CN118806991A - hEGF和PDGF-BB丝胶水凝胶材料的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了hEGF和PDGF‑BB丝胶水凝胶材料的制备方法及其应用，本发明利用种质创制生物合成人表皮细胞生长因子（hEGF）和血小板衍生生长因子（PDGF‑BB）蚕丝的家蚕种质素材，再利用获得的hEGF和PDGF‑BB功能性蚕丝，开发双细胞因子丝胶水凝胶材料。最后，将开发的双细胞因子丝胶水凝胶材料用于修复糖尿病慢性伤口，并对其促进糖尿病慢性伤口愈合的治疗效果以及作用机制进行了系统研究。结果发现，制得的丝胶水凝胶材料能够促进细胞增殖，促进慢性创面愈合，可以用于糖尿病慢性创面愈合材料。

Description

hEGF和PDGF-BB丝胶水凝胶材料的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物材料，具体涉及hEGF和PDGF-BB丝胶水凝胶材料的制备方法，还涉及hEGF和PDGF-BB丝胶水凝胶材料的应用。

背景技术

随着人们生活水平的提高，糖尿病患者的人数也在逐年增加，尤其是肥胖者患糖尿病的概率也更高，然而糖尿病所引起的足部溃疡感染导致截肢的风险比非糖尿病患者要高10-20倍，因此如何能够有效的促进糖尿病所引起的慢性创面愈合是目前研究的焦点。伤口愈合是一个高度复杂，并且需要互相调控的过程，在这一过程中，生长因子担负着重要的角色，生长因子通过促进细胞的增殖和迁移从而促进伤口的愈合，因此在近几年生长因子疗法也逐渐受到越来越多人的关注，除此之外，针对慢性伤口治疗的伤口敷料种类繁多，人们期望于理想的伤口敷料既能够保护伤口免受外界环境的感染，又能够对伤口的愈合有促进作用，其中水凝胶因为其自身独特的优势：可以吸收并且保留水分，保持湿润的伤口环境；具有生物可降解性和生物相容性；保护伤口免受外部环境的影响等受到研究者的青睐，并且新型的水凝胶可以装载生长因子、药物、干细胞等生物活性物质，从而使得水凝胶作为伤口敷料更加受到人们的关注。

表皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF)是一种生长因子，是由53个氨基酸残基组成的单一多肽，具有调节细胞增殖、迁移、分化的功能。据研究表明，施用外源的重组表达人表皮生长因子(human recombinant epidermal growth factor，rhEGF)可以促进皮肤伤口的愈合，并且在放疗或化疗相关的皮肤反应，治疗特应性皮炎、皮肤老化和色素沉积等方面也有非常大的优势，在临床研究中，表皮生长因子在治疗坏死性小肠结肠炎等方面也有非常大的优势。与此同时，血小板衍生生长因子(Platelet-derived growthfactor，PDGF)是由二硫键连接起来的二聚体蛋白，它有五种不同的亚型，分别是PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-CC、PDGF-DD和PDGF-AB，其中PDGF-AB为异二聚体，PDGF是一种有效的细胞分裂原，通常在胚胎发育、细胞增殖、细胞迁移和血管生成等方面发挥作用。然而，由于细胞因子的来源少，成本高，安全性，易降解，以及缺合适的递送系统等局限，极大地限制了其在组织工程领域应用。

