CN118490892A - 缓释Apt19S募集内源性干细胞和引导中枢神经轴突直行再生的生物活性支架及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种缓释Apt19S募集内源性干细胞和引导中枢神经轴突直行再生的生物活性支架及其应用，该生物活性支架由脱细胞视神经(DON)及适配子Apt19S组成，其制备方法包括以下步骤：1.制备DON支架。2.激活DON支架表面的羧基。3.DON支架与经过氨基修饰的Apt19S通过酰胺化反应进行结合，得到所述的DON‑Apt19S支架(简称DON‑A)。这种生物活性支架可以持续释放Apt19S，募集ALPL阳性的内源神经干细胞和间充质细胞，引导中枢神经轴突直行再生，并为原位脊髓修复提供神经发生和血管再生的微环境。该生物活性支架在中枢神经损伤修复中具有重要转化前景和应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及医学组织工程学领域，特别涉及了利用去细胞视神经(DON)和DNAaptamer(Apt)19S(Apt19S)构建一种缓释Apt19S募集内源性干细胞和引导中枢神经轴突直行再生的生物活性支架DON-Apt19S(下文统一简称：DON-A)，能够通过Apt19S与干细胞膜表面的碱性磷酸酶(ALPL)受体特异性结合，在中枢神经系统募集内源性ALPL阳性的神经干细胞和间充质干细胞，为干细胞的增殖和分化提供中枢神经特有的细胞外基质微环境支持并引导中枢神经、血管再生。
背景技术
传统观点认为严重损伤的脊髓无法自我修复，除了存在不利于再生的缺氧缺血和炎性微环境；另一个重要原因是内源性干细胞缺乏，功能细胞得不到补充。而脊髓损伤急性期产生的炎症因子具有双刃剑的作用，一方面导致神经细胞坏死和凋亡，另一方面具有激活内源干细胞的作用。这为动员自体干细胞实现脊髓损伤(SCI)自我修复提供了可能：如果能充分动员自体干细胞并诱导其分化为功能细胞参与组织修复，将可避免细胞移植策略所面临系列难题(如免疫排斥、难以长期存活、功能整合不足等)，更易于向临床应用转化。
SCI前2周是神经干细胞激活和增殖的关键时期。然而这些受到炎症因子激活的神经干细胞(NSCs)通常在炎症微环境中面临凋亡或者分化参与瘢痕形成的命运。一些缓释的趋化因子已经被证实在脊髓损伤处可协调内源性NSCs迁移,促进SCI后的内源性修复。如缓释基质细胞衍生因子1(SDF-1)的胶原支架移植到大鼠脊髓损伤处能够募集内源神经干细胞，此外，缓释Cetuximab、IL-10、paclitaxel(PTX)、N-cadherin的微环境，可促进内源神经干细胞分化为神经元参与脊髓损伤修复。有研究表明，富含神经营养因子的生物材料或者间充质干细胞(MSC)外泌体也能够促使迁移到材料中的内源NSCs更好地存活和进一步分化为神经元或者少突胶质细胞参与神经修复。由此可见，吸引内源神经干细胞、防止神经干细胞凋亡及促进神经干细胞分化为神经元的方案，对于脊髓损伤修复具有重要作用。然而目前尚无在脊髓损伤处同时募集内源性NSCs和MSCs的研究报道。而且现有的方案主要是改善损伤微环境防止内源干细胞凋亡，并非特异性募集内源干细胞。脊髓损伤处缺血缺氧，内源神经干细胞数量不足、分化方向不可控，仍然是制约脊髓自我修复的根本难题。
DNA aptamer(Apt)19S(Apt19S)是近年来发现的小分子核酸类药物，其作为配体可与干细胞表面的ALPL受体结合，特异地募集ALPL高表达的干细胞(包括胚胎干细胞、多能干细胞等)这些干细胞的增殖和分化潜能往往和ALPL的表达成正比。近年来还发现Apt19S对MSCs和NSCs也具有特异的募集作用，被用于软骨和神经退行性疾病的靶向治疗。但Apt19S应用于静脉注射容易被降解，因而常常被用于局部给药。我们的前期研究提示，DON支架具有较好的机械强度，并能够为NSCs提供中枢神经发育微环境且具有引导神经轴突直行再生的潜能。
综上所述，我们提出利用Apt19S经过氨基修饰之后能够与蛋白质羧基特异性结合的特点，将其稳定地负载到富含蛋白质羧基的DON支架中，设计一种既可支撑脊髓的神经再生通道又可稳定缓释Apt19S的生物活性支架DON-A，可在脊髓损伤处高效募集和“孵化”ALPL阳性的内源NSCs和MSCs，有效实现受损脊髓的原位神经、血管再生和神经通路的功能重建。
