CN118530372A - 一种重组腺相关病毒AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种重组腺相关病毒AAV2/2‑sFLT‑1‑P2A‑sIL‑1Ra及其构建方法和应用，选用2/2型腺相关病毒(AAV2/2)构建了治疗组AAV2/2‑sFLT‑1‑P2A‑sIL‑1Ra。其中sFLT‑1蛋白会中和VEGF‑A并阻止其与其膜结合受体VEGFR‑2的异二聚化，从而阻止VEGF‑A介导的血管生成。sIL‑1Ra为IL‑1受体拮抗蛋白(IL‑1Ra)的可溶形式，能够与IL‑1竞争IL‑1受体(IL‑1R)的结合位点，从而抑制IL‑1与其受体的相互作用，达到抗炎和抑制血管形成的目的。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其是涉及一种重组腺相关病毒AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra及其构建方法和应用。
背景技术
年龄相关黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)是55岁以上人群严重的、不可逆视力丧失的主要原因，占全球失明的6-9％。2021年对全球人群汇总研究的Meta分析估计，AMD的年进展率为5.5/100人年。随着全球老龄化的发展和人均寿命的延长，预计到2050年，全球AMD患者将新增4546万。根据晚期表现，AMD可以大致分为两类：湿性AMD及干性AMD。湿性AMD以脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)为主要特点。在CNV中，脉络膜毛细血管生长至视网膜色素上皮层(Retinal pigment epithelium,RPE)和玻璃膜(Bruch membrane,BrM)，导致脉络膜新生血管形成。由于新生血管结构不完善，会导致渗出、出血、瘢痕等一系列病理变化，进而导致中心视力丧失。干性AMD以光感受器、RPE和脉络膜毛细血管的融合性萎缩为特征，导致进行性中央视野丧失。通常情况下，湿性AMD比干性AMD视力丧失更快，在因AMD而导致失明的患者中占比90％。
年龄相关黄斑变性的一线治疗方法为抗VEGF疗法。血管内皮细胞生长因子(VEGF)是作用于血管内皮细胞的重要血管调节因子，具有促进内皮细胞增殖/分化、诱导血管生成、增加微血管通透性等多种功能，在CNV的发生发展中起重要作用。因此通过靶向VEGF抑制新生血管的形成，可以达到改善湿性AMD患者的视力及黄斑水肿等情况的目的。抗新生VEGF疗法自2000年引入后，对新生血管性AMD治疗产生了良好的改善效果，是目前新生血管性AMD的主流疗法。目前有几种抗VEGF药物应用于新生血管性AMD，如阿柏西普、康柏西普、雷珠单抗、贝伐单抗等。
尽管抗VEGF治疗得到了广泛应用，但仍然存在一些尚未解决的问题。首先，只有大约1/3的新生血管性AMD患者在接受抗VEGF治疗时视力得到了明显改善，大多数患者的视力仍呈现持续下降的趋势，现有的治疗方法对改善预后的效果有限。其次，现行的抗VEGF药物疗法，须通过玻璃体腔内连续反复注射给药，不仅会给患者生活带来不便，且反复注射容易造成眼内炎、眼压增高、视网膜脱离等并发症。最后，在AMD发展过程中，有相当比例的患者会进展为终末期的纤维斑块或盘状瘢痕，最终导致不可逆的视力丧失。接受康柏西普等抗VEGF药物治疗常规疗法的患者当中，约有50％的患者两年内会出现视网膜下纤维化导致治疗失败，而针对视网膜下纤维化目前还没有有效的药物能够治疗或预防。现有技术治疗效果有限、药物眼内注射后作用时间短、无法解决疾病进展导致视网膜下纤维化的问题，是当下抗VEGF药物的缺点。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种重组腺相关病毒AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra及其构建方法和应用。本发明旨在解决目前AMD一线治疗中，抗VEGF药物治疗效果欠佳、药效持续时间较短、以及无法解决疾病进展导致视网膜下纤维化的三大问题。针对AMD发病机制复杂这一特点，我们研究发现在湿性AMD发生发展过程中，促炎细胞因子白细胞介素IL-1β具有独立于抗VEGF的促进新生血管形成的作用，因而阻断IL-1信号很有可能会提高抗VEGF治疗的疗效。针对年龄相关黄斑变性具有病情迁延不愈，患者须反复接受玻腔注射的特点，我们设计了同时抗VEGF途径和抗炎途径的治疗目的基因的组合，并以重组腺相关病毒2(AAV2/2)为载体进行递送，解决目前抗VEGF药物作用时间短且需要频繁注射的问题。同时我们还发现，本发明在抗新生血管的同时，还具有延缓纤维化的进展，改善当下湿性AMD的治疗效果。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一种靶向抑制湿性AMD的融合蛋白，所述融合蛋白的组成元件包括sFLT-1蛋白和sIL-1Ra蛋白。
优选地，所述sFLT-1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述sIL-1Ra蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示.
