CN119219781A - 一种抗人btnl2抗体、生物检测产品及其在抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗人BTNL2抗体、生物检测产品及其在抗肿瘤药物中的应用，涉及生物医学技术领域。该抗体包括如SEQ ID NO：1所示的重链可变区中的重链互补决定区，和如SEQ ID NO：2所示的轻链可变区中的轻链互补决定区。该抗体能够特异性识别并阻断人BTNL2，使得BTNL2无法抑制T细胞的功能，增强T细胞的肿瘤杀伤功能。因此，本发明提供的抗人BTNL2的特异性抗体在肿瘤治疗或与BTNL2相关的自身免疫病中具有良好的预防或治疗应用前景。此外，该抗体还可以用于BTNL2标志物相关的疾病的诊断或辅助诊断。

Description

一种抗人BTNL2抗体、生物检测产品及其在抗肿瘤药物中的 应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及一种抗人BTNL2抗体、生物检测产品及其在抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
肿瘤免疫治疗是继放疗、化疗和手术治疗之外的第四种肿瘤治疗方法，其作用机理是激发和调动机体的免疫系统，以达到控制和杀灭肿瘤细胞的目的。肿瘤免疫治疗的方法主要包括肿瘤疫苗、过继性免疫治疗、免疫检查点阻断剂等，它们大多数都是通过T细胞发挥抗肿瘤作用。其中，针对免疫检查点的阻断是增强T细胞激活的有效方式之一，也是近年来抗肿瘤药物开发的热门靶点。常见的免疫检查点如CTLA-4、PD-1、PD-L1、BTLA、TIM-3、LAG-3等都是共抑制分子，在免疫系统中扮演着类似“刹车”的角色。当免疫系统过度活跃时，机体就会利用这些免疫检查点来控制免疫反应的强度和持续时间，从而最大限度地减少对周围正常组织的损伤，避免自身免疫疾病的发生。肿瘤细胞就是利用这一机制来抑制T细胞的激活，导致肿瘤免疫逃逸的发生。
目前，临床上已经有针对CTLA-4、PD-1、PD-L1的单克隆抗体药物用于肿瘤的治疗。例如，针对CTLA-4的单抗Yervoy、针对PD-1的单抗Opdivo和Keytruda分别于2011、2014被FDA批准为治疗黑色素瘤的新药，针对PD-L1的单抗Tecentrq于2016被FDA批准为治疗膀胱癌的新药，并且这几种免疫检查点阻断剂的治疗范围已经逐渐扩大到非小细胞肺癌、肾细胞癌、结直肠癌、头颈部鳞状细胞癌和霍奇金淋巴瘤。但是这些肿瘤患者中仅有一小部分对CTLA-4、PD-1、PD-L1阻断剂有响应。因此，寻找其它有效的免疫检查点并针对免疫检查点进行阻断剂的研发对肿瘤治疗具有重要意义。
嗜乳脂样蛋白-2(BTNL2)属于嗜乳脂样蛋白家族成员，与PD-L1、B7-1、B7-H3等B7家族分子在结构上具有高度同源性。BTNL2主要参与T细胞的活化过程，其受体表达于活化的T细胞，BTNL2通过与其受体结合抑制活化T细胞的增殖及细胞因子的分泌，是T细胞活化的共抑制分子。与PD-L1类似，BTNL2也与肠炎、结节病、关节炎等多种自身免疫疾病相关。另外，BTNL2外显子上两个位点的错义突变及第4个内含子上的一个位点突变分别与前列腺癌和肺腺癌易感相关。提示BTNL2可能是肿瘤治疗的一个靶点。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗人BTNL2的抗体、生物检测产品及其在抗肿瘤药物中的应用以解决上述技术问题。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一种抗人BTNL2的抗体或其抗原结合片段，其包括如SEQID NO：1所示的重链可变区中的重链互补决定区，和如SEQ ID NO：2所示的轻链可变区中的轻链互补决定区。
第二方面，本发明还提供了一种生物产品，其包括：上述的抗人BTNL2的抗体或其抗原结合片段，生物产品选自：试剂、试剂盒、试纸条、抗体芯片、抗体探针、抗体与化学药物的偶联物、亲和层析柱或检测仪。
第三方面，本发明还提供了抗人BTNL2的抗体或其抗原结合片段在制备如下至少一种产品中的应用：
(1)BTNL2检测产品；
(2)肿瘤诊断或辅助诊断产品；
(3)自身免疫病诊断或辅助诊断产品；
(4)BTNL2富集产品；
(5)肿瘤预防或治疗产品；
(6)自身免疫病预防或治疗产品；
(7)与联用药物在制备肿瘤预防或治疗产品中的应用；
(8)与联用药物在制备自身免疫病预防或治疗产品中的应用。
第四方面，本发明还提供了一种分离的核酸分子，其编码上述的抗人BTNL2的抗体或其抗原结合片段在制备BTNL2检测产品。
第五方面，本发明还提供了一种重组细胞，其包括：上述的分离的核酸分子。
第六方面，本发明还提供了一种组合物，其包括上述的抗人BTNL2的抗体或其抗原结合片段，组合物为药物组合物或疫苗组合物。