发明内容
本发明的目的在于克服脊髓损伤后内源神经干细胞不足、且难以在损伤微环境存活的难题，开发一种缓释Apt19S募集内源性干细胞和引导中枢神经轴突直行再生的生物活性支架，其中，DON-A用于移植到脊髓损伤处，促进脊髓原位神经和血管再生，利用DON支架的空间微拓扑结构和其表面丰富的蛋白质羧基，通过酰胺化反应负载氨基修饰的Apt19S以制备缓释Apt19S的生物活性支架DON-A，从而实现Apt19S的持续释放，进而与干细胞膜表面的ALPL特异性结合，募集大量内源性NSCs和MSCs到DON支架内部，利用DON提供的中枢神经细胞外基质微环境实现原位脊髓神经、血管再生。
本发明目的之一采用如下技术方案实现：
一种缓释Apt19S募集内源性干细胞和引导中枢神经轴突直行再生的生物活性支架，由脱细胞视神经(decellularized optic nerve,DON)支架和适配子Apt19S组成，具体的，该生物活性支架包括如下制备步骤：1)制备DON支架；2)激活DON支架的羧基；3)制备DON-A生物活性支架：将激活羧基的DON支架和经过氨基修饰的Apt19S共同孵育得到缓释Apt19S的DON-A生物活性支架。
进一步地，在步骤1)中，DON支架的制备步骤包括如下步骤：
将新鲜的猪视神经去除脂肪组织后，在含有青霉素-链霉素和真菌毒素/两性霉素溶液的蒸馏水中，于4℃洗涤过夜，随后用Triton X-100、脱氧胆酸钠、DNA酶和RNA酶去除视神经的细胞，保留细胞外基质及其天然物理结构，然后将去除细胞的视神经浸入离心管中的无菌蒸馏水中，并冷冻干燥24小时，得到DON支架。
进一步优选地，在步骤1)中，DON支架的制备步骤包括如下步骤：
a)提取成年猪的新鲜的视神经，将神经去除脂肪组织和神经鞘膜，得到第一视神经；
b)将第一视神经置于含有1％的青霉素-链霉素、真菌毒素和两性霉素的蒸馏水中，在4℃下处理24h，得到第二视神经；其中，真菌毒素为100μg/mL，两性霉素为2.5μg/mL。
c)然后将第二视神经浸泡于3％Triton-X-100溶液中，摇床250r/min，震荡12h，得到第三视神经；
d)随之，再将第三视神经浸泡于4％脱氧胆酸钠水溶液中，摇床250r/min震荡24h，得到第四视神经；
e)再将第四视神经浸泡于50U/ml DNA酶、50U/ml RNA酶、10mM MgCl2·6H2O、50mMTris的水溶液中，37℃恒温摇床150r/min，震荡3h，使神经脱细胞，得到第五视神经；
f)然后，将第五视神经浸入无菌双蒸馏水中，置于离心管中冷冻干燥24h，得到所述的DON支架。
进一步地，在步骤2)中，激活DON支架的羧基的制备步骤包括如下步骤：
将步骤1)所得的DON支架置于0.1M的吗啉乙磺酸(MES，PH＝6)的溶液中，室温孵育30分钟，然后在吗啉乙磺酸溶液中加入80mg的1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐和60mg的N-羟基琥珀酰亚胺，孵育20分钟，激活DON表面的羧基。
进一步优选地，激活DON支架的羧基的制备步骤中在DON支架置于吗啉乙磺酸前还包括如下步骤：
将步骤1)所得的DON支架制作直径为3mm，高度为2mm的圆柱体结构的DON支架。
进一步地，在步骤3)中，DON-A生物活性支架的制备步骤包括如下步骤：
将激活羧基的DON支架和经过氨基修饰的Apt19S共同孵育，通过酰胺化反应，形成稳定结合的化学键，实现Apt19S在DON支架中的稳定负载与缓释。
进一步优选地，在步骤3)中，DON-A生物活性支架的制备步骤包括如下步骤：
将激活羧基的DON支架置于经过氨基修饰的Apt19S溶液中共同孵育12h，通过酰胺化反应，形成稳定结合的化学键，实现Apt19S在DON支架中的稳定负载与缓释，得到所述的搭载Apt19S的DON-A生物活性支架。
上述制备方法得到的一种缓释Apt19S募集内源性干细胞和引导中枢神经轴突直行再生的生物活性支架在脊髓损伤修复中的应用均属于本发明的保护范围之内。