蚕的丝腺是合成、分泌蚕丝蛋白的器官，是整个蚕丝业的生物学基础。经过数千年的人工驯化，家蚕的丝腺具备了超强的蛋白质合成与分泌能力，一头体重5g左右家蚕能合成分泌约0.5g蚕丝蛋白，为目前已知昆虫之最，这一特征使其成为理想的生物反应器模型，备受各国研究人员关注并竞相开发利用。近年来，国内外研究人员建立了基于piggyBac转座子的蚕丝素表达体系和丝胶表达体系，并先后对数十种外源蛋白进行了表达研究。其中，利用丝素表达体系融合表达了：EGFP(Shimizu et al.2007；Zhao et al.2010)，猫干扰素(Kurihara etal.2007)，蜘蛛丝牵引蛋白(Zhu et al.2010)，人Ⅲ型胶原蛋白的部分肽段(Tomita et al.2003；Adachi et al.2006；Yanagisawa et al.,2007)，FGF2(Hino etal.2006)，以及RFP(Royer et al.2005)等；利用丝胶体系重组表达了：EGFP(Tomita etal.2007)、鼠单克隆抗体(Iizuka et al.2009)，人胶原蛋白α链基因(Adachi etal.2010)，GM-Csf受体α(Urano et al.2010)，FGF1(Feng Wang et al.,2015)，PDGF-BB(Wenjing Chen et al.,2018)，Lactoferrin(Sheng Xu et al.,2019)，CTGF(YuanchengWang et al.,2020)，人超氧化物歧化酶3(Feng Wang et al.,2023)，以及人血清白蛋白(Ogawa et al.2007；Huanhuan Tan et al.,2023)等。综上表明，利用家蚕丝腺作为生物反应器，生产具有高附加值的外源蛋白，不仅具有广阔的市场前景，同时也能打破家蚕只能作为传统产业的壁垒，为家蚕新型产业的开发提供基础技术体系保障。

与此同时，蚕丝本身也是一种力学性能和生物相容性优异的生物基材料。首先，蚕丝中的丝素蛋白较其他天然纤维机械特性好，可加工成膜支架或其他形式，如电纺丝，电纺膜，凝胶，生物膜，微球以及支架等，表面易化学共价修饰粘附位点和细胞因子，可被生物降解，且其降解速率可控，降解产物不仅对周围组织无毒副作用，而且对周围组织有营养和修复作用，可模拟细胞外基质，为细胞黏附、增殖以及分化成组织提供良好的环境和支撑。其次，蚕丝中丝胶蛋白因其亲水性、生物相容性和生物降解性，近来被认为是一种有潜力的生物应用生物材料，可以被制成与组织工程和再生有关的特性的水凝胶，薄膜或3D支架。目前丝胶材料的医学应用主要有伤口敷料，药物输送，修复神经损伤。因此，通过家蚕丝腺生物合成技术，对蚕丝进行定向设计和功能化遗传改良，将进一步拓展蚕丝以及合成的各类外源蛋白在组织医学领域的应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种hEGF和PDGF-BB丝胶水凝胶材料的制备方法；本发明的目的之二在于提供由所述制备方法制得的hEGF和PDGF-BB丝胶水凝胶材料；本发明的目的之三在于提供所述hEGF和PDGF-BB丝胶水凝胶材料在制备促进细胞增殖的伤口敷料中的应用；本发明的目的之四在于提供所述hEGF和PDGF-BB丝胶水凝胶材料在制备促慢性创面愈合的敷料中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、hEGF和PDGF-BB丝胶水凝胶材料的制备方法，以浴比为1.5-6％(w/v)分别对人表皮细胞生长因子hEGF蚕丝和血小板衍生生长因子PDGF-BB蚕丝提取含人表皮细胞生长因子hEGF蚕丝和血小板衍生生长因子PDGF-BB的丝胶，将含人表皮细胞生长因子hEGF丝胶和血小板衍生生长因子PDGF-BB丝胶按体积比为1：1混合，在温度为0～10℃下透析诱导成胶及除盐除杂。

本发明优选的，所述人表皮细胞生长因子hEGF丝胶和血小板衍生生长因子PDGF-BB丝胶中人表皮细胞生长因子hEGF浓度0.1-0.5μg/mL；血小板衍生生长因子PDGF-BB的浓度高于1.0-4.0μg/mL。

本发明优选的，提取丝胶的方法是将表皮细胞生长因子hEGF蚕丝或血小板衍生生长因子PDGF-BB蚕丝粉碎后，溶于萃取缓冲液中，置于60-100℃的水浴锅中提取30-60min，过滤离心收集上清液为含人表皮细胞生长因子hEGF蚕丝或血小板衍生生长因子PDGF-BB的丝胶；所述萃取缓冲液为4-8M尿素，20-200mM Tris-Cl，pH 6.8-7.3的溶液。