本发明具有以下有益效果：
本发明利用人BTNL2胞外段蛋白(hBTNL2-his蛋白)免疫小鼠制备了靶向人BTNL2的特异性抗体，发现抗hBTNL2的抗体能够特异性识别并结合BTNL2，从而封闭细胞表面配体BTNL2，能在体外逆转(或解除)hBTNL2对T细胞活化的抑制效应，增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤效应，因此，本发明提供的抗人BTNL2的特异性抗体在肿瘤治疗或与BTNL2相关的自身免疫病中具有良好的预防或治疗应用前景。
此外，该抗体还可以用于BTNL2标志物相关的疾病的诊断或辅助诊断，从而实现疾病的早发现早治疗。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为抗人BTNL2的单克隆抗体特异性结合hBTNL2-his蛋白结果图；
图2为抗人BTNL2的单克隆抗体解除对T细胞抑制作用的统计结果图；
图3为抗人BTNL2的单克隆抗体促进T细胞对人肺癌细胞的杀伤作用结果图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
名词定义
术语“抗原结合片段”泛指包含CDR区的一切蛋白/蛋白片段，特别是抗体或抗体功能片段。“抗原结合片段”包括上述这些抗体的抗原化合物结合片段，包括Fab、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、双特异抗体、多特异性抗体和抗体最小识别单位，以及这些抗体和片段的单链衍生物。抗体的类型可以选择IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD等。此外，“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如嵌合型(chimeric)、双功能型(bifunctional)和人源化(humanized)抗体，以及相关的合成异构形式(isoforms)。“抗体”此用语可和“免疫球蛋白”互换使用。
本文中的术语“抗体”在最广义上使用，其可以包括全长单克隆抗体，双特异性或多特异性抗体，嵌合抗体，以及抗体片段，只要他们展示所需的生物学活性，如特异性结合BTNL2蛋白或其片段。
在本发明中，术语“互补性决定区或互补决定区”、“CDR”是指免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区，指包含一种或多种或者甚至全部的对抗体或抗原结合片段与其识别的抗原或表位的结合亲和力起作用的主要氨基酸残基的区域。在本发明具体实施方式中，CDRs是指所述抗体的重链和轻链的高度可变区。
在本发明中，重链互补决定区用HCDR表示，其包括HCDR1、HCDR2和HCDR3；轻链互补决定区用LCDR表示，其包括LCDR1、LCDR2和LCDR3。本领域常用的CDR标示方法包括：Kabat编号方案、IMGT编号方案、Chothia和Lesk编号方案以及1997年Lefranc等人为免疫球蛋白超家族的所有蛋白质序列引入的新的标准化编号系统。Kabat等人是第一个为免疫球蛋白可变区提出标准化编号方案的人。在过去的几十年中，序列的积累导致了KABATMAN数据库的创建，Kabat编号方案通常被认为是编号抗体残基广泛采用的标准。本发明采用Kabat注释标准标示CDR区，但其他方法标示的CDR区也属于本发明的保护范围。
通常情况下，抗体的重链的可变区VH可由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4。HCDR1与CDR-H1同义。
抗体的轻链的可变区VL可由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4。
第一方面，本发明提供了一种抗人BTNL2的抗体或其抗原结合片段，其包括如SEQID NO：1所示的重链可变区中的重链互补决定区，和如SEQ ID NO：2所示的轻链可变区中的轻链互补决定区。
重链可变区(VH)，SEQ ID NO：1的序列为：
EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNTKYDPKFQGKATITADTSSNTVYLQLSSLTSEDTAVYYCPRYYGNYLYAMDYWGQGTSVTVSS
轻链可变区(VL)，SEQ ID NO：2的序列为：
DIVMTQSQKVMSTSVGDRVSITCKASQNVRSAVAWFQQKPGQSPKVLIY LASNRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCLQHWNYPLTFGAG TKLELK。
将上述SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2序列输入CDR标示系统，能获得相应的CDR序列。