实验证明：本发明制备的DON-A支架在体外证实Apt19S可通过ALPL与NSCs和MSCs的特异性结合，体内实验证实DON-A移植到脊髓完全性横断大鼠损伤处可募集大量内源性干细胞，促进NSCs更多地向神经元分化，MSC向血管内皮细胞分化，增加内源性干细胞向神经元分化的潜能和成血管的能力，引导中枢神经轴突直行再生，促进瘫痪后肢运动功能恢复。
本发明目的之二采用如下技术方案实现：
一种应用，将上述所述的缓释Apt19S募集内源性干细胞和引导中枢神经轴突直行再生的生物活性支架在脊髓损伤修复中的应用。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明的缓释Apt19S募集内源性干细胞和引导中枢神经轴突直行再生的生物活性支架利用DON支架的空间微拓扑结构和其表面丰富的蛋白质羧基，通过酰胺化反应负载氨基修饰的Apt19S以制备缓释Apt19S的生物活性支架DON-A，从而实现Apt19S的持续释放，进而与干细胞膜表面的ALPL特异性结合，募集大量内源性NSCs和MSCs到DON支架内部，利用DON提供的中枢神经细胞外基质微环境实现原位脊髓神经、血管再生。
2、本发明的DON-A生物活性支架，通过持续释放Apt19S有效招募内源性NSCs和MSCs，与它们的ALPL受体结合，促进了损伤脊髓的原位神经和血管再生，在脊髓损伤等中枢神经修复中有着重要的应用价值。
3、在本发明中，DON保留了其天然的属于中枢神经的细胞外基质成分，具有引导轴突的黏附和生长和促进中枢神经组织来源的细胞归巢和发育分化的特性；DON保留了其天然的容许神经束直行生长的通道和空间微拓扑结构，具有引导中枢神经轴突直行再生的特性。移植到脊髓损伤处后，DON持续缓释Apt19S，具有通过Apt19S和干细胞膜表面的碱性磷酸酶(ALPL)受体特异性识别和结合，募集高表达ALPL受体的内源神经干细胞和间充质干细胞亚群，实现双干细胞的特异性高效募集的特性。移植到脊髓损伤处后，所募集的高表达ALPL受体的内源神经干细胞能够在DON提供的中枢神经细胞外基质微环境中增殖后分化为神经元参与脊髓神经通路的修复或者分化为少突胶质细胞形成新生髓鞘。移植到脊髓损伤处后，所募集的高表达ALPL受体的内源间充质干细胞能够在DON提供的中枢神经细胞外基质微环境中先增殖后分化为血管内皮细胞参与血管再生，或者发挥旁分泌作用调节免疫微环境和促进神经再生。移植到脊髓损伤处后，低表达ALPL的肌成纤维细胞和巨噬细胞不会被Apt19S募集到损伤处，不会加重脊髓损伤后的炎症和瘢痕形成。
附图说明
图1为DON-A生物活性支架构建示意图；
图2为DON-A中Apt19S与NSCs和MSCs的特异性结合及缓释情况图；
图3为DON-A体外募集NSCs和MSCs及细胞分化情况图；
图4为巨噬细胞和血管平滑肌细胞的ALPL表达情况图；
图5为DON-A移植到损伤部位后募集NSCs及NSCs分化为神经元和少突胶质细胞的情况图；
图6为DON-A移植到损伤部位后血管和神经再生情况图。
图7为DON-A移植到损伤部位后神经纤维再生和髓鞘化及运动功能恢复情况图。
具体实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。下面通过具体实施例对本发明所用本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。在以下实施例中，所有原料材料除了部分合成外，其他材料都是外购所得。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
1、DON-A支架制备
本发明构建生物活性支架所用到的生物材料是脱细胞猪视神经，所用的Apt19S由上海生工合成。