更优选地，所述sFLT-1蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述sIL-1Ra蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
优选地，所述sFLT-1蛋白为如下a1-a3任一种：
(a1)SEQ ID No.1所示的蛋白质；
(a2)在(a1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(a3)与(a1)-(a2)任一种具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
所述sIL-1Ra蛋白为如下b1-b3任一种：
(b1)SEQ ID No.2所示的蛋白质；
(b2)在(b1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(b3)与(b1)-(b2)任一种具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
第二方面，本发明提供了一种重组腺相关病毒，以腺相关病毒AAV2/2为基础毒株，重组表达sFLT-1蛋白和sIL-1Ra蛋白。
优选地，所述重组腺相关病毒的基因组为将含有sFLT-1蛋白和sIL-1Ra蛋白的编码基因插入腺相关病毒AAV基因组内切酶EcoRI及HindIII之间。
第三方面，本发明还提供了一种表达上述重组腺相关病毒的载体，所述载体为pAAV-MCS质粒。
优选地，所述pAAV-MCS质粒的EcoRI和HindIII酶切位点之间插入含有sFLT-1蛋白和sIL-1Ra蛋白的编码基因。
第四方面，本发明还提供了上述重组腺相关病毒的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：
1)构建重组腺相关病毒表达质粒pAAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra；
2)将所述腺相关病毒表达质粒pAAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra转染腺相关病毒包装细胞，培养，得到所述重组腺相关病毒。
优选地，所述包装细胞为HEK293T细胞。
第四方面，本发明还提供了一种包含上述重组腺相关病毒的药物。
优选地，所述药物为如下任一种药物：
1)预防和/或治疗新生血管性年龄相关性黄斑变性的药物；
2)预防和/或治疗脉络膜新生血管得药物；
3)抑制脉络膜新生血管进展的药物；
4)抑制脉络膜新生血管中血管渗漏面积的药物；
5)抑制脉络膜新生血管中新生血管体积的药物；
6)抑制脉络膜新生血管引发的炎症浸润的药物。
优选地，所述的药物还包含药学上可接受的载体。
优选地，所述的药物的剂型为注射剂。
优选地，所述的注射剂包括注射液和冻干粉针剂。
相对于现有技术，本发明具有以下优势：
(1)本发明选用2/2型腺相关病毒(AAV2/2)构建了治疗组AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra。其中sFLT-1蛋白会中和VEGF-A并阻止其与其膜结合受体VEGFR-2的异二聚化，从而阻止VEGF-A介导的血管生成。sIL-1Ra为IL-1受体拮抗蛋白(IL-1Ra)的可溶形式，能够与IL-1竞争IL-1受体(IL-1R)的结合位点，从而抑制IL-1与其受体的相互作用，达到抗炎和抑制血管形成的目的；
(2)本发明构建载体可成功包装病毒，且，通过玻璃体腔内注射可将AAV递送有效递送至视网膜。治疗基因sFLT-1及sIL-1Ra均为分泌蛋白，可分泌至病灶区域发挥作用。在小鼠CNV模型中，短期内AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra病毒能有效抑制脉络膜新生血管的发展，且与阳性对照组Conbercept相比，各个治疗组之间FFA结果、CD31染色、F4/80染色结果无统计学差异。在探索治疗药物对CNV长期抑制效果的实验中发现，AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra治疗组单次注射效果优于Conbercept组单针注射，能够长期可有效抑制AMD血管的发展；
(3)本发明选择AMD不同致病途径(抗VEGF途径、抗炎途径)的治疗靶点进行组合，证明多途径抑制AMD优于抗VEGF单药治疗效果。本发明选择的AAV2/2病毒载体递送系统表达稳定且时间长，治疗组单次注射效果优于Conbercept组单针注射CNV，具有进一步开发、应用的潜力。
附图说明
图1为AAV2/2病毒载体设计模式图；
图2为AAV2/2病毒携带目的基因的体内外表达情况；
图3为AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra病毒对CNV模型的短期新生血管抑制效果；
图4为AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra病毒对CNV模型的长期新生血管抑制效果；
图5为AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra病毒对CNV模型的纤维化具有抑制效果；
图6为AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra病毒无视网膜毒性。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中材料部分如下：