上述互补决定区的氨基酸序列是本发明首次发现并揭示，是一种新的序列，可赋予该抗体或其抗原结合片段特异性识别和结合人BTNL2蛋白的能力。
在本发明应用较佳的实施方式中，重链互补决定区包括：CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其氨基酸序列依次为SEQ ID NO：3-5所示，轻链互补决定区包括CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其氨基酸序列依次为SEQ ID NO：6-8所示。
重链互补决定区，CDR-H1，SEQ ID NO：3的序列为：DTYMH；
CDR-H2，SEQ ID NO：4的序列为：RIDPANGNTKYDPKFQG；
CDR-H3，SEQ ID NO：5的序列为：YYGNYLYAMDY；
CDR-L1，SEQ ID NO：6的序列为：KASQNVRSAVA；
CDR-L2，SEQ ID NO：7的序列为：LASNRHT；
CDR-L3，SEQ ID NO：8的序列为：LQHWNYPLT。
在本发明应用较佳的实施方式中，抗体或其抗原结合片段还包括重链框架区，和/或，轻链框架区；
在本发明应用较佳的实施方式中，重链框架区包括依次与SEQ ID NO:9-12所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的HFR1、HFR2、HFR3及HFR4；例如重链框架区包括依次与SEQ ID NO:9-12所示的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同源性的HFR1、HFR2、HFR3及HFR4。
轻链框架区包括依次与SEQ ID NO:13-16所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的LFR1、LFR2、LFR3及LFR4；例如轻链框架区包括依次与SEQ ID NO:13-16所示的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同源性的LFR1、LFR2、LFR3及LFR4。
SEQ ID NO:9：EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIK；
SEQ ID NO:10：WVKQRPEQGLEWIG；
SEQ ID NO:11：KATITADTSSNTVYLQLSSLTSEDTAVYYCPR；
SEQ ID NO:12：WGQGTSVTVSS；
SEQ ID NO:13：DIVMTQSQKVMSTSVGDRVSITC；
SEQ ID NO:14：WFQQKPGQSPKVLIY；
SEQ ID NO:15：
GVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFC；
SEQ ID NO:16：FGAGTKLELK。
在本发明应用较佳的实施方式中，抗体或其抗原结合片段还包括恒定区，恒定区包括重链恒定区，和/或，轻链恒定区；
在本发明应用较佳的实施方式中，重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的重链恒定区；轻链恒定区选自κ型或λ型轻链恒定区；
在本发明应用较佳的实施方式中，恒定区的种属来源为牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、或人；
在本发明应用较佳的实施方式中，恒定区的种属来源为人；
在本发明应用较佳的实施方式中，抗原结合片段选自抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、Fab′-SH和scFv中的任意一种。其中，Fab’-SH是指在恒定区的半胱氨酸残基带有自由硫醇基的Fab’。
上述抗体的抗原结合片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的功能片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。
上述抗体的抗原结合片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪合成获得。
在本发明应用较佳的实施方式中，抗体是嵌合抗体。
第二方面，本发明还提供了一种生物产品，其包括：上述的抗人BTNL2的抗体或其抗原结合片段，生物产品选自：试剂、试剂盒、试纸条、抗体芯片、抗体探针、抗体与化学药物的偶联物、亲和层析柱或检测仪。