从成年猪分离新鲜的视神经。在离心管中，将获得的视神经在含有1％的青霉素-链霉素和真菌毒素/两性霉素溶液的蒸馏水(真菌毒素为100μg/mL，两性霉素为2.5μg/mL)中于4℃洗涤过夜。随后用3％Triton X-100、4％脱氧胆酸钠，50U/ml DNA酶、50U/ml RNA酶、10mM MgCl2·6H2O、50mM Tris等去除神经的细胞含量。然后将视神经浸入1.5ml离心管中的无菌蒸馏水中并冷冻干燥24小时。将中枢神经来源的DON，制成一种圆柱体的支架(直径3mm，高2mm)，如图1的A-B所示，在扫描电镜下，可观察到圆柱体DON支架的横向(A)和纵向(B)结构。在室温下将支架浸入10mL吗啉乙磺酸(MES，0.1M，pH＝6)中30分钟。然后将80mg1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)和60mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入MES溶液中以活化DON表面上的羧基。20分钟后，除去活化缓冲液，将2nmol氨基修饰的Apt19S或氨基修饰的FITC标记的Apt19S加入1ml的缓冲液中，并在室温下在往复式振荡器中进行反应12小时。最后，用缓冲液洗涤DON-A支架3次，得到所述的Apt19S搭载的DON生物活性支架，24h内使用。如图1C所示，Apt19S通过形成酰胺键与DON支架及结合，并可通过ALPL与NSCs和MSCs特异性结合。
2、DON-A生物活性支架修复脊髓损伤的功能检测
(1)DON-A的体外生物学活性检测
(a)DON-A支架缓释Apt19S的特性检测。
图2G显示负载FITC-Apt19S的DON-A支架的纵切面在荧光显微镜下发出绿色荧光，而普通的DON支架没有显示绿色荧光(图2H)。将负载有氨基修饰的FITC标记的Apt19S或无氨基的FITC标记(用于对照)的Apt19S的DON支架浸入含有1ml无菌缓冲液的24孔培养板中。然后将支架在37℃下孵育。在每个预定的时间点(1、2、3、4、5、6、7、10、15、20、25、30天)取出1ml无菌缓冲液并加入相等体积的新的无菌缓冲液。使用FITC作为模型客体分子来监测Apt19S的释放动力学。将收集的悬浮液加入96孔培养板中，并使用多模平板读取器在525nm的波长下定量，以此测量释放的Apt19S浓度。图2I为氨基修饰的Apt19S从DON支架上的释放曲线。在整个30天的观察过程中，负载Apt19S的DON支架可持续且稳定地将Apt19S释放到溶液中。
(b)检测DON-A支架在体外特异结合ALPL阳性的NSCs及其分化的情况。
选用出生3～5天的SD乳鼠，在无菌条件下断头取脑，将脑置于冷的D-Hank’s液中，解剖显微镜下用器械分离出海马。采用机械吹打法培养NSCs：先用眼科剪将海马组织剪碎，再连同D-Hank’s液移入离心管中用细头玻璃吸管轻轻吹打数次，直至肉眼见不到明显的组织块，吹打时应慢速并用力适度，避免产生气泡，以1000rpm离心5min，去上清，重复操作一次，用NSCs培养液重新吹打悬浮细胞沉淀，计数并调整细胞密度约为1×105/ml，将此细胞悬液移入培养瓶，于37℃、5％CO2培养箱中进行悬浮培养。当观察到大量的细胞克隆球开始形成时，隔天用细头玻璃吸管机械吹打分离NSCs克隆球进行传代。传代2周后，取第2代的NSCs漂浮法进行nestin免疫荧光细胞化学鉴定。如图2A所示,NSCs呈nestin阳性的神经球形态，图2B显示神经球贴壁生长后nestin阳性的细胞骨架被ALPL阳性的细胞膜包裹，ALPL具有明显的细胞膜表达模式。将这些nestin阳性的细胞和带绿色荧光基团的Apt19s共孵育，图2C可见nestin阳性的神经干细胞能够特异性的结合Apt19S，在胞体和突起都可见带绿色荧光基团(FITC)的Apt19S。
(c)检测DON-A支架在体外特异结合ALPL阳性的MSCs及其分化的情况。
选用出生7天的SD乳鼠。在无菌条件下取其股骨整段，放置于无菌的含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养液中，利用1ml注射器将骨髓腔的骨髓吹打至细胞培养皿。再吹打至均匀的细胞悬液，再放置于细胞培养箱中。48小时后，换液移去不贴壁的细胞。当细胞长满至约80％时，用包含0.02％EDTA的0.25％胰酶消化细胞，按1：3传代。取第3-6代间的MSCs进行CD73和CD90免疫荧光细胞化学鉴定。图2D表示这些MSCs的细胞膜高表达ALPL。图2E-F表示，MSCs可同时表达CD73和CD90，并可与带FITC的Apt19s特异性结合。