表达GFP或sFLT-1-P2A-sIL-1Ra的AAV2/2病毒、pAAV-MCS(NCBI:txid167882)、pAAV2/2(NCBI:NC_001401.2)质粒、pHelper(NCBI:txid161366)质粒购自OBIOTECHNOLOGY。
HEK293T细胞(ATCC,CRL-3216)购于中国科学院上海细胞生物学研究所。
成年野生型C57BL/6J小鼠购自南京大学模型动物研究中心。
下面结合实施例来详细说明本发明。
实验方法
一、AAV质粒的构建
在NCBI中查找sFLT-1基因和sIL-1Ra基因，对其进行人源性密码子优化，并在北京擎科生物公司合成基因序列。将目的基因序列克隆至pAAV-MCS质粒上，对载体进行Sanger测序无误后，进行质粒抽提。
sFLT-1氨基酸序列为：
MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSSSGSKLKDPELSLKGTQHIMQAGQTLHLQCRGEAAHKWSLPEMVSKESERLSITKSACGRNGKQFCSTLTLNTAQANHTGFYSCKYLAVPTSKKKETESAIYIFISDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVQISTPRPVKLLRGHTLVLNCTATTPLNTRVQMTWSYPDEKNKRASVRRRIDQSNSHANIFYSVLTIDKMQNKDKGLYTCRVRSGPSFKSVNTSVHIYDKAFITVKHRKQQVLETVAGKRSYRLSMKVKAFPSPEVVWLKDGLPATEKSARYLTRGYSLIIKDVTEEDAGNYTILLSIKQSNVFKNLTATLIVNVKPQIYEKAVSSFPDPALYPLGSRQILTCTAYGIPQPTIKWFWHPCNHNHSEARCDFCSNNEESFILDADSNMGNRIESITQRMAIIEGKNKMASTLVVADSRISGIYICIASNKVGTVGRNISFYITDVPNGFHVNLEKMPTEGEDLKLSCTVNKFLYRDVTWILLRTVNNRTMHYSISKQKMAITKEHSITLNLTIMNVSLQDSGTYACRARNVYTGEEILQKKEITIRDQEAPYLLRNLSDHTVAISSSTTLDCHANGVPEPQITWFKNNHKIQQEPGIILGPGSSTLFIERVTEEDEGVYHCKATNQKGSVESSAYLTVQGTSDKSNLELITLTCTCVAATLFWLLLTLFIRKMKRSSSEIKTDYLSIIMDPDEVPLDEQCERLPYDASKWEFARERLKLGKSLGRGAFGKVVQASAFGIKKSPTCRTVAVKMLKEGATASEYKALMTELKILTHIGHHLNVVNLLGACTKQGGPLMVIVEYCKYGNLSNYLKSKRDLFFLNKDAALHMEPKKEKMEPGLEQGKKPRLDSVTSSESFASSGFQEDKSLSDVEEEEDSDGFYKEPITMEDLISYSFQVARGMEFLSSRKCIHRDLARNILLSENNVVKICDFGLARDIYKNPDYVRKGDTRLPLKWMAPESIFDKIYSTKSDVWSYGVLLWEIFSLGGSPYPGVQMDEDFCSRLREGMRMRAPEYSTPEIYQIMLDCWHRDPKERPRFAELVEKLGDLLQANVQQDGKDYIPINAILTGNSGFTYSTPAFSEDFFKESISAPKFNSGSSDDVRYVNAFKFMSLERIKTFEELLPNATSMFDDYQGDSSTLLASPMLKRFTWTDSKPKASLKIDLRVTSKSKESGLSDVSRPSFCHSSCGHVSEGKRRFTYDHAELERKIACCSPPPDYNSVVLYSTPPI(SEQ ID No.1)；
优化后的sFLT-1核苷酸序列为：
ATGGTCAGCTACTGGGACACCGGGGTCCTGCTGTGCGCGCTGCTCAGCTGTCTGCTTCTCACAGGATCTAGTTCAGGTTCAAAATTAAAAGATCCTGAACTGAGTTTAAAAGGCACCCAGCACATCATGCAAGCAGGCCAGACACTGCATCTCCAATGCAGGGGGGAAGCAGCCCATAAATGGTCTTTGCCTGAAATGGTGAGTAAGGAAAGCGAAAGGCTGAGCATAACTAAATCTGCCTGTGGAAGAAATGGCAAACAATTCTGCAGTACTTTAACCTTGAACACAGCTCAAGCAAACCACACTGGCTTCTACAGCTGCAAATATCTAGCTGTACCTACTTCAAAGAAGAAGGAAACAGAATCTGCAATCTATATATTTATTAGTGATACAGGTAGACCTTTCGTAGAGATGTACAGTGAAATCCCCGAAATTATACACATGACTGAAGGAAGGGAGCTCGTCATTCCCTGCCGGGTTACGTCACCTAACATCACTGTTACTTTAAAAAAGTTTCCACTTGACACTTTGATCCCTGATGGAAAACGCATAATCTGGGACAGTAGAAAGGGCTTCATCATATCAAATGCAACGTACAAAGAAATAGGGCTTCTGACCTGTGAAGCAACAGTCAATGGGCATTTGTATAAGACAAACTATCTCACACATCGACAAACCAATACAATCATAGATGTCCAAATAAGCACACCACGCCCAGTCAAATTACTTAGAGGCCATACTCTTGTCCTCAATTGTACTGCTACCACTCCCTTGAACACGAGAGTTCAAATGACCTGGAGTTACCCTGATGAAAAAAATAAGAGAGCTTCCGTAAGGCGACGAATTGACCAAAGCAATTCCCATGCCAACATATTCTACAGTGTTCTTACTATTGACAAAATGCAGAACAAAGACAAAGGACTTTATACTTGTCGTGTAAGGAGTGGACCATCATTCAAATCTGTTAACACCTCAGTGCATATATATGATAAAGCATTCATCACTGTGAAACATCGAAAACAGCAGGTGCTTGAAACCGTAGCTGGCAAGCGGTCTTACCGGCTCTCTATGAAAGTGAAGGCATTTCCCTCGCCGGAAGTTGTATGGTTAAAAGATGGGTTACCTGCGACTGAGAAATCTGCTCGCTATTTGACTCGTGGCTACTCGTTAATTATCAAGGACGTAACTGAAGAGGATGCAGGGAATTATACAATCTTGCTGAGCATAAAACAGTCAAATGTGTTTAAAAACCTCACTGCCACTCTAATTGTCAATGTGAAACCCCAGATTTACGAAAAGGCCGTGTCATCGTTTCCAGACCCGGCTCTCTACCCACTGGGCAGCAGACAAATCCTGACTTGTACCGCATATGGTATCCCTCAACCTACAATCAAGTGGTTCTGGCACCCCTGTAACCATAATCATTCCGAAGCAAGGTGTGACTTTTGTTCCAATAATGAAGAGTCCTTTATCCTGGATGCTGACAGCAACATGGGAAACAGAATTGAGAGCATCACTCAGCGCATGGCAATAATAGAAGGAAAGAATAAGATGGCTAGCACCTTGGTTGTGGCTGACTCTAGAATTTCTGGAATCTACATTTGCATAGCTTCCAATAAAGTTGGGACTGTGGGAAGAAACATAAGCTTTTATATCACAGATGTGCCAAATGGGTTTCATGTTAACTTGGAAAAAATGCCGACGGAAGGAGAGGACCTGAAACTGTCTTGCACAGTTAACAAGTTCTTATACAGAGACGTTACTTGGATTTTACTGCGGACAGTTAATAACAGAACAATGCACTACAGTATTAGCAAGCAAAAAATGGCCATCACTAAGGAGCACTCCATCACTCTTAATCTTACCATCATGAATGTTTCCCTGCAAGATTCAGGCACCTATGCCTGCAGAGCCAGGAATGTATACACAGGGGAAGAAATCCTCCAGAAGAAAGAAATTACAATCAGAGGTGAGCACTGCAACAAAAAGGCTGTTTTCTCTCGGATCTCCAAATTTAAAAGCACAAGGAATGATTGTACCACACAAAGTAATGTAAAACATTAA(SEQ ID No.2)；
sIL-1Ra的氨基酸序列为：
MEICRGLRSHLITLLLFLFHSETICRPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQEDE(SEQ ID No.3)；
优化后的sIL-1Ra的核苷酸序列为：
ATGGAAATCTGCAGAGGCCTCCGCAGTCACCTAATCACTCTCCTCCTCTTCCTGTTCCATTCAGAGACGATCTGCCGACCCTCTGGGAGAAAATCCAGCAAGATGCAAGCCTTCAGAATCTGGGATGTTAACCAGAAGACCTTCTATCTGAGGAACAACCAACTAGTTGCCGGATACTTGCAAGGACCAAATGTCAATTTAGAAGAAAAGATAGATGTGGTACCCATTGAGCCTCATGCTCTGTTCTTGGGAATCCATGGAGGGAAGATGTGCCTGTCCTGTGTCAAGTCTGGTGATGAGACCAGACTCCAGCTGGAGGCAGTTAACATCACTGACCTGAGCGAGAACAGAAAGCAGGACAAGCGCTTCGCCTTCATCCGCTCAGACAGTGGCCCCACCACCAGTTTTGAGTCTGCCGCCTGCCCCGGTTGGTTCCTCTGCACAGCGATGGAAGCTGACCAGCCCGTCAGCCTCACCAATATGCCTGACGAAGGCGTCATGGTCACCAAATTCTACTTCCAGGAGGACGAGTAG(SEQ ID No.4)；
二、AAV病毒包装
将上述构建的重组腺相关病毒质粒pAAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra及pAAV2/2-GFP与pHelper及pAAV2/2按质量比1:2:4比例(5.7μg:11.4μg:22.8μg)转染1盘150dish的HEK293T细胞，96小时后收取含AAV病毒的上清，使用PEG8000(上清:PEG8000＝4:1)过夜沉淀重组AAV病毒。沉淀后上清4000g，4℃离心30分钟，收集沉淀使用1ml SAN buffer重悬后加入SAN酶(100U/ml)，37℃水浴40分钟，得到AAV病毒。