在一种实施方式中，上述试剂为抗人BTNL2的抗体或其抗原结合片段的制品，也可包括蛋白稳定剂、保护剂等功能成分。蛋白稳定剂选自：蔗糖、海藻糖、BSA、甘油、甘露醇、TritonX-100和Tween-20。保护剂选自冷冻保护剂，如多元醇和糖。多元醇如选自山梨糖醇、甘露糖醇或它们的混合物。
在一种实施方式中，试剂的形态包括不限于固体、液体、半固体。
抗体芯片是指：将上述的抗人BTNL2的抗体或其抗原结合片段固定在载体上形成的芯片。
在本发明应用较佳的实施方式中，生物产品为检测功能的产品时，在抗人BTNL2的抗体或其抗原结合片段上标记有可被检测的标记物。可被检测的标记物是指具有能够被肉眼直接观察或被仪器检测或探测到的特性例如发光、显色、放射性等特性的一类物质，通过该特性可以实现对相应目标物的定性或定量检测。
在本发明应用较佳的实施方式中，可被检测的标记物选自荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物中的至少一种。
在实际的使用过程中，本领域技术人员可以根据检测条件或实际需要选择合适的标记物，无论使用何种标记物，其均属于本发明的保护范围。
荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物(例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)羟基光素(FAM)、四氯光素(TET)等或其类似物)、罗丹明类染料及其衍生物(例如包括但不限于红色罗丹明(RBITC)、四甲基罗丹明(TAMRA)、罗丹明B(TRITC)等或其类似物)、Cy系列染料及其衍生物(例如包括但不限于Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物)、Alexa系列染料及其衍生物(例如包括但不限于AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)和蛋白类染料及其衍生物(例如包括但不限于藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(preCP)等)。
在可选的实施方式中，催化底物显色的酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。
在可选的实施方式中，放射性同位素包括但不限于212Bi、131I、111In、90Y、186Re、211At、125I、188Re、153Sm、213Bi、32P、94mTc、99mTc、203Pb、67Ga、68Ga、43Sc、47Sc、110mIn、97Ru、62Cu、64Cu、67Cu、68Cu、86Y、88Y、121Sn、161Tb、166Ho、105Rh、177Lu、172Lu和18F。
在可选的实施方式中，化学发光试剂包括但不限于鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物和过氧草酸盐及其衍生物。
在可选的实施方式中，纳米颗粒类标记物包括但不限于纳米颗粒、胶体；纳米颗粒包括不限于：有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。
在本发明应用较佳的实施方式中，试剂盒包括固相，抗体或其抗原结合片段被包被于固相；如通过化学偶联的方式，使得抗体或其抗原结合片段与固相连接。
在本发明应用较佳的实施方式中，固相选自微球、板和膜；
在本发明应用较佳的实施方式中，固相选自磁性微球、塑料微球、塑胶微粒、乳胶微球、微孔板、玻璃、毛细管、尼龙和硝酸纤维素膜。
第三方面，本发明还提供了抗人BTNL2的抗体或其抗原结合片段在制备如下至少一种产品中的应用：
(1)BTNL2检测产品；
(2)肿瘤诊断或辅助诊断产品；
(3)自身免疫病诊断或辅助诊断产品；
(4)BTNL2富集产品；
(5)肿瘤预防或治疗产品；
(6)自身免疫病预防或治疗产品；
(7)与联用药物在制备肿瘤预防或治疗产品中的应用；
(8)与联用药物在制备自身免疫病预防或治疗产品中的应用；
在本发明应用较佳的实施方式中，检测产品、诊断产品或辅助诊断为试剂、试剂盒、试纸条、抗体芯片、抗体探针或检测仪；
在本发明应用较佳的实施方式中，肿瘤或自身免疫病是以BTNL2为标志物；
上述应用(5)和应用(7)中，肿瘤预防或治疗产品用于治疗通过BTNL2抑制T细胞功能从而加快肿瘤进展的所有肿瘤。本发明以小鼠单克隆抗体(克隆号为H2T-3-1-28)验证了其能解除BTNL2对T细胞的抑制并且增强T细胞的肿瘤杀伤功能。其在其他的T细胞活化的共抑制分子(BTNL2)相关的肿瘤也同样具有响应的预防或治疗效果。
上述应用(7)中联用药物例如：PD-1单抗、PD-L1单抗以及CTLA-4单抗。
在本发明应用较佳的实施方式中，肿瘤选自人黑色素瘤、肺癌、结肠癌、胰腺癌、神经母细胞瘤、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、非小细胞肺癌、胃癌、肾上腺皮质癌、宫颈鳞状细胞癌、胆管癌、食管癌、头颈部鳞状细胞癌、甲状腺癌、膀胱癌、胸腺瘤或子宫内膜癌。