(d)DON-A支架对NSCs和MSCs的特异性募集和支持分化情况验证。
采用悬浮吸附实验进一步验证Apt19S对NSCs和MSCs的募集情况。首先，将绿色荧光蛋白(GFP)转基因SD大鼠的神经球用0.125％胃蛋白酶消化10分钟，得到NSCs的单细胞悬浮液。将1ml DMEM/F12培养基中的5×104GFP-NSCs加入24孔板的每个孔中。用0.25％胃蛋白酶消化GFP-MSCs 3分钟，获得MSCs的单细胞悬液。然后，将1ml DMEM/F12培养基中的5×104GFP-NSCs或1ml含10％FBS的DMEM培养基中的5×104个GFP-MSCs接种于24孔板的每个孔中，每孔放置DON-A支架或DON切片，孵育12小时。实验分组包括空白支架(DON)组，DON-A组和DON-A添加了ALPL封闭抗体(DON-A+anti-ALPL)组。图3A-B显示的是各组GFP-NSCs和GFP-MSCs在支架上的贴附情况，悬浮在培养液中的NSCs或MSCs都更多地被吸引贴附到DON-A支架中，比空白的DON支架贴附的细胞数量多3倍以上。在DON-A组的细胞培养液中加入ALPL的封闭抗体之后，可见贴附到支架的细胞数量显著减少到和空白DON支架一致的水平。提示ALPL阳性的NSCs和MSCs通过ALPL与Apt19S的特异性结合被DON-A支架更多地吸引。图3C-D显示的是NSCs和MSCs在空白支架和DON-A支架上的分化情况。NSCs具有分化为Map2阳性神经元，Olig2阳性少突胶质细胞和GFAP阳性星形胶质细胞的3向分化潜能，两种支架的分化比例没有差异。图3E-F显示的是NSCs和MSCs的分化比例，种植在DON-A支架的MSCs和种植在DON支架的MSCs一样具有被诱导分化为VWF阳性和CD31阳性的血管内皮细胞的潜能，两组的分化比例没有统计学差异。以上结果提示DON-A支架不影响NSCs和MSCs的正常分化。此外，巨噬细胞(图4A-C)和血管平滑肌细胞(图4D-F)ALPL表达极低,提示DON-A移植后，低表达ALPL的巨噬细胞和肌成纤维细胞不会被Apt19S募集到损伤处，也不会加重脊髓损伤后的炎症和瘢痕形成，表明DON-A移植与炎症和纤维瘢痕形成的风险相关性较低。
(2)体内实验
实验步骤：雌性成年SD大鼠(体重220-250克)由中山大学实验动物中心提供，大鼠经过在T10水平的2mm完全性横断脊髓损伤后随机分为三组(每组n＝24)：(1)SCI组(损伤处无支架植入)，(2)DON组(直径3mm,高度2mm的圆柱体结构的DON支架植入损伤区)，(3)DON-A组(直径3mm,高度2mm的圆柱体结构的DON-A支架植入损伤区)。为了示踪SCI急性期有增殖分化能力的细胞，在损伤造模的第3天开始给各组大鼠的腹腔注射EDU，连续注射10天。
(a)DON-A移植4W后脊髓的内源干细胞增殖及分化情况
图5A-C表示术后4W观察各组纵切脊髓的损伤/移植区头端、中央和尾端的内源干细胞增殖及分化情况，DON-A组在损伤/移植区的头尾两端和支架内部可观察到有较多的Tuj阳性细胞的表达，且有大量EDU阳性和Olig2阳性的细胞分布。图5D显示的是各组的Tuj相对荧光密度的统计分析结果。图5E-F显示的是各组EDU和Olig2阳性细胞数量的统计分析结果。图5G显示的是各组Tuj和EDU双阳性以及Olig2和EDU双阳性细胞在EDU阳性细胞中的比例。结果显示，DON-A组在损伤/移植区的头尾两端和支架内部均可检测到显著多于其他两组的EDU阳性的细胞；在DON-A组的损伤/移植区的头端和中央，有显著多于其他两组的Tuj表达；但在尾端，DON-A组和DON组的Tuj表达无显著差异；在DON-A组的损伤/移植区的头尾两端和中央，可检测到显著多于另外两组的Olig2阳性细胞的数量。DON-A组的EDU阳性细胞更高比例分化为Tuj，在移植交界区可见大量EDU和Tuj双阳性的细胞由脊髓组织长入到支架内部，在支架内部可见大量EDU/Tuj双阳性的神经突起沿支架的通道直行生长；仅有极小部分EDU阳性细胞分化为Olig2且多数分布于头尾两端的脊髓组织中，提示募集而来的内源NSCs在DON营造的微环境中具有更高的神经元分化比例。
