CN118475365A - 缺乏脂多糖（lps）的鲍曼不动杆菌多价疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含来自不动杆菌属的缺乏LPS的灭活细胞和/或其外膜囊泡的组合物，以及它们在制造用于预防由肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌和/或胸膜肺炎放线杆菌以及可选的鲍曼不动杆菌引起的疾病的药物、优选疫苗中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及一种组合物，包含不能合成LPS的核心成分脂质A并且能够表达来自其他细菌的异源外膜蛋白和/或衍生自相同细胞的外膜囊泡的不动杆菌属灭活细胞，以及它们在制造用于预防由异源外膜蛋白原始来源的细菌和可选的鲍曼不动杆菌引起的疾病的药物(优选疫苗)中的用途。
背景技术
碳青霉烯类耐药感染的治疗通常基于抗生素，包括多粘菌素、替加环素、氨基糖苷类及其组合。然而，在最近的综述中，我们发现全球范围内越来越多地报告同时耐碳青霉烯类、氨基糖苷类、多粘菌素和替加环素(CAPT耐药)的革兰氏阴性菌(GNB)。因此，需要进一步治疗方案与快速诊断方法的结合。关于抗菌药物耐药性(AMR)影响的最全面研究表明，仅在2019年，全球就有500万人死于与AMR病原体引起的感染有关的原因。其中七种细菌占全球死亡人数的73％：革兰氏阴性菌肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)和大肠杆菌(Escherichia coli)，以及革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)。目前可用的只有针对这六种全球杀手之一肺炎链球菌的疫苗。在本发明中，我们特别关注一种能够递送用于作为针对细菌感染(特别是针对革兰氏阴性菌，包括肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和大肠杆菌)的疫苗的药物物质的技术。该技术可应用于任何革兰氏阴性菌，例如猪胸膜肺炎的致病因子胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)。本发明基于这样的事实：如前所述，使用衍生自不能合成LPS的鲍曼不动杆菌(A.baumannii)的脂质A突变体的灭活细胞作为疫苗可以预防由鲍曼不动杆菌引起的感染，并且不仅可预防由鲍曼不动杆菌的某些特定克隆引起的感染，还可预防来自多样克隆(diverse clones)的感染，因为脂质A(LPS)无效(null)灭活细胞引起的免疫力集中于鲍曼不动杆菌外膜的外膜蛋白(OMP)的多个高度保守的表位。本发明还依赖于这样的事实：OMP是免疫原性细菌成分，导致人类和动物的自然免疫反应，从而预防机会性感染。而且该方法依赖于这样的事实：通过将免疫力集中在外膜蛋白(OMP)抗原(其是高度保守的蛋白质)上，疫苗可导致针对所有循环细菌病原体克隆或变体的普遍免疫力，从而克服了细菌疫苗的典型问题，即其活性成分是来自LPS或荚膜多糖的抗原。来自LPS或荚膜多糖的抗原在同一细菌物种的克隆或变体之间变化很大，因此，活性成分基于衍生自LPS或荚膜多糖的免疫原性抗原的疫苗(包括缀合疫苗)只能覆盖有限数量的变体。此外，用作疫苗的鲍曼不动杆菌的脂质A无效的灭活突变体细胞引起针对细胞外膜中符合其天然构象的OMP蛋白的免疫力，使得免疫反应与使用重组OMP蛋白作为疫苗获得的免疫反应不同。最后，作为鲍曼不动杆菌的脂质A无效的突变体细胞的一部分的多种OMP在其天然构象下的抗原呈递比呈递以重组蛋白或衍生自OMP的肽的形式的特定蛋白作为疫苗的效果更好。基于所有这些背景，本发明的技术旨在提供一种产生鲍曼不动杆菌的脂质A无效的突变体细胞的方法，这种细胞不仅能够在其膜中呈递来自鲍曼不动杆菌的免疫原性OMP，而且还能够呈递来自其他革兰氏阴性菌病原体的免疫原性OMP。通过这种方式，上述使用鲍曼不动杆菌的脂质A无效的灭活突变体作为针对鲍曼不动杆菌的疫苗的优点可以应用于对抗其他革兰氏阴性菌病原体。
附图说明
图1.该图示出了Acineto Vax(一种基于LPS缺乏的鲍曼不动杆菌菌株的灭活全细胞加以佐剂氢氧化铝的疫苗，其特征是lpxC的完全失活，如EP2942389A1中所述)针对不同鲍曼不动杆菌临床分离株感染提供保护。在用Acineto Vax二次免疫后7天(第21天)，使小鼠感染所示鲍曼不动杆菌菌株(ATCC19606，Ab-154和Ab-113-16)，并监测了7天的存活率。ATCC19606是一种尿液感染临床分离株，用作小鼠脓毒症和肺炎感染模型的参考菌株。Ab-154是一种对碳青霉烯类药物敏感的临床分离株，来自2002年塞维利亚Virgen del Rocío医院疫情。Ab-113-16是一种全耐药临床分离株，来自2002年疫情中死亡的患者。
图2.VXD001(Acineto Vax)(A)在第一次给药后仅7天就引起了体液反应。IgG亚型分析显示出IgG1和IgG2亚型，部分偏好IgG1。在B中，我们看到接种低剂量(黄色条)或高剂量(灰色条)VXD001并用疫苗抗原离体刺激的小鼠脾细胞释放Th1细胞因子IFN-γ(与CD8+T细胞相关)。我们发现，在第一次给药后也有显著的反应，只有在第14天第二次注射时才会减弱。通过分析IL-4(Th1)和IL-17(Th17)细胞因子的释放，我们观察到了相同的模式。
图3.对来自药物物质Kapa Vax的细胞的LPS无效衍生体的分析。左图显示了包含LPS合成基因lpxC的基因组区域的PCR扩增结果。预期的野生型产物长1.5Kb。克隆4和5是将Kapa Vax2细胞接种到补充有粘菌素的平板上后筛选出的粘菌素抗性突变体。随后对lpxC基因组区域进行测序，并发现在lpxC处插入1Kb ISAba1转座元件是导致lpxC失活和LPS丢失的原因。右图显示了在亲本菌株鲍曼不动杆菌Ab283、先前从Ab283获得的LPS无效衍生体、以及KapaVax2的2个LPS无效克隆的培养物中通过显色LAL测定法(PierceTM显色内毒素定量试剂盒，Thermo Fisher Scientific)对LPS(内毒素)进行定量的结果。KapaVax或KapaVax2是鲍曼不动杆菌LPS无效菌株Ab283的细胞，表达来自肺炎克雷伯菌OmpA和OmpK36的异源OMP以及来自铜绿假单胞菌OprF和融合蛋白OprI::PcrV的异源OMP。
图4.对来自药物物质K-Vax和P-Vax的细胞的LPS无效衍生体的分析。左上图显示了包含LPS合成基因lpxC的基因组区域的PCR扩增结果。预期的野生型产物长1.5Kb。该图显示了从K-Vax细胞(即在外膜中表达肺炎克雷伯菌的OMP蛋白OmpA和OmpK36的鲍曼不动杆菌Ab283细胞)的3个不同克隆(克隆4、20、42)的几种粘菌素抗性衍生体的DNA中获得的PCR产物。对显示箭头标记产物的突变体进行测序，发现ISAbA1插入在lpxC基因处。插入使lpxC失活，因此细胞无法合成LPS。右上图是含有四个检测到的LPS无效突变体的细胞的平板，在Müller-Hilton培养基上显示出生长，在琼脂-MacConkey培养基上不显示生长。LPS的丢失与无法在琼脂-MacConkey培养基上生长有关。左下图显示了包含P-Vax细胞(即在外膜中表达铜绿假单胞菌的OMP蛋白OprF和融合蛋白OprI::PcrV的鲍曼不动杆菌Ab283细胞)的LPS合成基因lpxC和lpxD的基因组区域的PCR扩增结果。预期的野生型产物长1.5Kb。该图显示了从P-Vax细胞(即在外膜中表达铜绿假单胞菌的OMP蛋白OprF和融合蛋白OprI::PcrV的鲍曼不动杆菌Ab283细胞)的几种粘菌素抗性衍生体的DNA中获得的PCR产物。对显示箭头标记产物的突变体进行测序，发现ISAbA1插入在lpxC(c48)和lpxD(d69)基因处。插入使lpxC或lpxD失活，因此这些P-Vax细胞无法合成LPS。右下图的平板显示出在琼脂-MacConkey培养基上，亲本菌株Ab283 LPS+生长，但LPS无效的Ab283衍生体或P-Vax细胞c48和d69的LPS无效突变体没有生长。LPS的丢失与无法在琼脂-MacConkey培养基上生长有关。此外，还显示了通过显色LAL测定法(PierceTM显色内毒素定量试剂盒，Thermo Fisher Scientific)对几种菌株培养物中的LPS(内毒素)进行定量分析的结果。唯一显示内毒素水平高于试剂盒检测水平的菌株是亲本菌株鲍曼不动杆菌Ab283 LPS+。结果显示LPS无效Ab283衍生体或K-Vax细胞的LPS无效突变体(克隆15和25)和P-Vax细胞c48和d69的LPS无效突变体中不存在内毒素(LPS)。
图5.表达构建体在第2次重组事件后整合到鲍曼不动杆菌染色体中的确认性PCR示例。A：左侧是使用特异性引物扩增凝胶上方所示基因组区域所获得的PCR产物。所示基因组区域是用在cysI基因座处整合的质粒pVXD50::K-Vax转化的鲍曼不动杆菌Ab283细胞中第二重组事件后的最终表达构建体。整合导致构建K-Vax细胞，即表达肺炎克雷伯菌的OMP蛋白OmpA和OmpK36的鲍曼不动杆菌Ab283细胞。如图所示，箭头标记的PCR产物显示出几个克隆(克隆20、4、42和44)中最终整合表达构建体所预期的正确大小。右侧显示的凝胶显示了通过扩增分别在K-Vax克隆4、42、44和20的细胞中制备的表达构建体中的内部序列获得的几个确认性PCR产物的结果；B：使用特定引物扩增凝胶上方显示的基因组区域获得的PCR产物。所示基因组区域是用在cysI基因座处整合的质粒pVXD50::Eco1-Vax转化的鲍曼不动杆菌Ab283细胞中第二重组事件后的最终表达构建体。整合导致构建Eco1-Vax细胞，即表达来自大肠杆菌的OMP蛋白OmpA和OmpX的鲍曼不动杆菌Ab283细胞。Eco1-Vax细胞的4个克隆的PCR产物显示出最终整合表达构建体所预期的正确大小，证实了Eco1-Vax细胞的构建。
图6.异源OMP抗原在药物物质K-Vax中的表达和定位的确认示例。上图：Kp-OmpK36和Kp-OmpA的表面暴露。使用从DS3(K-Vax)或Ab283 LPS疫苗批次中获得的膜样品进行蛋白质印迹。DS3(K-Vax)细胞是表达来自肺炎克雷伯菌的OmpA和OmpK36的OMP的鲍曼不动杆菌LPS无效Ab283细胞。使用针对Kp-OmpK36或Kp-OmpA的鼠多克隆血清作为一抗。每个样品中用蛋白酶K处理以+K(处理)或–K(不处理)表示。实施例中描述了方案。下图：通过ELISA进行疫苗批次中DS3(K-Vax)的表达分析。用蛋白酶K处理(+)或不处理(-)之后，用灭活的DS3细胞或载体细胞Ab-283 LPS-包被ELISA平板。使用针对重组版本Kp-OmpA、Kp-OmpK36或Ab-Omp22产生的多克隆血清进行一抗检测。显示了3次技术重复的平均信号(误差棒CI95％)。
图7.异源OMP抗原在药物物质P-Vax中的表达和定位的确认示例。左上：Pa-OprF的表面暴露。使用从DS4(P-Vax)、Ab283 LPS-疫苗批次或野生型铜绿假单胞菌菌株PA14细胞中获得的膜样本进行蛋白质印迹。DS4(P-Vax)细胞是表达来自铜绿假单胞菌的OprF和融合蛋白OprI::PcrV的OMP的鲍曼不动杆菌LPS无效Ab283细胞。培养物生长后洗涤，在PBS中重悬，并在37℃下用0.5mg/ml蛋白酶K处理1小时。用针对Pa-OprF的单克隆抗体Hy221-n5进行蛋白质印迹。每个样品中用蛋白酶K处理以+K(处理)或–K(不处理)表示。实施例中描述了方案；右上：Pa-OprI::PcrV融合的表面暴露。使用从DS4(P-Vax)、Ab283 LPS-疫苗批次或野生型铜绿假单胞菌菌株PA14细胞中获得的膜样本进行蛋白质印迹。培养物生长后洗涤，在PBS中重悬，并在37℃下用0.5mg/ml蛋白酶K处理1小时。用针对Pa-OprI的单克隆抗体Hy243-n20进行蛋白质印迹。每个样品中用蛋白酶K处理以+K(处理)或–K(不处理)表示。实施例中描述了方案；下部：分别使用针对重组版本Pa-OprF、Pa-OprI和Pa-PcrV的多克隆血清通过ELISA对测量的DS4(P-Vax)的2个克隆中的铜绿假单胞菌OprF、OprI和PcrV进行检测。条形图代表3次重复的平均值，误差棒显示标准差(s.d)。ELISA平板用铜绿假单胞菌PA14菌株的野生型细胞、载体细胞Ab283 LPS-和DS4opt(P-Vax)的克隆c48和d69包被。通过单因素方差分析多重比较与Ab283 LPS-相比得到的统计差异以星号表示。(*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001；****p＜0.0001)
图8.异源OMP抗原在药物物质KapaVax中的表达和定位的确认示例。异源抗原的表面暴露(上图和中图)。使用从KapaVax或Ab283 LPS疫苗批次中获得的膜样品进行蛋白质印迹。KapaVax细胞是表达来自肺炎克雷伯菌的OmpA和OmpK36以及铜绿假单胞菌OprF和融合蛋白OprI::PcrV的OMP的鲍曼不动杆菌LPS无效Ab283细胞。培养物生长后洗涤，在PBS中重悬，并在37℃下用0.5mg/ml蛋白酶K处理1小时。用针对重组蛋白Kp-OmpA、Kp-OmpK36、Pa-OprF、Pa-OprI和Pa-PcrV的多克隆抗血清进行蛋白质印迹。请注意，抗Pa-OprI和抗Pa-PcrV均识别在KapaVax2中表达的相同融合蛋白OprI::PcrV。每个样品中用蛋白酶K处理以+(处理)或–(不处理)表示。Mb：外膜提取物；S：提取物上清液。实施例中描述了方案。下图：使用针对每种抗原的重组蛋白的多克隆抗血清通过ELISA对测量的异源OMP抗原进行检测。条形图代表3次重复的平均值，误差棒显示标准差。成对比较双尾T检验中的显著差异用星号表示。抗PaOprI和抗PcrV血清靶向相同的OprI::PcrV融合蛋白。ELISA平板用KapaVax2@cysI疫苗细胞(浅灰色条)或载体细胞Ab283 LPS-(深灰色条)包被。
图9.在LPS无效鲍曼不动杆菌细胞中表达来自大肠杆菌和胸膜肺炎不动杆菌的异源抗原的例子。上图：在LPS无效鲍曼不动杆菌载体细胞和表达大肠杆菌抗原的细胞之间OMP的差异表达的示例。上方箭头表示存在于实施例1中提到的药物物质Eco2-Vax中的条带。该条带对应于预期分子量为73.3KDa(天然蛋白)的抗原FyuA。下方箭头表示存在于实施例1中提到的药物物质Eco1-Vax中、但不存在于载体细胞LPS无效鲍曼不动杆菌LPS-(AbLPS-)或候选物Eco2-Vax中的条带。该条带对应于预期大小的大肠杆菌OmpA(38KDa，天然蛋白)。下图：LPS无效鲍曼不动杆菌载体细胞与表达胸膜肺炎不动杆菌(APP)OMP抗原的细胞之间OMP表达差异的示例。箭头指示存在于实施例1中提到的表达APP OmpA(APP OmpA)的药物物质Appe3-Vax中的条带。该条带对应于预期分子量为37.5KDa的抗原OmpA(天然蛋白)。该条带不存在于鲍曼不动杆菌载体细胞LPS-(Ab LPS-)的对照泳道中。
图10显示了肺炎克雷伯菌感染引起的鼠脓毒症模型的存活图。间隔一周用2剂(109个灭活细胞/剂)的KapaVax2(N＝18)、载体Ab283 LPS-细胞(N＝8)或单独的溶媒(N＝25)对动物进行免疫。肺炎克雷伯菌菌株ATCC43816进行IP攻击(第二次免疫后第7天)。该图合并了3个独立实验的数据，攻击剂量分别为8.5x103、6.7x103和6.7x103cfu，对应于最小致死剂量(MLD)。监测存活率7-12天。统计差异通过Log-rank(Mantel-Cox)检验来测量(ns代表不显著)。肺炎克雷伯菌ATCC43816是一种高毒性、高荚膜化(hypercapsulated)的临床分离株，在人类和小鼠中产生急性肺炎并全身传播。
图11显示了铜绿假单胞菌感染引起的脓毒症模型的存活图。间隔一周用2剂(109个灭活细胞/剂)候选疫苗KapaVax2或单独的溶媒对动物进行免疫。在第二次免疫后7天，用铜绿假单胞菌菌株PA14(4.4x106cfu；相当于MLD)进行IP攻击。监测存活率7天。N/组＝8。通过Log-rank(Mantel-Cox)检验测量存活率曲线的统计差异。铜绿假单胞菌PA14是一种毒性伤口感染临床分离株。
图12显示了肺炎克雷伯菌感染引起的鼠脓毒症模型的存活图。间隔一周用2剂的DS3(K-Vax)(N＝10；K-Vax剂量：108个灭活细胞/剂)、载体Ab283 LPS-细胞(N＝8；剂量：109个灭活细胞/剂)或单独的溶媒(N＝25)对动物进行免疫。用肺炎克雷伯菌菌株ATCC43816进行IP攻击(第二次免疫后第7天)。攻击剂量相当于5倍最小致死剂量(5xMLD)。监测存活率7-12天。通过Log-rank(Mantel-Cox)检验测量统计差异。肺炎克雷伯菌ATCC43816是一种高毒性、高荚膜化的临床分离株，在人类和小鼠中产生急性肺炎并全身传播。
图13显示了铜绿假单胞菌感染引起的脓毒症模型的存活图。间隔一周用2剂(109个灭活细胞/剂)候选疫苗DS4(P-Vax)、载体Ab283 LPS-细胞或单独的溶媒对动物进行免疫。在第二次免疫后7天，用铜绿假单胞菌菌株PA14(1.3x106cfu；1xMLD)进行IP攻击。监测存活率7天。N/组＝10。通过Log-rank(Mantel-Cox)检验测量存活率曲线的统计差异。铜绿假单胞菌PA14是一种毒性伤口感染临床分离株。
图14.鲍曼不动杆菌引起的脓毒症模型的生存图。间隔一周用2剂的KapaVax2(109个灭活细胞/剂，每剂用0.83mg氢氧化铝作为佐剂配制)、Acineto Vax(109个灭活细胞/剂量，每剂用0.83mg氢氧化铝作为佐剂配制)或溶媒(仅佐剂)对动物(每组N＝8)进行免疫。第二次免疫后第7天，使用4.8x106个鲍曼不动杆菌ATCC19606细胞(1xMLD)进行IP攻击。监测存活率7天。鲍曼不动杆菌ATCC19606是一种尿液感染临床分离株，用作小鼠脓毒症和肺炎感染模型的参考菌株。
图15显示针对肺炎克雷伯菌细胞的IgG水平。用2剂KapaVax(N＝10)或单独的溶媒(N＝10)免疫的动物的在第21天取样的抗血清对肺炎克雷伯菌ATCC43816细胞进行ELISA识别。通过双尾Mann-Whitney检验进行统计分析(ns，p＞0.05；*p＜0.05；**p＜0.005；***p＜0.001)。红色虚线表示检测限。
图16显示针对肺炎克雷伯菌抗原的IgG水平。用KapaVax(N＝4)或单独的溶媒(N＝4)免疫的动物的在第21天(第二次免疫后7天)取样的抗血清对重组蛋白Kp-OmpA和Kp-OmpK36进行ELISA识别。通过非配对双尾T检验进行统计分析(ns，p＞0.05；*p＜0.05；**p＜0.005；***p＜0.001)。红色虚线表示检测限。
图17显示针对铜绿假单胞菌细胞的IgG水平。用KapaVax(N＝5)或单独的溶媒(N＝5)免疫的动物的在第21天(第二次免疫后7天)取样的抗血清对铜绿假单胞菌PA14细胞进行ELISA识别。统计显著性：ns，p＞0.05；*p＜0.05；**p＜0.005；***p＜0.001。红色虚线表示检测限。
图18显示针对铜绿假单胞菌抗原的IgG水平。用2剂KapaVax(N＝4)或单独的溶媒(N＝4)免疫的动物的在第21天(第二次免疫后7天)取样的抗血清对重组蛋白进行ELISA识别。统计显著性：ns，p＞0.05；*p＜0.05；**p＜0.005；***p＜0.001。红色虚线表示检测限。
图19显示针对鲍曼不动杆菌细胞的IgG水平。用2剂KapaVax2(N＝9)或单独的溶媒(N＝9)免疫的动物的在第21天(第二次免疫后7天)取样的抗血清对鲍曼不动杆菌ATCC19606细胞进行ELISA识别。方框显示IQR，水平线和十字分别显示中位数和平均值。误差棒延伸至CI95％。通过非配对双尾Mann-Whitney检验进行统计分析(ns，p＞0.05；*p＜0.05；**p＜0.005；***p＜0.001)。红色虚线表示检测限。
图20显示了KapaVax2(经编辑以表达肺炎克雷伯菌OmpA和OpmK36以及铜绿假单胞菌OprF和融合蛋白OprI::PcrV的LPS缺乏的鲍曼不动杆菌细胞)和Acineto Vax(LPS缺乏的鲍曼不动杆菌细胞)的抗血清对15种肺炎克雷伯菌的临床分离株(9/15来自中低收入国家，LMIC)和铜绿假单胞菌的临床分离株(8/15来自LMIC)的检测的ELISA IgG滴度(1：稀释度)。
图21显示了KapaVax2(经编辑以表达肺炎克雷伯菌OmpA和OpmK36以及铜绿假单胞菌OprF和融合蛋白OprI::PcrV的LPS缺乏的鲍曼不动杆菌细胞)和Acineto Vax(LPS缺乏的鲍曼不动杆菌细胞)的抗血清对15种鲍曼不动杆菌的临床分离株(10/15来自中低收入国家，LMIC)的检测的ELISA IgG滴度(右图；1：稀释度)。左图显示有关所使用的鲍曼不动杆菌临床分离株的收集信息，具体是临床分离株的来源国和其所属的鲍曼不动杆菌的国际克隆类型。
图22显示KapaVax和AcinetoVax疫苗批次(来自疫苗批次的总裂解物制剂(2x1010个细胞/ml))中鲍曼不动杆菌抗原的表达。样品在具有4％-16％丙烯酰胺梯度的凝胶上运行。图中显示使用针对OmpA(左)和Omp22(右)产生的单克隆抗体获得的信号。
图23显示鲍曼不动杆菌Omp22在KapaVax和载体细胞Ab283 LPS-的OM处的表面暴露。培养物生长后洗涤，在PBS中重悬，并在37℃下用0.5mg/ml蛋白酶K处理1小时。使用针对Ab-Omp22产生的单克隆抗体进行蛋白质印迹。每个样品中用蛋白酶K处理以+(处理)或–(不处理)表示。Mb：外膜提取物；S：提取物上清液。实施例中描述了方案。
图24.上图：鲍曼不动杆菌OMV纯化组分(左)的考马斯染色和检测OMV纯化组分中的鲍曼不动杆菌Omp22的蛋白质印迹(右)。在LPS无效鲍曼不动杆菌Ab283载体细胞(上)和K-Vax(DS3)细胞(表达来自肺炎克雷伯菌的OMP抗原OmpA和OmpK36的LPS无效鲍曼不动杆菌Ab283；下)中用单克隆抗体中检测到Omp22。下图：来自OMV(来自鲍曼不动杆菌LPS-载体细胞(-)或表达肺炎克雷伯菌异源抗原OmpA和OmpK36的DS3候选物(D))纯化方案的各级分的每个样品(F1-F10；参见实施例)均通过WB进行分析。使用通过重组蛋白OmpA或OmpK36免疫C57BL/6J雌性获得的多克隆抗血清作为一抗。
具体实施方式
以下详细描述公开了本发明的各个特征的具体和/或优选变体。本发明还考虑将通过组合针对本发明的两个或更多个特征描述的两个或更多个具体和/或优选变体而产生的那些实施例作为特别优选的实施例。除非另有明确说明，否则本文所用的术语“包含”指的是，除“包含”引入列表成员外，还可以可选地存在其他成员。
本发明涉及：
a.缺乏脂多糖(LPS)的鲍曼不动杆菌菌株，其特征在于编码内源LPS生物合成基因的一种或多种细胞核酸分子部分或完全失活；其中缺乏脂多糖(LPS)的鲍曼不动杆菌菌株的特征在于选自由以下组成的列表中的基因部分或完全失活：lpxA、lpxB、lpxC、lpxD、lpxK、lpxL和/或lpxM；并且其中缺乏脂多糖(LPS)的鲍曼不动杆菌菌株表达被靶向位置位于外膜处的一种或多种异源(优选外膜蛋白(OMP))抗原，使得表面暴露此类异源抗原；或
b.衍生自如上段中所定义的缺乏脂多糖(LPS)的鲍曼不动杆菌菌株的外膜囊泡(OMV)。
灭活的LPS无效鲍曼不动杆菌细胞可有效用作疫苗，以预防鲍曼不动杆菌感染。这种免疫原的高效抗原呈递表现为小鼠体内引起快速的体液反应和显著的T细胞介导反应。由于细菌细胞壁中最易变的抗原性成分即LPS不存在于免疫原中，因此免疫反应针对的是保守的外膜蛋白，这些蛋白以多个拷贝形式呈递，而且重要的是，以其天然构象存在。这导致了一种非常普遍的免疫反应，能够用同一种疫苗产品中和鲍曼不动杆菌的多样变体的感染。灭活的LPS无效鲍曼不动杆菌全细胞引起的免疫反应的特性可能克服了针对细菌病原体的疫苗接种的经典挑战，例如基于重组蛋白或来自LPS或荚膜多糖的明确糖抗原的疫苗缺乏免疫原性或特异性过高。
本发明的目的是利用鲍曼不动杆菌的LPS无效细胞的免疫原性特性，并将其适用性扩展到对抗其他细菌病原体，特别是对抗革兰氏阴性菌，包括但不限于肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和大肠杆菌。该技术可应用于任何革兰氏阴性菌，例如猪胸膜肺炎的致病因子胸膜肺炎放线杆菌。
本发明教导了构建鲍曼不动杆菌LPS无效细胞的方法，其在同一细胞中在外膜上表达来自鲍曼不动杆菌和来自其他异源细菌物种的OMP。本发明的作者证明，可以在鲍曼不动杆菌中表达来自其他细菌细胞的OMP蛋白。这些OMP蛋白的性质是本领域众所周知的(Koebnik et al.,2000；Smithers et al.2021)。外膜保护革兰氏阴性菌免受恶劣环境的影响。同时，嵌入的蛋白质完成对细菌细胞至关重要的几项任务，例如溶质和蛋白质易位以及信号转导。本发明考虑的OMP类型之一是整合OMP蛋白(Koebnik et al.,2000)。与所有其他来源的膜蛋白不同，整合OMP蛋白不由跨膜α螺旋组成，而是折叠成反向平行的β桶。它们包括OmpA膜结构域、OmpX蛋白、磷脂酶A、一般孔蛋白、底物特异性孔蛋白和铁载体转运蛋白(Koebnik et al.,2000)。本发明考虑的第二种OMP蛋白是细菌脂蛋白(Juncker et al.,2003；Smithers et al.,2021)。细菌脂蛋白是一类翻译/后脂质修饰的外膜锚定蛋白，可执行多种通常必不可少的功能(Smithers et al.,2021)。所有脂蛋白的特征是N末端有信号序列，后跟半胱氨酸。到目前为止，已经注释了几百种革兰氏阴性菌中的推定脂蛋白(Juncker et al.,2003)。存在用于锚定至革兰氏阴性菌外膜的跨膜结构域使得菌毛的跨膜亚单位也成为本发明所考虑的一种蛋白质(Zhang et al.,2000；Antenuci et al.,2020)。
由于任何家族(包括Koebnik et al.,2000(整合OMP)或Smithers et al.,2021(细菌脂蛋白)中描述的家族)的异源OMP蛋白的表达都意图在鲍曼不动杆菌细胞中进行，并且表达的OMP蛋白的命运意图到达鲍曼不动杆菌的外膜，因此在本发明中，异源OMP蛋白包括来自OMP蛋白的信号序列，该信号序列可被鲍曼不动杆菌细胞加工以促进表达的蛋白在鲍曼不动杆菌外膜中定位。优选地，信号序列衍生自鲍曼不动杆菌的任何OMP，最优选衍生自鲍曼不动杆菌的OmpA蛋白。值得注意的是，鲍曼不动杆菌的OmpA蛋白由SEQ ID NO：1组成。
本发明还涵盖与SEQ ID NO：1的全长序列和/或来自鲍曼不动杆菌的OMP蛋白的已知信号序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的任何信号序列，前提是这些序列可被鲍曼不动杆菌细胞加工以促进表达的蛋白在鲍曼不动杆菌的外膜中定位。
本发明中提到的抗原、肽或蛋白质上下文中的术语“序列同一性”或“百分比同一性”是指两个或更多个序列或子序列在与第二个分子进行比较和对齐以实现最大对应性时是相同的(“一致”)或具有特定百分比的相同氨基酸残基(“百分比同一性”)，该测量是使用序列比较算法(例如，通过BLAST比对，或本领域技术人员已知的任何其他算法)或者通过目视检查进行的。
因此，本发明的异源抗原在缺乏脂多糖(LPS)的鲍曼不动杆菌外膜中的表达具有三个内在特性。首先，异源OMP蛋白的翻译后加工必须由衍生自上述OMP蛋白的信号序列引导，该信号序列可被鲍曼不动杆菌加工以将表达的蛋白定位至鲍曼不动杆菌的外膜。其次，异源OMP蛋白必须包含OMP跨膜结构域，包括Koebnik et al.2000描述的整合OMP蛋白的典型跨膜结构域或Juncker et al.2003描述的细菌脂蛋白的典型跨膜结构域，这将允许表达的蛋白插入在鲍曼不动杆菌的外膜处。再者，异源OMP蛋白必须包含免疫原性结构域。值得注意的是，被细菌病原体感染的人的血清主要识别来自细菌细胞的粗蛋白提取物中的OMP蛋白，这表明存在高滴度的针对细菌OMP蛋白产生的血清抗体。
值得注意的是，鲍曼不动杆菌中表达的异源OMP蛋白的免疫原性结构域是异源病原体野生型OMP所包含的结构域。本说明书的实施例中展示了基于鲍曼不动杆菌灭活细胞的不同药物物质的构建。具体而言，实施例显示了肺炎克雷伯菌(OmpA和OmpK36)、铜绿假单胞菌(OprF)、大肠杆菌(OmpA、OmpX、FuyA、HmA、IutA)或胸膜肺炎放线杆菌(OmpA、OmpW、TbpA和ApfA)的整合OMP的全长蛋白(即包括天然跨膜结构域和免疫原性结构域的天然全长OMP序列)的表达。
