CN1188526C - 一种基因克隆的高效方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出一种用于克隆基因组DNA的高效方法。构建的克隆载体经特定的限制性内切酶酶切后,产生的粘性末端能与Sau3A I(或Sau3A I的同尾酶)部分酶切的基因组片段补加一个碱基dGTP后的粘性末端匹配,可有效地构建基因组文库,也能克隆PCR产物。该方法选用的限制性内切酶可以是Ear I和Sap I中的任一种。使用该载体克隆PCR产物时需在PCR引物的5′端额外引进Sau3A I酶切位点,在dGTP存在的条件下,利用T4DNA聚合酶的3′~5′切酶活性消化,即能产生与载体双酶切得到粘性末端匹配的末端,因而也能有效地克隆PCR产物。
Description
技术领域
本发明涉及的是生物克隆方法,特别是一种基因克隆的高效方法,适合于克隆基因组DNA和PCR扩增产物。
背景资料
原核生物基因的克隆可以通过构建基因组文库方法来筛选目的基因,也可通过PCR扩增目的基因的方法来克隆。
目前最常见的基因组文库的构建方法是这样的。基因组DNA用Sau3AI部分酶切后,克隆到经BamHI酶切,去磷酸化的载体上,或基因组DNA用Sau3AI部分酶切,经半补平克隆到经Sal I(或Xho I)酶切,半补平的载体上。这两种方法均存在着不足,众所周知,载体去磷酸化反应难以控制,对转化效率影响很大,而载体和基因组半补平反应效率也不高,这都造成克隆效率低下的结果。
PCR产物的克隆目前常用的方法有限制性内切酶位点添加法、尿嘧啶DNA糖基化酶克隆法、不依赖连接反应的克隆法、T/A克隆法及平端克隆法。限制性内切酶位点添加法克隆PCR产物,需在PCR扩增后再增加几步处理过程,不仅花费时间,而且会损失DNA,降低克隆效率,而且基因内部存在的限制性酶切位点常常会妨碍这种方法的应用;不依赖连接反应的克隆方法引入非基因序列过多;而平端克隆效率很低;T/A克隆法是最流行的PCR产物克隆的方法,但使用T载体克隆,只能用缺乏3′~5′校正酶活性的DNA聚合酶(如Taq聚合酶)或这类酶与其它类聚合酶的混合物扩增目的基因,不适合于单一的具有3′~5′校正酶活性的DNA聚合酶扩增的PCR产物。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效基因克隆的方法,既可用来高效构建基因组文库,也适用于克隆任何一种DNA聚合酶扩增的PCR产物。
本发明是这样实现的。按克隆的要求选择载体和外源基因DNA片段。在载体上串联两个限制性内切酶的酶切位点(如Ear I或Sap I),经Ear I(或SapI)酶切或Ear I和Sap I双酶切产生5′端突出3个碱基的粘性末端:
5′ CTCTTCC 3′
3′ GAGAAGGCTA 5′;
外源基因组DNA用限制性内切酶Sau 3A I,或Sau 3A I的同尾酶酶切后,用Klenow酶补加一个碱基(dGTP),形成能与载体粘性末端匹配的粘性末端:
5′ NG
3′ NCTAG 5′;
或者在克隆PCR产物时,扩增引物的两端分别引入额外的3~4个核苷酸如Sau3A I酶切位点,得到的产物在dGTP存在下,被T4 DNA聚合酶削出5′端突出3个碱基的粘性末端;5′ GATC 3′
3′ G 5′恰好与载体酶切形成的粘性末端匹配。
载体与上述方法修饰过的基因组DNA片段或PCR产物通过三个碱基的粘性末端互补而连接起来。
载体选用的限制性内切酶可以是Ear I和Sap I中的任何一种,或者是这两种酶的组合,消化外源片段所选用的内切酶可以是Sau3A I,也可用其它Sau3A I的同尾酶。
本发明的原理是根据碱基互补配对的原则,使克隆载体与外源DNA片段产生能相互匹配的粘性末端,同时避免载体自连和外源片段串联,从而极大地提高克隆效率。
本发明不仅可用于基因组文库的构建,还可用于PCR产物的克隆,且适合各种DNA聚合酶扩增的PCR产物的克隆,克隆效率均优于现行的克隆方法。按本发明的方法克隆效率可达90%以上。
具体实施方式
实施例1
枯草芽孢杆菌外切菊粉酶基因的克隆:
首先通过定点诱变消除载体pUC18上的三个Ear I酶切位点,再接上一个含两个串联Ear I酶切位点的接头,构建好克隆载体,该克隆载体用Ear I酶切,回收大片段,片段两端均有一个5′端突出3个碱基的粘性末端。抽提枯草芽孢杆菌基因组DNA,用Sau3A I部分酶切并回收2~6kb片段,加dGTP,给Klenow酶作用后,片段两端均产生一个5′端突出3个碱基的粘性末端。然后该片段与酶切后回收的克隆载体连接,再转化大肠杆菌DH5a,通过特异性选择平板筛选到含目的基因的克隆,克隆重组效率达90%以上。
实施例2
短小芽孢杆菌内切-β-1,4-葡聚糖酶基因的克隆:
首先定点诱变消除载体pUC18上的一个Sap I位点,接上一个含两个串联Sap I酶切位点的接头,构建好克隆载体,用Sap I酶切该克隆载体,回收大片段,片段两端均有一个5′端突出3个碱基的粘性末端。根据已发表的内切-β-1,4-葡聚糖酶基因序列设计引物,并在5′端引入四个核苷酸5′GATC3′,扩增产物加dGTP和T4 DNA聚合酶作用后,产生5′端突出3个碱基的粘性末端。然后将该PCR产物与酶切后克隆载体连接,再转化大肠杆菌DH5a,通过特异性选择平板筛选到含目的基因的克隆。
限制性内切酶Ear I和Sap I是购自Biolab公司。
Claims (2)
1、基因克隆的高效方法,按克隆的要求选择载体和外源基因DNA片段,其特征在于在载体上串联EarI或SapI两个限制性内切酶的酶切位点,经EarI或SapI酶切或EarI和SapI双酶切产生5′端突出3个碱基的粘性末端:
5′ CTCTTCC 3′
3′ GAGAAGGCTA 5′;
外源基因组DNA用限制性内切酶Sau 3A I,或Sau 3A I的同尾酶酶切后,用Klenow酶补加一个碱基(dGTP),形成能与载体粘性末端匹配的粘性末端;
5 ′ NG
3′ NCTAG 5′;
或者在克隆PCR产物时,扩增引物的两端分别引入额外的3~4个核苷酸Sau3A I酶切位点,得到的产物在dGTP存在下,被T4 DNA聚合酶削出5′端突出3个碱基的粘性末端; 5′ GATC 3′
3′ G 5′
恰好与载体酶切形成的粘性末端匹配,载体与基因组DNA片段或PCR产物通过三个碱基的粘性末端互补而连接起来,因而外源DNA片段能克隆到载体上。
2、根据权利要求1所述的克隆方法,其特征在于该方法用于构建基因组文库,或者用于克隆用各种DNA聚合酶扩增的PCR产物。
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