(b)DON-A移植4W后内源NSCs及MSCs的分化及脊髓的血管和神经再生情况
图6A-C显示的是术后4W,EDU所代表的脊髓内源性干细胞向星形胶质细胞细胞和血管内皮细胞分化的情况。图6E-F显示的是各组GFAP和VWF的相对荧光密度的统计分析结果。DON-A组在头尾两端的交界区脊髓组织GFAP表达显著多于DON组和SCI组，且在DON-A组的损伤/移植区的头尾两端和中央均存在显著多于另外两组的VWF阳性的血管内皮细胞。图6G显示的是GFAP/EDU和VWF/EDU阳性细胞的比例。DON-A组的GFAP/EDU和VWF/EDU阳性细胞显著多于SCI组，在DON-A组的移植交界区可见密集且有分支的VWF/EDU双阳性内皮细胞形成的血管，这些血管可以沿着DON支架的通道再生到支架内部，提示DON-A组募集而来的内源性干细胞具有良好的成血管能力。图6D显示，在DON-A组移植区的头尾两端，GFAP/EDU双阳性星形胶质细胞的突起呈现与脊髓纵轴平行的趋势生长并和GAP43阳性的神经元突起伴随生长的现象。结果提示，Apt19S募集的ALPL强阳性的NSCs所分化的星型胶质细胞可能更类似于神经发育期的幼稚星形胶质细胞，不但有利于引导神经再生，还可能对新生神经元具有更好地营养支持作用，且Apt19S募集而来的ALPL强阳性的NSCs具有比星形胶质细胞更强的迁移能力，其分化的新生神经元具有良好的轴突生长潜能。
(c)DON-A生物活性支架移植后大鼠运动功能和脊髓神经传导通路恢复情况
术后每周采用旷场实验评估大鼠瘫痪后肢的运动功能恢复的情况。Basso,Beattie,and Bresnahan(BBB)评分系统用于定量评估自主运动和支持体重的能力。图7F显示各组0-8W的BBB评分的变化情况，DON-A组大鼠在4W时关节运动开始显著高于其他两组，在4-8W的时间点，行为学呈持续上升的趋势，8W时运动功能恢复情况显著高于其他两组。图7A-C显示的是大鼠治疗8周后，神经再生和神经传导通路的组织学证据，结果显示DON-A组NF阳性的神经纤维能够更明显地再生到损伤/移植区及其头尾两端脊髓组织，可以在头尾两端检测到这些NF阳性的神经纤维被MBP阳性的髓鞘包绕且无髓鞘溃变的表现；DON-A组的支架内部可观察到比另外两组更多NF阳性神经纤维直行再生。图7D-E显示DON-A组的NF和MBP表达的相对荧光密度显著多于其他两组。
综上，DON-A支架通过持续释放Apt19S有效招募内源性NSCs和MSCs，与它们的ALPL受体结合，并在DON提供的“孵育”微环境中快速启动修复。DON-A移植可引导中枢神经轴突直行再生，促进损伤脊髓的原位神经、血管再生，从而促进神经传导通路的修复。本发明的缓释Apt19S募集内源性干细胞和引导中枢神经轴突直行再生的生物活性支架的发明和应用于脊髓损伤修复挑战了内源性干细胞不足以支持脊髓损伤后的自我修复的传统观点，在中枢神经损伤修复中有重要的临床应用转化前景和重要的应用价值。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (8)
1.一种缓释Apt19S募集内源性干细胞和引导中枢神经轴突直行再生的生物活性支架，其特征在于，包括如下制备步骤：
1)制备DON支架；
2)激活DON支架的羧基；
3)制备DON-A生物活性支架：将激活羧基的DON支架和经过氨基修饰的Apt19S共同孵育得到缓释Apt19S的DON-A生物活性支架。
2.根据权利要求1所述的缓释Apt19S募集内源性干细胞和引导中枢神经轴突直行再生的生物活性支架，其特征在于，在步骤1)中，DON支架的制备步骤包括如下步骤：
将新鲜的猪视神经去除脂肪组织后，在含有青霉素-链霉素和真菌毒素/两性霉素溶液的蒸馏水中，于4℃洗涤过夜，随后用Triton X-100、脱氧胆酸钠、DNA酶和RNA酶去除视神经的细胞，保留细胞外基质及其天然物理结构，然后将去除细胞的视神经浸入离心管中的无菌蒸馏水中，并冷冻干燥24小时，得到DON支架。
3.根据权利要求2所述的缓释Apt19S募集内源性干细胞和引导中枢神经轴突直行再生的生物活性支架，其特征在于，所述DON支架的制备步骤包括如下步骤：
