CN1188526C - 一种基因克隆的高效方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出一种用于克隆基因组DNA的高效方法。构建的克隆载体经特定的限制性内切酶酶切后，产生的粘性末端能与Sau3A I(或Sau3A I的同尾酶)部分酶切的基因组片段补加一个碱基dGTP后的粘性末端匹配，可有效地构建基因组文库，也能克隆PCR产物。该方法选用的限制性内切酶可以是Ear I和Sap I中的任一种。使用该载体克隆PCR产物时需在PCR引物的5′端额外引进Sau3A I酶切位点，在dGTP存在的条件下，利用T₄DNA聚合酶的3′～5′切酶活性消化，即能产生与载体双酶切得到粘性末端匹配的末端，因而也能有效地克隆PCR产物。

Description

一种基因克隆的高效方法

                         技术领域

本发明涉及的是生物克隆方法，特别是一种基因克隆的高效方法，适合于克隆基因组DNA和PCR扩增产物。

                         背景资料

原核生物基因的克隆可以通过构建基因组文库方法来筛选目的基因，也可通过PCR扩增目的基因的方法来克隆。

目前最常见的基因组文库的构建方法是这样的。基因组DNA用Sau3AI部分酶切后，克隆到经BamHI酶切，去磷酸化的载体上，或基因组DNA用Sau3AI部分酶切，经半补平克隆到经Sal I(或Xho I)酶切，半补平的载体上。这两种方法均存在着不足，众所周知，载体去磷酸化反应难以控制，对转化效率影响很大，而载体和基因组半补平反应效率也不高，这都造成克隆效率低下的结果。

PCR产物的克隆目前常用的方法有限制性内切酶位点添加法、尿嘧啶DNA糖基化酶克隆法、不依赖连接反应的克隆法、T/A克隆法及平端克隆法。限制性内切酶位点添加法克隆PCR产物，需在PCR扩增后再增加几步处理过程，不仅花费时间，而且会损失DNA，降低克隆效率，而且基因内部存在的限制性酶切位点常常会妨碍这种方法的应用；不依赖连接反应的克隆方法引入非基因序列过多；而平端克隆效率很低；T/A克隆法是最流行的PCR产物克隆的方法，但使用T载体克隆，只能用缺乏3′～5′校正酶活性的DNA聚合酶(如Taq聚合酶)或这类酶与其它类聚合酶的混合物扩增目的基因，不适合于单一的具有3′～5′校正酶活性的DNA聚合酶扩增的PCR产物。

                         发明内容

本发明的目的是提供一种高效基因克隆的方法，既可用来高效构建基因组文库，也适用于克隆任何一种DNA聚合酶扩增的PCR产物。

本发明是这样实现的。按克隆的要求选择载体和外源基因DNA片段。在载体上串联两个限制性内切酶的酶切位点(如Ear I或Sap I)，经Ear I(或SapI)酶切或Ear I和Sap I双酶切产生5′端突出3个碱基的粘性末端：

5′    CTCTTCC       3′

3′    GAGAAGGCTA    5′；

外源基因组DNA用限制性内切酶Sau 3A I，或Sau 3A I的同尾酶酶切后，用Klenow酶补加一个碱基(dGTP)，形成能与载体粘性末端匹配的粘性末端：

5′    NG

3′    NCTAG    5′；

或者在克隆PCR产物时，扩增引物的两端分别引入额外的3～4个核苷酸如Sau3A I酶切位点，得到的产物在dGTP存在下，被T₄ DNA聚合酶削出5′端突出3个碱基的粘性末端；5′    GATC    3′

                     3′    G       5′恰好与载体酶切形成的粘性末端匹配。

载体与上述方法修饰过的基因组DNA片段或PCR产物通过三个碱基的粘性末端互补而连接起来。

载体选用的限制性内切酶可以是Ear I和Sap I中的任何一种，或者是这两种酶的组合，消化外源片段所选用的内切酶可以是Sau3A I，也可用其它Sau3A I的同尾酶。

本发明的原理是根据碱基互补配对的原则，使克隆载体与外源DNA片段产生能相互匹配的粘性末端，同时避免载体自连和外源片段串联，从而极大地提高克隆效率。

本发明不仅可用于基因组文库的构建，还可用于PCR产物的克隆，且适合各种DNA聚合酶扩增的PCR产物的克隆，克隆效率均优于现行的克隆方法。按本发明的方法克隆效率可达90％以上。

                       具体实施方式

实施例1

枯草芽孢杆菌外切菊粉酶基因的克隆：

首先通过定点诱变消除载体pUC18上的三个Ear I酶切位点，再接上一个含两个串联Ear I酶切位点的接头，构建好克隆载体，该克隆载体用Ear I酶切，回收大片段，片段两端均有一个5′端突出3个碱基的粘性末端。抽提枯草芽孢杆菌基因组DNA，用Sau3A I部分酶切并回收2～6kb片段，加dGTP，给Klenow酶作用后，片段两端均产生一个5′端突出3个碱基的粘性末端。然后该片段与酶切后回收的克隆载体连接，再转化大肠杆菌DH5a，通过特异性选择平板筛选到含目的基因的克隆，克隆重组效率达90％以上。

实施例2

短小芽孢杆菌内切-β-1，4-葡聚糖酶基因的克隆：

首先定点诱变消除载体pUC18上的一个Sap I位点，接上一个含两个串联Sap I酶切位点的接头，构建好克隆载体，用Sap I酶切该克隆载体，回收大片段，片段两端均有一个5′端突出3个碱基的粘性末端。根据已发表的内切-β-1，4-葡聚糖酶基因序列设计引物，并在5′端引入四个核苷酸5′GATC3′，扩增产物加dGTP和T₄ DNA聚合酶作用后，产生5′端突出3个碱基的粘性末端。然后将该PCR产物与酶切后克隆载体连接，再转化大肠杆菌DH5a，通过特异性选择平板筛选到含目的基因的克隆。

限制性内切酶Ear I和Sap I是购自Biolab公司。

Claims (2)

1、基因克隆的高效方法，按克隆的要求选择载体和外源基因DNA片段，其特征在于在载体上串联EarI或SapI两个限制性内切酶的酶切位点，经EarI或SapI酶切或EarI和SapI双酶切产生5′端突出3个碱基的粘性末端：

5′                CTCTTCC                 3′

3′                GAGAAGGCTA              5′；

外源基因组DNA用限制性内切酶Sau 3A I，或Sau 3A I的同尾酶酶切后，用Klenow酶补加一个碱基(dGTP)，形成能与载体粘性末端匹配的粘性末端；

5  ′              NG

3′                NCTAG                    5′；

或者在克隆PCR产物时，扩增引物的两端分别引入额外的3～4个核苷酸Sau3A I酶切位点，得到的产物在dGTP存在下，被T4 DNA聚合酶削出5′端突出3个碱基的粘性末端；  5′    GATC    3′

                   3′    G       5′

恰好与载体酶切形成的粘性末端匹配，载体与基因组DNA片段或PCR产物通过三个碱基的粘性末端互补而连接起来，因而外源DNA片段能克隆到载体上。

2、根据权利要求1所述的克隆方法，其特征在于该方法用于构建基因组文库，或者用于克隆用各种DNA聚合酶扩增的PCR产物。