还需要注意的是，如果去除不需要的序列或添加来自病原体的OMP蛋白或任何其他蛋白的额外免疫原性结构域不妨碍表达的OMP蛋白正确的翻译后加工和整合到鲍曼不动杆菌的外膜中，则鲍曼不动杆菌中表达的异源OMP蛋白的免疫原性结构域可以被工程改造以进行这样的去除或添加。在本说明书的实施例中，来自铜绿假单胞菌的3型分泌系统蛋白PcrV的免疫原性结构域与来自铜绿假单胞菌的外膜脂蛋白OprI的融合。
值得注意的是，实施例中所示的鲍曼不动杆菌中表达的OMP蛋白不仅属于不同的细菌病原体，而且属于不同的OMP类型，包括Koebnik et al.2000中描述的几个整合OMP家族，其中包括来自小β桶膜锚家族OmpA(来自肺炎克雷伯菌、大肠杆菌或胸膜肺炎放线杆菌的OmpA)或OmpX(来自大肠杆菌的OmpX)的蛋白质，经典的三聚体孔蛋白如来自肺炎克雷伯菌的OmpK36，非特异性孔蛋白如铜绿假单胞菌的OprF，或底物特异性孔蛋白如胸膜肺炎放线杆菌的TbpA，或TonB依赖性铁受体如大肠杆菌的FuyA、Hma和IutA。还值得注意的是，可以通过本发明的方法引导至鲍曼不动杆菌细胞的外膜的OMP蛋白可以是外膜脂蛋白，如来自铜绿假单胞菌的OprI，或者是来自胸膜肺炎放线杆菌的膜锚定IV型菌毛亚单位ApfA，如实施例中所示。
此外，本发明的作者证明，表达来自一种或多种微生物的一个或多个拷贝抗原性外膜异源蛋白的(优选灭活的)缺乏LPS的鲍曼不动杆菌的全细胞在接种到有需要的对象(优选人类对象)后，不仅产生针对鲍曼不动杆菌感染的免疫力，而且产生针对由原始表达一个或多个拷贝抗原性外膜蛋白的任何微生物引起的感染的免疫力，这证明了这些细胞作为预防性多价疫苗的实用性。
注意的是，由鲍曼不动杆菌的灭活LPS无效细胞组成的疫苗的免疫优势蛋白是鲍曼不动杆菌的OMP蛋白OmpA和Omp22，它们是这些细胞的外膜上最丰富的整合OMP蛋白。实施例中也指出并显示，这些蛋白仍是在外膜上表达来自其他细菌病原体的OMP蛋白的鲍曼不动杆菌LPS无效细胞的外膜上检测到的最丰富的蛋白。重要的是，实施例中指出并显示，表达来自不同异源细菌病原体的OMP蛋白的LPS无效鲍曼不动杆菌细胞中鲍曼不动杆菌抗原的存在不仅引起了对鲍曼不动杆菌感染的保护性免疫，还引起了对异源病原体引起的感染的部分交叉保护性免疫。例如，作者表明，由表达来自肺炎克雷伯菌的OMP蛋白OmpA和OmpK36的鲍曼不动杆菌的灭活LPS无效细胞组成的药物物质用作疫苗能够中和由高毒性、高荚膜化菌株肺炎克雷伯菌ATCC43816引起的感染(见图10和12)；而从肺炎克雷伯菌中去除异源OMP蛋白OmpA和OmpK36则显著降低了对肺炎克雷伯菌ATCC43816引起的感染的保护作用，尽管鲍曼不动杆菌抗原仍能引起部分交叉保护作用(见图10和12)。实施例中还显示，由表达铜绿假单胞菌的OMP蛋白OprF和融合蛋白OprI::PcrV的鲍曼不动杆菌的灭活LPS无效细胞组成的药物物质用作疫苗能够中和高毒性菌株铜绿假单胞菌PA14引起的感染(见图13)；而从铜绿假单胞菌中去除异源OMP蛋白OprF和融合蛋白OprI::PcrV显著降低了对铜绿假单胞菌PA14引起的感染的保护作用，尽管鲍曼不动杆菌抗原仍能引起部分交叉保护作用(见图13)。
该技术用于递送多病原体候选疫苗的能力是本发明的另一个方面。例如，作者表明，可以构建一种药物物质，该药物物质由在同一细胞中表达肺炎克雷伯菌的OMP蛋白OmpA和OmpK36以及铜绿假单胞菌的OMP蛋白OprF和融合蛋白OprI::PcrV的鲍曼不动杆菌的灭活LPS无效细胞组成。当用作疫苗时，这种药物物质产生的免疫力能够中和由高毒性、高荚膜化菌株肺炎克雷伯菌ATCC43816引起的感染(见图10)以及由高毒性菌株铜绿假单胞菌PA14引起的感染(见图11)。此外，仍然含有鲍曼不动杆菌的抗原的该药物物质引起的免疫力，正如本发明的所有药物物质一样，导致对鲍曼不动杆菌ATCC19606引起的致命脓毒症的保护作用(见图14)。
实施例中还指出并表明，在LPS无效鲍曼不动杆菌细胞中表达异源OMP抗原并不妨碍衍生自革兰氏阴性菌的典型外膜囊泡的形成(见图24)。
因此，本发明的第一方面涉及：
a.缺乏脂多糖(LPS)的鲍曼不动杆菌菌株，其特征在于编码内源LPS生物合成基因的一种或多种细胞核酸分子部分或完全失活；其中缺乏脂多糖(LPS)的鲍曼不动杆菌菌株的特征在于选自由以下组成的列表中的基因部分或完全失活：lpxA、lpxB、lpxC、lpxD、lpxK、lpxL和/或lpxM；并且其中缺乏脂多糖(LPS)的鲍曼不动杆菌菌株表达被靶向位置位于外膜处的来自一种或多种微生物的一个或多个拷贝抗原性外膜异源蛋白；和/或
b.衍生自如上段中所定义的缺乏脂多糖(LPS)的鲍曼不动杆菌菌株的外膜囊泡(OMV)。
应理解，“脂多糖(LPS)或脂寡糖”是在革兰氏阴性菌的外膜上发现的成分。由于LPS的发现历史，LPS一词经常与“内毒素”互换使用。LPS由多糖链组成，其余部分为脂质，称为脂质A，负责内毒素活性。不同细菌之间的多糖链是可变的，并决定血清型。内毒素的大小约为10kDa，但可形成高达1000kDa的大聚集体。人类能够产生针对LPS的抗体，但一般来说这些抗体只能防御特定血清型的细菌。内毒素是革兰氏阴性菌(例如脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)和鲍曼不动杆菌)引起的感染的许多临床表现的原因。
应理解，本发明中的“鲍曼不动杆菌的细胞”是属于细菌域，变形菌门，γ变形菌纲，假单胞菌目，莫拉氏菌科，不动杆菌属，鲍曼不动杆菌物种的那些细胞。不动杆菌属是严格需氧的非发酵非运动杆菌，其呈氧化酶阴性，在显微镜下成对出现。它们在自然界中分布广泛，对土壤很重要，有助于土壤矿化。
应理解，本发明的脂多糖(LPS)缺乏的鲍曼不动杆菌株优选是完整的灭活细胞，本发明中完整的“灭活细胞”是不具有复制能力但保留其免疫原性能力的细胞。本发明的细胞在其接种之前被灭活，以防止它们在宿主中复制，并因此防止由它们的施用产生的感染。本发明的细胞的灭活可以使用现有技术中已知的多种方法进行，例如但不限于吸附、热、紫外线、电离辐射、超声、苯酚、甲醛溶液、甲醛、结晶紫、甘油醛、环氧乙烷、丙内酯、乙烯胺、溴乙烯胺或福尔马林。在优选的形式中，本发明的细胞通过热灭活。在另一个优选的形式中，本发明的细胞来自鲍曼不动杆菌物种并且它们通过热灭活。
在本发明该方面的一个优选实施方式中，如EP2942389A1中教导的，LPS的缺乏可以通过编码LPS亚单位的内源基因(特别是LPS的lpxA、lpxB和/或lpxC)的核酸的一个或多个细胞分子的部分或完全失活来实现，这种部分或完全失活导致LPS完全丢失。lpxA、lpxB和/或lpxC的序列来自不动杆菌属物种，特别是鲍曼不动杆菌。在本发明的一个优选实施方式中，LPS的内源基因选自lpxA、lpxB和/或lpxC，或这些基因的任意组合。
优选地，本发明第一方面的缺乏脂多糖(LPS)的鲍曼不动杆菌菌株的内源性LPS生物合成基因中的一个或多个突变是通过在补充有抗生素粘菌素的平板上选择粘菌素抗性突变体，并对所选的粘菌素抗性突变体进行LPS合成基因突变筛选而获得的。从这个意义上讲，本发明的作者在实施例中表明，多种不同的鲍曼不动杆菌菌株可以通过LPS合成基因的导致LPS丢失的不同突变而变得具有粘菌素抗性(参见表1)。
表1.
a数据代表三次独立分析的平均值±平均值标准误差。
EU：内毒素单位
表1.作者从几个亲本鲍曼不动杆菌菌株中获得的LPS无效衍生体的示例。该表显示了作者从三种不同的无关鲍曼不动杆菌临床分离株中获得的LPS无效突变体的例子，具体是：旧临床分离株，现在可在ATCC以菌株ATCC19606获得，并在其他动物模型实验中用作参考鲍曼不动杆菌菌株；以及2002年塞维利亚Virgen del Rocío医院疫情的临床分离株，命名为IB001和Ab283。所有LPS无效突变体都是通过在补充有粘菌素的平板上选择粘菌素抗性突变体来构建的，除了K1以外，K1是通过lpxA基因的直接诱变获得的。该表显示了对LPS合成基因中发现或产生的突变的描述、粘菌素的最低抑制浓度以及通过用于定量细菌内毒素的显色LAL测定所在每个菌株的细胞培养物中测量的内毒素(LPS)的量。
在本发明第一方面的优选实施方式中，LPS合成基因的序列通过例如以下方式失活：构建含有基因lpxA、lpxB、lpxC、lpxD、lpxK、lpxL和/或lpxM或其任何组合的自杀运载体(suicide vector)，或者用选择标记基因中断，用运载体转化靶细胞，以及筛选LPS表达阴性的阳性细胞。在本发明的另一个优选实施方式中，通过在编码参与LPS生物合成的基因和/或控制其表达的序列的核酸序列中缺失和/或插入一个或多个核苷酸来获得缺乏LPS的不动杆菌细胞。缺失和/或插入可以通过同源重组、转座子插入或现有技术中已知的其他适当方法来产生。
在本发明第一方面的优选实施方式中，虽然本发明的细胞优选是鲍曼不动杆菌细胞，但是这种细胞可以潜在地被其他不动杆菌物种替代，不动杆菌例如选自由以下组成的列表的那些：贝氏不动杆菌(Acinetobacter baylyi)、拜叶林克氏不动杆菌(A.beijerinckii)、贝雷兹不动杆菌(A.bereziniae)、A.boissieri、波氏不动杆菌(A.bouvetii)、A.brisouii、碳酸钙不动杆菌(A.calcoaceticus)、金氏不动杆菌(A.gerneri)、A.guillouiae、格氏不动杆菌(A.grimontii)、A.gyllenbergii、溶血不动杆菌(A.haemolyticus)、A.indicus、约翰逊不动杆菌(A.johnsonii)、琼氏不动杆菌(A.junii)、洛菲不动杆菌(A.lwoffii)、A.nectaris、医院不动杆菌(A.nosocomialis)、小茵落不动杆菌(A.parvus)、皮特不动杆菌(A.pittii)、A.puyangensis、抗辐射不动杆菌(A.radioresistens)、A.rudis、信氏不动杆菌(A.schindleri)、A.soli、坦氏不动杆菌(A.tandoii)、腾氏不动杆菌(A.tjernbergiae)、唐氏不动杆菌(A.towneri)、乌氏不动杆菌(A.ursingii)或威尼斯不动杆菌(A.venetianus)。在本发明中，应当理解，不动杆菌是指细菌界，变形菌门，γ变形菌纲，假单胞菌目，莫拉氏菌科。
另一方面，并且如说明书中先前已经指出的，需要三个内在特性以在本发明第一方面的鲍曼不动杆菌细胞的外膜中表达和暴露异源抗原。首先，异源OMP蛋白的翻译后加工必须由衍生自OMP蛋白的信号序列引导，该信号序列可被鲍曼不动杆菌加工以将表达的蛋白定位至鲍曼不动杆菌的外膜。其次，异源OMP蛋白必须包括Koebnik et al.2000描述的整合OMP蛋白的典型OMP跨膜结构域或Juncker et al.2003描述的细菌脂蛋白的典型信号序列，这将允许表达的蛋白插入在鲍曼不动杆菌的外膜处。再者，异源OMP蛋白必须包含免疫原性结构域。
因此，一种或多种异源抗原(或异源OMP蛋白)的特征在于在N末端包含衍生自OMP蛋白的信号序列，该信号序列被鲍曼不动杆菌加工以将表达的蛋白定位至鲍曼不动杆菌的外膜。此外，一种或多种异源抗原的特征在于包含OMP跨膜结构域，包括Koebnik etal.2000描述的整合OMP蛋白的典型跨膜结构域或Juncker et al.2003描述的细菌脂蛋白的典型跨膜结构域，这将允许表达的蛋白插入在鲍曼不动杆菌的外膜处。再者，一种或多种异源抗原的特征在于包含免疫原性结构域。
因此，在本发明第一方面的另一个优选实施方式中，被靶向位置位于外膜的一种或多种异源抗原(或异源OMP蛋白)的特征在于包括：
1.位于所述异源抗原(或异源OMP蛋白)的N末端的衍生自OMP蛋白的信号序列，所述信号序列被鲍曼不动杆菌加工以将表达的蛋白定位至鲍曼不动杆菌的外膜；
2.整合OMP蛋白的典型OMP跨膜结构域或细菌脂蛋白的OMP跨膜结构域，其允许所述表达的蛋白插入在鲍曼不动杆菌的外膜处；和
3.免疫原性结构域。
优选地，异源抗原(或异源OMP蛋白)由以下构成：蛋白质的N末端处的信号序列，其直接或可选地通过接头与蛋白质的包含跨膜结构域和免疫原结构域的部分的N末端氨基酸结合。
优选地，如上所述，在本发明中，异源OMP蛋白包括来自OMP蛋白的信号序列，该信号序列可被鲍曼不动杆菌细胞加工以促进表达的蛋白在鲍曼不动杆菌外膜中的定位。优选地，信号序列衍生自鲍曼不动杆菌的任何OMP，最优选地衍生自鲍曼不动杆菌的OmpA蛋白。本发明还涵盖与来自鲍曼不动杆菌的OMP蛋白的SEQ ID NO：1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的任何信号序列，前提是所得序列能够被鲍曼不动杆菌细胞加工以促进表达的蛋白在鲍曼不动杆菌的外膜中定位。
优选地，鲍曼不动杆菌中表达的异源OMP蛋白的免疫原性结构域是异源病原体野生型OMP所包含的结构域。本说明书的实施例中展示了基于鲍曼不动杆菌灭活细胞的不同药物物质的构建。具体而言，实施例显示了肺炎克雷伯菌(OmpA和OmpK36)、铜绿假单胞菌(OprF)、大肠杆菌(OmpA、OmpX、FuyA、HmA、IutA)或胸膜肺炎放线杆菌(OmpA、OmpW、TbpA和ApfA)的整合OMP的全长蛋白(即包括天然跨膜结构域和免疫原性结构域的天然全长OMP序列)的表达。所有这些免疫原性结构域都明确地包括在本发明中。还优选地，还需要注意的是，如果去除不需要的序列或添加来自病原体的OMP蛋白或任何其他蛋白的额外免疫原性结构域不妨碍表达的OMP蛋白正确的翻译后加工和整合到鲍曼不动杆菌的外膜中，则鲍曼不动杆菌中表达的异源OMP蛋白的免疫原性结构域可以被工程改造以进行这样的去除或添加。在本说明书的实施例中，来自铜绿假单胞菌的3型分泌系统蛋白PcrV的免疫原性结构域与来自铜绿假单胞菌的外膜脂蛋白OprI的融合。
在本发明第一方面的另一优选实施方式中，实施例中所示的鲍曼不动杆菌中表达的异源OMP蛋白不仅属于不同的细菌病原体，而且属于不同的OMP类型，包括Koebnik etal.2000中描述的几个整合OMP家族，其中包括来自小β桶膜锚家族OmpA(来自肺炎克雷伯菌、大肠杆菌或胸膜肺炎放线杆菌的OmpA)或OmpX(来自大肠杆菌的OmpX)的蛋白质，经典的三聚体孔蛋白如来自肺炎克雷伯菌的OmpK36，非特异性孔蛋白如铜绿假单胞菌的OprF，或底物特异性孔蛋白如胸膜肺炎放线杆菌的TbpA，TonB依赖性铁受体如大肠杆菌的FuyA、Hma和IutA。还值得注意的是，可以通过本发明的方法引导至鲍曼不动杆菌细胞的外膜的异源OMP蛋白可以是外膜脂蛋白，如来自铜绿假单胞菌的OprI，或者是来自胸膜肺炎放线杆菌的膜锚定IV型菌毛亚单位ApfA，如实施例中所示。
此外，并且如已经指出的，本发明的作者证明，如上定义的表达来自一种或多种微生物的一个或多个拷贝抗原性外膜异源蛋白的(优选灭活的)缺乏LPS的鲍曼不动杆菌的全细胞在接种到有需要的对象(优选人类对象)后，不仅产生针对鲍曼不动杆菌感染的免疫力，而且产生针对由原始表达一个或多个拷贝抗原性外膜蛋白的任何微生物引起的感染的免疫力，这证明了这些细胞作为预防性和甚至治疗性的多价疫苗的实用性。
另一方面，如上所述，缺乏脂多糖(LPS)的鲍曼不动杆菌菌株必须表达被靶向位置位于其外膜的来自一种或多种微生物的一个或多个拷贝抗原性外膜异源蛋白。应进行此类表达，使得表面暴露此类异源抗原。为此，本发明的候选疫苗可以通过使用任何用于重组菌株生产的等位基因交换技术对鲍曼不动杆菌进行基因组编辑来构建，所述等位基因交换技术涉及一个或多个将表达构建体插入鲍曼不动杆菌基因组中的特定基因座的重组步骤。待插入的表达构建体可以通过线性DNA片段或质粒携带到细胞中。具体而言，编码一个或多个拷贝抗原性外膜异源蛋白的构建体可以在细胞变为缺乏LPS之前、同时或之后插入鲍曼不动杆菌的任何合适基因座，例如EP2942389A1中所教导的。合适的基因座是鲍曼不动杆菌染色体上可以通过重组来掺入插入物的任何基因座，例如：cysI、trpE、lpxA、lpxC、lpxD、lpxB、lpxK、lpxL、lpxM和/或Tn5/Tn7位点。值得注意的是，鲍曼不动杆菌细胞可以优选用包含用于促进在目标靶基因座重组到鲍曼不动杆菌基因组中的序列的运载体(优选自杀运载体)转化，这种基因座是鲍曼不动杆菌的包含适合进行如上所述的重组的序列的任何基因座。
在这个意义上，在本发明的优选实施方式中，通过插入编码一种或多种异源抗原(或异源OMP蛋白)的表达构建体，对菌株进行修饰，以表达被靶向位置位于外膜处的一种或多种异源抗原(或异源OMP蛋白)。更优选地，鲍曼不动杆菌细胞可以优选地用运载体转化，其中运载体的特征在于包含位于表达构建体侧翼的用于促进重组的序列，其进而又包含至少一个或多个转录启动子序列、一个或多个编码对鲍曼不动杆菌而言异源的蛋白的ORF和一个或多个转录终止序列。启动子序列可以是现有技术中能够促进鲍曼不动杆菌细胞中转录的任何已知序列。这些启动子序列是常规用于细菌学研究的。在本发明的一个优选实施方式中，所使用的启动子序列是位于编码外膜蛋白OmpA的鲍曼不动杆菌ORF上游的启动子序列。表达构建体可能包含几个串联的ORF，每个ORF侧翼各自有启动子和终止子、转录终止子、ORF的上游和下游序列，因此构建为允许每个ORF受特定启动子控制独立表达。可替代地，表达构建体可以在操纵子样结构内具有一个或多个ORF，并由共同启动子控制多顺反子式表达。表达运载体的ORF编码通过其免疫原性特性选择的外膜蛋白或肽，这些蛋白或肽衍生自不同于鲍曼不动杆菌的已知人类或动物病原体，并且其在鲍曼不动杆菌细胞中的表达旨在引起接种鲍曼不动杆菌细胞的人或动物对不同于鲍曼不动杆菌的病原体的免疫反应。由于异源外膜蛋白(包括Koebnik et al.,2000(整合OMP)或Smithers et al.2021(细菌脂蛋白)中描述的任何家族的蛋白)的表达都意图在鲍曼不动杆菌细胞中进行，并且表达的OMP蛋白的命运意图到达鲍曼不动杆菌的外膜，因此在本发明中，异源OMP蛋白包括来自OMP蛋白的信号序列，该信号序列可被鲍曼不动杆菌细胞加工以促进表达的蛋白在鲍曼不动杆菌外膜中定位。优选地，信号序列衍生自鲍曼不动杆菌的任何OMP，最优选衍生自鲍曼不动杆菌的OmpA蛋白，包括与来自鲍曼不动杆菌的OMP蛋白的SEQ ID NO：1的全长序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的任何信号序列，这些序列能够被鲍曼不动杆菌细胞加工以促进表达的蛋白在鲍曼不动杆菌的外膜中定位。优选地，表达运载体的ORF编码异源抗原(或异源OMP蛋白)，该异源抗原(或异源OMP蛋白)的特征如上文所定义，包括：
1.位于所述异源抗原(或异源OMP蛋白)的N末端的衍生自OMP蛋白的信号序列，所述信号序列被鲍曼不动杆菌加工以将表达的蛋白定位至鲍曼不动杆菌的外膜；
2.整合OMP蛋白的典型OMP跨膜结构域或细菌脂蛋白的典型OMP跨膜结构域，其允许所述表达的蛋白插入鲍曼不动杆菌的外膜处；和
3.免疫原性结构域。
优选地，信号序列衍生自鲍曼不动杆菌的任何OMP，最优选衍生自鲍曼不动杆菌的OmpA蛋白，包括与来自鲍曼不动杆菌的OMP蛋白的SEQ ID NO：1的全长序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的任何信号序列，这些序列能够被鲍曼不动杆菌细胞加工以促进表达的蛋白在鲍曼不动杆菌的外膜中定位。
优选地，鲍曼不动杆菌中表达的异源OMP蛋白的免疫原性结构域是异源病原体野生型OMP所包含的结构域。本说明书的实施例中展示了基于鲍曼不动杆菌灭活细胞的不同药物物质的构建。具体而言，实施例显示了肺炎克雷伯菌(OmpA和OmpK36)、铜绿假单胞菌(OprF)、大肠杆菌(OmpA、OmpX、FuyA、Hma、IutA)或胸膜肺炎放线杆菌(OmpA、OmpW、TbpA和ApfA)的整合OMP的全长蛋白(即包括天然跨膜结构域和免疫原性结构域的天然全长OMP序列)的表达。所有这些免疫原性结构域都明确地包括在本发明中，因为它们可能由表达构建体的ORF编码。还优选地，还需要注意的是，如果去除不需要的序列或添加来自病原体的OMP蛋白或任何其他蛋白的额外免疫原性结构域不妨碍表达的OMP蛋白正确的翻译后加工和整合到鲍曼不动杆菌的外膜中，则表达构建体的ORF所编码的异源OMP蛋白的免疫原性结构域可以被工程改造以进行这样的去除或添加。在本说明书的实施例中，来自铜绿假单胞菌的3型分泌系统蛋白PcrV的免疫原性结构域与来自铜绿假单胞菌的外膜脂蛋白OprI的融合。
在本发明第一方面的另一优选实施方式中，实施例中所示的由表达构建体的ORF所编码的OMP蛋白不仅属于不同的细菌病原体，而且属于不同的OMP类型，包括Koebnik etal.2000中描述的几个整合OMP家族，其中包括来自小β桶膜锚家族OmpA(来自肺炎克雷伯菌、大肠杆菌或胸膜肺炎放线杆菌的OmpA)或OmpX(来自大肠杆菌的OmpX)的蛋白质，经典的三聚体孔蛋白如来自肺炎克雷伯菌的OmpK36，非特异性孔蛋白如铜绿假单胞菌的OprF，或底物特异性孔蛋白如胸膜肺炎放线杆菌的TbpA，或TonB依赖性铁受体如大肠杆菌的FuyA、Hma和IutA。还值得注意的是，由表达构建体的ORF所编码并引导至鲍曼不动杆菌细胞的外膜的异源OMP蛋白可以是外膜脂蛋白，如来自铜绿假单胞菌的OprI，或者是来自胸膜肺炎放线杆菌的膜锚定IV型菌毛亚单位ApfA，如实施例中所示。
此外，如下文说明书中所述，一旦鲍曼不动杆菌细胞用运载体(优选自杀运载体)转化，宿主中的靶基因座序列与运载体中的序列之间的重组会导致产生运载体的序列已整合到鲍曼不动杆菌染色体上的靶基因座中的重组细胞。该重组事件可以通过本领域中众所周知的策略来辅助，例如使用基因组编辑工具(例如基于CRISPR方法的工具)在插入位点处诱导双链断裂。在本发明的优选实施方式中，第一重组事件导致插入包含选择性标记和表达构建体的运载体序列。选择性标记用于选择已发生这种第一重组事件的细胞。第二重组事件可能导致只有表达构建体而不是编码选择性标记的序列保持整合在插入位点处的重组细胞。利用选择性标记的缺乏作为选择工具，可以选出已发生此类第二重组事件的鲍曼不动杆菌细胞。一旦选定，便使用PCR和DNA测序等常见技术检查运载体序列是否按预期整合到靶基因座中。
另一方面，在认为重组鲍曼不动杆菌细胞中分析的异源蛋白质的表达是令人满意的之前、同时或之后，通过替代方法如定点诱变的LPS合成基因(包括选自由lpxA、lpxB、lpxC、lpxD、lpxK、lpxL和/或lpxM组成的列表中的基因)，从而导致LPS合成基因部分或完全失活来诱导鲍曼不动杆菌细胞中LPS的丢失；或者通过选择对抗生素粘菌素有抗性的鲍曼不动杆菌细胞，并通过常见的基因组方法如PCR和/或DNA测序来筛选细胞的导致LPS合成基因(包括选自由lpxA、lpxB、lpxC、lpxD、lpxK、lpxL和/或lpxM组成的列表中的基因)部分或完全失活的突变来诱导鲍曼不动杆菌细胞中LPS的丢失。
在本发明的具体实施方式中，当上述重组事件插入的靶基因座是包含编码LPS合成基因(包括选自由lpxA、lpxB、lpxC、lpxD、lpxK、lpxL和/或lpxM组成的列表中的基因)的ORF的基因座，且重组导致此类ORF部分或完全失活时，所得重组鲍曼不动杆菌细胞为LPS阴性细胞，这是因为LPS合成基因(包括选自由lpxA、lpxB、lpxC、lpxD、lpxK、lpxL和/或lpxM组成的列表中的基因)的部分或完全失活。
在将构建体插入在合适的基因座(例如在cysI基因座)处后，可以进行异源抗原在外膜处的表达和定位的证明(如实施例中教导的)，然后证明LPS-阴性衍生体的选择可以例如通过平铺在粘菌素中并选择LPS-阴性突变体来进行。每种抗原在外膜的表达和定位可以通过蛋白质印迹和ELISA来确认。因此，可以使用抗原特异性抗体对全细胞裂解物和外膜提取物进行蛋白质印迹分析来确认鲍曼不动杆菌细胞中异源抗原的表达和定位。全细胞表面上的重组抗原的识别也可以在ELISA实验中使用抗原特异性抗体来验证。
在本发明第一方面的进一步特定实施方式中，缺乏脂多糖(LPS)的鲍曼不动杆菌菌株的外膜处表达的异源抗原至少衍生自肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌和/或胸膜肺炎放线杆菌。
具体地，缺乏脂多糖(LPS)的鲍曼不动杆菌菌株的外膜处表达的异源抗原至少衍生自肺炎克雷伯菌并且选自由以下组成的列表：Kp-OmpA(SEQ ID NO：31或17)和Kp-Ompk36(SEQ ID No：32或18)，包括与SEQ ID NO：31、32、17或18中任一个的全长序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的任何序列，所述序列在通过使用可被鲍曼不动杆菌细胞加工以促进表达的蛋白在鲍曼不动杆菌的外膜中定位的信号序列而在鲍曼不动杆菌的外膜中以一个或多个拷贝表达或暴露(如本发明所教导的)时并且在被接种到有需要的对象(优选人类对象)中后，产生免疫(优选保护性免疫反应)，所述免疫不仅针对鲍曼不动杆菌感染而且还针对肺炎克雷伯菌引起的感染。本发明中鉴定的SEQ ID：2或3保留了来自肺炎克雷伯菌的天然信号肽。然而，如本发明所教导的，天然肽被来自OMP蛋白的信号序列取代，该信号序列可被鲍曼不动杆菌细胞加工以促进表达的蛋白在鲍曼不动杆菌外膜中的定位。优选地，信号序列衍生自鲍曼不动杆菌的任何OMP，最优选衍生自鲍曼不动杆菌的OmpA蛋白(SEQ ID NO：1)。SEQ ID：17和18显示具有来自鲍曼不动杆菌OmpA的信号肽的Kp-OmpA和Kp-OmpK36的最终序列。SEQ ID：31和32显示不具有信号肽的Kp-OmpA和Kp-OmpK36的最终序列，即跨膜结构域和抗原结构域。
-Kp-OmpA。OmpA是肠杆菌科中高度保守的膜孔蛋白。它不仅是被鉴定为负责我们的LPS无效鲍曼不动杆菌细胞在动物模型中发挥保护作用的2个主要抗原之一的同源版本，而且它被描述为被由肺炎克雷伯菌引起的急性感染患者的抗血清识别最多的蛋白质抗原(Kurupati et al.2006)。此外，它用作DNA疫苗(Kurupati et al.2011)，导致鼠脓毒症模型产生保护性免疫反应。简而言之，Kurupati et al.(2011)发表的结果表明，用4剂50ulompA DNA制剂对BALB/c雌性进行肌内免疫，将用致命剂量的肺炎克雷伯菌临床分离株攻击后第8天的存活率提高至60％。
-Kp-OmpK36。OmpK36也是肺炎克雷伯菌中高度保守的膜孔蛋白，据报道其是被感染患者的抗血清识别次多(仅次于OmpA)的蛋白质，在不同临床感染的血清中覆盖率最高(Kurupati et al.2006)。它在上述鼠脓毒症模型中用作DNA疫苗(Kurupati et al.2011)，显示出比OmpA疫苗接种获得的保护水平更高(Kurupati et al.2011)，特别是第8天的存活率增加至75％，而仅表达OmpA的疫苗则为60％。此外，当作为单一亚单位疫苗使用时，用3剂的25ug全长重组OmpK36联合弗氏不完全佐剂进行免疫，能够保护小鼠免受腹膜内攻击(存活率60％)，并且免疫血清能够中和肺炎克雷伯菌的多样菌株(Babu et al.2017；Husseinet al.2018)。
在本发明第一方面的另一个具体实施方式中，缺乏脂多糖(LPS)的鲍曼不动杆菌菌株的外膜处表达的异源抗原至少衍生自铜绿假单胞菌并且选自由以下组成的列表：Pa-OprF(SEQ ID NO：33或19)、Pa-OprI(SEQ ID NO：35或21)、Pa-PcrV(SEQ ID NO：45)、或Pa-OprI:PcrV(SEQ ID NO：34或20)、或与SEQ ID NO：33-35、19-21或45中任一个的全长序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的任何序列，所述序列在通过使用可被鲍曼不动杆菌细胞加工以促进表达的蛋白在鲍曼不动杆菌的外膜中定位的信号序列而在鲍曼不动杆菌的外膜中以一个或多个拷贝表达或暴露(如本发明所教导的)时并且在被接种到有需要的对象(优选人类对象)中后，产生免疫(优选保护性免疫反应)，所述免疫不仅针对鲍曼不动杆菌感染而且还针对铜绿假单胞菌引起的感染。SEQ IDNO：4-7保留了来自铜绿假单胞菌的天然信号肽。如本发明所教导的，天然肽被来自OMP蛋白的信号序列取代，该信号序列可被鲍曼不动杆菌细胞加工以促进表达的蛋白在鲍曼不动杆菌外膜中的定位。优选地，信号序列衍生自鲍曼不动杆菌的任何OMP，最优选衍生自鲍曼不动杆菌的OmpA蛋白(SEQ ID NO：1)。SEQ ID:19-21分别显示具有来自鲍曼不动杆菌OmpA的信号肽的Pa-OprF、Pa-OprF::PcrV和Pa-OprI的最终序列。SEQ ID NO：33-35分别显示不具有信号肽的Pa-OprF、Pa-OprF::PcrV和Pa-OprI的最终序列，即跨膜结构域和抗原结构域。SEQ ID NO：45显示不具有信号的Pa-PcrV的最终序列，即抗原结构域。