在本发明应用较佳的实施方式中，自身免疫病选自肠炎、史蒂文斯-约翰逊综合征、系统性红斑狼疮、再生障碍性贫血、肌炎、多发性关节炎、特发性血小板减少症、结节病、干燥综合征、葡萄膜炎、肺纤维化、类风湿性关节炎、重症肌无力、牛皮癣、肝硬化、再生障碍性贫血、脑病、多发性硬化症、硬皮病和慢性肝炎中的至少一种；
在本发明应用较佳的实施方式中，肠炎是克罗恩病或溃疡性结肠炎。
在本发明应用较佳的实施方式中，肠炎是医源性自身免疫性结肠炎；
在本发明应用较佳的实施方式中，医源性自身免疫性结肠炎选自由一种或多种化疗剂诱导的结肠炎、由过继性细胞疗法治疗诱导的结肠炎、和由一种或多种同种免疫性疾病相关的结肠炎；
在本发明应用较佳的实施方式中，肿瘤预防或治疗产品或自身免疫病预防或治疗产品选自：药物组合物或疫苗组合物；
在本发明应用较佳的实施方式中，肿瘤预防或治疗产品或自身免疫病预防或治疗产品通过如下至少一种方式实现肿瘤的预防或治疗或自身免疫病的预防或治疗：
(1)抗人BTNL2的抗体或其抗原结合片段特异性识别并结合BTNL2，阻断细胞表面配体BTNL2，解除BTNL2对T细胞的抑制；
(2)活化T细胞的增殖和细胞因子的分泌。
第四方面，本发明还提供了一种分离的核酸分子，其编码上述的抗人BTNL2的抗体或其抗原结合片段在制备BTNL2检测产品。
考虑到密码子的简并性，可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，编码上述抗体的基因序列可以进行修改，获得编码相同抗体氨基酸序列的基因；也可以根据表达抗体宿主的密码子偏爱性，人工合成改造基因，以提高抗体的表达效率。
第五方面，本发明还提供了一种重组细胞，其包括：上述的分离的核酸分子。
在本发明应用较佳的实施方式中，重组细胞为细菌、真菌或293细胞、293T细胞、293FT细胞、CHO细胞、COS细胞、Per6细胞。293系列细胞，Per6细胞和CHO细胞是用于生产制备抗体或重组蛋白的常用哺乳动物细胞，为本领域普通技术人员所熟知。
在本发明应用较佳的实施方式中，细菌为农杆菌、分枝杆菌、链霉菌、大肠杆菌或枯草芽孢杆菌。
在本发明应用较佳的实施方式中，真菌为里氏木霉或酵母菌。
上述宿主细胞包括转化体和转化细胞，其包括原代转化细胞和源自其的后代，不考虑传代次数。后代在核酸含量上可能与亲代细胞不完全相同，但可能含有突变。
上述重组细胞，由通过本领域常规方法将重组表达载体转化至宿主细胞(如微生物)中制得；宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，且所携带的外源基因可被有效表达即可。宿主微生物为细菌或真菌。
第六方面，本发明还提供了一种组合物，其包括上述的抗人BTNL2的抗体或其抗原结合片段，组合物为药物组合物或疫苗组合物。
在一种可选的实施方式中，药物组合物包括药用赋形剂、载体和稀释剂中的至少一种。
上述药学上可接受的载体，包括但不限于填充剂、润滑剂、崩解剂、粘合剂、助流剂等。
本发明的优选技术方案中，所述药学上可接受的载体包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮及其衍生物、聚乙烯醇及其衍生物、甲基纤维素及其衍生物、乙基纤维素及其衍生物、羟丙基纤维素及其衍生物、淀粉及其衍生物、聚乙二醇及其衍生物、乳糖、蔗糖、甘露醇、海藻糖、山梨糖醇、糊精、微晶纤维素、丙烯酸树脂、磷酸氢钙、硬脂酸钙、硬脂酰富马酸钠、二氧化硅、二氧化钛、滑石粉、色靛中的一种或其组合。
在一种可选的实施方式中，疫苗组合物除了包括抗人BTNL2的抗体或其抗原结合片段之外，还包括佐剂。佐剂的类型包括不限于：水包油乳液、油包水、水包油包水乳液。
在本发明应用较佳的实施方式中，佐剂选自Toll样受体激动剂、RIG-I样受体激动剂、NOD样受体激动剂、C-型凝集素受体、STING激动剂、细菌毒素及其衍生物、皂苷类、细胞因子和其他佐剂中的至少一种；其他佐剂选自热激蛋白、A151、GTP-GDP、氟化钠、烷基聚丙烯酯多聚体、二甲基双十八烷基季胺溴化物(DDA)的至少一种。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例进行人BTNL2-his蛋白的制备和小鼠抗人BTNL2单克隆抗体的制备。
1.制备人BTNL2-his蛋白
利用基因工程技术构建人BTNL2基因表达载体。我们将人BTNL2 cDNA(如SEQ IDNO：17)构建入pATX2(普健生物公司(AtaGenix)，酶切位点EcoRI/NotI)表达载体，转化，摇菌，提取无内毒素质粒。转染质粒(500μg)到500ml 293F细胞，待细胞活率降至30％左右，收集细胞培养上清,1500rpm离心5分钟去除细胞和细胞碎片，再10000rpm高速离心5钟后用0.45uM滤膜过滤细胞培养上清。将细胞培养上清过镍柱纯化人BTNL2-his蛋白。
