
或
A肽、B肽分别是长度为3至65个氨基酸残基的多肽片段，A肽、B肽分别具有抗纤维蛋白形成或抗凝血的活性。设计PCR引物或定点突变引物，用PCR反应或定点突变技术构建嵌合分子基因。然后通过重组DNA技术即基因工程方法构建表达质粒，在大肠杆菌或酵母菌中进行表达。表达产物经乙醇或硫酸铵分级沉淀、离子交换层析、疏水层析及凝胶过滤等分离纯化获得人胎盘抗凝蛋白介导的抗凝蛋白。该类人胎盘抗凝蛋白介导的抗凝蛋白同时具有抗纤维蛋白形成和抗活化血小板的生物活性，对含活化血小板的血栓具有高亲和性和选择性，即具有血栓特异的导向性。该类抗凝蛋白集中了多种分子的抗凝血反应的生物活性，能在凝血反应的不同阶段或者针对不同的凝血反应靶分子发挥抗凝血生物活性，能更有效、特异地发挥抗凝血作用。该类人胎盘抗凝蛋白介导的抗凝蛋白能够作为抗血栓形成的抗凝药物，具有高效抗凝和安全、低副作用的特点。
同已有报道的抗凝药物的设计及技术相比，本发明的特色在于不循现有的或者只着重于抗纤维蛋白形成，或只着眼于抗活化血小板的抗凝药物设计思路，而是认为一个理想的抗凝剂应该是同时兼有纤维蛋白选择性和活化血小板亲和性，既具有抗纤维蛋白形成又具有抗活化血小板的能力，才能真正达到高效抗凝和安全的目的。而且在设计活化血小板的导向分子时没有采用目前国际上最常用的抗活化血小板单抗单克隆抗体或其Fv片段，如抗GP IIb/IIIa单克隆抗体及其重组Fv片段，或者GP IIb/IIIa拮抗肽等已有专利的分子作为抗活化血小板及活化血小板的导向分子，而是采用了既对活化血小板具有高亲和性，又具有抑制凝血反应活性的人胎盘抗凝蛋白。人胎盘抗凝蛋白不光具有上述的抗凝活性及活化血小板亲和性，而且没有专利保护；由于该分子只含有一个半胱氨酸，在大肠杆菌中表达时表达量高，产物全部为可溶的、生物活性形式，因此有利于重组人胎盘抗凝蛋白介导的新型抗凝蛋白的基因工程生产和纯化，从而为大规模工业生产和实用化奠定了基础。
四、附图说明：
重组Gly-Pro-Arg-Pro-人胎盘抗凝蛋白-水蛭素C端结构域新型抗凝蛋白的凝血酶抑制活性。
五、具体实施方式：
1.在计算机工作站上，利用MSI公司的分子设计软件(InsightII、Discover等模块)，进行Gly-Pro-Arg-Pro-人胎盘抗凝蛋白-水蛭素C端20肽融合分子的分子模建和分子设计，确定所设计的抗凝蛋白中人胎盘抗凝蛋白和水蛭素C端结构域的结构都未受影响，水蛭素C端结构域仍然可以和凝血酶形成复合物。Gly-Pro-Arg-Pro-人胎盘抗凝蛋白-水蛭素C端结构域新型抗凝蛋白氨基酸全序列：
MGPRPAQVLRGTVTDFPGFDERADAETLRKAMKGLGTDEE
SILTLLTSRSNAQRQEISAAFKTLFGRDLLDDLKSELTGKFEK
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2.设计引物，通过PCR反应，构建、获得Gly-Pro-Arg-Pro-人胎盘抗凝蛋白-水蛭素C端20肽新型抗凝蛋白的编码基因，该新型抗凝蛋白的氨基酸序列见本实施例第一条。
3.将获得的人新型抗凝蛋白编码基因克隆在通用的大肠杆菌表达载体如pET23a中，进行表达。表达产物经破碎细菌，收集裂解上清液，在分别经过乙醇分级沉淀、DE52离子交换柱层析、Sephadex G75凝胶柱层析、超滤浓缩、脱盐，获得SDS-PAGE一条带纯的重组Gly-Pro-Arg-Pro-人胎盘抗凝蛋白-水蛭素C端结构域新型抗凝蛋白。氨基酸组成分析实验表明：重组Gly-Pro-Arg-Pro-人胎盘抗凝蛋白-水蛭素C端20肽新型抗凝蛋白的氨基酸组成和理论值相符合。