-Pa-OprI。OprI是一种高度保守的膜脂蛋白，已被证明当在对抗结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的由结核分枝杆菌N末端融合蛋白OprI-Ag85组成的基于蛋白质的疫苗中用作佐剂时，可通过激活Toll样受体(TLR)2和4(这是诱导Th1型T细胞的重要步骤)发挥免疫刺激活性(Gartner et al.2007)。OprI的这种Th1诱导特性先前已在小鼠皮肤利什曼病模型(Cote-Sierra et al.2002)和猪瘟模型(Rau et al.2006)中得到证实。OprI对铜绿假单胞菌感染的保护作用在使用免疫功能低下的Balb/c雌性的鼠脓毒症模型中得到证实，其中用4剂50ug纯化OprI进行腹膜内免疫的动物的LD50是未免疫动物的35倍(Finke et al.1990&1991)。重要的是，OprI免疫在健康志愿者中被证明是安全的且具有免疫原性(von Specht et al.1996)。
-Pa-PcrV。PcrV是铜绿假单胞菌3型分泌器系统形成的针的主要抗原。研究表明，抗PcrV抗体对针对毒性铜绿假单胞菌感染提供保护有显著作用(Sawa et al.1999&2014；Moriyama et al.2009；Milla et al.2014)，而主动接种PcrV疫苗可诱导对铜绿假单胞菌感染的保护性免疫(Meynet et al.2018；Aguilera-Herce et al.2019)。Meynet et al.(2018)获得的结果表明，对C57Bl/6J雌性动物每2周一次进行3剂皮下免疫，其中包含1-2x108CFU的已杀死但具有代谢活性的PcrV过表达铜绿假单胞菌，与未接种疫苗的动物相比，在急性肺部感染模型中，7天存活率为58.3％。此外，Hamaoka et al.(2017)在鼠急性肺炎模型中测试了重组PcrV(rPcrV)与三种佐剂联合免疫的效果。腹膜内免疫3剂(每剂10ugrPcrV，与AlOH3联合使用)的结果与使用等效剂量佐剂免疫的对照组相比，存活率提高至73％。重要的是，两种针对PcrV的单克隆抗体疗法目前正处于临床开发阶段，其中一项研究表明，与安慰剂相比，铜绿假单胞菌感染率(肺炎)显著下降(Francois et al.2012；Ali etal.2019)。
-Pa-OprF。OprF是高度保守的OmpA同源物，是铜绿假单胞菌中的主要外膜孔蛋白。先前在实验模型中进行的免疫研究表明，OprF针对铜绿假单胞菌感染提供保护。Gillelandet al.(1984)证明，在使用CD-1小鼠的鼠脓毒症模型中，用2剂10ug来自铜绿假单胞菌PAO1的纯化OprF进行腹膜内免疫提供的保护高达67％。此外，Hassan et al.2018最近报道了用在诱导型启动子的控制下在大肠杆菌中异源表达获得的铜绿假单胞菌重组全长OprF对小鼠进行免疫。在鼠急性肺炎模型中，用作亚单位疫苗的全长OprF能够分别保护Balb/c雌性小鼠免受非粘液型和粘液型铜绿假单胞菌菌株PAO1和PAK的感染。未免疫的动物在鼻腔内接种铜绿假单胞菌后48-72小时内100％死亡，而用4剂重组OprF(rOprF)(含50ug重组蛋白)皮下免疫的动物在7天时的存活率分别为50％(PaO1)和60％(PAK)。不过，在同一研究中，当rOprF与重组OprI结合时，对抗PAO1攻击的存活率提高到100％。
在本发明第一方面的另一个具体实施方式中，缺乏脂多糖(LPS)的鲍曼不动杆菌菌株的外膜处表达的异源抗原至少衍生自大肠杆菌并且选自由以下组成的列表：Ec-OmpA(SEQ ID NO：36或22)、Ec-OmpX(SEQ ID NO：37或23)、Ec-FuyA(SEQ ID NO：38或24)、Ec-Hma(SEQ ID NO：39或25)或Ec-IutA(SEQ ID NO：40或26)，包括与SEQ ID NO：22-26或36-40中任一个的全长序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的任何序列，所述序列在通过使用可被鲍曼不动杆菌细胞加工以促进表达的蛋白在鲍曼不动杆菌的外膜中定位的信号序列而在鲍曼不动杆菌的外膜中以一个或多个拷贝表达或暴露(如本发明所教导的)时并且在被接种到有需要的对象(优选人类对象)中后，产生免疫(优选保护性免疫反应)，所述免疫不仅针对鲍曼不动杆菌感染而且还针对大肠杆菌引起的感染。SEQ ID NO：8-12保留了来自大肠杆菌的天然信号肽。如本发明所教导的，天然肽被来自OMP蛋白的信号序列取代，该信号序列可被鲍曼不动杆菌细胞加工以促进表达的蛋白在鲍曼不动杆菌外膜中的定位。优选地，信号序列衍生自鲍曼不动杆菌的任何OMP，最优选衍生自鲍曼不动杆菌的OmpA蛋白(SEQ ID NO：1)。SEQ ID:22-26分别显示了具有来自鲍曼不动杆菌OmpA的信号肽的Ec-OmpA、Ec-OmpX、Ec-FuyA、Ec-Hma和Ec-IutA的最终序列。SEQID:36-40分别显示了不具有信号肽的Ec-OmpA、Ec-OmpX、Ec-FuyA、Ec-Hma和Ec-IutA的最终序列，即跨膜结构域和抗原结构域。
-Ec-OmpA。外膜蛋白A(OmpA)是大肠杆菌外膜的主要蛋白质。OmpA由三个功能结构域组成，包括亲水性胞外团、β-桶状跨膜结构和肽聚糖结合结构域(Wang,2002)。Gu etal.2018发现，用基于OmpA的疫苗接种小鼠诱导了Th1、Th2和Th17免疫反应并产生有效保护作用。此外，OmpAVac特异性抗体能够介导调理吞噬作用(opsonophagocytosis)并抑制细菌入侵，从而在大肠杆菌K1攻击的成年小鼠和新生小鼠中产生预防性保护作用。这些结果表明基于OmpA的疫苗可以成为控制大肠杆菌感染的良好候选疫苗。
-Ec-OmpX。来自大肠杆菌的整合外膜蛋白X(OmpX)属于高度保守的细菌蛋白家族，其促进细菌粘附和进入哺乳动物细胞。此外，这些蛋白质在抵抗人类补体系统的攻击中发挥着作用(Vogt and Schulz,1999)。Maisnier-Patin et al.(2003)使用来自大肠杆菌的重组OmpX，报道了EcOmpX与人类抗原呈递细胞结合并被其内化。
-Ec-FuyA。耶尔森菌素是一种铁载体，存在于致病菌鼠疫耶尔森氏菌(Yersiniapestis)、假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)和小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)，以及包括肠病性大肠杆菌和沙门氏菌(Salmonellaenterica)在内的多种肠杆菌菌株中。尿路感染性大肠杆菌具有高效的铁获取机制，其中之一是耶尔森菌素系统。人们发现，编码耶尔森菌素受体的fyuA基因对于人类尿液等缺铁环境中生物膜的形成非常重要(Hancock et al.2008)。在小鼠模型中，Habibi et al.(2017)表明，接种FyuA诱导了IgG1(Th2)和IgG2a(Th1)类型的体液反应，并减少尿路致病性大肠杆菌定植于膀胱和肾脏。
-Ec-Hma。Hma是外膜血红素获取蛋白的79kDa血红素受体，其功能独立于ChuA，以介导尿路致病性大肠杆菌菌株对血红素的摄取(Hagan and Mobley,2009)。用与霍乱毒素缀合的外膜铁受体FyuA、Hma、IreA和IutA对小鼠进行鼻内免疫，在小鼠中在尿路致病性大肠杆菌菌株攻击的条件下为膀胱或肾脏提供保护(Forsyth et al.2020)。
-Ec-IutA。IutA是大肠杆菌外膜上的75kDa铁氧杆菌素受体。用重组抗原EcpA、EcpD、IutA或IroN对小鼠进行主动免疫引发高水平的总IgG抗体IgG1/IgG2a同种型，并被确定在致命和非致命脓毒症攻击中对大肠杆菌感染具有高度保护作用(Mellata etal.2016)。
在本发明第一方面的另一个具体实施方式中，缺乏脂多糖(LPS)的鲍曼不动杆菌菌株的外膜处表达的异源抗原至少衍生自胸膜肺炎放线杆菌并且选自由以下组成的列表：Ap-OmpA(SEQ ID NO：27或41)、Ap-OmpW(SEQ ID NO：28或42)、Ap-TbpA(SEQ ID NO：29或43)、或Ap-ApfA(SEQ ID NO：30或44)，包括与SEQ ID NO：27-30或41-44中任一个的全长序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的任何序列，所述序列在通过使用可被鲍曼不动杆菌细胞加工以促进表达的蛋白在鲍曼不动杆菌的外膜中定位的信号序列而在鲍曼不动杆菌的外膜中以一个或多个拷贝表达或暴露(如本发明所教导的)时并且在被接种到有需要的对象(优选人类对象)中后，产生免疫(优选保护性免疫反应)，所述免疫不仅针对鲍曼不动杆菌感染而且还针对胸膜肺炎放线杆菌引起的感染。SEQ ID NO：13-16保留了来自胸膜肺炎放线杆菌的天然信号肽。如本发明所教导的，天然肽被来自OMP蛋白的信号序列取代，该信号序列可被鲍曼不动杆菌细胞加工以促进表达的蛋白在鲍曼不动杆菌外膜中的定位。优选地，信号序列衍生自鲍曼不动杆菌的任何OMP，最优选衍生自鲍曼不动杆菌的OmpA蛋白(SEQ ID NO：1)。SEQ ID:27-30分别显示了具有鲍曼不动杆菌OmpA的信号肽的Ap-OmpA、Ap-OmpW、Ap-TbpA和Ap-ApfA的最终序列。SEQ ID:41-44分别显示不具有信号肽的Ap-OmpA、Ap-OmpW、Ap-TbpA和Ap-ApfA的最终序列，即跨膜结构域和抗原结构域。
-Ap-OmpA。它是其他革兰氏阴性菌(如大肠杆菌)外膜中的主要蛋白质的胸膜肺炎放线杆菌的同源物。OmpA由三个功能结构域组成，包括亲水性胞外团、β-桶状跨膜结构和肽聚糖结合结构域(Wang,2002)。
-Ap-OmpW。它是胸膜肺炎放线杆菌中的另一种整合OMP蛋白。ompW基因存在于许多细菌中，例如大肠杆菌、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)。对OmpW蛋白的免疫反应已被证明提供对气单胞菌攻击的免疫力。在胸膜肺炎放线杆菌中，OmpW似乎在感染期间调节表型(Chen et al.2022)。
-Ap-TbpA。TbpA(转铁蛋白结合蛋白A)是一种100KDa的外膜β-桶，形成转铁蛋白的输入通道，这已被证明是胸膜肺炎放线杆菌毒力和发病机制的分子决定因素(Nahar etal.2021)。
-Ap-ApfA。ApfA是锚定胸膜肺炎放线杆菌IV型菌毛的外膜蛋白。已显示出，IV型菌毛增加细菌与细菌之间的相互作用，促进细菌粘附和定植，从而促进细菌感染的进展(Zhang et al.2000)。在胸膜肺炎放线杆菌中，已鉴定出外膜蛋白ApfA的N末端部分中与跨膜结构域相邻的保守通用分泌途径(GSP)结构域。ApfA已被用作外膜锚，潜在的免疫原可附着在其上(Antenuci et al.2020)。
SEQ ID NO：1—鲍曼不动杆菌OmpA信号肽
MKLSRIALATMLVAAPLAAANA
SEQ ID NO：1的核苷酸序列
Atgaaattgagtcgtattgcacttgctactatgcttgttgctgctccattagctgctgctaatgct
SEQ ID NO：2—肺炎克雷伯菌OmpA
MKAIFVLNAAPKDNTWYAGGKLGWSQYHDTGFYGNGFQNNNGPTRNDQLGAGAFGGYQVNPYLGFEMGYDWLGRMAYKGSVDNGAFKAQGVQLTAKLGYPITDDLDIYTRLGGMVWRADSKGNYASTGVSRSEHDTGVSPVFAGGVEWAVTRDIATRLEYQWVNNIGDAGTVGTRPDNGMLSLGVSYRFGQEDAAPVVAPAPAPAPEVATKHFTLKSDVLFNFNKATLKPEGQQALDQLYTQLSNMDPKDGSAVVLGYTDRIGSEAYNQQLSEKRAQSVVDYLVAKGIPAGKISARGMGESNPVTGNTCDNVKARAALIDCLAPDRRVEIEVKGYKEVVTQPQA
*粗体表示肺炎克雷伯菌天然信号肽
SEQ ID NO：2的核苷酸序列
atgaaagcaattttcgtactgaatgcggctccgaaagataacacctggtatgcaggtggtaaactgggttggtcccagtatcacgacaccggtttctacggtaacggtttccagaacaacaacggtccgacccgtaacgatcagcttggtgctggtgcgttcggtggttaccaggttaacccgtacctcggtttcgaaatgggttatgactggctgggccgtatggcatataaaggcagcgttgacaacggtgctttcaaagctcagggcgttcagctgaccgctaaactgggttacccgatcactgacgatctggacatctacacccgtctgggcggcatggtttggcgcgctgactccaaaggcaactacgcttctaccggcgtttcccgtagcgaacacgacactggcgtttccccagtatttgctggcggcgtagagtgggctgttactcgtgacatcgctacccgtctggaataccagtgggttaacaacatcggcgacgcgggcactgtgggtacccgtcctgataacggcatgctgagcctgggcgtttcctaccgcttcggtcaggaagatgctgcaccggttgttgctccggctccggctccggctccggaagtggctaccaagcacttcaccctgaagtctgacgttctgttcaacttcaacaaagctaccctgaaaccggaaggtcagcaggctctggatcagctgtacactcagctgagcaacatggaCccgaaagacggttccgctgttgttctgggctacaccgaccgcatcggttccgaagcttacaaccagcagctgtctgagaaacgtgctcagtccgttgttgactacctggttgctaaaggcatcccggctggcaaaatctccgctcgcggcatgggtgaatccaacccggttactggcaacacctgtgacaacgtgaaagctcgcgctgccctgatcgattgcctggctccggatcgtcgtgtagagatcgaagttaaaggctacaaagaagttgtaactcagccgcaggcttaa
SEQ ID NO：3—肺炎克雷伯菌OmpK36
MKVKVLSLLVPALLVAGAANAAEIYNKDGNKLDLYGKIDGLHYFSDDKSVDGDQTYMRVGVKGETQINDQLTGYGQWEYNVQANNTESSSDQAWTRLAFAGLKFGDAGSFDYGRNYGVVYDVTSWTDVLPEFGGDTYGSDNFLQSRANGVATYRNSDFFGLVDGLNFALQYQGKNGSVSGEGALSPTNNGRTALKQNGDGYGTSLTYDIYDGISAGFAYSNSKRLGDQNSKLALGRGDNAETYTGGLKYDANNIYLATQYTQTYNATRAGSLGFANKAQNFEVVAQYQFDFGLRPSVAYLQSKGKDLEGYGDQDILKYVDVGATYYFNKNMSTYVDYKINLLDDNSFTHNAGISTDDVVALGLVYQF
*粗体表示肺炎克雷伯菌天然信号肽
SEQ ID NO：3的核苷酸序列
atgaaagttaaagtactgtccctcctggtaccggctctgctggtagcaggcgcagcaaatgcggctgaaatttataacaaagacggcaacaaattagacctgtacggtaaaattgacggtctgcactacttctctgacgacaagagcgtcgacggcgaccagacctacatgcgtgtaggcgtgaaaggcgaaacccagatcaacgaccagctgaccggttacggccagtgggaatacaacgttcaggcgaacaacactgaaagctccagcgatcaggcatggactcgtctggcattcgcaggcctgaaatttggcgacgcgggctctttcgactacggtcgtaactacggcgtagtatacgacgtaacgtcctggaccgacgttctgccggaattcggcggcgacacctacggttctgacaacttcctgcagtcccgtgctaacggcgttgcaacctaccgtaactctgatttcttcggtctggttgacggcctgaactttgctctgcagtatcagggtaaaaacggcagcgtcagcggcgaaggcgctctgtctcctaccaacaacggtcgtaccgccttgaaacagaacggcgacggttacggtacttctctgacctatgacatctatgatggcatcagcgctggtttcgcatactctaactccaaacgtcttggcgaccagaacagcaagctggcactgggtcgtggcgacaacgctgaaacctacaccggcggtctgaaatacgacgcgaacaacatctacctggccactcagtacacccagacctacaacgcgacccgcgccggttccctgggctttgctaacaaagcgcagaacttcgaagtggttgctcagtaccagttcgacttcggtctgcgtccgtccgtggcttacctgcagtctaaaggtaaggatctggaaggctacggcgaccaggacatcctgaaatatgttgacgttggcgcgacctactacttcaacaaaaacatgtccacctatgttgactacaaaatcaacctgctggacgacaatagcttcacccacaacgccggtatctctaccgacgacgtggttgcactgggcctggtttaccagttctaa
SEQ ID NO：4—铜绿假单胞菌OprF
MKLKNTLGVVIGSLVAASAMNAFAQGQNSVEIEAFGKRYFTDSVRNMKNADLYGGSIGYFLTDDVELALSYGEYHDVRGTYETGNKKVHGNLTSLDAIYHFGTPGVGLRPYVSAGLAHQNITNINSDSQGRQQMTMANIGAGLKYYFTENFFAKASLDGQYGLEKRDNGHQGEWMAGLGVGFNFGGSKAAPAPEPVADVCSDSDNDGVCDNVDKCPDTPANVTVDANGCPAVAEVVRVQLDVKFDFDKSKVKENSYADIKNLADFMKQYPSTSTTVEGHTDSVGTDAYNQKLSERRANAVRDVLVNEYGVEGGRVNAVGYGESRPVADNATAEGRAINRRVEAEVEAEAK
*粗体表示铜绿假单胞菌天然信号肽
SEQ ID NO：4的核苷酸序列
atgaaactgaagaacaccttaggcgttgtcatcggctcgctggttgccgcttcggcaatgaacgcctttgcccagggccagaactcggtagagatcgaagccttcggcaagcgctacttcaccgacagcgttcgcaacatgaagaacgcggacctgtacggcggctcgatcggttacttcctgaccgacgacgtcgagctggcgctgtcctacggtgagtaccatgacgttcgtggcacctacgaaaccggcaacaagaaggtccacggcaacctgacctccctggacgccatctaccacttcggtaccccgggcgtaggtctgcgtccgtacgtgtcggctggtctggctcaccagaacatcaccaacatcaacagcgacagccaaggccgtcagcagatgaccatggccaacatcggcgctggtctgaagtactacttcaccgagaacttcttcgccaaggccagcctcgacggccagtacggtctggagaagcgtgacaacggtcaccagggcgagtggatggctggcctgggcgtcggcttcaacttcggtggttcgaaagccgctccggctccggaaccggttgccgacgtttgctccgactccgacaacgacggcgtttgcgacaacgtcgacaagtgcccggataccccggccaacgtcaccgttgacgccaacggctgcccggctgtcgccgaagtcgtacgcgtacagctggacgtgaagttcgacttcgacaagtccaaggtcaaagagaacagctacgctgacatcaagaacctggctgacttcatgaagcagtacccgtccacttccaccaccgttgaaggtcacaccgactccgtcggcaccgacgcttacaaccagaagctgtccgagcgtcgtgccaacgccgttcgtgacgtactggtcaacgagtacggtgtagaaggtggtcgcgtgaacgctgttggttacggcgagtcccgcccggttgccgacaacgccaccgctgaaggccgcgctatcaaccgtcgcgttgaagccgaagtagaagctgaagccaagtaa
SEQ ID NO：5—铜绿假单胞菌OprI::PcrV融合蛋白
MNNVLKFSALALAAVLATGCSSHSKETEARLTATEDAAARAQARADEAYRKADEALGAAQKAQQTADEANERALRMLEKASRKGGGGSGGGGSGGGGSSAAPASAEQEELLALLRSERIVLAHAGQPLSEAQVLKALAWLLAANPSAPPGQGLEVLREVLQARRQPGAQWDLREFLVSAYFSLHGRLDEDVIGVYKDVLQTQDGKRKALLDELKALTAELKVYSVIQSQINAALSAKQGIRIDAGGIDLVDPTLYGYAVGDPRWKDSPEYALLSNLDTFSGKLSIKDFLSGSPKQSGELKGLSDEYPFEKDNNPVGNFATTVSDRSRPLNDKVNEKTTLLNDTSSRYNSAVEALNRFIQKYDSVLRDILSAI
*粗体表示铜绿假单胞菌天然信号肽
*下划线表示融合蛋白的接头
SEQ ID NO：5的核苷酸序列
atgaacaacgttctgaaattctctgctctggctctggctgctgttctggccaccggttgcagcagccactccaaagaaaccgaagctcgtctgaccgctaccgaagacgcagctgctcgtgctcaggctcgcgctgacgaagcctatcgcaaggctgacgaagctctgggcgctgctcagaaagctcagcagactgctgacgaggctaacgagcgtgccctgcgcatgctggaaaaagccagccgcaagggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagctcggcggcgcctgccagtgccgagcaggaggaactgctggccctgttgcgcagcgagcggatcgtgctggcccacgccggccagccgctgagcgaggcgcaagtgctcaaggcgctcgcctggttgctcgcggccaatccgtccgcgcctccggggcagggcctcgaggtactccgcgaagtcctgcaggcacgtcggcagcccggtgcgcagtgggatctgcgcgagttcctggtgtcggcctatttcagcctgcacgggcgtctcgacgaggatgtcatcggtgtctacaaggatgtcctgcagacccaggacggcaagcgcaaggcgctgctcgacgagctgaaggcgctgaccgcggagttgaaggtctacagcgtgatccagtcgcagatcaacgccgcgctgtcggccaagcagggcatcaggatcgacgctggcggtatcgatctggtcgaccccacgctatatggctatgccgtcggcgatcccaggtggaaggacagccccgagtatgcgctgctgagcaatctggataccttcagcggcaagctgtcgatcaaggattttctcagcggctcgccgaagcagagcggggaactcaagggcctcagcgatgagtaccccttcgagaaggacaacaacccggtcggcaatttcgccaccacggtgagcgaccgctcgcgtccgctgaacgacaaggtcaacgagaagaccaccctgctcaacgacaccagctcccgctacaactcggcggtcgaggcgctcaaccgcttcatccagaaatacgacagcgtcctgcgcgacattctcagcgcgatctag
SEQ ID NO：6—铜绿假单胞菌OprI
MNNVLKFSALALAAVLATGCSSHSKETEARLTATEDAAARAQARADEAYRKADEALGAAQKAQQTADEANERALRMLEKASRK
*粗体表示铜绿假单胞菌天然信号肽
SEQ ID NO：6的核苷酸序列
atgaacaacgttctgaaattctctgctctggctctggctgctgttctggccaccggttgcagcagccactccaaagaaaccgaagctcgtctgaccgctaccgaagacgcagctgctcgtgctcaggctcgcgctgacgaagcctatcgcaaggctgacgaagctctgggcgctgctcagaaagctcagcagactgctgacgaggctaacgagcgtgccctgcgcatgctggaaaaagccagccgcaatag
SEQ ID NO：7—铜绿假单胞菌PcrV
MEVRNLNAARELFLDELLAASAAPASAEQEELLALLRSERIVLAHAGQPLSEAQVLKALAWLLAANPSAPPGQGLEVLREVLQARRQPGAQWDLREFLVSAYFSLHGRLDEDVIGVYKDVLQTQDGKRKALLDELKALTAELKVYSVIQSQINAALSAKQGIRIDAGGIDLVDPTLYGYAVGDPRWKDSPEYALLSNLDTFSGKLSIKDFLSGSPKQSGELKGLSDEYPFEKDNNPVGNFATTVSDRSRPLNDKVNEKTTLLNDTSSRYNSAVEALNRFIQKYDSVLRDILSAI
*粗体表示铜绿假单胞菌天然信号肽
SEQ ID NO：7的核苷酸序列
atggaagtcagaaaccttaatgccgctcgcgagctgttcctggacgagctcctggccgcgtcggcggcgcctgccagtgccgagcaggaggaactgctggccctgttgcgcagcgagcggatcgtgctggcccacgccggccagccgctgagcgaggcgcaagtgctcaaggcgctcgcctggttgctcgcggccaatccgtccgcgcctccggggcagggcctcgaggtactccgcgaagtcctgcaggcacgtcggcagcccggtgcgcagtgggatctgcgcgagttcctggtgtcggcctatttcagcctgcacgggcgtctcgacgaggatgtcatcggtgtctacaaggatgtcctgcagacccaggacggcaagcgcaaggcgctgctcgacgagctcaaggcgctgaccgcggagttgaaggtctacagcgtgatccagtcgcagatcaacgccgcgctgtcggccaagcagggcatcaggatcgacgctggcggtatcgatctggtcgaccccacgctatatggctatgccgtcggcgatcccaggtggaaggacagccccgagtatgcgctgctgagcaatctggataccttcagcggcaagctgtcgatcaaggattttctcagcggctcgccgaagcagagcggggaactcaagggcctcagcgatgagtaccccttcgagaaggacaacaacccggtcggcaatttcgccaccacggtgagcgaccgctcgcgtccgctgaacgacaaggtcaacgagaagaccaccctgctcaacgacaccagctcccgctacaactcggcggtcgaggcgctcaaccgcttcatccagaaatacgacagcgtcctgcgcgacattctcagcgcgatctag