采用碘克沙醇密度梯度离心法对上述AAV病毒进行病毒纯化，分别将60％、40％、25％及15％碘克沙醇加入离心管中，加入病毒液，配平后使用超速离心机进行离心(转子Type70Ti，转速58400rpm，4℃离心2h30min)。病毒纯化液使用15ml PBS+0.001％PF68重悬，采用100KD超滤管进行浓缩，得到300-500μl浓缩病毒AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra。浓缩后的病毒分装后取10μl进行qRT-PCR检测病毒物理滴度。
三、AAV病毒2/2(AAV2/2)载体的构建与传递
使用复方托吡卡胺滴眼液对小鼠进行散瞳，用异氟烷对小鼠进行气麻。在手术显微镜下，采用5μl Hamilton注射器和34号针头(Hamilton,Reno,NV,USA)在角巩膜缘后1mm进针，通过扩张的瞳孔观察到针头后，注射1.5μl AAV病毒，浓度为8.75×109vg/μl。注射病毒3周后，用Western blot证实sFlt1蛋白和sIL-1Ra蛋白过表达。
四、细胞培养
将HEK-293T细胞置于DMEM(D5796,Sigma-Aldrich,Germany)培养基中培养，加入10％牛血清(10711454001,Sigma-Aldrich,Germany)和1％青霉素/链霉素(C100C5,NCMBiotech,China)，在5％CO2和37℃的环境中生长。
五、激光诱导CNV模型
所有涉及动物的实验均经天津医科大学机构动物保护与使用委员会(TMUaMEC2020005)批准。将8-12周龄成年C57BL/6J小鼠饲养于标准饲料和水的笼子中，光照/黑暗周期设置为12小时。使用复方托吡卡胺滴眼液对小鼠眼睛进行散瞳，用4％水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠后，给小鼠眼睛涂抹左氧氟沙星凝胶。用Nd:YAG激光器(LB-002088REVB,Lumenis,USA)在视盘周围3、6、9和12点钟位置诱导出4个激光光斑。设置参数为：光斑直径100μm，曝光时间0.15s，功率200mW。光凝后有气泡产生标志Bruch膜破裂，记为有效光凝点。在造模后第7天取RPE-脉络膜-巩膜复合体铺片染色，指标为CD31和F4/80，并在第7天和第14天行眼底荧光造影(FFA)评估血管渗漏情况。
六、玻璃体腔内注射
将小鼠随机分为4组，分别向玻璃体内注射1.5μl Saline、AAV2/2-GFP(1.8×109vg/μl)、AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra(1.8×109vg/μl)或Conbercept(10mg/ml)。Saline和Conbercept在激光光凝后后立即用33号注射器针头(Hamilton,US)注射至玻璃体腔内。AAV治疗组则在激光造模前3周向玻璃体腔内注射AAV2/2-GFP或AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra。术前术后均涂抹左氧氟沙星凝胶防止结膜囊感染。眼内炎、眼内出血等受注射影响的情况都排除在后续实验之外。
七、眼底荧光造影(FFA)
使用复方托吡卡胺滴眼液给小鼠散瞳，之后用4％水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，再将10％荧光素钠腹腔注射0.1ml并等待荧光素钠循环2min。将小鼠固定于镜头前，调节镜头使视神经位于视野中央，缓慢推动镜头至看清眼底。采用Heidelberg共聚焦视网膜血管造影(HRA)获取FFA图像，并通过ImageJ软件计算FFA评价渗漏光斑区灰度值，评价CNV荧光素渗漏情况。
八、光学相干断层扫描(OCT)
使用复方托吡卡胺滴眼液给小鼠散瞳后用4％水合氯醛腹腔注射麻醉，之后用左氧氟沙星凝胶涂抹眼睛以保持角膜湿润。将小鼠固定于镜头前，选取视盘周围视网膜结构进行扫描，用视网膜成像显微镜(Micron IV,Phoenix Research Labs,USA)捕获OCT图像。每一只小鼠眼睛对应一个厚度值，由显微镜内嵌的软件计算获得。
九、RNA提取和实时荧光定量PCR
取组织加入适量的TRIzol试剂(101254514,SIGMA,USA)，用匀浆仪破碎组织后提取总RNA。使用Nanodrop ND-1000(Thermo Fisher Scientific,USA)分光光度法测定RNA浓度后根据mRNA逆转录试剂盒(K1622,Thermo Fisher Scientific,USA)的说明将等量RNA逆转录为cDNA，并用SYBRTMGreen Master Mix(AQ602,TransGen Biotech,China)和Real-TimePCR系统(Applied Biosystems QuantStudio,USA)分析mRNA表达情况。检测结果以目的基因mRNA含量与内参基因GAPDH含量之比表示。实时荧光定量PCR的引物序列如下：
十、RNA测序和数据分析