2.制备小鼠抗人BTNL2单克隆抗体
(1)人BTNL2-his蛋白免疫小鼠
用制备的人BTNL2-his重组蛋白免疫4只Balb/c小鼠，在小鼠腋窝、脚掌和腹股沟皮下注射1mg/0.025ml抗原进行免疫。先进行初次免疫，再进行2-4次加强免疫，每一次的免疫间隔时间均为14天，最后一次加强免疫后第七天取小鼠血清测效价，测定效价符合标准则腹腔注射0.5ml 200ug/ml抗原溶液进行冲击免疫，三天后取脾脏细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合。
(2)细胞融合
选取进行了冲击免疫并且血清效价符合的小鼠，摘除眼球取血用于杂交瘤筛选的阳性对照，然后颈部脱臼处死小鼠置于75％的酒精中消毒至少30秒，取小鼠脾脏制备成脾细胞悬液并计数，另取SP2/0骨髓瘤细胞并计数，将脾细胞和骨髓瘤细胞按5:1的比例混合在50ml离心管中，1000rpm离心5min，弃去上清，轻弹离心管壁，松动细胞沉淀，将离心管置于37℃水浴中，向细胞沉淀内匀速加入已预热的PEG(1min内加入1ml)，加入PEG过程中，一边转动离心管一边用枪头的尖端温柔地搅拌，静止90s。匀速加入已预热的1640基本培养基(第一次)，1min内加入1ml，边加边温柔地搅拌；匀速加入已预热的1640基本培养基(第二次)，1min内加入2ml，边加边温柔地搅拌；匀速加入已预热的1640基本培养基(第三次)，3min内加入9ml，边加边温柔地搅拌；匀速加入已预热的1640基本培养基，边加边温柔地搅拌直至40ml，将离心管置于37℃水浴中静置3min。已融合的细胞悬液经800rpm离心5min，去上清，轻弹离心管壁，松动细胞沉淀，根据脾细胞数加入适量的HAT培养基，吹打混匀，接种到96孔细胞培养板，HAT选择培养基维持7～10天后换用HT培养液。在选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，收集细胞培养上清开始检测特异性抗体，筛选出含有阳性抗体的孔。
(3)ELISA检测抗体
利用BTNL2-his蛋白抗原溶液100μl(2ug/ml)包被96孔酶标板，4℃孵育过夜。第二天去除包被液，加入5％脱脂牛奶300ul/孔室温封闭1小时，去除封闭液，用PBST洗涤3次，在吸水纸巾上拍干。加一抗100ul/孔37℃孵育60分钟，去除一抗，用PBST洗涤3次，在吸水纸巾上拍干。加入二抗100ul/孔37℃孵育30分钟，去除二抗，用PBST洗涤3次，在吸水纸巾上拍干。加入TMB显色液100ul/孔37℃孵育5-20min，观察显色情况，加入终止液2M盐酸50ul/孔，选择450-620nm波长，酶标仪读取吸光值。
(4)杂交瘤亚克隆
通过有限稀释法对阳性孔杂交瘤细胞进行亚克隆。将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内重悬起来计数，调整为10个细胞/ml，每孔加入稀释细胞100μl，置于37℃8％ CO2培养箱，培养8-9天收培养液上清检测抗体活性，选择单克隆杂交瘤生长良好的阳性孔，转移到24孔板再做亚克隆或扩大培养。
(5)生产小鼠抗人BTNL2单克隆抗体
提前7-21天给小鼠腹腔注射0.5ml弗氏不完全佐剂，收集杂交瘤细胞，密度调整为2×106个/ml，选取注射过不完全佐剂的小鼠腹腔注射杂交瘤细胞2×106/0.5ml/只，细胞注射后7-12天收集小鼠腹水，将小鼠腹水过Protein G亲和层析纯化柱，用0.1M甘氨酸溶液(pH 2.5)进行洗脱，用1M Tris-HCl(pH 9.0)溶液进行中和，PH试纸测试洗脱液是否为中性，然后过50KD的超滤柱，将抗体置换在PBS中，测定抗体浓度，同时取2ug抗体跑胶，通过考马斯亮蓝染色法验证抗体纯度。
(6)验证具有恢复BTNL2对T细胞抑制功能的小鼠抗人BTNL2单克隆抗体
以CD3和CD28抗体(anti-CD3/CD28)诱导原代CD4+、CD8+T细胞的活化，ELISA检测细胞培养上清中IL-2的水平作为T细胞活化和增殖的标志。为了评估hBTNL2-his对T细胞活化的影响，anti-CD3/CD28包被的孔板在hBTNL2-his包被后再铺种PBMC细胞。已获取的研究结果显示，hBTNL2-his对anti-CD3/CD28诱导的PBMC上清中IL-2水平均有显著的抑制效应，提示BTNL2能抑制T细胞的活化，为了验证我们筛选的H2T-3-1-28克隆能否恢复BTNL2对T细胞的抑制，在anti-CD3/CD28包被的孔板上将hBTNL2-his与单克隆株上清预混后共包被，再铺种PBMC细胞，通过ELISA检测IL-2水平，发现H2T-3-1-28的单克隆上清能够显著解除BTNL2对原代T细胞的抑制，如图2所示。