4.纯化的重组Gly-Pro-Arg-Pro-人胎盘抗凝蛋白-水蛭素C端结构域新型抗凝蛋白经流式细胞仪实验分析，实验结果证明该融合蛋白确实保留了人胎盘抗凝蛋白和血小板结合的性质。凝血酶抑制活性实验表明：重组Gly-Pro-Arg-Pro-人胎盘抗凝蛋白-水蛭素C端结构域新型抗凝蛋白具有明显的凝血酶抑制活性，而且其凝血酶抑制活性具有鲜明的剂量依赖关系，结果见说明书附图。
从本实例中可以看到，本发明具有鲜明的特色和创新之处：本实例中所设计的新型抗凝蛋白分子的作用机制是依照凝血反应的生理过程实现的。其作用机制是：1.由于人胎盘抗凝蛋白对暴露于活化血小板表面的磷脂酰丝氨酸具有高亲和性，对凝血酶原及凝血酶的形成具有很强的抑制作用，因此该新型抗凝蛋白分子首先能够阻止在活化血小板表面形成凝血酶，并抑制血小板的粘附和聚集；2.位于新型抗凝蛋白分子表面的水蛭素C端结构域对少量逃脱人胎盘抗凝蛋白的抑制作用而刚刚产生的凝血酶发生抑制作用，而同时也位于新型抗凝蛋白分子表面的N端的GPRP四肽是有效的纤维蛋白聚合抑制剂，具有纤维蛋白亲和力，因此能赋予新型抗凝蛋白分子纤维蛋白导向性和抑制纤维蛋白聚集的能力；3.人胎盘抗凝蛋白对活化血小板的高亲和性使得变体分子具有鲜明的血栓导向性，从而达到高效抗凝和安全的目的。设计的新型抗凝蛋白分子先是防止凝血酶的生成，又能继而抑制漏网而产生的凝血酶的活性，抑制纤维蛋白的聚集，从而有效发挥抗凝作用。设计的新型抗凝蛋白目标分子只是在人胎盘抗凝蛋白的C端添加了一段20肽的水蛭素C端结构域，在N端加上了GPRP四肽，简易可行。从已经完成的蛋白质结构预测结果来看：新型抗凝蛋白分子设计合理，人胎盘抗凝蛋白和水蛭素C端结构域的结构都未受到影响，水蛭素C端结构域仍然可以和凝血酶形成复合物。实验结果也证明我们分子设计是合理和正确的。
Claims (5)
1.一类人胎盘抗凝蛋白介导的抗凝蛋白，其特征是在该类抗凝蛋白分子中，具有抗纤维蛋白形成及有纤维蛋白导向性的多肽分别融合在人胎盘抗凝蛋白的N端或C端，或者将不同或相同的上述多肽分子同时融合在人胎盘抗凝蛋白的N端和C端，其序列组成为：
其中，A肽、B肽分别是长度为3至65个氨基酸残基的多肽片段，分别具有抗纤维蛋白形成或抗凝血的活性。
2.根据权利要求1.所述的人胎盘抗凝蛋白介导的抗凝蛋白的制备方法，其特征是在计算机辅助的蛋白质工程设计的基础上，用重组DNA技术构建和表达人胎盘抗凝蛋白介导的抗凝蛋白嵌合分子，将具有活化血小板亲和性及抗凝活性的人胎盘抗凝蛋白和具有抗纤维蛋白形成及有纤维蛋白导向性的多肽分子相融合，这些多肽分子长度分别为3至65个氨基酸残基；该类人胎盘抗凝蛋白介导的抗凝蛋白同时具有抗纤维蛋白形成和抗活化血小板的生物活性，对含活化血小板的血栓具有高亲和性和选择性。
3.根据权利要求1.所述的人胎盘抗凝蛋白介导的抗凝蛋白，其特征是该类人胎盘抗凝蛋白介导的抗凝蛋白能够作为制备抗血栓形成的抗凝药物，具有血栓特异性，能有效抑制凝血反应、抑制纤维蛋白聚集，具有高效抗凝和安全、低副作用的特点。
4.根据权利要求1.所述的人胎盘抗凝蛋白介导的抗凝蛋白，其特征是集中了多种分子的抗凝血反应的生物活性，能在凝血反应的不同阶段或者针对不同的凝血反应靶分子发挥抗凝血生物活性，能更有效、特异地发挥抗凝血作用。
5.一种Gly-Pro-Arg-Pro-人胎盘抗凝蛋白-水蛭素C端结构域抗凝蛋白，其特征是具有血栓特异性，能有效抑制凝血反应、抑制纤维蛋白聚集，具有凝血酶抑制剂的生物活性，能够作为高效、安全的抗凝血药物。
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