SEQ ID NO：8—大肠杆菌OmpA
MKKTAIAIAVALAGFATVAQAAPKDNTWYTGAKLGWSQYHDTGFIPNNGPTHENQLGAGAFGGYQVNPYVGFEMGYDWLGRMPYKGDNINGAYKAQGVQLTAKLGYPITDDLDIYTRLGGMVWRADTKANVPGGASFKDHDTGVSPVFAGGVEYAITPEIATRLEYQWTNNIGDAHTIGTRPDNGMLSLGVSYRFGQGEVAPVVAPAPAPAPEVQTKHFTLKSDVLFTFNKATLKPEGQAALDQLYSQLSNLDPKDGSVVVLGYTDRIGSDAYNQALSERRAQSVVDYLISKGIPADKISARGMGESNPVTGNTCDNVKQRAALIDCLAPDRRVEIEVKGIKDVVTQPQA
*粗体表示大肠杆菌天然信号肽
SEQ ID NO：8的核苷酸序列
atgaaaaagacagctatcgcgattgcagtggcactggctggtttcgctaccgtagcgcaggccgctccgaaagataacacctggtacactggtgctaaactgggctggtcccagtaccatgacactggttttattcctaacaatggtccgacccacgaaaaccaactgggtgcaggtgcttttggtggttaccaggttaacccgtatgttggctttgaaatgggttacgactggttaggtcgtatgccgtacaaaggcgacaacatcaacggcgcatacaaagctcagggcgttcagctgaccgctaaactgggttacccaatcactgacgatctggacatctacactcgtctgggtggtatggtatggcgtgcagacaccaaggctaacgtacctggtggcgcatcctttaaagaccacgacaccggcgtttctccggtcttcgctggcggtgttgagtatgcgatcactcctgaaatcgctacccgtctggaataccagtggaccaacaacatcggtgacgcacacaccatcggcactcgtccggacaacggcatgctgagcctgggtgtttcctaccgtttcggtcagggcgaagtagctccagtagttgctccggctccagctccggcaccggaagtacagaccaagcacttcactctgaagtctgacgttctgttcaccttcaacaaagcaaccctgaaaccggaaggtcaggctgctctggatcagctgtacagccagctgagcaacctggatccgaaagacggttccgtagttgttctgggttacactgaccgcatcggttctgacgcttataaccaggctctgtccgagcgtcgtgctcagtccgttgttgattacctgatctctaaaggtatcccggcagacaaaatctccgcacgtggtatgggcgaatccaacccggttactggcaacacctgtgacaacgtgaaacagcgtgctgcactgatcgattgcctggctccggatcgtcgcgtagagatcgaagttaaaggcatcaaagacgttgtaactcagccgcaggcttaa
SEQ ID NO：9—大肠杆菌OmpX
MKKIACLSALAAVLAFTAGTSVAATSTVTGGYAQSDAQGQMNKMGGFNLKYRYEEDNSPLGVIGSFTYTEKSRTASSGDYNKNQYYGITAGPAYRINDWASIYGVVGVGYGKFQTTEYPTYKHDTSDYGFSYGAGLQFNPMENVALDFSYEQSRIRSVDVGTWIAGVGYRF
*粗体表示大肠杆菌天然信号肽
SEQ ID NO：9的核苷酸序列
atgaaaaaaattgcatgtctttcagcactggccgcagttctggctttcaccgcaggtacttccgtagctgcgacttctaccgtaactggcggttacgcacaaagcgacgctcagggccaaatgaacaaaatgggcggtttcaacctgaaataccgctatgaagaagacaacagcccgctgggtgtgatcggttctttcacttacaccgagaaaagccgtactgcaagctctggtgactacaacaaaaaccagtactacggcatcactgctggtccggcttaccgcattaacgactgggcaagcatctacggtgtagtgggtgtgggttatggtaaattccagaccactgaatacccgacctacaaacacgacaccagcgactacggtttctcctacggtgctggtttgcagttcaacccgatggaaaacgttgctctggacttctcttacgagcagagccgtattcgtagcgttgacgtaggcacctggattgccggtgttggttaccgcttctaa
SEQ ID NO：10—大肠杆菌FyuA
MKMTRLYPLALGGLLLPAIANAQTSQQDESTLVVTASKQSSRSASANNVSSTVVSAPELSDAGVTASDKLPRVLPGLNIENSGNMLFSTISLRGVSSAQDFYNPAVTLYVDGVPQLSTNTIQALTDVQSVELLRGPQGTLYGKSAQGGIINIVTQQPDSTPRGYIEGGVSSRDSYRSKFNLSGPIQDGLLYGSVTLLRQVDDGDMINPATGSDDLGGTRASIGNVKLRLAPDDQPWEMGFAASRECTRATQDAYVGWNDIKGRKLSISDGSPDPYMRRCTDSQTLSGKYTTDDWVFNLISAWQQQHYSRTFPSGSLIVNMPQRWNQDVQELRAATLGDARTVDMVFGLYRQNTREKLNSAYDMPTMPYLSSTGYTTAETLAAYSDLTWHLTDRFDIGGGVRFSHDKSSTQYHGSMLGNPFGDQGKSNDDQVLGQLSAGYMLTDDWRVYTRVAQGYKPSGYNIVPTAGLDAKPFVAEKSINYELGTRYETADVTLQAATFYTHTKDMQLYSGPVGMQTLSNAGKADATGVELEAKWRFAPGWSWDINGNVIRSEFTNDSELYHGNRVPFVPRYGAGSSVNGVIDTRYGALMPRLAVNLVGPHYFDGDNQLRQGTYATLDSSLGWQATERMNISVYVDNLFDRRYRTYGYMNGSSAVAQVNMGRTVGINTRIDFF
*粗体表示大肠杆菌天然信号肽
SEQ ID NO：10的核苷酸序列
atgaaaatgacacggctttatcctctggccttggggggattattgctccccgccattgctaatgcccagacttcacagcaagacgaaagcacgctggtggttaccgccagtaaacaatcttcccgctcggcatcagccaacaacgtctcatctactgttgtcagcgcgccggaattaagcgacgccggcgtcaccgccagcgacaaactccccagagtcttgcccgggctcaatattgaaaatagcggcaacatgcttttttcgacgatctcgctacgcggcgtctcttcagcgcaggacttctataaccccgccgtcaccctgtatgtcgatggcgtccctcagctttccaccaacaccatccaggcgcttaccgatgtgcaaagcgtggagttgctgcgaggcccacagggaacgttatatggcaaaagcgctcagggcgggatcatcaacatcgtcacccagcagccggacagcacgccgcgcggctatattgaaggcggcgtcagtagccgcgacagttatcgaagtaagttcaacctgagcggccccattcaggatggcctgctgtacggcagcgtcaccctgttacgccaggttgatgacggcgacatgattaaccccgcgacgggaagcgatgacttaggcggcacccgcgccagcatagggaatgtgaaactgcgtctggcgccggacgatcagccctgggaaatgggctttgccgcctcacgcgaatgtacccgcgccacccaggatgcctatgtgggatggaatgatattaagggccgtaagctgtcgatcagcgatggttcaccagacccgtacatgcggcgctgcactgacagccagaccctgagtgggaaatacaccaccgatgactgggttttcaacctgatcagcgcctggcagcagcagcattattcgcgcaccttcccttccggttcgttaatcgtcaatatgcctcagcgctggaatcaggatgtgcaggagctgcgcgccgcaaccctgggcgatgcgcgtaccgttgatatggtgtttgggctgtaccggcagaacacccgcgagaagttaaattcagcctacgacatgccgacaatgccttatttaagcagtaccggctataccaccgctgaaacgctggccgcatacagtgacctgacctggcatttaaccgatcgttttgatatcggcggcggcgtgcgcttctcgcatgataaatccagtacacaatatcacggcagcatgctcggcaacccgtttggcgaccagggtaagagcaatgacgatcaggtgctcgggcagctatccgcaggctatatgctgaccgatgactggagagtgtatacccgtgtagcccagggatataaaccttccgggtacaacatcgtgcctactgcgggtcttgatgccaaaccgttcgtcgccgagaaatccatcaactatgaacttggcacccgctacgaaaccgctgacgtcacgctgcaagccgcgacgttttatacccacaccaaagacatgcagctttactctggcccggtcgggatgcagacattaagcaatgcgggtaaagccgacgccaccggcgttgagcttgaagcgaagtggcggtttgcgccaggctggtcatgggatatcaatggcaacgtgatccgttccgaattcaccaatgacagtgagttgtatcacggtaaccgggtgccgttcgtacc acgttatggcgcgggaagcagcgtgaacggcgtgattgatacgcgctatggcgcactgatgccccgactggcggttaatctggtcgggccgcattatttcgatggcgacaaccagttgcggcaaggcacctatgccaccctggacagcagcctgggctggcaggcgactgaacggatgaacatttccgtctatgtcgataacctgttcgaccgtcgttaccgtacctatggctacatgaacggcagcagcgccgtcgcgcaggtcaatatgggtcgcaccgtcggtatcaatacgcgaattgatttcttctga
SEQ ID NO：11—大肠杆菌Hma
MLYNIPCRIYILSTLSLCISGIVSTATATSSETKISNEETLVVTTNRSASNLWESPATIQVIDQQTLQNSTNASIADNLQDIPGVEITDNSLAGRKQIRIRGEASSRVLILIDGQEVTYQRAGDNYGVGLLIDESALERVEVVKGPYSVLYGSQAIGGIVNFITKKGGDKLASGVVKAVYNSATAGWEESIAVQGSIGGFDYRINGSYSDQGNRDTPDGRLPNTNYRNNSQGVWLGYNSGNHRFGLSLDRYRLATQTYYEDPDGSYEAFSVKIPKLEREKVGVFYDTDVDGDYLKKIHFDAYEQTIQRQFANEVKTTQPVPSPMIQALTVHNKTDTHDKQYTQAVTLQSHFSLPANNELVTGAQYKQDRVSQRSGGMTSSKSLTGFINKETRTRSYYESEQSTVSLFAQNDWRFADHWTWTMGVRQYWLSSKLTRGDGVSYTAGIISDTSLARESASDHEMVTSTSLRYSGFDNLELRAAFAQGYVFPTLSQLFMQTSAGGSVTYGNPDLKAEHSNNFELGARYNGNQWLIDSAVYYSEAKDYIASLICDGSIVCNGNTNSSRSSYYYYDNIDRAKTWGLEISAEYNGWVFSPYISGNLIRRQYETSTLKTTNTGEPAINGRIGLKHTLVMGQANIISDVFIRAASSAKDDSNGTETNVPGWATLNFAVNTEFGNEDQYRINLALNNLTDKRYRTAHETIPAAGFNAAIGFVWNF
*粗体表示大肠杆菌天然信号肽
SEQ ID NO：11的核苷酸序列
atgttatataatataccttgtcgaatttatatcctttccactctgtcattatgcatttctgggatagtttctactgcaaccgcaacttcttcagaaacaaaaatcagcaacgaagagacgctcgtcgtgaccacgaatcgttcggcaagcaacctttgggaaagcccggcgactatacaggttattgaccaacaaacattgcagaactccaccaatgcctccatagccgataatttgcaggacatccccggagtagagataacagacaactccttggcaggccgtaaacaaatccgcattcgtggcgaagcatcctcccgtgttttaattctcattgatggtcaggaggtaacttatcagcgcgccggagataattatggtgtgggactgttgatagatgagtctgcgctggagcgtgttgaggtagtgaaaggtccatattccgtactgtacggttcacaggcaattggcggtattgttaacttcataaccaaaaagggaggtgacaaacttgcatctggagttgtgaaagctgtttataattccgcaacagcaggctgggaagaatcaatcgcggtccaggggagcatcggtggatttgattatcgcatcaacggtagttattctgatcagggcaatcgtgatacgccggatggacgtctgccgaataccaactatcgtaacaatagtcagggtgtatggttgggttataactccggaaaccatcgttttggcctctcgcttgatcgctacagactcgcgacgcaaacttactatgaggatccagacggaagctatgaggcatttagtgtcaaaatacctaaacttgaacgagagaaagttggggtattctatgacacagacgtggacggtgactatctaaaaaaaattcatttcgacgcgtatgagcagaccatccagcgccaatttgccaacgaagtaaaaacgacacagcctgttcccagtccgatgattcaggctctgaccgttcataacaagactgacacccatgataagcaatacactcaggcggtcacattgcagagtcacttttcgctgcctgctaataatgaacttgttaccggtgcacagtacaaacaagacagggtcagccaaaggtccggtggcatgacctcaagcaaatctctgaccggcttcattaataaggaaacacgaactcgctcctattatgagtcagagcaaagtacagtctcactattcgcacaaaatgactggcgattcgccgatcactggacatggacaatgggagttcgccaatactggctttcttcaaagttgacgcgtggtgacggagtatcatataccgcaggcattataagcgatacctctcttgccagagagtctgcgagtgatcacgaaatggtaacatctacaagcctgcgctattcaggtttcgataacttggagttacgcgctgcgttcgcgcaaggctacgtatttcccacactctcccagctttttatgcagacatctgcgggcggcagtgtcacatacggaaatcctgatcttaaggctgaacactccaataactttgaattaggtgcacgatataatggtaatcagtggctgattgacagcgcagtttactactcagaagctaaagattatattgcaagtctgatctgtgatggcagtatagtttgcaatggtaacaccaactcctcccgtagtagctactattattatgacaatattgatcgggcaaaaacatggggactggaaataagcgcggaatataatggctgggttttctcgccatatatcagtggcaatttaattcgtcggcaatatgaaacttcaacattaaaaacaactaatacaggagaaccagcgataaacggacgtatagggctgaaacatactcttgtgatgggtcaggccaacataatctctgatgtttttattcgtgctgcctctagtgcaaaagatgacagtaacggtaccgaaacaaatgttccgggctgggccactctcaactttgcagtaaatacagaattcggtaacgaggatcagtaccggattaacctagcactcaataacctgacagacaaacgctaccgtacagcacatgaaactattcctgcagcaggttttaatgcagctataggttttgtatggaatttctga
SEQ ID NO：12—大肠杆菌IutA
MPRALGPLLLVVLSPAVAQQNDDNEIIVSASRSNRTVAEMAQTTWVIENAELEQQIQGGKELKDAL AQLIPGLDVSSQSRTNYGMNMRGRPLVVLIDGVRLNSSRSDSRQLDSVDPFNIDHIEVISGATALYGGGSTGGLINIVTKKGQPETMMEFEAGTKSGFNSSKDHDERIAGAVSGGNDHISGRLSVAYQKFGGWFDGNGDATLLDNTQTGLQHSNRLDIMGTGTLNIDESRQLQLITQYYKSQGDDNYGLNLGKGFSAISGSSTPYVSKGLNSDRIPGTERHLISLQYSDSDFLRQELVGQVYYRDESLRFYPFPTVNANKQATAFSSSQQDTDQYGMKLTLNSQLMDGWQITWGLDAEHERFTSNQMFFDLAQASASGGLNNHKIYTTGRYPSYDITNLAAFLQSSYDINDIFTVSGGVRYQYTENRVDDFIDYTQQQKIAAGKAISADAIPGGSVDYDNFLFNAGLLMHITERQQAWFNFSQGVALPDPGKYYGRGIYGAAVNGHLPLTKSVNVSDSKLEGVKVDSYELGWRFTGDNLRTQIAAYYSLSNKSVERNKDLTISVKDDRRRIYGVEGAVDYLIPDTDWSTGVNFNVLKTESKVNGQWQKYDVKESSPSKATAYINWAPEPWSLRVQSTTSFDVSDAEGNDINGYTTVDFISSWQLPVGTLSFSVENLFDRDYTTVWGQRAPLYYSPGYGPASLYDYKGRGRTFGLNYSVLF
*粗体表示大肠杆菌天然信号肽
SEQ ID NO：12的核苷酸序列
atgccccgggctcttggtccgctgcttcttgtcgtgctgtcaccagctgtcgcccagcaaaacgatgataatgagatcatagtgtctgccagccgcagcaatcgaactgtagcggagatggcgcaaaccacctgggttatcgaaaatgccgaactggagcagcagattcagggcggtaaagagctgaaagacgcactggctcagttaatccccggccttgatgtcagcagccagagccgaaccaactacggtatgaacatgcgtggccgcccgctggttgtcctgattgacggtgtgcgcctcaactcttcacgttccgacagccgacaactggactctgtcgatccttttaatatcgaccatattgaagtgatctccggcgcgacggccctgtacggtggcgggagtaccggagggttgatcaacatcgtgaccaaaaaaggccagccggaaaccatgatggagtttgaggctggcacaaaaagtggctttaacagcagtaaagatcacgatgagcgcattgccggtgctgtctccggcggaaatgaccatatctccggacgtctttccgtggcatatcagaaatttggcggctggtttgacggtaacggcgatgccaccctgcttgataacacccagaccggcctgcagcactccaatcggctggacatcatgggaaccggtacgctgaacatcgatgaatcccggcagcttcaactgataacgcagtactataaaagtcagggggacgacaattacgggcttaatctcgggaaaggcttttccgccatcagcgggagcagcacaccatacgtcagtaaggggctgaattctgaccgcattcccggcactgagcggcatttgatcagcctgcagtactctgacagtgatttcctgagacaggaactggtcggtcaggtttactaccgcgatgagtcgttgcggttctacccgttcccgacggtaaatgcgaataaacaggcgacggctttctcctcgtcacagcaggataccgaccagtacggcatgaaactgactctgaacagccaacttatggacggctggcaaatcacctgggggctggatgctgagcatgagcgctttacctccaaccagatgttcttcgatctggctcaggcaagtgcttccggagggctgaacaaccataagatttacaccaccgggcgctatccgtcatatgacatcaccaatctggcggccttcctgcaatccagctatgacattaatgatatttttaccgttagcggtggcgtacgctatcagtatactgagaacagggtagatgatttcatcgactacacgcagcaacagaagattgctgccgggaaggcgatatctgccgacgccattcctggtggttcggtagattacgataactttctgttcaatgctggtctgctgatgcacatcaccgaacgtcagcaggcatggttcaatttttcccagggggtggcattgccggatccggggaaatattatggtcgcggcatctatggtgcagcagtgaacggccatcttcccctgacaaagagcgtgaacgtcagcgacagtaagctggaaggcgtgaaagtcgattcttatgaactgggctggcgctttaccggtgacaacctgcggactcaaatcgcggcatattactcgctttccaataagagcgtggaaaggaataaagatctgaccatcagtgtgaaggacgacaggcgccgtatttacggcgtggaaggtgcggtggactacctgatcccggatactgactggagtaccggtgtgaacttcaatgtgctgaaaaccgagtcgaaagtgaacggtcaatggcaaaaatatgacgtgaaggaatcaagtccatcgaaagcgacagcttacattaactgggcgccggaaccgtggagtctgcgtgtacagagcaccacttctttcgacgtaagcgatgcagagggtaacgatattaatggttacactaccgtcgattttatcagtagttggcagcttccggtgggaacactcagcttcagcgttgagaacctcttcgaccgtgactataccactgtctggggacagcgtgcacctctgtactacagcccgggttacggccctgcttcactgtacgactacaaaggccggggccgaacctttggtctgaactactcagtgctgttctga
SEQ ID NO：13—胸膜肺炎放线杆菌OmpA
MKKSLVALTVLSAAAVAQAAPQQNTFYAGAKAGWASFHDGIEQLDSAKNTDRGTKYGINRNSVTYGVFGGYQILNQDKLGLAAELGYDYFGRVRGSEKPNGKADKKTFRHAAHGATIALKPSYEVLPDLDVYGKVGIALVNNTYKTFNAAQEKVKTRRFQSSLILGAGVEYAILPELAARVEYQWLNNAGKASYSTLNRMGATDYRSDISSVSAGLSYRFGQGAVPVAAPAVETKNFAFSSDVLFAFGKSNLKPAAATALDAMQTEINNAGLSNAAIQVNGYTDRIGKEASNLKLSQRRAETVANYIVSKGALAANVTAVGYGEANPVTGATCDKVKGRKA LIACLAPDRRVEVQVQGTKEVTM
*粗体表示胸膜肺炎放线杆菌天然信号肽
SEQ ID NO：13的核苷酸序列
atgaaaaaatcattagttgctttaacagtattatcggctgcagcggtagctcaagcagcgccacaacaaaatactttctacgcaggtgcgaaagcaggttgggcgtcattccatgatggtatcgaacaattagattcagctaaaaacacagatcgcggtacaaaatacggtatcaaccgtaattcagtaacttacggcgtattcggcggttaccaaattttaaaccaagacaaattaggtttagcggctgaattaggttatgactatttcggtcgtgtgcgcggttctgaaaaaccaaacggtaaagcggacaagaaaactttccgtcacgctgcacacggtgcgacaatcgcattaaaacctagctacgaagtattacctgacttagacgtttacggtaaagtaggtatcgcattagtaaacaatacatataaaacattcaatgcagcacaagagaaagtgaaaactcgtcgtttccaaagttctttaattttaggtgcgggtgttgagtacgcaattcttcctgaattagcggcacgtgttgaataccaatggttaaacaacgcaggtaaagcaagctactctactttaaatcgtatgggtgcaactgactaccgttcggatatcagttccgtatctgcaggtttaagctaccgtttcggtcaaggtgcggtaccggttgcagctccggcagttgaaactaaaaacttcgcattcagctctgacgtattattcgcattcggtaaatcaaacttaaaaccggctgcggcaacagcattagatgcaatgcaaaccgaaatcaataacgcaggtttatcaaatgctgcgatccaagtaaacggttacacggaccgtatcggtaaagaagcttcaaacttaaaactttcacaacgtcgtgcggaaacagtagctaactacatcgtttctaaaggtgctctggcagctaacgtaactgcagtaggttacggtgaagcaaaccctgtaaccggcgcaacatgtgacaaagttaaaggtcgtaaagcattaatcgcttgcttagcaccggatcgtcgtgttgaagttcaagttcaaggtactaaagaagtaactatgtaa