2、由所述制备方法制得的hEGF和PDGF-BB丝胶水凝胶材料。

3、所述hEGF和PDGF-BB丝胶水凝胶材料在制备促进细胞增殖的伤口敷料中的应用。

4、所述hEGF和PDGF-BB丝胶水凝胶材料在制备促慢性创面愈合的敷料中的应用。

本发明优选的，所述促慢性创面愈合为糖尿病慢性创面愈合。

本发明的有益效果在于：本发明利用种质创制生物合成人表皮细胞生长因子(hEGF)和血小板衍生生长因子(PDGF-BB)蚕丝的家蚕种质素材，再利用获得的hEGF和PDGF-BB功能性蚕丝，开发双细胞因子丝胶水凝胶材料。最后，将开发的双细胞因子丝胶水凝胶材料用于修复糖尿病慢性伤口，并对其促进糖尿病慢性伤口愈合的治疗效果以及作用机制进行了系统研究。结果发现，制得的丝胶水凝胶材料能够促进细胞增殖，促进慢性创面愈合，可以用于糖尿病慢性创面愈合材料。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为不同蚕丝浓度水凝胶的成胶情况与扫描电镜(A：6～1％(w/v)提取浴比制备的丝胶水凝胶成胶情况(左)，以及3％(w/v)提取浴比制成的丝胶水凝胶样品图(右)；B：6～1％(w/v)提取浴比制备的丝胶水凝胶的扫描电镜图；比例尺为200μm；C：不同浴比制备的丝胶水凝胶的孔径大小统计；D：不同浴比制备的丝胶水凝胶的孔隙率统计；E：不同浴比制备的丝胶水凝胶的吸水率对比；F：CCK-8检测细胞在不同浴比制备的丝胶水凝胶表面的贴附情况；G：不同丝胶水凝胶的粘弹性；H：不同丝胶水凝胶的振幅扫描)。

图2为EGF/PDGF-BB双细胞因子丝胶水凝胶的制备与表征(A：转EGF和PDGF-BB基因载体示意图；B：SDS-PAGE检测蚕丝中的EGF蛋白(左)和PDGF-BB蛋白(右)；C：EGF/PDGF-BB双细胞因子丝胶水凝胶实物图，标尺大小1cm；D：SEM观察不同细胞因子丝胶水凝胶的表面结构；E：制备的细胞因子丝胶水凝胶的体外降解)。

图3为EGF-PDGF-BB双细胞因子丝胶水凝胶的细胞粘附和缓释特征(A：不同细胞因子丝胶水凝胶表面的细胞贴附情况；B：CCK-8检测不同细胞因子丝胶水凝胶的细胞贴附能力；C：EGF在丝胶水凝胶中的缓释特征；D)PDGF-BB在丝胶水凝胶中的缓释特征)。

图4为EGF-PDGF-BB双细胞因子丝胶水凝胶的生物相容性评价(A：水凝胶的体外毒性检测，绿色荧光代表活细胞，红色荧光代表死细胞，比例尺为200μm；B：体外溶血试验；C：溶血率统计，显示为平均值±标准差(n＝3))。

图5为EGF-PDGF-BB双细胞因子丝胶水凝胶的细胞炎症检测(A：Raw264.7细胞的形态，白光图显示Raw264.7细胞的形态，红色荧光表示细胞骨架，蓝色荧光表示为细胞核，比例尺为100μm；B：细胞直径；C：细胞面积，数据显示为平均值±标准差(n＝10))。

图6为EGF/PDGF-BB双细胞因子丝胶水凝胶促进细胞增殖的效果性评估(A：EDU检测细胞增殖；B：CCK-8检测双生长因子丝胶水凝胶的促细胞增殖功效；数据显示为平均值±标准差(n＝3)，比例尺为200μm)。

图7为双生长因子丝胶水凝胶促进细胞迁移情况。比例尺为300μm。

图8EGF-PDGF-BB丝胶水凝胶促进糖尿病小鼠创面愈合(A：构建慢创模型和愈合分析流程图；B：12d内伤口愈合分析；C：第12d小鼠伤口愈合面积统计；D：第12d小鼠伤口愈合统计率；E：第12d小鼠伤口的疤痕宽度统计。数据显示为平均值±标准差(n＝3))。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1、丝胶水凝胶的制备工艺

首先，将天然削口蚕茧经过液氮冷却后粉碎，溶于萃取缓冲液(4-8M尿素，20-200mM Tris-cl，pH 6.8-7.3)溶液中，置于60-100℃的水浴锅中提取丝胶蛋白30-60min。随后，提取样品经过滤和离心处理，获得上清液溶液。