在第1次激光造模3天后，取小鼠视网膜-脉络膜复合体，将1只小鼠的两只眼睛作为一个样本提取RNA。使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies,SantaClara,CA,USA)分析RNA质量。测序由美吉生物(Shanghai,China)根据说明书(Illumina,San Diego,CA,USA)在Illumina Hiseq平台上进行。小鼠被随机分配至以下各组：Saline组3只，AAV2/2-GFP组4只，AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra组4只，Conbercept组5只。使用DESeq2软件包计算各组之间的表达变化(Love et al.,2014)。功能富集分析由Enrichr(https://maayanlab.cloud/Enrichr/)完成，使用分子特征数据库(MSigDB)中的基因集。用于基因集富集分析(GSEA)的基因集也来自MSigDB数据库，并用GSEA_4.1.0软件进行分析。
十一、免疫荧光染色
取颈椎脱位法处死小鼠后，取眼球在4％多聚甲醛固定1小时。铺片染色需要在显微镜下用剪刀和镊子分离RPE-脉络膜-巩膜复合体。制备冷冻切片需要在眼球固定后用30％蔗糖脱水，OCT包埋，使用Leica切片机设置20μm连续切片。之后铺片和切片都用1％的Triton渗透，然后在室温下用阻断缓冲液孵育1小时，其中阻断缓冲液为含有2％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)。随后用一抗(在阻断缓冲液中稀释)在4℃下孵育过夜。在PBS中洗涤三次后，再与二抗(在阻断缓冲液中稀释)孵育2小时，并用中性树脂(0100-01,SouthernBiotech,USA)或封固剂(ab104139,Abcam,USA)固定。最后，用共聚焦显微镜(LSM900；Carl Zeiss,Germany)来获取图像。采用Imaris v9.0.1软件统计CNV血管渗漏面积和巨噬细胞浸润情况，采用ImageJ软件统计视网膜下纤维化面积。
十二、蛋白质印迹法(Western blot)
采用蛋白质印迹法(Western blot)检测各个目的蛋白的表达水平。向样品中加入含有蛋白酶抑制剂PI、PPI的RIPA细胞裂解液(R0010；Solarbio,China)在4℃下放置30分钟，然后在12,000×g(4℃)下离心20分钟。蛋白质在10％-15％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶(Bio-Rad,USA)中均匀负载和电泳后转移到PVDF膜(IPVH00010,Millipore,USA)上。然后在5％的PBST(PBS+Tween-20)中加入牛奶在室温下封闭1小时，并与相应的一抗在4℃下孵育过夜。洗膜后在室温下孵育相应的二抗2小时，最后用ECL化学发光液对样品进行曝光。
十三、TUNEL实验
取冷冻切片在PBS中洗涤10分钟，然后室温下在含0.3％Triton X-100和2％BSA的PBS中孵育5分钟。按照制造商的说明，使用TUNEL凋亡检测试剂盒(C1088,Beyotime,China)进行检测，细胞核用DAPI染色(蓝色)。每只小鼠统一取3个切片，通过共聚焦激光扫描显微镜(LSM 900；ZEISS,Germany)计数Tunel阳性细胞。
十四、数据分析
使用GraphPad Prism 9.0软件进行统计分析，所有图表均以平均值标准误(means±SEM)表示。两组间的比较采用双尾非配对Student’s t检验，多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)和Tukey多重比较检验分析(Tukey's multiple comparisonstest)。P值＜0.05认为有统计学差异。
实验结果
一、AAV病毒2/2(AAV2/2)介导的基因体外和体内传递的设计和验证
为了检测AAV病毒包装完成后能否正常翻译目的基因及目的基因蛋白表达是否正确，在HEK293T细胞系中感染AAV病毒并进行Western Blot检测，证明AAV病毒(2/2)能够在体外表达sFLT-1蛋白及sIL-1Ra蛋白(图2A-图2B)。之后向小鼠玻璃体腔内注射AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra病毒，对照组注射AAV2/2-GFP病毒或Saline，并于不同时间点观测目的基因的表达趋势及视网膜定位(图2G)。眼底荧光素血管造影(FFA)结果显示，注射AAV2/2-GFP后第2周即可检测到GFP的表达，从第3周开始表达量逐渐趋于稳定(图2F)。注射3周后取小鼠RPE-脉络膜-巩膜复合体，提取RNA进行qPCR检测可见AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra组小鼠sFLT-1及sIL-1Ra在转录水平高表达(图2C)，提取蛋白进行Western blot检测可见sFLT-1和sIL-1Ra蛋白显著升高(图2D-图2E)。
二、玻璃体腔内注射AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra病毒可有效抑制激光诱导的CNV渗漏