通过细胞功能实验，我们验证出1株能够恢复BTNL2对T细胞抑制的小鼠抗人BTNL2单克隆抗体：克隆号为H2T-3-1-28。
3.杂交瘤细胞测序/可变区基因测序
待杂交瘤细胞长至对数生长期收集细胞(克隆号为H2T-3-1-28)，提取杂交瘤细胞总RNA，利用3’RACE技术与5’RACE技术，RT-PCR得到与全长mRNA互补的第一链cDNA，以合成的cDNA作为模板，PCR扩增获得抗体重链与轻链可变区基因，将抗体可变区基因连接至T载体，转化并挑选阳性克隆进行测序，通过生物信息学分析测序结果，得到抗体可变区基因序列。
ELISA实验检测human BTNL2-His重组蛋白与抗体H2T-3-1-28的结合能力：
向酶标板(Corning，3590)中加入2μg/mL浓度的human BTNL2-His重组蛋白(ACROBiosystems，BT2-H81Q5)，共24孔，每孔100μL，封板后于4°C孵育过夜；去除抗原溶液，用0.05％ PBST(PBS，西安赫特生物，BF001；Tween-20，生工生物，A100777)缓冲液洗涤孔板3次，每次200μL/孔，吸出或倒置孔板去除全部洗涤液；用含1％ BSA(生工生物，A500023-0100)的PBS缓冲液封闭，每孔300μL，封板后于室温孵育1小时；去除封闭溶液，用0.05％PBST缓冲液洗涤孔板5次，每次200μL/孔，吸出或倒置孔板去除全部洗涤液；加入实验组抗体H2T-3-1-28或对照组抗体Blank，每组首孔为10μg/mL，以4倍梯度稀释依次至11个孔，末孔为空白缓冲液，共12孔，每孔100μL，封板后于室温孵育1小时；去除抗体溶液，用0.05％PBST缓冲液洗涤板5次，每次200μL/孔，吸出或倒置孔板去除全部洗涤液；加入二抗GoatAnti-Human IgG-HRP(Sino biologica，SSA001)，以1:10000稀释，每孔100uL，封板后于室温孵育1小时；去除二抗溶液，用0.05％ PBST缓冲液洗涤孔板5次，每次200μL/孔，吸出或倒置孔板去除全部洗涤液；加入TMB(北京梅科万德，1001)底物溶液，每孔100uL，避光于室温显色；达到所需的强度后，向加入1M H2SO4溶液终止反应，每孔50μL；用酶联仪测量450nm吸光度；用样品读数与两组抗体浓度的相关性绘制曲线。ELISA结果显示(图1)，抗体H2T-3-1-28与human BTNL2-His重组蛋白具有较高的亲和力。
实施例2
本实施例对实施例1筛选获得的抗人BTNL2的鼠源抗体进行抗体特性的鉴定。
1.抗人BTNL2抗体H2T-3-1-28能促进T淋巴细胞对人肺癌细胞的杀伤作用。
在高亲和96孔板中包被T细胞激活剂浓度为2μg/mL的抗CD3抗体及浓度为1μg/mL为抗CD28抗体，每孔100μL，4℃包被过夜；用试剂盒(Miltenyi Biotec，130-104-075)分离小鼠脾脏CD8+T细胞；将抗体H2T-3-1-28按照0μg/mL、10μg/mL及20μg/mL的浓度加入到密度为2×105/mL、体积为100μL的H460细胞(人大细胞肺癌细胞)中，37℃共孵育30min；按照H460：T细胞的比例为1:1、1:2及1:10的比例将细胞分别种到预包被T细胞激活剂的孔板中；37℃细胞培养18-24h；使用FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit(BD Pharmingen，556547)通过流式细胞仪检测凋亡细胞比例，结果如图3所示。图3中的对照IgG为Mouse IgG(碧云天,A7050)。
结果显示，人BTNL2的鼠源抗体对人肺癌细胞的具有良好的杀伤作用，且具有剂量依赖性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抗人BTNL2的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其包括如SEQ ID NO：1所示的重链可变区中的重链互补决定区，和如SEQ ID NO：2所示的轻链可变区中的轻链互补决定区。
2.根据权利要求1所述的抗人BTNL2的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链互补决定区包括：CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其氨基酸序列依次为SEQ ID NO：3-5所示，所述轻链互补决定区包括CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其氨基酸序列依次为SEQ ID NO：6-8所示。