为验证不同提取浴比所获得的丝胶蛋白总浓度，以及对水凝胶的影响。以6％(w/v)、5％(w/v)、4％(w/v)、3％(w/v)、2.5％(w/v)、2％(w/v)、1.5％(w/v)、1％(w/v)提取浴比制备8种丝胶丝胶总浓度，称为A液。然后将不同浓度的A液倒入透析袋(MWCO 3500Da,Spectrum Laboratory,Inc.,USA)中，并至于4℃低温环境诱导形成凝胶，期间每6小时置换去离子水，累计6-9次，以彻底去除溶液中的尿素，制得不同浓度的丝胶水凝胶。

结果发现：1.5-6％(w/v)浴比区间的提取液能在3天内形成水凝胶，而1％(w/v)浴比及其以下的提取液因为其丝胶含量过低不能形成凝胶(图1，A)。随后，将不同A液所制备的丝胶水凝胶样品进行扫描电镜(SEM)观察各自内部的空间结构。结果发现：不同水凝胶的内部呈现相连的多孔结构，且丝胶含量越高，材料越致密，材料内部的孔径就越小(图1，B)。其中，3-5％(w/v)浴比的水凝胶孔径在160-190μm之间(图1，C)，适合组织愈合的材料孔径要求。对不同样品的孔隙率和吸水率进行测定。结果发现：丝胶水凝胶的孔隙率随着丝胶含量的增加逐渐减小(图1，D)，而不同浓度的丝胶水凝胶的吸水率无明显变化，均在96％左右(图1，E)。进一步对不同浓度丝胶水凝胶材料的流变性能进行了测试。结果发现：随着丝胶浓度的增加，丝胶水凝胶材料的粘弹性逐渐增加，代表材料固体特性的储能模量也逐渐增加，而6％(w/v)和5％(w/v)浴比的储能模量几乎重合，无明显差异(图1，G-H)。细胞的贴附能力是衡量材料性能的一个重点指标，为测试不同丝胶水凝胶的细胞粘附力，将HaCaT细胞接种到不同浓度的丝胶水凝胶表面，4h后观察细胞贴附效果。结果发现：细胞在水凝胶的表面伸展呈现梭状，说明细胞贴附状态良好，CCK-8检测显示，不同n浓度的丝胶水凝胶表面贴附的细胞数目一致，且与TCP对照组无明显差异(图1，F)，说明所制备的丝胶水凝胶具有优异的细胞粘附特性。综上所示，采用5％(w/v)浴比提取的丝胶溶液所制成的丝胶水凝胶孔径大小约为163.25μm，其固体特性更为稳定，也易于后续材料的加工，具有良好的细胞相容性，更适合伤口组织愈合所需要的材料要求。

实施例2、人表皮细胞生长因子(hEGF)和血小板衍生生长因子(PDGF-BB)蚕丝的生物合成

本发明所用的人表皮细胞生长因子(hEGF)和血小板衍生生长因子(PDGF-BB)蚕丝原料由公开号为CN116239667A，发明名称为：具有促细胞增殖活性的ehEGF重组蛋白及其制备方法和应用；和公开号为CN110354307A，发明名称为基于转人血小板衍生生长因子基因蚕丝的蛋白丝胶凝胶及其制备方法和应用的中国专利制备的转hEGF基因家蚕和转PDGF-BB基因的蚕丝作为材料原料，转基因载体如图2中A所示。