为了评估AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra对nvAMD的治疗潜力，我们采用激光诱导CNV模型，并在激光损伤前3周在小鼠玻璃体内注射AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra病毒，对照组注射AAV2/2-GFP病毒。对照组同时加入了抗VEGF药物Conbercept作为阳性对照(图3A)。眼底荧光素血管造影(FFA)结果显示，与Saline或AAV2/2-GFP组相比，AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra组在激光光凝后第7天和第14天眼底脉络膜新生血管面积明显减少，且与Conbercept组相比没有显著差异(图3B-图3D)，表明AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra病毒和Conbercept在短期内的治疗效果相似。RPE-脉络膜-巩膜复合体的铺片染色显示AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra组CD31及F4/80荧光强度相较Saline组或AAV2/2-GFP组呈现下调趋势(图3E-图3G)，表明AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra病毒能够显著抑制CNV的形成和巨噬细胞的浸润。
为了研究AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra病毒抗血管生成作用的机制，我们对Saline组、AAV2/2-GFP组、AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra组和Conbercept组小鼠的视网膜-脉络膜复合体进行了转录组分析。富集分析的结果显示AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra组下调基因主要体现在上皮间充质转化(EMT)、血管生成、缺氧等过程中(图3H)。基因集富集分析(GSEA)进一步表明，Saline组相比于AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra组在血管生成相关基因方面显著富集，但AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra组与Conbercept治疗组之间的基因富集情况无显著差异(图3I-图3L)。这一结果支持短期内AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra病毒和Conbercept有类似的抗血管生成作用。由于细胞外信号调节激酶ERK介导的信号传导在内皮细胞分化和增殖过程中起着至关重要的作用，通过检测ERK激活水平能够评估血管生成的情况。因此，我们取CNV造膜后3天小鼠的视网膜-脉络膜复合体，通过Western blot检测发现与生理盐水组或AAV2/2-GFP组相比，AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra组的磷酸化ERK(pERK)水平显著降低，且与康柏西普组之间无显著差异(图3M-图3N)，提示AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra病毒在CNV早期通过抑制ERK活化抑制血管生成，与Conbercept的效果相似。
三、AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra病毒可长期抑制激光诱导的CNV泄漏
为了进一步评估AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra病毒是否具有持久的抗血管生成作用，我们采用了两阶段激光诱导CNV模型，并在第二次激光光凝后第7天和第14天进行眼底荧光素血管造影(FFA)(图4A)。结果表明与Saline组和AAV2/2-GFP组相比，AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra组光斑周围的渗漏面积明显减少，与Conbercept组相比渗漏面积下降且具有统计学差异(图4B-图4D)。RPE-脉络膜-巩膜复合体铺片染色同样显示AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra组CD31和F4/80的荧光强度明显下降(图4E-图4G)，表明AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra病毒长期可以有效抑制小鼠CNV的发展，且优于Conbercept的两次注射效果。
四、AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra抑制激光诱导CNV模型视网膜下纤维化
在AMD发展过程中，有相当比例的患者会进展为终末期的纤维斑块或盘状瘢痕，最终导致不可逆的视力丧失。接受康柏西普等抗VEGF药物治疗常规疗法的患者当中，约有50％的患者两年内会出现视网膜下纤维化导致治疗失败，而针对视网膜下纤维化目前还没有有效的药物能够治疗或预防。激光损伤后早期测序结果亦显示，上皮间充质转化(EMT)进程在AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra组显著下调(图3H)。由于EMT功能在纤维化进程中扮演重要角色，这提示AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra可能具有潜在抑制视网膜下纤维化的功能。为了验证这一猜想，我们通过基因集富集分析GSEA富集分析发现AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra组中上皮间充质转化(EMT)过程明显下调，而EMT过程正是在各种纤维化进展中起关键作用的信号。GSEA同样表明AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra组相较Saline组胶原/纤维组织和EMT基因均呈现下调趋势(图5B-图5C)。免疫荧光染色结果也表明在CNV模型中AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra组α-SMA和FN1的积累明显减少(图5D)。