SEQ ID NO：14—胸膜肺炎放线杆菌OmpW
MKKAVLAAVLGGALLADSAMAHQAGDVIFRAGAIGVIANSSSDYQTGADVNLDVNNNIQLGLTGTYMLSDNLGLELLAATPFSHKITGKLGATDLGEVAKVKHLPPSLYLQYYFFDSNATVRPYVGAGLNYTRFFSAESLKPQLVQNLRVKKHSVAPIANLGVDVKLTDNLSFNAAAWYTRIKTTADYDVPGLGHVSTPITLDPVVLFSGISYKF
*粗体表示胸膜肺炎放线杆菌天然信号肽
SEQ ID NO：14的核苷酸序列
atgaaaaaagcagtattagcggcagtattaggcggtgcgttattagcggattcggcaatggcacatcaagcgggcgatgtgattttccgtgccggtgcgatcggtgtgattgcaaattcaagttcggattatcaaaccggggcggacgtaaacttagatgtaaataataatattcagcttggtttaaccggtacctatatgttaagtgataatttaggtcttgaattattagcggcaacaccgttttctcacaaaatcaccggtaagttaggtgcaacagatttaggcgaagtggcaaaagtaaaacatcttccgccgagcctttacttacaatattatttctttgattctaatgcgacagttcgtccatacgttggtgccggtttaaactatactcgctttttcagtgctgaaagtttaaaaccgcaattagtacaaaacttacgtgttaaaaaacattccgtcgcaccgattgcgaatttaggtgttgatgtgaaattaacggataatctatcattcaatgcggcagcttggtacacacgtattaaaactactgccgattatgatgttccgggattaggtcatgtaagtacaccgattactttagatcctgttgtattattctcaggtattagctacaaattctaa
SEQ ID NO：15—胸膜肺炎放线杆菌TbpA
MKNKLNLISLALLSLFAVQSYAEQAVQLNDVYVTGTKKKAHKKENEVTGLGKVVKTPDTLSKEQVLGIRDLTRYDPGISVVEQGRGATTGYSIRGVDRNRVGLALDGLPQIQSYVSQYSRSSSGAINEIEYENLRSIQISKGASSSEFGSGSLGGSVQFRTKEVSDIIKPGQSWGLDTKSAYSSKNQQWLNSLAFAGTHNGFDALVIYTHRDGKETKAHKNAESRSQNITRVGVETNELDTSNRYTATTNNQHTYGWFLIKDECPTLDCTPKQMARVTKDTPSFRSYPEYTPEEKQAYENQKHITERLNAQDYTGEYRALPDPLKYKSDSWLVKLGYTFSPKHYVAGTYEHSKQRYDTRDMTYTAYWQPSDLLRTGRNWYPMNNAKGLYRDNALDGVAIDYFTEDGVKSSKGLRWAKARFIDEWHTRDRLGALYRYTNQDGNRLIDRLSLSFDQQKINLSTRLRENNCSEYPTIDKNCRATLDKLWSSTKNEQSSYEEKHDTIQLSLDKTVQTGLGKHQLNMLLGSDRFNSTLKRHEILSEFSVGSWGLVRDIGYRNGSYNNPYVYELKDQAIYSKNECDYSGTIAGRADCATSKIKGHNHYIALRDNFAITKYLDIGLGYRFDKHKFRSTHRWANQGDYKNSAWNIGIVAKPTSFLSLSYRASSGFRVPSFQELFGLRYDGAMKGSSDAYQKTEKLSPEKSLNQEVAATFKGDFGVVEVSYFKNDYKQLIAPAERMHQTQSMINYFNVQDIKLDGINLIGK LDWNGVFDKIPEGIYTTLAYSKMRVKEVKNYQGYMNIRSPLLDTIQPARYVVGVGYDQPDEKWGVNLTMTHSSGKNPNELRGNEQVGFANYERTATKKRTRSWHTFDLTGYITPWKHTTVRAGVYNLMNYRYTTWESVRQSSLNAIHQHTNVKDYARYAAPGRNYVVSFEMKF
*粗体表示胸膜肺炎放线杆菌天然信号肽
SEQ ID NO：15的核苷酸序列
atgaaaaataaattaaatctgattagccttgctctgcttagcctctttgccgtacaaagctatgcagaacaagcggtgcaattgaacgatgtttatgtcacaggaacaaaaaagaaagcacataaaaaagagaacgaagtcacaggcttagggaaagtagttaaaacaccagatactcttagtaaggagcaagtgttaggaatacgagatctgactcgttacgaccccggtatttctgtcgtagaacaagggagaggtgcgactacaggctactcaattcgtggggtagatcgtaaccgtgttggcttggcattagatggtttaccacagattcagtcctatgtaagccagtattcacgttcctcaagcggtgccattaatgaaatagaatacgaaaatctgcgttcgatccaaattagtaaaggggctagttcttctgagtttggtagtggctcactaggcggttcggtgcaattccgtaccaaagaggtaagcgacattattaagccagggcaatcttggggattagataccaaaagtgcctacagtagcaaaaatcaacaatggttaaactcacttgcttttgctggtactcacaatggctttgatgctcttgtgatttacactcaccgtgatggtaaggaaacgaaagctcataaaaatgcagagagtcgttctcagaatatcacccgagtaggagtggaaaccaacgagcttgatacctcaaatagatatactgcgacgacgaataatcaacatacttatggctggtttttgattaaagatgaatgtccaacgttagattgtacgccgaaacagatggctagggtgacaaaagatacgccatctttccgttcttaccctgaatatactcctgaggaaaaacaggcttatgagaaccaaaaacatattacagagcgtctaaatgctcaggattacactggtgaatatagagctttacctgatccgcttaaatataaatctgattcttggctggttaaattaggatacacattctctccgaaacattatgtcgctggtacttatgaacatagcaaacagcgttacgacacccgagatatgacctataccgcttattggcaaccatcggatttacttagaactggtagaaattggtatccaatgaataatgctaaaggattatatcgtgataatgctttagatggtgttgctattgactactttacggaagatggtgtgaaatcctcaaaaggtttacgttgggcaaaagctcgttttattgacgagtggcacactcgtgatcgcttaggtgctttatatcgttatactaatcaagatggaaatcgtctgattgatagactatccttgagtttcgatcagcaaaaaattaatttatctacccgcttgagagaaaacaactgttcggaatatccaaccatagataagaattgccgtgcaactcttgataaactttggtcttctactaaaaatgagcaaagttcttatgaagaaaaacacgacactattcagctctcgttagataaaaccgtacaaacgggattgggtaaacatcaattaaatatgttattaggttcagaccgtttcaattccaccttaaaacgccatgaaattttgagtgaattttctgtagggagttgggggcttgttagagacattggctatcgaaatggatcttacaataatccttatgtgtatgagctaaaagatcaggcaatttatagtaaaaatgaatgtgattatagtggcactattgcaggtagggctgattgtgctacaagtaaaatcaaagggcataatcactacatcgctctgagagataattttgccataaccaagtatttggatattggtttgggttaccgtttcgataagcataaattccgtagcactcatcgctgggcaaatcaaggcgattataaaaatagtgcgtggaatattggcatagtcgcaaaaccaacgtcattcctatcgctctcttatcgagcatcatctggctttagagtgccaagtttccaagagctatttggcttacgttatgatggtgcaatgaaaggctccagcgatgcttaccaaaaaacagagaagttatctcctgaaaaatccttaaaccaagaggttgctgcgactttcaaaggtgattttggtgtcgttgaagtcagttatttcaaaaatgactataagcagttaattgctccagcagaaagaatgcaccaaactcaatcaatgattaactattttaatgtgcaagatattaaattggacggcattaatcttattggtaagctagattggaatggggtatttgataaaattcctgagggcatttacacaacattggcttatagcaaaatgcgagtaaaagaggtgaaaaactatcaagggtatatgaatattcgttctccattgttagataccattcagcctgctcgctatgttgtaggagtggggtacgatcagccagatgaaaaatggggcgtgaatctaacaatgacacactccagtggaaaaaatccaaatgagttaagaggtaatgaacaagtcggttttgccaattatgagcgaactgccacgaagaaaagaacacgttcttggcatacctttgacttaacgggatatatcaccccttggaaacatacaacggtacgagctggcgtatataacctgatgaattatcgttacaccacttgggaatccgtacgtcaatcttcgcttaatgcaattcatcagcatactaacgtaaaagactatgcaaggtatgcagcgcccggtagaaattatgttgtttcattcgaaatgaaattctaa
SEQ ID NO：16—胸膜肺炎放线杆菌ApfA
MQKLSLIRPLTNAFTLIELMIVIAIIAILATVAIPSYNSYTQKAALSELLAASASYKTDVEICIYNTGDSKNCSGGQNGVRKMTELRQAKYLNAITVEGGTITVTGKGNLQEYGYTMTPIHNGSTISWETKCKGEDLSLFPANFCAIN
*粗体表示胸膜肺炎放线杆菌天然信号肽
SEQ ID NO：16的核苷酸序列
atgcaaaaactaagtcttattcgaccgcttactaacgcgtttactttaattgaattgatgatcgtgattgcgattattgccattttagctacggttgcaattccgtcatataacagttatacccaaaaagcggcgctttcggagctattggcggcatcggcttcttataaaacggatgtcgagatctgcatatataacaccggagattctaaaaactgtagcggcggtcaaaacggtgtcagaaaaatgacggagcttagacaggctaaatatttaaatgccattacggtggaaggcggaacgattacggtaacggggaaggggaatctgcaggaatacggttatacgatgacaccgattcataacggtagcactatttcttgggaaacgaaatgtaaaggggaggacttaagtttatttccggcaaatttctgtgcgataaattag
SEQ ID NO：17—肺炎克雷伯菌OmpA
KLSRIALATMLVAAPLAAANAGGKLGWSQYHDTGFYGNGFQNNNGPTRNDQLGAGAFGGYQVNPYLGFEMGYDWLGRMAYKGSVDNGAFKAQGVQLTAKLGYPITDDLDIYTRLGGMVWRADSKGNYASTGVSRSEHDTGVSPVFAGGVEWAVTRDIATRLEYQWVNNIGDAGTVGTRPDNGMLSLGVSYRFGQEDAAPVVAPAPAPAPEVATKHFTLKSDVLFNFNKATLKPEGQQALDQLYTQLSNMDPKDGSAVVLGYTDRIGSEAYNQQLSEKRAQSVVDYLVAKGIPAGKISARGMGESNPVTGNTCDNVKARAALIDCLAPDRRVEIEVKGYKEVVTQPQA
*粗体表示鲍曼不动杆菌信号肽
SEQ ID NO：17的核苷酸序列
atgaaattgagtcgtattgcacttgctactatgcttgttgctgctccattagctgctgctaatgctggtggtaaactgggttggtcccagtatcacgacaccggtttctacggtaacggtttccagaacaacaacggtccgacccgtaacgatcagcttggtgctggtgcgttcggtggttaccaggttaacccgtacctcggtttcgaaatgggttatgactggctgggccgtatggcatataaaggcagcgttgacaacggtgctttcaaagctcagggcgttcagctgaccgctaaactgggttacccgatcactgacgatctggacatctacacccgtctgggcggcatggtttggcgcgctgactccaaaggcaactacgcttctaccggcgtttcccgtagcgaacacgacactggcgtttccccagtatttgctggcggcgtagagtgggctgttactcgtgacatcgctacccgtctggaataccagtgggttaacaacatcggcgacgcgggcactgtgggtacccgtcctgataacggcatgctgagcctgggcgtttcctaccgcttcggtcaggaagatgctgcaccggttgttgctccggctccggctccggctccggaagtggctaccaagcacttcaccctgaagtctgacgttctgttcaacttcaacaaagctaccctgaaaccggaaggtcagcaggctctggatcagctgtacactcagctgagcaacatggaCccgaaagacggttccgctgttgttctgggctacaccgaccgcatcggttccgaagcttacaaccagcagctgtctgagaaacgtgctcagtccgttgttgactacctggttgctaaaggcatcccggctggcaaaatctccgctcgcggcatgggtgaatccaacccggttactggcaacacctgtgacaacgtgaaagctcgcgctgccctgatcgattgcctggctccggatcgtcgtgtagagatcgaagttaaaggctacaaagaagttgtaactcagccgcaggcttaa
SEQ ID NO：18—肺炎克雷伯菌OmpK36
MKLSRIALATMLVAAPLAAANAAEIYNKDGNKLDLYGKIDGLHYFSDDKSVDGDQTYMRVGVKGETQINDQLTGYGQWEYNVQANNTESSSDQAWTRLAFAGLKFGDAGSFDYGRNYGVVYDVTSWTDVLPEFGGDTYGSDNFLQSRANGVATYRNSDFFGLVDGLNFALQYQGKNGSVSGEGALSPTNNGRTALKQNGDGYGTSLTYDIYDGISAGFAYSNSKRLGDQNSKLALGRGDNAETYTGGLKYDANNIYLATQYTQTYNATRAGSLGFANKAQNFEVVAQYQFDFGLRPSVAYLQSKGKDLEGYGDQDILKYVDVGATYYFNKNMSTYVDYKINLLDDNSFTHNAGISTDDVVALGLVYQF
*粗体表示鲍曼不动杆菌信号肽
SEQ ID NO：18的核苷酸序列
atgaaattgagtcgtattgcacttgctactatgcttgttgctgctccattagctgctgctaatgctgctgaaatttataacaaagacggcaacaaattagacctgtacggtaaaattgacggtctgcactacttctctgacgacaagagcgtcgacggcgaccagacctacatgcgtgtaggcgtgaaaggcgaaacccagatcaacgaccagctgaccggttacggccagtgggaatacaacgttcaggcgaacaacactgaaagctccagcgatcaggcatggactcgtctggcattcgcaggcctgaaatttggcgacgcgggctctttcgactacggtcgtaactacggcgtagtatacgacgtaacgtcctggaccgacgttctgccggaattcggcggcgacacctacggttctgacaacttcctgcagtcccgtgctaacggcgttgcaacctaccgtaactctgatttcttcggtctggttgacggcctgaactttgctctgcagtatcagggtaaaaacggcagcgtcagcggcgaaggcgctctgtctcctaccaacaacggtcgtaccgccttgaaacagaacggcgacggttacggtacttctctgacctatgacatctatgatggcatcagcgctggtttcgcatactctaactccaaacgtcttggcgaccagaacagcaagctggcactgggtcgtggcgacaacgctgaaacctacaccggcggtctgaaatacgacgcgaacaacatctacctggccactcagtacacccagacctacaacgcgacccgcgccggttccctgggctttgctaacaaagcgcagaacttcgaagtggtt gctcagtaccagttcgacttcggtctgcgtccgtccgtggcttacctgcagtctaaaggtaaggatctggaaggctacggcgaccaggacatcctgaaatatgttgacgttggcgcgacctactacttcaacaaaaacatgtccacctatgttgactacaaaatcaacctgctggacgacaatagcttcacccacaacgccggtatctctaccgacgacgtggttgcactgggcctggtttaccagttctaa
SEQ ID NO：19—铜绿假单胞菌OprF
MKLSRIALATMLVAAPLAAANAQGQNSVEIEAFGKRYFTDSVRNMKNADLYGGSIGYFLTDDVELALSYGEYHDVRGTYETGNKKVHGNLTSLDAIYHFGTPGVGLRPYVSAGLAHQNITNINSDSQGRQQMTMANIGAGLKYYFTENFFAKASLDGQYGLEKRDNGHQGEWMAGLGVGFNFGGSKAAPAPEPVADVCSDSDNDGVCDNVDKCPDTPANVTVDANGCPAVAEVVRVQLDVKFDFDKSKVKENSYADIKNLADFMKQYPSTSTTVEGHTDSVGTDAYNQKLSERRANAVRDVLVNEYGVEGGRVNAVGYGESRPVADNATAEGRAINRRVEAEVEAEAK
*粗体表示鲍曼不动杆菌信号肽
SEQ ID NO：19的核苷酸序列
atgaaattgagtcgtattgcacttgctactatgcttgttgctgctccattagctgctgctaatgctcagggccagaactcggtagagatcgaagccttcggcaagcgctacttcaccgacagcgttcgcaacatgaagaacgcggacctgtacggcggctcgatcggttacttcctgaccgacgacgtcgagctggcgctgtcctacggtgagtaccatgacgttcgtggcacctacgaaaccggcaacaagaaggtccacggcaacctgacctccctggacgccatctaccacttcggtaccccgggcgtaggtctgcgtccgtacgtgtcggctggtctggctcaccagaacatcaccaacatcaacagcgacagccaaggccgtcagcagatgaccatggccaacatcggcgctggtctgaagtactacttcaccgagaacttcttcgccaaggccagcctcgacggccagtacggtctggagaagcgtgacaacggtcaccagggcgagtggatggctggcctgggcgtcggcttcaacttcggtggttcgaaagccgctccggctccggaaccggttgccgacgtttgctccgactccgacaacgacggcgtttgcgacaacgtcgacaagtgcccggataccccggccaacgtcaccgttgacgccaacggctgcccggctgtcgccgaagtcgtacgcgtacagctggacgtgaagttcgacttcgacaagtccaaggtcaaagagaacagctacgctgacatcaagaacctggctgacttcatgaagcagtacccgtccacttccaccaccgttgaaggtcacaccgactccgtcggcaccgacgcttacaaccagaagctgtccgagcgtcgtgccaacgccgttcgtgacgtactggtcaacgagtacggtgtagaaggtggtcgcgtgaacgctgttggttacggcgagtcccgcccggttgccgacaacgccaccgctgaaggccgcgctatcaaccgtcgcgttgaagccgaagtagaagctgaagccaagtaa
SEQ ID NO：20—铜绿假单胞菌OprI::PcrV融合蛋白
MKLSRIALATMLVAAPLAAANASHSKETEARLTATEDAAARAQARADEAYRKADEALGAAQKAQQTADEANERALRMLEKASRKGGGGSGGGGSGGGGSSAAPASAEQEELLALLRSERIVLAHAGQPLSEAQVLKALAWLLAANPSAPPGQGLEVLREVLQARRQPGAQWDLREFLVSAYFSLHGRLDEDVIGVYKDVLQTQDGKRKALLDELKALTAELKVYSVIQSQINAALSAKQGIRIDAGGIDLVDPTLYGYAVGDPRWKDSPEYALLSNLDTFSGKLSIKDFLSGSPKQSGELKGLSDEYPFEKDNNPVGNFATTVSDRSRPLNDKVNEKTTLLNDTSSRYNSAVEALNRFIQKYDSVLRDILSAI
*粗体表示鲍曼不动杆菌信号肽
*下划线表示接头
SEQ ID NO：20的核苷酸序列
atgaaattgagtcgtattgcacttgctactatgcttgttgctgctccattagctgctgctaatgctagccactccaaagaaaccgaagctcgtctgaccgctaccgaagacgcagctgctcgtgctcaggctcgcgctgacgaagcctatcgcaaggctgacgaagctctgggcgctgctcagaaagctcagcagactgctgacgaggctaacgagcgtgccctgcgcatgctggaaaaagccagccgcaagggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcag ctcggcggcgcctgccagtgccgagcaggaggaactgctggccctgttgcgcagcgagcggatcgtgctggcccacgccggccagccgctgagcgaggcgcaagtgctcaaggcgctcgcctggttgctcgcggccaatccgtccgcgcctccggggcagggcctcgaggtactccgcgaagtcctgcaggcacgtcggcagcccggtgcgcagtgggatctgcgcgagttcctggtgtcggcctatttcagcctgcacgggcgtctcgacgaggatgtcatcggtgtctacaaggatgtcctgcagacccaggacggcaagcgcaaggcgctgctcgacgagctgaaggcgctgaccgcggagttgaaggtctacagcgtgatccagtcgcagatcaacgccgcgctgtcggccaagcagggcatcaggatcgacgctggcggtatcgatctggtcgaccccacgctatatggctatgccgtcggcgatcccaggtggaaggacagccccgagtatgcgctgctgagcaatctggataccttcagcggcaagctgtcgatcaaggattttctcagcggctcgccgaagcagagcggggaactcaagggcctcagcgatgagtaccccttcgagaaggacaacaacccggtcggcaatttcgccaccacggtgagcgaccgctcgcgtccgctgaacgacaaggtcaacgagaagaccaccctgctcaacgacaccagctcccgctacaactcggcggtcgaggcgctcaaccgcttcatccagaaatacgacagcgtcctgcgcgacattctcagcgcgatctag
SEQ ID NO：21—铜绿假单胞菌OprI
MKLSRIALATMLVAAPLAAANASHSKETEARLTATEDAAARAQARADEAYRKADEALGAAQKAQQTADEANERALRMLEKASRK
*粗体表示鲍曼不动杆菌信号肽
SEQ ID NO：21的核苷酸序列
atgaaattgagtcgtattgcacttgctactatgcttgttgctgctccattagctgctgctaatgctagccactccaaagaaaccgaagctcgtctgaccgctaccgaagacgcagctgctcgtgctcaggctcgcgctgacgaagcctatcgcaaggctgacgaagctctgggcgctgctcagaaagctcagcagactgctgacgaggctaacgagcgtgccctgcgcatgctggaaaaagccagccgcaatag
SEQ ID NO：22—大肠杆菌OmpA
MKLSRIALATMLVAAPLAAANAAPKDNTWYTGAKLGWSQYHDTGFIPNNGPTHENQLGAGAFGGYQVNPYVGFEMGYDWLGRMPYKGDNINGAYKAQGVQLTAKLGYPITDDLDIYTRLGGMVWRADTKANVPGGASFKDHDTGVSPVFAGGVEYAITPEIATRLEYQWTNNIGDAHTIGTRPDNGMLSLGVSYRFGQGEVAPVVAPAPAPAPEVQTKHFTLKSDVLFTFNKATLKPEGQAALDQLYSQLSNLDPKDGSVVVLGYTDRIGSDAYNQALSERRAQSVVDYLISKGIPADKISARGMGESNPVTGNTCDNVKQRAALIDCLAPDRRVEIEVKGIKDVVTQPQA