hEGF蚕丝和PDGF-BB蚕丝中活性重组蛋白的提取与定量：

分别将转hEGF基因家蚕和转PDGF-BB基因家蚕的蚕卵置于25℃，相对湿度85％的环境中孵化，孵化的幼虫(G1代)采用人工饲料或桑叶饲育至上簇吐丝节茧，获得hEGF和PDGF-BB蚕茧。蚕茧总蛋白中重组蛋白的提取和检测方法：分别将新鲜的hEGF蚕茧和PDGF-BB蚕茧于液氮中粉碎成粉末，按照实施例1的方法提取丝胶，之后经过滤和离心获得分别含有hEGF和PDGF-BB重组蛋白的上清液，上清液浓缩5倍后，制成B液。随后，将制成的B液分别与已知浓度的EGF和PDGF-BB商品化标准品进行12％SDS-Page电泳检测，并利用考马斯亮蓝染色。同时，样品经SDS-Page胶电泳分离后，采用电转膜法将SDS-Page胶中的蛋白转移至PVDF膜上，依次利用抗hEGF或抗PDGF-BB一抗(Abcam)和HRP标记的羊抗兔二抗(碧云天公司)对PVDF膜进行孵育杂交，再利用ECL(Amersham Biosciences)对PDVF膜进行显色，随后在Chemiscope Series(Clinx science instruments)仪器中曝光和成像。结果如图2中B所示，结果显示从EGF和PDGF-BB蚕丝中均检测到了明显的EGF和PDGF-BB重组蛋白表达。进一步使用ImageJ估算出两种蚕丝中EGF重组蛋白的含量为320μg/g，PDGF-BB重组蛋白的含量为240μg/g。

实施例3、具有活性的EGF/PDGF-BB双细胞因子丝胶水凝胶的制备与表征

从蚕丝中提取具有生物活性的EGF和PDGF-BB原料，使用更加温和条件，使用含1～8M尿素、20-50mM Tris-Cl，pH 7.0的缓冲液在4℃环境中，按照30mg/mL(3％(w/v))浴比对EGF蚕丝进行提取。同时，使用4M尿素缓冲液在室温环境中，按照30mg/mL(3％(w/v))的浴比对PDGF-BB蚕丝进行提取，两种提取液经过透析除盐除杂以及浓缩5倍后制成活性B液。使用ELISA试剂盒测定其中的EGF和PDGF-BB蛋白含量分别为：0.1-0.5μg/mL和1.0-4.0μg/mL，由于体系更加温和，所以较实施例2的方法提取浓度更低。最后，将EGF或PDGF-BB的活性B液、EGF和PDGF-BB的混合B液，或5％提取浴比制备的丝胶A液按照1:1体积比充分混合，并将不同的A/B混合物装入透析袋中进行低温诱导成胶以及除盐除杂，最终制成WT丝胶水凝胶(WT-SH)，EGF丝胶水凝胶(EGF-SH)，PDGF-BB丝胶水凝胶(PDGF-SH)，以及EGF-PDGF-BB丝胶水凝胶(EGF-PDGF-SH)四种水凝胶材料(图2，C)。对制备的各种丝胶水凝胶进行SEM观察，结果发现：四种材料均形成了内部连接的多孔结构(图2，D)。为检测制备丝胶水凝胶的生物可降解性，将不同的生长因子丝胶水凝胶各切取1g浸泡在PBS缓冲液中，并置于37℃恒温培养箱中，每隔一定时间称量水凝胶的重量，连续收集28天，结果发现：在28天的降解过程中，各组水凝胶的降解趋势基本一致，说明生长因子蚕丝水凝胶具有明显的生物可降解特点，且在28天内总共降解约60％，每组样品无明显差异(图2，E)。

实施例4、EGF-PDGF-BB丝胶水凝胶的生物相容性评价

为了评价EGF-PDGF-SH的细胞贴附能力，将生长状态良好的HaCaT细胞接种到含有不同丝胶水凝胶的96孔板上，培养4h后使用CCK-8检测不同丝胶水凝胶表面的细胞数目，结果表明：制备的不同生长因子丝胶水凝胶表面贴附的细胞数目无明显差异，与商品化TCP板效果几乎一致(图3，A-B)。说明制备的生长因子丝胶水凝胶与D9L-WT蚕丝水凝胶一致，均具有良好的细胞贴附效果。随后，使用ELISA对水凝胶中细胞因子的缓释特征进行测定，结果表明：制备的多款丝胶水凝胶均具有缓释两种细胞因子的能力。在EGF蛋白缓释的过程中，1g的EGF-SH单生长因子蚕丝水凝胶28天累计缓释约7.4ng的EGF重组蛋白。而1g的EGF-PDGF-BB双生长因子蚕丝水凝胶28天累计缓释约19.8ng的EGF重组蛋白(图3，C)；在PDGF-BB蛋白缓释过程中，1g的PDGF-BB-SH单生长因子蚕丝水凝胶28天累计缓释约49.8ng的PDGF-BB重组蛋白。而1g的EGF-PDGF-BB双生长因子蚕丝水凝胶28天累计缓释约117.6ng的PDGF-BB重组蛋白(图3，D)。从结果可知：丝胶水凝胶仅缓释了少量的细胞因子，而绝大部分细胞因子均存在于丝胶水凝胶中。EGF-PDGF双细胞因子丝胶水凝胶缓释重组蛋白的速度比单因子蚕丝水凝胶要更快一些，水凝胶的缓慢降解和释放能力有利于后续的原位促慢创组织修复。