五、AAV2/2-sFLT-1-sIL-1Ra病毒不改变小鼠视网膜形态和功能
为了评估AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra病毒对正常视网膜的毒性，我们在注射前及注射后2、4、8周进行了光学相干断层扫描(OCT)检查(图6A)。结果显示，AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra组眼底状况良好，无出血、视网膜脱离、炎症表现(图6B)，且与Saline组或AAV2/2-GFP组相比视网膜厚度无明显变化、无水肿、无高反射区域(图6C)。用TUNEL法检测视网膜细胞凋亡情况，AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra组和Saline组均未见阳性细胞(图6D)。这些结果都表明AAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra病毒对视网膜没有明显的毒性作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种靶向抑制湿性AMD的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的组成元件包括sFLT-1蛋白和sIL-1Ra蛋白。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述sFLTt-1蛋白的氨基酸序列如SEQID No.1所示，所述sIL-1Ra蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；优选地，所述sFLT-1蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述sIL-1Ra蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；更优选地，所述sFLT-1蛋白为如下a1-a3任一种：
(a1)SEQ ID No.1所示的蛋白质；
(a2)在(a1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(a3)与(a1)-(a2)任一种具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
所述sIL-1Ra蛋白为如下b1-b3任一种：
(b1)SEQ ID No.2所示的蛋白质；
(b2)在(b1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(b3)与(b1)-(b2)任一种具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
3.一种重组腺相关病毒，其特征在于：以腺相关病毒AAV2/2为基础毒株，重组表达sFLT-1蛋白和sIL-1Ra蛋白。
4.根据权利要求3所述的重组腺相关病毒，其特征在于：所述重组腺相关病毒的基因组为将含有sFLT-1蛋白和sIL-1Ra蛋白的编码基因插入腺相关病毒AAV基因组内切酶EcoRI及HindIII之间。
5.一种表达权利要求3或4所述的重组腺相关病毒的载体，其特征在于：所述载体为pAAV-MCS质粒；
优选地，所述pAAV-MCS质粒的EcoRI和HindIII酶切位点之间插入含有sFLT-1蛋白和sIL-1Ra蛋白的编码基因。
6.权利要求3或4所述的重组腺相关病毒的构建方法，其特征在于：所述构建方法包括如下步骤：
1)构建重组腺相关病毒表达质粒pAAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra；
2)将所述腺相关病毒表达质粒pAAV2/2-sFLT-1-P2A-sIL-1Ra转染腺相关病毒包装细胞，培养，得到所述重组腺相关病毒。
7.根据权利要求6所述的重组腺相关病毒的构建方法，其特征在于：所述包装细胞为HEK293T细胞。
8.一种包含权利要求3或4重组腺相关病毒的药物。
9.根据权利要求7所述的药物，其特征在于：所述药物为如下任一种药物：
1)预防和/或治疗新生血管性年龄相关性黄斑变性的药物；
2)预防和/或治疗脉络膜新生血管得药物；
3)抑制脉络膜新生血管进展的药物；
4)抑制脉络膜新生血管中血管渗漏面积的药物；
5)抑制脉络膜新生血管中新生血管体积的药物；
6)抑制脉络膜新生血管引发的炎症浸润的药物。
10.根据权利要求7所述的药物，其特征在于：所述的药物还包含药学上可接受的载体；优选地，所述的药物的剂型为注射剂；优选地，所述的注射剂包括注射液和冻干粉针剂。
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2024
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