*粗体表示鲍曼不动杆菌信号肽
SEQ ID NO：22的核苷酸序列
atgaaattgagtcgtattgcacttgctactatgcttgttgctgctccattagctgctgctaatgctgctccgaaagataacacctggtacactggtgctaaactgggctggtcccagtaccatgacactggttttattcctaacaatggtccgacccacgaaaaccaactgggtgcaggtgcttttggtggttaccaggttaacccgtatgttggctttgaaatgggttacgactggttaggtcgtatgccgtacaaaggcgacaacatcaacggcgcatacaaagctcagggcgttcagctgaccgctaaactgggttacccaatcactgacgatctggacatctacactcgtctgggtggtatggtatggcgtgcagacaccaaggctaacgtacctggtggcgcatcctttaaagaccacgacaccggcgtttctccggtcttcgctggcggtgttgagtatgcgatcactcctgaaatcgctacccgtctggaataccagtggaccaacaacatcggtgacgcacacaccatcggcactcgtccggacaacggcatgctgagcctgggtgtttcctaccgtttcggtcagggcgaagtagctccagtagttgctccggctccagctccggcaccggaagtacagaccaagcacttcactctgaagtctgacgttctgttcaccttcaacaaagcaaccctgaaaccggaaggtcaggctgctctggatcagctgtacagccagctgagcaacctggatccgaaagacggttccgtagttgttctgggttacactgaccgcatcggttctgacgcttataaccaggctctgtccgagcgtcgtgctcagtccgttgttgattacctgatctctaaaggtatcccggcagacaaaatctccgcacgtggtatgggcgaatccaacccggttactggcaacacctgtgacaacgtgaaacagcgtgctgcactgatcgattgcctggctccggatcgtcgcgtagagatcgaagttaaaggcatcaaagacgttgtaactcagccgcaggcttaa
SEQ ID NO：23—大肠杆菌OmpX
MKLSRIALATMLVAAPLAAANAATSTVTGGYAQSDAQGQMNKMGGFNLKYRYEEDNSPLGVIGSFTYTEKSRTASSGDYNKNQYYGITAGPAYRINDWASIYGVVGVGYGKFQTTEYPTYKHDTSDYGFSYGAGLQFNPMENVALDFSYEQSRIRSVDVGTWIAGVGYRF
*粗体表示鲍曼不动杆菌信号肽
SEQ ID NO：23的核苷酸序列
atgaaattgagtcgtattgcacttgctactatgcttgttgctgctccattagctgctgctaatgctgcgacttctaccgtaactggcggttacgcacaaagcgacgctcagggccaaatgaacaaaatgggcggtttcaacctgaaataccgctatgaagaagacaacagcccgctgggtgtgatcggttctttcacttacaccgagaaa agccgtactgcaagctctggtgactacaacaaaaaccagtactacggcatcactgctggtccggcttaccgcattaacgactgggcaagcatctacggtgtagtgggtgtgggttatggtaaattccagaccactgaatacccgacctacaaacacgacaccagcgactacggtttctcctacggtgctggtttgcagttcaacccgatggaaaacgttgctctggacttctcttacgagcagagccgtattcgtagcgttgacgtaggcacctggattgccggtgttggttaccgcttctaa
SEQ ID NO：24—大肠杆菌FyuA
MKLSRIALATMLVAAPLAAANANAQTSQQDESTLVVTASKQSSRSASANNVSSTVVSAPELSDAGVTASDKLPRVLPGLNIENSGNMLFSTISLRGVSSAQDFYNPAVTLYVDGVPQLSTNTIQALTDVQSVELLRGPQGTLYGKSAQGGIINIVTQQPDSTPRGYIEGGVSSRDSYRSKFNLSGPIQDGLLYGSVTLLRQVDDGDMINPATGSDDLGGTRASIGNVKLRLAPDDQPWEMGFAASRECTRATQDAYVGWNDIKGRKLSISDGSPDPYMRRCTDSQTLSGKYTTDDWVFNLISAWQQQHYSRTFPSGSLIVNMPQRWNQDVQELRAATLGDARTVDMVFGLYRQNTREKLNSAYDMPTMPYLSSTGYTTAETLAAYSDLTWHLTDRFDIGGGVRFSHDKSSTQYHGSMLGNPFGDQGKSNDDQVLGQLSAGYMLTDDWRVYTRVAQGYKPSGYNIVPTAGLDAKPFVAEKSINYELGTRYETADVTLQAATFYTHTKDMQLYSGPVGMQTLSNAGKADATGVELEAKWRFAPGWSWDINGNVIRSEFTNDSELYHGNRVPFVPRYGAGSSVNGVIDTRYGALMPRLAVNLVGPHYFDGDNQLRQGTYATLDSSLGWQATERMNISVYVDNLFDRRYRTYGYMNGSSAVAQVNMGRTVGINTRIDFF
*粗体表示鲍曼不动杆菌信号肽
SEQ ID NO：24的核苷酸序列
atgaaattgagtcgtattgcacttgctactatgcttgttgctgctccattagctgctgctaatgctcagacttcacagcaagacgaaagcacgctggtggttaccgccagtaaacaatcttcccgctcggcatcagccaacaacgtctcatctactgttgtcagcgcgccggaattaagcgacgccggcgtcaccgccagcgacaaactccccagagtcttgcccgggctcaatattgaaaatagcggcaacatgcttttttcgacgatctcgctacgcggcgtctcttcagcgcaggacttctataaccccgccgtcaccctgtatgtcgatggcgtccctcagctttccaccaacaccatccaggcgcttaccgatgtgcaaagcgtggagttgctgcgaggcccacagggaacgttatatggcaaaagcgctcagggcgggatcatcaacatcgtcacccagcagccggacagcacgccgcgcggctatattgaaggcggcgtcagtagccgcgacagttatcgaagtaagttcaacctgagcggccccattcaggatggcctgctgtacggcagcgtcaccctgttacgccaggttgatgacggcgacatgattaaccccgcgacgggaagcgatgacttaggcggcacccgcgccagcatagggaatgtgaaactgcgtctggcgccggacgatcagccctgggaaatgggctttgccgcctcacgcgaatgtacccgcgccacccaggatgcctatgtgggatggaatgatattaagggccgtaagctgtcgatcagcgatggttcaccagacccgtacatgcggcgctgcactgacagccagaccctgagtgggaaatacaccaccgatgactgggttttcaacctgatcagcgcctggcagcagcagcattattcgcgcaccttcccttccggttcgttaatcgtcaatatgcctcagcgctggaatcaggatgtgcaggagctgcgcgccgcaaccctgggcgatgcgcgtaccgttgatatggtgtttgggctgtaccggcagaacacccgcgagaagttaaattcagcctacgacatgccgacaatgccttatttaagcagtaccggctataccaccgctgaaacgctggccgcatacagtgacctgacctggcatttaaccgatcgttttgatatcggcggcggcgtgcgcttctcgcatgataaatccagtacacaatatcacggcagcatgctcggcaacccgtttggcgaccagggtaagagcaatgacgatcaggtgctcgggcagctatccgcaggctatatgctgaccgatgactggagagtgtatacccgtgtagcccagggatataaaccttccgggtacaacatcgtgcctactgcgggtcttgatgccaaaccgttcgtcgccgagaaatccatcaactatgaacttggcacccgctacgaaaccgctgacgtcacgctgcaagccgcgacgttttatacccacaccaaagacatgcagctttactctggcccggtcgggatgcagacattaagcaatgcgggtaaagccgacgccaccggcgttgagcttgaagcgaagtggcggtttgcgccaggctggtcatgggatatcaatggcaacgtgatccgttccgaattcaccaatgacagtgagttgtatcacggtaaccgggtgccgttcgtaccacgttatggcgcgggaagcagcgtgaacggcgtgattgatacgcgctatggcgcactgatgccccgactggcggttaatctggtcgggccgcattatttcgatggcgacaaccagttgcggcaaggcacctatgccaccctggacagcagcctgggctggcaggcgactgaacggatgaacatttccgtctatgtcgataacctgttcgaccgtcgttaccgtacctatggctacatgaacggcagcagcgccgtcgcgcaggtcaatatgggtcgcaccgtcggtatcaatacgcgaattgatttcttctga
SEQ ID NO：25—大肠杆菌Hma
MKLSRIALATMLVAAPLAAANATSSETKISNEETLVVTTNRSASNLWESPATIQVIDQQTLQNSTNASIADNLQDIPGVEITDNSLAGRKQIRIRGEASSRVLILIDGQEVTYQRAGDNYGVGLLIDESALERVEVVKGPYSVLYGSQAIGGIVNFITKKGGDKLASGVVKAVYNSATAGWEESIAVQGSIGGFDYRINGSYSDQGNRD TPDGRLPNTNYRNNSQGVWLGYNSGNHRFGLSLDRYRLATQTYYEDPDGSYEAFSVKIPKLEREKVGVFYDTDVDGDYLKKIHFDAYEQTIQRQFANEVKTTQPVPSPMIQALTVHNKTDTHDKQYTQAVTLQSHFSLPANNELVTGAQYKQDRVSQRSGGMTSSKSLTGFINKETRTRSYYESEQSTVSLFAQNDWRFADHWTWTMGVRQYWLSSKLTRGDGVSYTAGIISDTSLARESASDHEMVTSTSLRYSGFDNLELRAAFAQGYVFPTLSQLFMQTSAGGSVTYGNPDLKAEHSNNFELGARYNGNQWLIDSAVYYSEAKDYIASLICDGSIVCNGNTNSSRSSYYYYDNIDRAKTWGLEISAEYNGWVFSPYISGNLIRRQYETSTLKTTNTGEPAINGRIGLKHTLVMGQANIISDVFIRAASSAKDDSNGTETNVPGWATLNFAVNTEFGNEDQYRINLALNNLTDKRYRTAHETIPAAGFNAAIGFVWNF
*粗体表示鲍曼不动杆菌信号肽
SEQ ID NO：25的核苷酸序列
atgaaattgagtcgtattgcacttgctactatgcttgttgctgctccattagctgctgctaatgctacttcttcagaaacaaaaatcagcaacgaagagacgctcgtcgtgaccacgaatcgttcggcaagcaacctttgggaaagcccggcgactatacaggttattgaccaacaaacattgcagaactccaccaatgcctccatagccgataatttgcaggacatccccggagtagagataacagacaactccttggcaggccgtaaacaaatccgcattcgtggcgaagcatcctcccgtgttttaattctcattgatggtcaggaggtaacttatcagcgcgccggagataattatggtgtgggactgttgatagatgagtctgcgctggagcgtgttgaggtagtgaaaggtccatattccgtactgtacggttcacaggcaattggcggtattgttaacttcataaccaaaaagggaggtgacaaacttgcatctggagttgtgaaagctgtttataattccgcaacagcaggctgggaagaatcaatcgcggtccaggggagcatcggtggatttgattatcgcatcaacggtagttattctgatcagggcaatcgtgatacgccggatggacgtctgccgaataccaactatcgtaacaatagtcagggtgtatggttgggttataactccggaaaccatcgttttggcctctcgcttgatcgctacagactcgcgacgcaaacttactatgaggatccagacggaagctatgaggcatttagtgtcaaaatacctaaacttgaacgagagaaagttggggtattctatgacacagacgtggacggtgactatctaaaaaaaattcatttcgacgcgtatgagcagaccatccagcgccaatttgccaacgaagtaaaaacgacacagcctgttcccagtccgatgattcaggctctgaccgttcataacaagactgacacccatgataagcaatacactcaggcggtcacattgcagagtcacttttcgctgcctgctaataatgaacttgttaccggtgcacagtacaaacaagacagggtcagccaaaggtccggtggcatgacctcaagcaaatctctgaccggcttcattaataaggaaacacgaactcgctcctattatgagtcagagcaaagtacagtctcactattcgcacaaaatgactggcgattcgccgatcactggacatggacaatgggagttcgccaatactggctttcttcaaagttgacgcgtggtgacggagtatcatataccgcaggcattataagcgatacctctcttgccagagagtctgcgagtgatcacgaaatggtaacatctacaagcctgcgctattcaggtttcgataacttggagttacgcgctgcgttcgcgcaaggctacgtatttcccacactctcccagctttttatgcagacatctgcgggcggcagtgtcacatacggaaatcctgatcttaaggctgaacactccaataactttgaattaggtgcacgatataatggtaatcagtggctgattgacagcgcagtttactactcagaagctaaagattatattgcaagtctgatctgtgatggcagtatagtttgcaatggtaacaccaactcctcccgtagtagctactattattatgacaatattgatcgggcaaaaacatggggactggaaataagcgcggaatataatggctgggttttctcgccatatatcagtggcaatttaattcgtcggcaatatgaaacttcaacattaaaaacaactaatacaggagaaccagcgataaacggacgtatagggctgaaacatactcttgtgatgggtcaggccaacataatctctgatgtttttattcgtgctgcctctagtgcaaaagatgacagtaacggtaccgaaacaaatgttccgggctgggccactctcaactttgcagtaaatacagaattcggtaacgaggatcagtaccggattaacctagcactcaataacctgacagacaaacgctaccgtacagcacatgaaactattcctgcagcaggttttaatgcagctataggttttgtatggaatttctga
SEQ ID NO：26—大肠杆菌IutA
MKLSRIALATMLVAAPLAAANAQQNDDNEIIVSASRSNRTVAEMAQTTWVIENAELEQQIQGGKELKDALAQLIPGLDVSSQSRTNYGMNMRGRPLVVLIDGVRLNSSRSDSRQLDSVDPFNIDHIEVISGATALYGGGSTGGLINIVTKKGQPETMMEFEAGTKSGFNSSKDHDERIAGAVSGGNDHISGRLSVAYQKFGGWFDGNGDATLLDNTQTGLQHSNRLDIMGTGTLNIDESRQLQLITQYYKSQGDDNYGLNLGKGFSAISGSSTPYVSKGLNSDRIPGTERHLISLQYSDSDFLRQELVGQVYYRDESLRFYPFPTVNANKQATAFSSSQQDTDQYGMKLTLNSQLMDGWQITWGLDAEHERFTSNQMFFDLAQASASGGLNNHKIYTTGRYPSYDITNLAAFLQSSYDINDIFTVSGGVRYQYTENRVDDFIDYTQQQKIAAGKAISADAIPGGSVDYDNFLFNAGLLMHITERQQAWFNFSQGVALPDPGKYYGRGIYGAAVNGHLPLTKSVNVSDSKLEGVKVDSYELGWRFTGDNLRTQIA AYYSLSNKSVERNKDLTISVKDDRRRIYGVEGAVDYLIPDTDWSTGVNFNVLKTESKVNGQWQKYDVKESSPSKATAYINWAPEPWSLRVQSTTSFDVSDAEGNDINGYTTVDFISSWQLPVGTLSFSVENLFDRDYTTVWGQRAPLYYSPGYGPASLYDYKGRGRTFGLNYSVLF
*粗体表示鲍曼不动杆菌信号肽
SEQ ID NO：26的核苷酸序列
atgaaattgagtcgtattgcacttgctactatgcttgttgctgctccattagctgctgctaatgctcagcaaaacgatgataatgagatcatagtgtctgccagccgcagcaatcgaactgtagcggagatggcgcaaaccacctgggttatcgaaaatgccgaactggagcagcagattcagggcggtaaagagctgaaagacgcactggctcagttaatccccggccttgatgtcagcagccagagccgaaccaactacggtatgaacatgcgtggccgcccgctggttgtcctgattgacggtgtgcgcctcaactcttcacgttccgacagccgacaactggactctgtcgatccttttaatatcgaccatattgaagtgatctccggcgcgacggccctgtacggtggcgggagtaccggagggttgatcaacatcgtgaccaaaaaaggccagccggaaaccatgatggagtttgaggctggcacaaaaagtggctttaacagcagtaaagatcacgatgagcgcattgccggtgctgtctccggcggaaatgaccatatctccggacgtctttccgtggcatatcagaaatttggcggctggtttgacggtaacggcgatgccaccctgcttgataacacccagaccggcctgcagcactccaatcggctggacatcatgggaaccggtacgctgaacatcgatgaatcccggcagcttcaactgataacgcagtactataaaagtcagggggacgacaattacgggcttaatctcgggaaaggcttttccgccatcagcgggagcagcacaccatacgtcagtaaggggctgaattctgaccgcattcccggcactgagcggcatttgatcagcctgcagtactctgacagtgatttcctgagacaggaactggtcggtcaggtttactaccgcgatgagtcgttgcggttctacccgttcccgacggtaaatgcgaataaacaggcgacggctttctcctcgtcacagcaggataccgaccagtacggcatgaaactgactctgaacagccaacttatggacggctggcaaatcacctgggggctggatgctgagcatgagcgctttacctccaaccagatgttcttcgatctggctcaggcaagtgcttccggagggctgaacaaccataagatttacaccaccgggcgctatccgtcatatgacatcaccaatctggcggccttcctgcaatccagctatgacattaatgatatttttaccgttagcggtggcgtacgctatcagtatactgagaacagggtagatgatttcatcgactacacgcagcaacagaagattgctgccgggaaggcgatatctgccgacgccattcctggtggttcggtagattacgataactttctgttcaatgctggtctgctgatgcacatcaccgaacgtcagcaggcatggttcaatttttcccagggggtggcattgccggatccggggaaatattatggtcgcggcatctatggtgcagcagtgaacggccatcttcccctgacaaagagcgtgaacgtcagcgacagtaagctggaaggcgtgaaagtcgattcttatgaactgggctggcgctttaccggtgacaacctgcggactcaaatcgcggcatattactcgctttccaataagagcgtggaaaggaataaagatctgaccatcagtgtgaaggacgacaggcgccgtatttacggcgtggaaggtgcggtggactacctgatcccggatactgactggagtaccggtgtgaacttcaatgtgctgaaaaccgagtcgaaagtgaacggtcaatggcaaaaatatgacgtgaaggaatcaagtccatcgaaagcgacagcttacattaactgggcgccggaaccgtggagtctgcgtgtacagagcaccacttctttcgacgtaagcgatgcagagggtaacgatattaatggttacactaccgtcgattttatcagtagttggcagcttccggtgggaacactcagcttcagcgttgagaacctcttcgaccgtgactataccactgtctggggacagcgtgcacctctgtactacagcccgggttacggccctgcttcactgtacgactacaaaggccggggccgaacctttggtctgaactactcagtgctgttctga
SEQ ID NO：27—胸膜肺炎放线杆菌OmpA
MKLSRIALATMLVAAPLAAANAAAPQQNTFYAGAKAGWASFHDGIEQLDSAKNTDRGTKYGINRNSVTYGVFGGYQILNQDKLGLAAELGYDYFGRVRGSEKPNGKADKKTFRHAAHGATIALKPSYEVLPDLDVYGKVGIALVNNTYKTFNAAQEKVKTRRFQSSLILGAGVEYAILPELAARVEYQWLNNAGKASYSTLNRMGATDYRSDISSVSAGLSYRFGQGAVPVAAPAVETKNFAFSSDVLFAFGKSNLKPAAATALDAMQTEINNAGLSNAAIQVNGYTDRIGKEASNLKLSQRRAETVANYIVSKGALAANVTAVGYGEANPVTGATCDKVKGRKALIACLAPDRRVEVQVQGTKEVTM
*粗体表示鲍曼不动杆菌信号肽
SEQ ID NO：27的核苷酸序列
atgaaattgagtcgtattgcacttgctactatgcttgttgctgctccattagctgctgctaatgctgcagcgccacaacaaaatactttctacgcaggtgcgaaagcaggttgggcgtcattccatgatggtatcgaacaattagattcagctaaaaacacagatcgcggtacaaaatacggtatcaaccgtaattcagtaacttacggcgtattcggcggttaccaaattttaaaccaagacaaattaggtttagcggctgaattaggttatgactatttcggtcgtgtgcgcggttctgaaaaaccaaacggtaaagcggacaagaaaactttccgtcacgctgcacacggtgcgacaatcgcattaaaacctagctacgaagtattacctgacttagacgtttacggtaaagtaggtatcgcattagtaa acaatacatataaaacattcaatgcagcacaagagaaagtgaaaactcgtcgtttccaaagttctttaattttaggtgcgggtgttgagtacgcaattcttcctgaattagcggcacgtgttgaataccaatggttaaacaacgcaggtaaagcaagctactctactttaaatcgtatgggtgcaactgactaccgttcggatatcagttccgtatctgcaggtttaagctaccgtttcggtcaaggtgcggtaccggttgcagctccggcagttgaaactaaaaacttcgcattcagctctgacgtattattcgcattcggtaaatcaaacttaaaaccggctgcggcaacagcattagatgcaatgcaaaccgaaatcaataacgcaggtttatcaaatgctgcgatccaagtaaacggttacacggaccgtatcggtaaagaagcttcaaacttaaaactttcacaacgtcgtgcggaaacagtagctaactacatcgtttctaaaggtgctctggcagctaacgtaactgcagtaggttacggtgaagcaaaccctgtaaccggcgcaacatgtgacaaagttaaaggtcgtaaagcattaatcgcttgcttagcaccggatcgtcgtgttgaagttcaagttcaaggtactaaagaagtaactatgtaa
SEQ ID NO：28—胸膜肺炎放线杆菌OmpW
MKLSRIALATMLVAAPLAAANAAHQAGDVIFRAGAIGVIANSSSDYQTGADVNLDVNNNIQLGLTGTYMLSDNLGLELLAATPFSHKITGKLGATDLGEVAKVKHLPPSLYLQYYFFDSNATVRPYVGAGLNYTRFFSAESLKPQLVQNLRVKKHSVAPIANLGVDVKLTDNLSFNAAAWYTRIKTTADYDVPGLGHVSTPITLDPVVLFSGISYKF
*粗体表示鲍曼不动杆菌信号肽