为评价EGF/PDGF-BB双细胞因子丝胶水凝胶的生物相容性。首先使用Live&Dead试剂对与不同水凝胶样品共培养了24h的细胞进行染色，其中绿色信号指示活细胞，红色信号指示死细胞，结果发现：与不同丝胶水凝胶共培养的细胞呈绿色信号，而未见有表示死细胞的红色信号，表明所制备的生长因子丝胶水凝胶具有良好的细胞相容性(图4，A)。进一步采用小鼠溶血试验评价EGF/PDGF-BB双细胞因子丝胶水凝胶的血液相容性，结果显示：阳性对照组(ddH₂O)中红细胞破裂，溶液呈现红色，而阴性对照组(生理盐水)红细胞沉淀在离心管底部，上清液澄清透明，WT、EGF、PDGF、EGF-PDGF的水凝胶浸出液和商品化EGF-PDGF蛋白溶液中红细胞因离心而沉积在离心管底部，上清依然澄清，颜色呈现轻微棕色(图4，B)，取溶血处理后的各实验组上清液在波长为580nm处测量吸光值，根据吸光值计算溶血率，将阳性对照组的溶血率设置为100％，阴性对照组设置为0，计算可得WT水凝胶浸出液的溶血率为3.51％，EGF水凝胶浸出液的溶血率为2.45％，PDGF水凝胶浸出液的溶血率为1.01％，EGF-PDGF水凝胶浸出液的溶血率为4.57％，商品化EGF-PDGF蛋白溶液的溶血率为2.65％，各实验组的溶血率均低于5％(图4，C)，说明所制备的各类生长因子丝胶水凝胶与商品化的EGF、PDGF蛋白均具有良好的血液相容性，满足后续动物实验的安全性需求。

为了检测EGF-PDGF-BB双生长因子丝胶水凝胶是否会诱导细胞产生炎症，因此将含有生长因子的水凝胶与生长状态良好的Raw264.7细胞进行共培养，同时设置了空白对照组以及LPS阳性对照组，培养24h后，使用鬼笔环肽和DAPI分别对细胞骨架和细胞核进行染色，红色荧光显示细胞骨架，蓝色荧光显示为细胞核，结果发现：空白对照组、阴性对照组以及含有生长因子的蚕丝水凝胶组的细胞外表形态绝大多数没有发生变化，依然呈现圆形，细胞骨架显示也依然为圆形的细胞状态，而细胞核也与正常的细胞无明显差异，而经过LPS诱导过的Raw264.7细胞形状已经发生了明显的分化，白光图下显示细胞的边缘伸出触角，呈现不规则变化，骨架染色也显示细胞变大，且边缘不清晰，DAPI染色显示细胞核有变大的趋势(图5，A)。进一步对细胞面积和直径进行测量，结果发现LPS处理的阳性对照组与其他实验组相比，具有明显的细胞变大的趋势(图5，B-C)。以上结果说明制备的生长因子丝胶水凝胶不会诱导细胞炎症反应。