3.根据权利要求2所述的抗人BTNL2的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段还包括重链框架区，和/或，轻链框架区；
优选地，所述重链框架区包括依次与SEQ ID NO:9-12所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的HFR1、HFR2、HFR3及HFR4；
所述轻链框架区包括依次与SEQ ID NO:13-16所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的LFR1、LFR2、LFR3及LFR4；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段还包括恒定区，所述恒定区包括重链恒定区，和/或，轻链恒定区；
优选地，所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的重链恒定区；所述轻链恒定区选自κ型或λ型轻链恒定区；
优选地，所述恒定区的种属来源为牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、或人；
优选地，所述恒定区的种属来源为人；
优选地，所述抗原结合片段选自所述抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、Fab′-SH和scFv中的任意一种；
优选地，所述抗体是嵌合抗体。
4.一种生物产品，其特征在于，其包括：权利要求1-3任一项所述的抗人BTNL2的抗体或其抗原结合片段，所述生物产品选自：试剂、试剂盒、试纸条、抗体芯片、抗体探针、抗体与化学药物的偶联物、亲和层析柱或检测仪。
5.根据权利要求4所述的生物产品，其特征在于，所述生物产品为检测功能的产品时，在所述抗人BTNL2的抗体或其抗原结合片段上标记有可被检测的标记物；
优选地，所述可被检测的标记物选自荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的生物产品，其特征在于，所述试剂盒包括固相，所述抗体或其抗原结合片段被包被于固相；
优选地，所述固相选自微球、板和膜；
优选地，所述固相选自磁性微球、塑料微球、塑胶微粒、乳胶微球、微孔板、玻璃、毛细管、尼龙和硝酸纤维素膜。
7.权利要求1-3任一项所述的抗人BTNL2的抗体或其抗原结合片段在制备如下至少一种产品中的应用：
(1)BTNL2检测产品；
(2)肿瘤诊断或辅助诊断产品；
(3)自身免疫病诊断或辅助诊断产品；
(4)BTNL2富集产品；
(5)肿瘤预防或治疗产品；
(6)自身免疫病预防或治疗产品；
(7)与联用药物在制备肿瘤预防或治疗产品中的应用；
(8)与联用药物在制备自身免疫病预防或治疗产品中的应用；
优选地，所述检测产品、诊断产品或辅助诊断为试剂、试剂盒、试纸条、抗体芯片、抗体探针或检测仪；
优选地，所述肿瘤或自身免疫病是以BTNL2为标志物；
优选地，所述肿瘤选自人黑色素瘤、肺癌、结肠癌、胰腺癌、神经母细胞瘤、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、非小细胞肺癌、胃癌、肾上腺皮质癌、宫颈鳞状细胞癌、胆管癌、食管癌、头颈部鳞状细胞癌、甲状腺癌、膀胱癌、胸腺瘤或子宫内膜癌；
优选地，所述自身免疫病选自肠炎、史蒂文斯-约翰逊综合征、系统性红斑狼疮、再生障碍性贫血、肌炎、多发性关节炎、特发性血小板减少症、结节病、干燥综合征、葡萄膜炎、肺纤维化、类风湿性关节炎、重症肌无力、牛皮癣、肝硬化、再生障碍性贫血、脑病、多发性硬化症、硬皮病和慢性肝炎中的至少一种；
优选地，所述肠炎是克罗恩病或溃疡性结肠炎；
优选地，所述肠炎是医源性自身免疫性结肠炎；
优选地，所述医源性自身免疫性结肠炎选自由一种或多种化疗剂诱导的结肠炎、由过继性细胞疗法治疗诱导的结肠炎、和由一种或多种同种免疫性疾病相关的结肠炎；
优选地，所述肿瘤预防或治疗产品或自身免疫病预防或治疗产品选自：药物组合物或疫苗组合物；
优选地，所述肿瘤预防或治疗产品或自身免疫病预防或治疗产品通过如下至少一种方式实现肿瘤的预防或治疗或自身免疫病的预防或治疗：
(1)所述抗人BTNL2的抗体或其抗原结合片段特异性识别并结合BTNL2，阻断细胞表面配体BTNL2，解除BTNL2对T细胞的抑制；
(2)活化T细胞的增殖和细胞因子的分泌。
8.一种分离的核酸分子，其特征在于，其编码权利要求1-3任一项所述的抗人BTNL2的抗体或其抗原结合片段在制备BTNL2检测产品。
9.一种重组细胞，其特征在于，其包括：权利要求8所述的分离的核酸分子。
10.一种组合物，其特征在于，其包括权利要求1-3任一项所述的抗人BTNL2的抗体或其抗原结合片段，所述组合物为药物组合物或疫苗组合物。
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