SEQ ID NO：28的核苷酸序列
atgaaattgagtcgtattgcacttgctactatgcttgttgctgctccattagctgctgctaatgctgcacatcaagcgggcgatgtgattttccgtgccggtgcgatcggtgtgattgcaaattcaagttcggattatcaaaccggggcggacgtaaacttagatgtaaataataatattcagcttggtttaaccggtacctatatgttaagtgataatttaggtcttgaattattagcggcaacaccgttttctcacaaaatcaccggtaagttaggtgcaacagatttaggcgaagtggcaaaagtaaaacatcttccgccgagcctttacttacaatattatttctttgattctaatgcgacagttcgtccatacgttggtgccggtttaaactatactcgctttttcagtgctgaaagtttaaaaccgcaattagtacaaaacttacgtgttaaaaaacattccgtcgcaccgattgcgaatttaggtgttgatgtgaaattaacggataatctatcattcaatgcggcagcttggtacacacgtattaaaactactgccgattatgatgttccgggattaggtcatgtaagtacaccgattactttagatcctgttgtattattctcaggtattagctacaaattctaa
SEQ ID NO：29—胸膜肺炎放线杆菌TbpA
MKLSRIALATMLVAAPLAAANAAEQAVQLNDVYVTGTKKKAHKKENEVTGLGKVVKTPDTLSKEQVLGIRDLTRYDPGISVVEQGRGATTGYSIRGVDRNRVGLALDGLPQIQSYVSQYSRSSSGAINEIEYENLRSIQISKGASSSEFGSGSLGGSVQFRTKEVSDIIKPGQSWGLDTKSAYSSKNQQWLNSLAFAGTHNGFDALVIYTHRDGKETKAHKNAESRSQNITRVGVETNELDTSNRYTATTNNQHTYGWFLIKDECPTLDCTPKQMARVTKDTPSFRSYPEYTPEEKQAYENQKHITERLNAQDYTGEYRALPDPLKYKSDSWLVKLGYTFSPKHYVAGTYEHSKQRYDTRDMTYTAYWQPSDLLRTGRNWYPMNNAKGLYRDNALDGVAIDYFTEDGVKSSKGLRWAKARFIDEWHTRDRLGALYRYTNQDGNRLIDRLSLSFDQQKINLSTRLRENNCSEYPTIDKNCRATLDKLWSSTKNEQSSYEEKHDTIQLSLDKTVQTGLGKHQLNMLLGSDRFNSTLKRHEILSEFSVGSWGLVRDIGYRNGSYNNPYVYELKDQAIYSKNECDYSGTIAGRADCATSKIKGHNHYIALRDNFAITKYLDIGLGYRFDKHKFRSTHRWANQGDYKNSAWNIGIVAKPTSFLSLSYRASSGFRVPSFQELFGLRYDGAMKGSSDAYQKTEKLSPEKSLNQEVAATFKGDFGVVEVSYFKNDYKQLIAPAERMHQTQSMINYFNVQDIKLDGINLIGKLDWNGVFDKIPEGIYTTLAYSKMRVKEVKNYQGYMNIRSPLLDTIQPARYVVGVGYDQPDEKWGVNLTMTHSSGKNPNELRGNEQVGFANYERTATKKRTRSWHTFDLTGYITPWKHTTVRAGVYNLMNYRYTTWESVRQSSLNAIHQHTNVKDYARYAAPGRNYVVSFEMKF
*粗体表示鲍曼不动杆菌信号肽
SEQ ID NO：29的核苷酸序列
atgaaattgagtcgtattgcacttgctactatgcttgttgctgctccattagctgctgctaatgctgcagaacaagcggtgcaattgaacgatgtttatgtcacaggaacaaaaaagaaagcacataaaaaagagaacgaagtcacaggcttagggaaagtagttaaaacaccagatactcttagtaaggagcaagtgttaggaatacg agatctgactcgttacgaccccggtatttctgtcgtagaacaagggagaggtgcgactacaggctactcaattcgtggggtagatcgtaaccgtgttggcttggcattagatggtttaccacagattcagtcctatgtaagccagtattcacgttcctcaagcggtgccattaatgaaatagaatacgaaaatctgcgttcgatccaaattagtaaaggggctagttcttctgagtttggtagtggctcactaggcggttcggtgcaattccgtaccaaagaggtaagcgacattattaagccagggcaatcttggggattagataccaaaagtgcctacagtagcaaaaatcaacaatggttaaactcacttgcttttgctggtactcacaatggctttgatgctcttgtgatttacactcaccgtgatggtaaggaaacgaaagctcataaaaatgcagagagtcgttctcagaatatcacccgagtaggagtggaaaccaacgagcttgatacctcaaatagatatactgcgacgacgaataatcaacatacttatggctggtttttgattaaagatgaatgtccaacgttagattgtacgccgaaacagatggctagggtgacaaaagatacgccatctttccgttcttaccctgaatatactcctgaggaaaaacaggcttatgagaaccaaaaacatattacagagcgtctaaatgctcaggattacactggtgaatatagagctttacctgatccgcttaaatataaatctgattcttggctggttaaattaggatacacattctctccgaaacattatgtcgctggtacttatgaacatagcaaacagcgttacgacacccgagatatgacctataccgcttattggcaaccatcggatttacttagaactggtagaaattggtatccaatgaataatgctaaaggattatatcgtgataatgctttagatggtgttgctattgactactttacggaagatggtgtgaaatcctcaaaaggtttacgttgggcaaaagctcgttttattgacgagtggcacactcgtgatcgcttaggtgctttatatcgttatactaatcaagatggaaatcgtctgattgatagactatccttgagtttcgatcagcaaaaaattaatttatctacccgcttgagagaaaacaactgttcggaatatccaaccatagataagaattgccgtgcaactcttgataaactttggtcttctactaaaaatgagcaaagttcttatgaagaaaaacacgacactattcagctctcgttagataaaaccgtacaaacgggattgggtaaacatcaattaaatatgttattaggttcagaccgtttcaattccaccttaaaacgccatgaaattttgagtgaattttctgtagggagttgggggcttgttagagacattggctatcgaaatggatcttacaataatccttatgtgtatgagctaaaagatcaggcaatttatagtaaaaatgaatgtgattatagtggcactattgcaggtagggctgattgtgctacaagtaaaatcaaagggcataatcactacatcgctctgagagataattttgccataaccaagtatttggatattggtttgggttaccgtttcgataagcataaattccgtagcactcatcgctgggcaaatcaaggcgattataaaaatagtgcgtggaatattggcatagtcgcaaaaccaacgtcattcctatcgctctcttatcgagcatcatctggctttagagtgccaagtttccaagagctatttggcttacgttatgatggtgcaatgaaaggctccagcgatgcttaccaaaaaacagagaagttatctcctgaaaaatccttaaaccaagaggttgctgcgactttcaaaggtgattttggtgtcgttgaagtcagttatttcaaaaatgactataagcagttaattgctccagcagaaagaatgcaccaaactcaatcaatgattaactattttaatgtgcaagatattaaattggacggcattaatcttattggtaagctagattggaatggggtatttgataaaattcctgagggcatttacacaacattggcttatagcaaaatgcgagtaaaagaggtgaaaaactatcaagggtatatgaatattcgttctccattgttagataccattcagcctgctcgctatgttgtaggagtggggtacgatcagccagatgaaaaatggggcgtgaatctaacaatgacacactccagtggaaaaaatccaaatgagttaagaggtaatgaacaagtcggttttgccaattatgagcgaactgccacgaagaaaagaacacgttcttggcatacctttgacttaacgggatatatcaccccttggaaacatacaacggtacgagctggcgtatataacctgatgaattatcgttacaccacttgggaatccgtacgtcaatcttcgcttaatgcaattcatcagcatactaacgtaaaagactatgcaaggtatgcagcgcccggtagaaattatgttgtttcattcgaaatgaaattctaa
SEQ ID NO：30—胸膜肺炎放线杆菌ApfA
MKLSRIALATMLVAAPLAAANAFTLIELMIVIAIIAILATVAIPSYNSYTQKAALSELLAASASYKTDVEICIYNTGDSKNCSGGQNGVRKMTELRQAKYLNAITVEGGTITVTGKGNLQEYGYTMTPIHNGSTISWETKCKGEDLSLFPANFCAIN
*粗体表示鲍曼不动杆菌信号肽
SEQ ID NO：30的核苷酸序列
atgaaattgagtcgtattgcacttgctactatgcttgttgctgctccattagctgctgctaatgcttttactttaattgaattgatgatcgtgattgcgattattgccattttagctacggttgcaattccgtcatataacagttatacccaaaaagcggcgctttcggagctattggcggcatcggcttcttataaaacggatgtcgagatctgcatatataacaccggagattctaaaaactgtagcggcggtcaaaacggtgtcagaaaaatgacggagcttagacaggctaaatatttaaatgccattacggtggaaggcggaacgattacggtaacggggaaggggaatctgcaggaatacggttatacgatgacaccgattcataacggtagcactatttcttgggaaacgaaatgtaaaggggaggacttaagtttatttccggcaaatttctgtgcgataaattag
SEQ ID NO：31—肺炎克雷伯菌OmpA
GGKLGWSQYHDTGFYGNGFQNNNGPTRNDQLGAGAFGGYQVNPYLGFEMGYDWLGRMAYKGSVDNGAFKAQGVQLTAKLGYPITDDLDIYTRLGGMVWRADSKGNYASTGVSRSEHDTGVSPVFAGGVEWAVTRDIATRLEYQWVNNIGDAGTVGTRPDNGMLSLGVSYRFGQEDAAPVVAPAPAPAPEVATKHFTLKSD VLFNFNKATLKPEGQQALDQLYTQLSNMDPKDGSAVVLGYTDRIGSEAYNQQLSEKRAQSVVDYLVAKGIPAGKISARGMGESNPVTGNTCDNVKARAALIDCLAPDRRVEIEVKGYKEVVTQPQA
SEQ ID NO：31的核苷酸序列
ggtggtaaactgggttggtcccagtatcacgacaccggtttctacggtaacggtttccagaacaacaacggtccgacccgtaacgatcagcttggtgctggtgcgttcggtggttaccaggttaacccgtacctcggtttcgaaatgggttatgactggctgggccgtatggcatataaaggcagcgttgacaacggtgctttcaaagctcagggcgttcagctgaccgctaaactgggttacccgatcactgacgatctggacatctacacccgtctgggcggcatggtttggcgcgctgactccaaaggcaactacgcttctaccggcgtttcccgtagcgaacacgacactggcgtttccccagtatttgctggcggcgtagagtgggctgttactcgtgacatcgctacccgtctggaataccagtgggttaacaacatcggcgacgcgggcactgtgggtacccgtcctgataacggcatgctgagcctgggcgtttcctaccgcttcggtcaggaagatgctgcaccggttgttgctccggctccggctccggctccggaagtggctaccaagcacttcaccctgaagtctgacgttctgttcaacttcaacaaagctaccctgaaaccggaaggtcagcaggctctggatcagctgtacactcagctgagcaacatggaCccgaaagacggttccgctgttgttctgggctacaccgaccgcatcggttccgaagcttacaaccagcagctgtctgagaaacgtgctcagtccgttgttgactacctggttgctaaaggcatcccggctggcaaaatctccgctcgcggcatgggtgaatccaacccggttactggcaacacctgtgacaacgtgaaagctcgcgctgccctgatcgattgcctggctccggatcgtcgtgtagagatcgaagttaaaggctacaaagaagttgtaactcagccgcaggcttaa
SEQ ID NO：32—肺炎克雷伯菌OmpK36
AEIYNKDGNKLDLYGKIDGLHYFSDDKSVDGDQTYMRVGVKGETQINDQLTGYGQWEYNVQANNTESSSDQAWTRLAFAGLKFGDAGSFDYGRNYGVVYDVTSWTDVLPEFGGDTYGSDNFLQSRANGVATYRNSDFFGLVDGLNFALQYQGKNGSVSGEGALSPTNNGRTALKQNGDGYGTSLTYDIYDGISAGFAYSNSKRLGDQNSKLALGRGDNAETYTGGLKYDANNIYLATQYTQTYNATRAGSLGFANKAQNFEVVAQYQFDFGLRPSVAYLQSKGKDLEGYGDQDILKYVDVGATYYFNKNMSTYVDYKINLLDDNSFTHNAGISTDDVVALGLVYQF
SEQ ID NO：32的核苷酸序列
gctgaaatttataacaaagacggcaacaaattagacctgtacggtaaaattgacggtctgcactacttctctgacgacaagagcgtcgacggcgaccagacctacatgcgtgtaggcgtgaaaggcgaaacccagatcaacgaccagctgaccggttacggccagtgggaatacaacgttcaggcgaacaacactgaaagctccagcgatcaggcatggactcgtctggcattcgcaggcctgaaatttggcgacgcgggctctttcgactacggtcgtaactacggcgtagtatacgacgtaacgtcctggaccgacgttctgccggaattcggcggcgacacctacggttctgacaacttcctgcagtcccgtgctaacggcgttgcaacctaccgtaactctgatttcttcggtctggttgacggcctgaactttgctctgcagtatcagggtaaaaacggcagcgtcagcggcgaaggcgctctgtctcctaccaacaacggtcgtaccgccttgaaacagaacggcgacggttacggtacttctctgacctatgacatctatgatggcatcagcgctggtttcgcatactctaactccaaacgtcttggcgaccagaacagcaagctggcactgggtcgtggcgacaacgctgaaacctacaccggcggtctgaaatacgacgcgaacaacatctacctggccactcagtacacccagacctacaacgcgacccgcgccggttccctgggctttgctaacaaagcgcagaacttcgaagtggttgctcagtaccagttcgacttcggtctgcgtccgtccgtggcttacctgcagtctaaaggtaaggatctggaaggctacggcgaccaggacatcctgaaatatgttgacgttggcgcgacctactacttcaacaaaaacatgtccacctatgttgactacaaaatcaacctgctggacgacaatagcttcacccacaacgccggtatctctaccgacgacgtggttgcactgggcctggtttaccagttctaa
SEQ ID NO：33—铜绿假单胞菌OprF
QGQNSVEIEAFGKRYFTDSVRNMKNADLYGGSIGYFLTDDVELALSYGEYHDVRGTYETGNKKVHGNLTSLDAIYHFGTPGVGLRPYVSAGLAHQNITNINSDSQGRQQMTMANIGAGLKYYFTENFFAKASLDGQYGLEKRDNGHQGEWMAGLGVGFNFGGSKAAPAPEPVADVCSDSDNDGVCDNVDKCPDTPANVTVDANGCPAVAEVVRVQLDVKFDFDKSKVKENSYADIKNLADFMKQYPSTSTTVEGHTDSVGTDAYNQKLSERRANAVRDVLVNEYGVEGGRVNAVGYGESRPVADNATAEGRAINRRVEAEVEAEAK
SEQ ID NO：33的核苷酸序列
cagggccagaactcggtagagatcgaagccttcggcaagcgctacttcaccgacagcgttcgcaacatgaagaacgcggacctgtacggcggctcgatcg gttacttcctgaccgacgacgtcgagctggcgctgtcctacggtgagtaccatgacgttcgtggcacctacgaaaccggcaacaagaaggtccacggcaacctgacctccctggacgccatctaccacttcggtaccccgggcgtaggtctgcgtccgtacgtgtcggctggtctggctcaccagaacatcaccaacatcaacagcgacagccaaggccgtcagcagatgaccatggccaacatcggcgctggtctgaagtactacttcaccgagaacttcttcgccaaggccagcctcgacggccagtacggtctggagaagcgtgacaacggtcaccagggcgagtggatggctggcctgggcgtcggcttcaacttcggtggttcgaaagccgctccggctccggaaccggttgccgacgtttgctccgactccgacaacgacggcgtttgcgacaacgtcgacaagtgcccggataccccggccaacgtcaccgttgacgccaacggctgcccggctgtcgccgaagtcgtacgcgtacagctggacgtgaagttcgacttcgacaagtccaaggtcaaagagaacagctacgctgacatcaagaacctggctgacttcatgaagcagtacccgtccacttccaccaccgttgaaggtcacaccgactccgtcggcaccgacgcttacaaccagaagctgtccgagcgtcgtgccaacgccgttcgtgacgtactggtcaacgagtacggtgtagaaggtggtcgcgtgaacgctgttggttacggcgagtcccgcccggttgccgacaacgccaccgctgaaggccgcgctatcaaccgtcgcgttgaagccgaagtagaagctgaagccaagtaa
SEQ ID NO：34—铜绿假单胞菌OprI::PcrV融合蛋白
SHSKETEARLTATEDAAARAQARADEAYRKADEALGAAQKAQQTADEANERALRMLEKASRKGGGGSGG GGSGGGGSSAAPASAEQEELLALLRSERIVLAHAGQPLSEAQVLKALAWLLAANPSAPPGQGLEVLREVLQARRQPGAQWDLREFLVSAYFSLHGRLDEDVIGVYKDVLQTQDGKRKALLDELKALTAELKVYSVIQSQINAALSAKQGIRIDAGGIDLVDPTLYGYAVGDPRWKDSPEYALLSNLDTFSGKLSIKDFLSGSPKQSGELKGLSDEYPFEKDNNPVGNFATTVSDRSRPLNDKVNEKTTLLNDTSSRYNSAVEALNRFIQKYDSVLRDILSAI
SEQ ID NO：34的核苷酸序列
agccactccaaagaaaccgaagctcgtctgaccgctaccgaagacgcagctgctcgtgctcaggctcgcgctgacgaagcctatcgcaaggctgacgaagctctgggcgctgctcagaaagctcagcagactgctgacgaggctaacgagcgtgccctgcgcatgctggaaaaagccagccgcaagggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcg gcggcggcagctcggcggcgcctgccagtgccgagcaggaggaactgctggccctgttgcgcagcgagcggatcgtgctggcccacgccggccagccgctgagcgaggcgcaagtgctcaaggcgctcgcctggttgctcgcggccaatccgtccgcgcctccggggcagggcctcgaggtactccgcgaagtcctgcaggcacgtcggcagcccggtgcgcagtgggatctgcgcgagttcctggtgtcggcctatttcagcctgcacgggcgtctcgacgaggatgtcatcggtgtctacaaggatgtcctgcagacccaggacggcaagcgcaaggcgctgctcgacgagctgaaggcgctgaccgcggagttgaaggtctacagcgtgatccagtcgcagatcaacgccgcgctgtcggccaagcagggcatcaggatcgacgctggcggtatcgatctggtcgaccccacgctatatggctatgccgtcggcgatcccaggtggaaggacagccccgagtatgcgctgctgagcaatctggataccttcagcggcaagctgtcgatcaaggattttctcagcggctcgccgaagcagagcggggaactcaagggcctcagcgatgagtaccccttcgagaaggacaacaacccggtcggcaatttcgccaccacggtgagcgaccgctcgcgtccgctgaacgacaaggtcaacgagaagaccaccctgctcaacgacaccagctcccgctacaactcggcggtcgaggcgctcaaccgcttcatccagaaatacgacagcgtcctgcgcgacattctcagcgcgatctag
SEQ ID NO：35—铜绿假单胞菌OprI
SHSKETEARLTATEDAAARAQARADEAYRKADEALGAAQKAQQTADEANERALRMLEKASRK
SEQ ID NO：35的核苷酸序列
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SEQ ID NO：36—大肠杆菌OmpA
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SEQ ID NO：36的核苷酸序列
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SEQ ID NO：37—大肠杆菌OmpX
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SEQ ID NO：37的核苷酸序列
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SEQ ID NO：38—大肠杆菌FyuA
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SEQ ID NO：38的核苷酸序列
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SEQ ID NO：39—大肠杆菌Hma
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SEQ ID NO：39的核苷酸序列
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SEQ ID NO：40—大肠杆菌IutA
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SEQ ID NO：40的核苷酸序列