实施例5、EGF-PDGF-BB双细胞因子丝胶水凝胶的促细胞增殖功能评价

为了评估双生长因子丝胶水凝胶的促进细胞增殖功效，使用HaCaT细胞对水凝胶进行活性检测，将生长状态良好的细胞使用0.5％低浓度血清培养基重悬后，细胞计数后按照每孔1×10⁴的细胞数量铺在24孔板中，待细胞贴附使用Transwell装置加入载有不同生长因子的丝胶水凝胶共培养，24h后使用EdU染色试剂盒对细胞进行染色。其中，蓝色荧光显示细胞核，红色荧光显示细胞增殖状态。结果发现：与空白对照和阴性对照相比，EGF-SH，PDGF-SH单因子丝胶水凝胶与EGF和PDGF-BB蛋白标准品均能明显促进细胞的增殖，且EGF-PDGF-SH双因子丝胶水凝胶促细胞增殖的效果比单因子的更好(图6，A)。进一步对24孔板中的细胞进行了CCK-8检测，结果发现：与空白对照和阴性对照相比，EGF-SH，PDGF-SH单因子丝胶水凝胶与EGF和PDGF-BB蛋白标准品均能明显促进细胞的增殖，其中商品化EGF蛋白比EGF-SH的增殖效果更好一些，且两者表现出显著性差异，而PDGF-BB蛋白标准品与PDGF-SH对细胞的增殖效果表现一致，而EGF-PDGF-SH双因子丝胶水凝胶的促细胞增殖效果要比单因子的效果更好，且与EGF-PDGF蛋白标准品对细胞的增殖效果表现一致(图6，B)，以上结果说明载有生长因子的蚕丝水凝胶可以促进细胞的增殖，且双因子比单因子的增殖效果更好。

为了评估双因子丝胶水凝胶的促细胞迁移功效，将HFF细胞铺板后进行培养，当生长到80％-90％融合度时，使用白枪头对细胞进行划痕处理，PBS清洗两次后，加入0.5％低浓度血清培养基，随后将不同细胞因子丝胶水凝胶样品与细胞进行共培养9h，结果发现：NULL和WT-SH两组空白对照在细胞划痕处理后的9h，细胞迁移活动不明显，而EGF-SH和PDGF-SH与空白对照相比，均有明显的细胞迁移活动，且EGF-PDGF-SH的迁移活动比单因子水凝胶EGF-SH和PDGF-SH的迁移效果更好(图7)。结果说明载有生长因子的蚕丝水凝胶可以促进细胞的迁移，且双因子水凝胶比单因子水凝胶促细胞迁移的效果更好。

实施例6、EGF-PDGF-BB丝胶水凝胶促糖尿病小鼠慢性创面愈合

利用C57BL/6小鼠构建糖尿病小鼠模型，实验流程如图所示(图8，A)，建模前对小鼠的初始血糖进行测量，然后按照180mg/kg的量注射STZ，72h后空腹再次测量小鼠的血糖，测量结果可得，在注射STZ之前，小鼠空腹血糖含量均保持在5mmol/L左右，而注射STZ之后72h，小鼠空腹的血糖含量均高于11.1mmol/L，说明小鼠的糖尿病模型构建成功。随后，将小鼠背部剃毛并打孔后，将小鼠随机分为五组，其中阴性对照的背部涂抹生理盐水，实验组小鼠的背部分别贴敷WT-SH、EGF-SH、PDGF-SH、EGF-PDGF-SH样品，阳性对照小鼠的背部涂抹相同剂量的商品化蛋白标准品溶液EGF-PDGF-STD，随后使用透气纱布包扎结实后将小鼠进行单笼饲养，随后在伤口愈合的第3、7、12、20天进行观察。在伤口愈合的第3天(3d)，伤口表面出现黄色的脓液，说明伤口进入了炎症阶段，且阴性对照组的炎症反应更加强烈，但是在第三天伤口面积有减小的趋势，随后在第7天(7d)，伤口的炎症反应减小，伤口面积进一步减小，到第12天时(12d)，EGF-PDGF-SH双因子凝胶组与EGF-PDGF-STD阳性对照组的伤口面积基本愈合，且愈合程度优于EGF-SH，PDGF-SH单因子凝胶组，而CK组小鼠的伤口还未愈合(图8，B-C)。对不同组糖尿病小鼠的伤口愈合率进行统计，结果发现：经过12天伤口愈合，CK组糖尿病小鼠的伤口愈合率为64.45％，WT-SH为72.79％，EGF-SH,PDGF-SH单因子凝胶组糖尿病小鼠的愈合率分别为85.78％和86.97％，而EGF-PDGF-SH双因子凝胶组以及EGF-PDGF-STD阳性对照组糖尿病小鼠的愈合率分别为91.65％和91.06％(图8，D)。进一步对第12天各处理组糖尿病小鼠伤口宽度进行统计，结果发现：CK组糖尿病小鼠的伤口宽度为0.68cm，WT-SH为0.65cm，EGF-SH，PDGF-SH单因子凝胶组糖尿病小鼠的伤口宽度分别为0.41cm和0.42cm，而EGF-PDGF-SH双因子凝胶组以及EGF-PDGF-STD阳性对照组糖尿病小鼠的伤口宽度分别为0.28cm和0.27cm(图8，E)。以上结果说明：与CK组和WT-SH相比，EGF-SH，PDGF-SH，EGF-PDGF-SH和EGF-PDGF-STD均具有显著促进伤口愈合的效果，其中EGF-PDGF-SH双因子凝胶组促伤口愈合的效果优于EGF-SH，PDGF-SH两个单因子凝胶组，且与EGF-PDGF-STD阳性对照的相当。