a)提取成年猪的新鲜的视神经，将神经去除脂肪组织和神经鞘膜，得到第一视神经；
b)将第一视神经置于含有1％的青霉素-链霉素、真菌毒素和两性霉素的蒸馏水中，在4℃下处理24h，得到第二视神经；其中，真菌毒素为100μg/mL，两性霉素为2.5μg/mL。
c)然后将第二视神经浸泡于3％Triton-X-100溶液中，摇床250r/min，震荡12h，得到第三视神经；
d)随之，再将第三视神经浸泡于4％脱氧胆酸钠水溶液中，摇床250r/min震荡24h，得到第四视神经；
e)再将第四视神经浸泡于50U/ml DNA酶、50U/ml RNA酶、10mM MgCl2·6H2O、50mM Tris的水溶液中，37℃恒温摇床150r/min，震荡3h，使神经脱细胞，得到第五视神经；
f)然后，将第五视神经浸入无菌双蒸馏水中，置于离心管中冷冻干燥24h，得到所述的DON支架。
4.根据权利要求1所述的缓释Apt19S募集内源性干细胞和引导中枢神经轴突直行再生的生物活性支架，其特征在于，在步骤2)中，激活DON支架的羧基的制备步骤包括如下步骤：
将步骤1)所得的DON支架置于0.1M的吗啉乙磺酸的溶液中，室温孵育30分钟，然后在吗啉乙磺酸溶液中加入80mg的1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐和60mg的N-羟基琥珀酰亚胺，孵育20分钟，激活DON表面的羧基。
5.根据权利要求4所述的缓释Apt19S募集内源性干细胞和引导中枢神经轴突直行再生的生物活性支架，其特征在于，所述激活DON支架的羧基的制备步骤中在DON支架置于吗啉乙磺酸前还包括如下步骤：
将步骤1)所得的DON支架制作直径为3mm，高度为2mm的圆柱体结构的DON支架。
6.根据权利要求1所述的缓释Apt19S募集内源性干细胞和引导中枢神经轴突直行再生的生物活性支架，其特征在于，在步骤3)中，DON-A生物活性支架的制备步骤包括如下步骤：
将激活羧基的DON支架和经过氨基修饰的Apt19S共同孵育，通过酰胺化反应，形成稳定结合的化学键，实现Apt19S在DON支架中的稳定负载与缓释。
7.根据权利要求6所述的缓释Apt19S募集内源性干细胞和引导中枢神经轴突直行再生的生物活性支架，其特征在于，在步骤3)中，DON-A生物活性支架的制备步骤包括如下步骤：
将激活羧基的DON支架置于经过氨基修饰的Apt19S溶液中共同孵育12h，通过酰胺化反应，形成稳定结合的化学键，实现Apt19S在DON支架中的稳定负载与缓释，得到所述的搭载Apt19S的DON-A生物活性支架。
8.一种应用，其特征在于，将如权利要求书1-7任一项所述的缓释Apt19S募集内源性干细胞和引导中枢神经轴突直行再生的生物活性支架在脊髓损伤修复中的应用。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202410573202.9A CN118490892A (zh) | 2024-05-10 | 2024-05-10 | 缓释Apt19S募集内源性干细胞和引导中枢神经轴突直行再生的生物活性支架及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410573202.9A CN118490892A (zh) | 2024-05-10 | 2024-05-10 | 缓释Apt19S募集内源性干细胞和引导中枢神经轴突直行再生的生物活性支架及其应用 |
Publications (1)
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Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
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Country Status (1)
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2024
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