随后，对糖尿病小鼠伤口愈合第12d的创面组织进行病理分析，愈合组织经H&E染色后细胞核呈现蓝色，而细胞质呈现红色，结果发现：EGF-SH，PDGF-SH，EGF-PDGF-SH和EGF-PDGF-STD组已经能够观察到较多的汗腺和毛囊的存在，而CK对照和WT-SH组小鼠的毛囊和汗腺数量较少。EGF-PDGF-SH和EGF-PDGF-STD组的上皮化程度最高，真皮区域发育良好，其次是PDGF-SH和EGF-SH单因子水凝胶组，WT-SH水凝胶组和CK组的上皮化程度最差，真皮组织很少。CK以及WT-SH组的中性粒细胞数目更多，而EGF-SH，PDGF-SH，EGF-PDGF-SH和EGF-PDGF-STD组的中性粒细胞数目要较少一些，说明细胞因子的介入能缓解创面的炎症反应。进一步对组织样品进行Masson染色，其中，胶原纤维呈现蓝色，肌纤维、纤维素和红细胞被染成红色，细胞核被染成黑蓝色。结果发现：EGF-PDGF-SH和EGF-PDGF-STD组可明显观察到有大量的胶原纤维沉积且呈交织排列，其次是EGF-SH和PDGF-SH单因子凝胶组，而CK组和WT-SH组的胶原纤维沉积少且排列紊乱。以上结果表明：EGF-PDGF-SH水凝胶能够更有效促进糖尿病小鼠的伤口愈合。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (7)

1.hEGF和PDGF-BB丝胶水凝胶材料的制备方法，其特征在于：以浴比为1.5-6 %（w/v）分别对人表皮细胞生长因子hEGF蚕丝和血小板衍生生长因子PDGF-BB蚕丝提取含人表皮细胞生长因子hEGF蚕丝和血小板衍生生长因子PDGF-BB的丝胶，将含人表皮细胞生长因子hEGF丝胶和血小板衍生生长因子PDGF-BB丝胶按体积比为1：1混合，在温度为0~10℃下透析诱导成胶及除盐除杂。

2.根据权利要求1所述hEGF和PDGF-BB丝胶水凝胶材料的制备方法，其特征在于：所述人表皮细胞生长因子hEGF丝胶和血小板衍生生长因子PDGF-BB丝胶中人表皮细胞生长因子hEGF浓度0.1-0.5 μg/mL； 血小板衍生生长因子PDGF-BB的浓度高于1.0-4.0 μg/mL。

3.根据权利要求1所述hEGF和PDGF-BB丝胶水凝胶材料的制备方法，其特征在于：提取丝胶的方法是将表皮细胞生长因子hEGF蚕丝或血小板衍生生长因子PDGF-BB蚕丝粉碎后，溶于萃取缓冲液中，置于60-100 °C的水浴锅中提取30-60 min，过滤离心收集上清液为含人表皮细胞生长因子hEGF蚕丝或血小板衍生生长因子PDGF-BB的丝胶；所述萃取缓冲液为4-8 M尿素，20-200 mM Tris-Cl，pH 6.8-7.3的溶液。

4.由权利要求1~3任一项所述制备方法制得的hEGF和PDGF-BB丝胶水凝胶材料。

5.权利要求4所述hEGF和PDGF-BB丝胶水凝胶材料在制备促进细胞增殖的伤口敷料中的应用。

6.权利要求4所述hEGF和PDGF-BB丝胶水凝胶材料在制备促慢性创面愈合的敷料中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述促慢性创面愈合为糖尿病慢性创面愈合。