cagcaaaacgatgataatgagatcatagtgtctgccagccgcagcaatcgaactgtagcggagatggcgcaaaccacctgggttatcgaaaatgccgaactggagcagcagattcagggcggtaaagagctgaaagacgcactggctcagttaatccccggccttgatgtcagcagccagagccgaaccaactacggtatgaacatgcgtggccgcccgctggttgtcctgattgacggtgtgcgcctcaactcttcacgttccgacagccgacaactggactctgtcgatccttttaatatcgaccatattgaagtgatctccggcgcgacggccctgtacggtggcgggagtaccggagggttgatcaacatcgtgaccaaaaaaggccagccggaaaccatgatggagtttgaggctggcacaaaaagtggctttaacagcagtaaagatcacgatgagcgcattgccggtgctgtctccggcggaaatgaccatatctccggacgtctttccgtggcatatcagaaatttggcggctggtttgacggtaacggcgatgccaccctgcttgataacacccagaccggcctgcagcactccaatcggctggacatcatgggaaccggtacgctgaacatcgatgaatcccggcagcttcaactgataacgcagtactataaaagtcagggggacgacaattacgggcttaatctcgggaaaggcttttccgccatcagcgggagcagcacaccatacgtcagtaaggggctgaattctgaccgcattcccggcactgagcggcatttgatcagcctgcagtactctgacagtgatttcctgagacaggaactggtcggtcaggtttactaccgcgatgagtcgttgcggttctacccgttcccgacggtaaatgcgaataaacaggcgacggctttctcctcgtcacagcaggataccgaccagtacggcatgaaactgactctgaacagccaacttatggacggctggcaaatcacctgggggctggatgctgagcatgagcgctttacctccaaccagatgttcttcgatctggctcaggcaagtgcttccggagggctgaacaaccataagatttacaccaccgggcgctatccgtcatatgacatcaccaatctggcggccttcctgcaatccagctatgacattaatgatatttttaccgttagcggtggcgtacgctatcagtatactgagaacagggtagatgatttcatcgactacacgcagcaacagaagattgctgccgggaaggcgatatctgccgacgccattcctggtggttcggtagattacgataactttctgttcaatgctggtctgctgatgcacatcaccgaacgtcagcaggcatggttcaatttttcccagggggtggcattgccggatccggggaaatattatggtcgcggcatctatggtgcagcagtgaacggccatcttcccctgacaaagagcgtgaacgtcagcgacagtaagctggaaggcgtgaaagtcgattcttatgaactgggctggcgctttaccggtgacaacctgcggactcaaatcgcggcatattactcgctttccaataagagcgtggaaaggaataaagatctgaccatcagtgtgaaggacgacaggcgccgtatttacggcgtggaaggtgcggtggactacctgatcccggatactgactggagtaccggtgtgaacttcaatgtgctgaaaaccgagtcgaaagtgaacggtcaatggcaaaaatatgacgtgaaggaatcaagtccatcgaaagcgacagcttacattaactgggcgccggaaccgtggagtctgcgtgtacagagcaccacttctttcgacgtaagcgatgcagagggtaacgatattaatggttacactaccgtcgattttatcagtagttggcagcttccggtgggaacactcagcttcagcgttgagaacctcttcgaccgtgactataccactgtctggggacagcgtgcacctctgtactacagcccgggttacggccctgcttcactgtacgactacaaaggccggggccgaacctttggtctgaactactcagtgctgttctga
SEQ ID NO：41—胸膜肺炎放线杆菌OmpA
AAPQQNTFYAGAKAGWASFHDGIEQLDSAKNTDRGTKYGINRNSVTYGVFGGYQILNQDKLGLAAELGYDYFGRVRGSEKPNGKADKKTFRHAAHGATIALKPSYEVLPDLDVYGKVGIALVNNTYKTFNAAQEKVKTRRFQSSLILGAGVEYAILPELAARVEYQWLNNAGKASYSTLNRMGATDYRSDISSVSAGLSYRFGQGAVPVAAPAVETKNFAFSSDVLFAFGKSNLKPAAATALDAMQTEINNAGLSNAAIQVNGYTDRIGKEASNLKLSQRRAETVANYIVSKGALAANVTAVGYGEANPVTGATCDKVKGRKALIACLAPDRRVEVQVQGTKEVTM
SEQ ID NO：41的核苷酸序列
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SEQ ID NO：42—胸膜肺炎放线杆菌OmpW
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SEQ ID NO：42的核苷酸序列
gcacatcaagcgggcgatgtgattttccgtgccggtgcgatcggtgtgattgcaaattcaagttcggattatcaaaccggggcggacgtaaacttagatgtaaataataatattcagcttggtttaaccggtacctatatgttaagtgataatttaggtcttgaattattagcggcaacaccgttttctcacaaaatcaccggtaagttaggtgcaacagatttaggcgaagtggcaaaagtaaaacatcttccgccgagcctttacttacaatattatttctttgattctaatgcgacagttcgtccatacgttggtgccggtttaaactatactcgctttttcagtgctgaaagtttaaaaccgcaattagtacaaaacttacgtgttaaaaaacattccgtcgcaccgattgcgaatttaggtgttgatgtgaaattaacggataatctatcattcaatgcggcagcttggtacacacgtattaaaactactgccgattatgatgttccgggattaggtcatgtaagtacaccgattactttagatcctgttgtattattctcaggtattagctacaaattctaa
SEQ ID NO：43—胸膜肺炎放线杆菌TbpA
AEQAVQLNDVYVTGTKKKAHKKENEVTGLGKVVKTPDTLSKEQVLGIRDLTRYDPGISVVEQGRGATTGYSIRGVDRNRVGLALDGLPQIQSYVSQYSRSSSGAINEIEYENLRSIQISKGASSSEFGSGSLGGSVQFRTKEVSDIIKPGQSWGLDTKSAYSSKNQQWLNSLAFAGTHNGFDALVIYTHRDGKETKAHKNAESRSQNITRVGVETNELDTSNRYTATTNNQHTYGWFLIKDECPTLDCTPKQMARVTKDTPSFRSYPEYTPEEKQAYENQKHITERLNAQDYTGEYRALPDPLKYKSDSWLVKLGYTFSPKHYVAGTYEHSKQRYDTRDMTYTAYWQPSDLLRTGRNWYPMNNAKGLYRDNALDGVAIDYFTEDGVKSSKGLRWAKARFIDEWHTRDRLGALYRYTNQDGNRLIDRLSLSFDQQKINLSTRLRENNCSEYPTIDKNCRATLDKLWSSTKNEQSSYEEKHDTIQLSLDKTVQTGLGKHQLNMLLGSDRFNSTLKRHEILSEFSVGSWGLVRDIGYRNGSYNNPYVYELKDQAIYSKNECDYSGTIAGRADCATSKIKGHNHYIALRDNFAITKYLDIGLGYRFDKHKFRSTHRWANQGDYKNSAWNIGIVAKPTSFLSLSYRASSGFRVPSFQELFGLRYDGAMKGSSDAYQKTEKLSPEKSLNQEVAATFKGDF GVVEVSYFKNDYKQLIAPAERMHQTQSMINYFNVQDIKLDGINLIGKLDWNGVFDKIPEGIYTTLAYSKMRVKEVKNYQGYMNIRSPLLDTIQPARYVVGVGYDQPDEKWGVNLTMTHSSGKNPNELRGNEQVGFANYERTATKKRTRSWHTFDLTGYITPWKHTTVRAGVYNLMNYRYTTWESVRQSSLNAIHQHTNVKDYARYAAPGRNYVVSFEMKF
SEQ ID NO：43的核苷酸序列
gcagaacaagcggtgcaattgaacgatgtttatgtcacaggaacaaaaaagaaagcacataaaaaagagaacgaagtcacaggcttagggaaagtagttaaaacaccagatactcttagtaaggagcaagtgttaggaatacgagatctgactcgttacgaccccggtatttctgtcgtagaacaagggagaggtgcgactacaggctactcaattcgtggggtagatcgtaaccgtgttggcttggcattagatggtttaccacagattcagtcctatgtaagccagtattcacgttcctcaagcggtgccattaatgaaatagaatacgaaaatctgcgttcgatccaaattagtaaaggggctagttcttctgagtttggtagtggctcactaggcggttcggtgcaattccgtaccaaagaggtaagcgacattattaagccagggcaatcttggggattagataccaaaagtgcctacagtagcaaaaatcaacaatggttaaactcacttgcttttgctggtactcacaatggctttgatgctcttgtgatttacactcaccgtgatggtaaggaaacgaaagctcataaaaatgcagagagtcgttctcagaatatcacccgagtaggagtggaaaccaacgagcttgatacctcaaatagatatactgcgacgacgaataatcaacatacttatggctggtttttgattaaagatgaatgtccaacgttagattgtacgccgaaacagatggctagggtgacaaaagatacgccatctttccgttcttaccctgaatatactcctgaggaaaaacaggcttatgagaaccaaaaacatattacagagcgtctaaatgctcaggattacactggtgaatatagagctttacctgatccgcttaaatataaatctgattcttggctggttaaattaggatacacattctctccgaaacattatgtcgctggtacttatgaacatagcaaacagcgttacgacacccgagatatgacctataccgcttattggcaaccatcggatttacttagaactggtagaaattggtatccaatgaataatgctaaaggattatatcgtgataatgctttagatggtgttgctattgactactttacggaagatggtgtgaaatcctcaaaaggtttacgttgggcaaaagctcgttttattgacgagtggcacactcgtgatcgcttaggtgctttatatcgttatactaatcaagatggaaatcgtctgattgatagactatccttgagtttcgatcagcaaaaaattaatttatctacccgcttgagagaaaacaactgttcggaatatccaaccatagataagaattgccgtgcaactcttgataaactttggtcttctactaaaaatgagcaaagttcttatgaagaaaaacacgacactattcagctctcgttagataaaaccgtacaaacgggattgggtaaacatcaattaaatatgttattaggttcagaccgtttcaattccaccttaaaacgccatgaaattttgagtgaattttctgtagggagttgggggcttgttagagacattggctatcgaaatggatcttacaataatccttatgtgtatgagctaaaagatcaggcaatttatagtaaaaatgaatgtgattatagtggcactattgcaggtagggctgattgtgctacaagtaaaatcaaagggcataatcactacatcgctctgagagataattttgccataaccaagtatttggatattggtttgggttaccgtttcgataagcataaattccgtagcactcatcgctgggcaaatcaaggcgattataaaaatagtgcgtggaatattggcatagtcgcaaaaccaacgtcattcctatcgctctcttatcgagcatcatctggctttagagtgccaagtttccaagagctatttggcttacgttatgatggtgcaatgaaaggctccagcgatgcttaccaaaaaacagagaagttatctcctgaaaaatccttaaaccaagaggttgctgcgactttcaaaggtgattttggtgtcgttgaagtcagttatttcaaaaatgactataagcagttaattgctccagcagaaagaatgcaccaaactcaatcaatgattaactattttaatgtgcaagatattaaattggacggcattaatcttattggtaagctagattggaatggggtatttgataaaattcctgagggcatttacacaacattggcttatagcaaaatgcgagtaaaagaggtgaaaaactatcaagggtatatgaatattcgttctccattgttagataccattcagcctgctcgctatgttgtaggagtggggtacgatcagccagatgaaaaatggggcgtgaatctaacaatgacacactccagtggaaaaaatccaaatgagttaagaggtaatgaacaagtcggttttgccaattatgagcgaactgccacgaagaaaagaacacgttcttggcatacctttgacttaacgggatatatcaccccttggaaacatacaacggtacgagctggcgtatataacctgatgaattatcgttacaccacttgggaatccgtacgtcaatcttcgcttaatgcaattcatcagcatactaacgtaaaagactatgcaaggtatgcagcgcccggtagaaattatgttgtttcattcgaaatgaaattctaa
SEQ ID NO：44—胸膜肺炎放线杆菌ApfA
FTLIELMIVIAIIAILATVAIPSYNSYTQKAALSELLAASASYKTDVEICIYNTGDSKNCSGGQNGVRKMTELRQAKYLNAITVEGGTITVTGKGNLQEYGYTMTPIHNGSTISWETKCKGEDLSLFPANFCAIN
SEQ ID NO：44的核苷酸序列
tttactttaattgaattgatgatcgtgattgcgattattgccattttagctacggttgcaattccgtcatataacagttatacccaaaaagcggcgctttcggagctattggcggcatcggcttcttataaaacggatgtcgagatctgcatatataacaccggagattctaaaaactgtagcggcggtcaaaacggtgtcagaaaaatgacggagcttagacaggctaaatatttaaatgccattacggtggaaggcggaacgattacggtaacggggaaggggaatctgcaggaatacggttatacgatgacaccgattcataacggtagcactatttcttgggaaacgaaatgtaaaggggaggacttaagtttatttccggcaaatttctgtgcgataaattag
SEQ ID NO：45—铜绿假单胞菌PcrV
AAPASAEQEELLALLRSERIVLAHAGQPLSEAQVLKALAWLLAANPSAPPGQGLEVLREVLQARRQPGAQWDLREFLVSAYFSLHGRLDEDVIGVYKDVLQTQDGKRKALLDELKALTAELKVYSVIQSQINAALSAKQGIRIDAGGIDLVDPTLYGYAVGDPRWKDSPEYALLSNLDTFSGKLSIKDFLSGSPKQSGELKGLSDEYPFEKDNNPVGNFATTVSDRSRPLNDKVNEKTTLLNDTSSRYNSAVEALNRFIQKYDSVLRDILSAI
SEQ ID NO：45的核苷酸序列
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在本发明的第一方面的另一个实施方式中，在缺乏脂多糖(LPS)的鲍曼不动杆菌菌株的外膜上表达的异源抗原至少衍生自肺炎克雷伯菌并且选自由Kp-OmpA和/或Kp-OmpK36和/或其任何一致序列组成的列表(如本发明所教导的)；和/或衍生自铜绿假单胞菌并且选自由Pa-OprF和/或Pa-OprI、和/或融合蛋白Pa-OprI::PcrV、和/或其任何一致序列组成的列表(如本发明所教导的)；和/或衍生自大肠杆菌并且选自由Ec-OmpA和/或Ec-OmpX和/或Ec-FuyA和/或Ec-Hma和/或Ec-IutA，和/或其任何一致序列组成的列表(如本发明所教导的)；和/或衍生自胸膜肺炎放线杆菌并且选自由Ap-OmpA和/或Ap-OmpW和/或Ap-TbpA和/或Ap-ApfA，和/或其任何一致序列组成的列表(如本发明所教导的)，并且优选地，所述缺乏脂多糖(LPS)的鲍曼不动杆菌菌株还包含鲍曼不动杆菌抗原Ab-OmpA和Ab-Omp22的表达。
在本发明的第一方面的另一个实施方式中，缺乏脂多糖(LPS)的鲍曼不动杆菌菌株的特征在于选自由lpxA、lpxC和lpxD组成的列表中的基因部分或完全失活。
本发明的第二方面涉及一种组合物(下文称为本发明的组合物)，其包含如本发明的第一方面或其任何优选实施方式中所定义的在其外膜表达来自一种或多种微生物的一个或多个拷贝抗原性外膜异源蛋白的缺乏脂多糖(LPS)的鲍曼不动杆菌菌株。
优选地，本发明的组合物是药物组合物，其可选地包含可接受的药物溶媒、载体和/或赋形剂。更优选地，本发明的组合物是疫苗制剂，其可选地包含佐剂。优选地，所述组合物或疫苗制剂包含约106至约1012个如本发明的第一方面或其任何优选实施方式中所定义的在其外膜表达来自一种或多种微生物的一个或多个拷贝抗原性外膜异源蛋白的缺乏脂多糖(LPS)的鲍曼不动杆菌菌株，并且优选包含约109个此种菌株。同样优选地，如果疫苗制剂中存在佐剂，则佐剂优选为Al(OH)3。进一步优选地，组合物中(优选疫苗制剂中)存在的缺乏脂多糖(LPS)的鲍曼不动杆菌菌株是灭活的。尽管如此，获得有效治疗量的剂量取决于多种因素，例如哺乳动物的年龄、体重、性别、耐受性等。如本说明书中所用，任何治疗量均应是有效的，因此应指产生所需效果的不动杆菌属灭活细胞的量，并且通常由所需的治疗效果决定。
术语“赋形剂”是指有助于本发明药物的组合物要素吸收、稳定所述要素、激活或帮助药物的制备从而提供稠度或使其更适口的风味的物质。赋形剂可以将成分保持在一起，例如淀粉、糖、纤维素、甜味剂、着色剂的情况下，保护药物的功能，例如将其与空气和/或湿气隔离，填充药丸、胶囊或任何其他形式的药物的功能，例如磷酸氢钙的情况下，促进组分溶解及其在肠道中的吸收的功能，但不排除本段中描述的其他类型的赋形剂。
溶媒与赋形剂一样，是用于药物中将本发明的任何组分稀释至所需体积或重量的物质。药学上可接受的溶媒是惰性物质或与本发明的任何要素具有相似作用的物质。溶媒的功能是促进其他要素的结合，允许更好的给药和施用，并赋予药物稠度和形态。当呈现形式为液体时，药学上可接受的溶媒是稀释剂。
本发明组合物中可使用的佐剂和药学上可接受的溶媒是本领域技术人员已知的那些溶媒。在本发明中，术语“佐剂”是指任何本身不具有抗原活性的物质，其可用于刺激免疫系统以增加对疫苗的反应。佐剂有很多，例如但不限于磷酸铝、氢氧化铝、Toll样受体激动剂、细胞因子、角鲨碱、弗氏不完全佐剂和弗氏完全佐剂。在本发明该方面的优选形式中，佐剂选自由以下组成的列表：磷酸铝、氢氧化铝、Toll样受体激动剂、细胞因子、角鲨碱、皂苷、弗氏不完全佐剂和弗氏完全佐剂。
在本发明的上下文中，术语“疫苗”是指用于诱导针对疾病的免疫反应的抗原制剂。它们由抗原制备而成，一旦进入宿主体内，就会通过产生抗体激发免疫反应，并产生免疫记忆，从而产生短暂或永久的免疫力。
制造本发明的疫苗制剂可以，但不限于通过两步发酵过程和随后的热灭活来实现。疫苗制剂应优选为无菌、冻干疫苗制剂的形式。一旦与赋形剂和佐剂一起配制，就应对最终产品进行冻干。基于LPS无效鲍曼不动杆菌细胞技术的疫苗制剂优选不进行过滤或高压灭菌来获得无菌。细胞通常在发酵后、配制最终产品之前的制造药物物质的最后一步中被灭活。灭活方法应优选基于温和的热灭活方案(75℃，30分钟)，以保持全细胞、多抗原活性成分的效力。
第三方面涉及如本发明的第一方面或其任何优选实施方式中所定义的在其外膜表达来自一种或多种微生物的一个或多个拷贝抗原性外膜异源蛋白的缺乏脂多糖(LPS)的鲍曼不动杆菌菌株或本发明第二方面的组合物用作药物或用于治疗。更优选地，用作诱导针对由原始表达一个或多个拷贝抗原性外膜蛋白的的任何微生物引起的疾病的免疫应答的疫苗。
本报告中使用的术语“药物”是指用于预防、缓解、治疗或治愈人类或动物疾病的任何物质。
在第四方面，使用本发明第一方面或其任何优选实施方式的缺乏脂多糖(LPS)的鲍曼不动杆菌菌株或本发明第二方面或其任何优选实施方式的组合物用于递送细菌外膜抗原至有需要的对象(优选人类对象)，以使所述对象对包含、携带或表达所述抗原的任何传染病免疫。在优选实施方式中，使用本发明第一方面或其任何优选实施方式的缺乏脂多糖(LPS)的鲍曼不动杆菌菌株或本发明第二方面或其任何优选实施方式的组合物用于递送细菌外膜抗原，以在有需要的对象中诱导针对肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌和/或胸膜肺炎放线杆菌和可选的鲍曼不动杆菌的免疫应答。在优选实施方式中，使用本发明第一方面或其任何优选实施方式的缺乏脂多糖(LPS)的鲍曼不动杆菌菌株或本发明第二方面或其任何优选实施方式的组合物用于递送细菌外膜抗原，以预防、改善或治疗由肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌和/或胸膜肺炎放线杆菌和可选的鲍曼不动杆菌引起的感染。优选地，对于任何这些目的，在缺乏脂多糖(LPS)的鲍曼不动杆菌菌株的外膜处表达的异源抗原至少衍生自本发明通篇所示的肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌和胸膜肺炎放线杆菌，例如但不限于：对于肺炎克雷伯菌，选自由Kp-OmpA和/或Kp-OmpK36组成的列表的那些；对于铜绿假单胞菌，选自由Pa-OprF和/或Pa-OprI和/或融合蛋白Pa-OprI::PcrV组成的列表的那些；对于大肠杆菌，选自由Ec-OmpA和/或Ec-OmpX和/或Ec-FuyA和/或Ec-Hma和/或Ec-IutA组成的列表的那些；以及对于胸膜肺炎放线杆菌，选自由Ap-OmpA和/或Ap-OmpW和/或Ap-TbpA和/或Ap-ApfA组成的列表的那些；并且优选地，缺乏脂多糖(LPS)的鲍曼不动杆菌菌株还包含鲍曼不动杆菌抗原Ab-OmpA和/或Ab-Omp22的表达。
本发明的药物和组合物可以单独使用或者与其他药物或活性成分或组合物组合使用，以用于治疗由不动杆菌属生物产生的疾病。
本文所用的术语“活性成分”是指在疾病的诊断、治愈、缓解、治疗或预防中可能提供药理活性或其他不同效果或影响人体或动物体结构或功能的任何成分。该术语包括在药物加工过程中促进化学变化并以提供特定活性或效果的相同形式和修饰形式存在的那些组分。
“肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌和/或胸膜肺炎放线杆菌和可选的鲍曼不动杆菌引起的感染”应理解为其中病理学致病因子是肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌和/或胸膜肺炎放线杆菌和/或鲍曼不动杆菌中的任一种的那些疾病。不动杆菌属产生多样病症，例如但不限于菌血症、脑膜炎、尿路感染、皮肤和软组织感染、手术部位感染和肺炎。由于这些原因，更优选的形式之一是由不动杆菌属生物体产生的疾病选自由菌血症、脑膜炎、尿路感染、皮肤和软组织感染、手术部位感染和肺炎组成的列表。
本发明的第五方面涉及一种抗体或其活性片段，其可通过用本发明第一或第二方面的组合物对哺乳动物进行免疫而获得，优选地，所述抗体或活性片段由组合物组成，其中优选地，所述组合物是药物组合物，并且所述药物组合物用作疗法，特别是用于治疗由肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌和/或胸膜肺炎放线杆菌和可选的鲍曼不动杆菌引起的感染的疗法。
根据本发明的能够呈递异源外膜抗原的LPS无效不动杆菌细胞的制备方法
该具体部分包括制备根据本发明的第一方面或其任何优选实施方式的鲍曼不动杆菌菌株的方法的非限制性示例。
第一，鲍曼不动杆菌细胞用包含用于促进在目标靶基因座重组到鲍曼不动杆菌基因组中的序列的运载体(优选自杀运载体)转化，这种基因座是鲍曼不动杆菌的包含适合进行重组的序列的任何基因座。例如，通过重组整合插入物的合适基因座可能是：cysI、trpE、lpxA、lpxC、lpxD、lpxB、lpxK、lpxL、lpxM和/或Tn5/Tn7位点。在本发明的优选实施方式中，合适的基因座是cysI。cysI基因座包含编码基因cysIORF，其包含1,644个nt的ORF，该ORF编码对于氨基酸半胱氨酸的生物合成至关重要的547个氨基酸的蛋白。在另一个优选实施方式中，合适的基因座是lpxA，其含有编码酰基转移酶LpxA的ORF，酰基转移酶LpxA是脂多糖生物合成途径中的第一个酶。
用于促进重组的运载体序列位于表达构建体的侧翼，该表达构建体包含至少一个或多个转录启动子序列、一个或多个编码对鲍曼不动杆菌而言异源的蛋白的ORF、以及一个或多个转录终止序列。启动子序列可以是现有技术中能够促进鲍曼不动杆菌细胞中转录的任何已知序列。这些启动子序列是常规用于细菌学研究的。在本发明的一个优选实施方式中，所使用的启动子序列是位于编码外膜蛋白OmpA的鲍曼不动杆菌ORF上游的启动子序列。表达构建体可能包含几个串联的ORF，每个ORF侧翼各自有启动子和终止子、转录终止子、ORF的上游和下游序列，因此构建为允许每个ORF受特定启动子控制独立表达。可替代地，表达构建体可以在操纵子样结构内具有一个或多个ORF，并由共同启动子控制多顺反子式表达。表达运载体的ORF编码通过其免疫原性特性选择的OMP蛋白或肽，这些OMP蛋白或肽衍生自不同于鲍曼不动杆菌的已知人类或动物病原体，并且其在鲍曼不动杆菌细胞中的表达旨在引起接种鲍曼不动杆菌细胞的人或动物对不同于鲍曼不动杆菌的病原体的免疫反应。本发明的技术基于在每个ORF的上游部分使用用于编码的蛋白的翻译后加工、特别是用于促进编码的蛋白在鲍曼不动杆菌细胞外膜上的定位的信号序列。能够促进表达的蛋白在鲍曼不动杆菌细胞外膜上定位的信号序列的性质是本领域众所周知的。在本发明的优选实施方式中，使用鲍曼不动杆菌外膜蛋白OmpA的信号序列来促进编码的蛋白在鲍曼不动杆菌外膜上的定位。本领域还众所周知，任何具有跨膜结构域的OMP蛋白，即使来自任何不同于鲍曼不动杆菌的其他细菌细胞，当表达为在N末端处包含鲍曼不动杆菌的信号序列的融合蛋白时，都会被鲍曼不动杆菌细胞加工以整合到鲍曼不动杆菌细胞的外膜中。因此，本发明开发的技术可应用于来自细菌细胞、特别是来自具有众所周知的OMP跨膜结构域的革兰氏阴性菌细胞的任何OMP蛋白，而与在鲍曼不动杆菌细胞中表达的所选OMP蛋白的其余结构域的性质无关。
前述的所选择的在鲍曼不动杆菌细胞中表达的异源OMP蛋白必须是衍生自任何已知细菌病原体的具有用于插入细菌外膜的OMP跨膜结构域的OMP蛋白。这些OMP蛋白的性质是本领域众所周知的。外膜保护革兰氏阴性菌免受恶劣环境的影响。同时，嵌入的蛋白质完成对细菌细胞至关重要的几项任务，例如溶质和蛋白质易位以及信号转导。与所有其他来源的膜蛋白不同，整合OMP蛋白不由跨膜α螺旋组成，而是折叠成反向平行的β桶。它们包括OmpA膜结构域、OmpX蛋白、磷脂酶A、一般孔蛋白、底物特异性孔蛋白和铁载体转运蛋白。本领域中还已知这些OMP蛋白定位于细菌病原体外表面赋予了它们免疫原性。本领域众所周知，被细菌病原体感染的人的血清主导性地识别从细菌细胞中提取的粗蛋白中的OMP蛋白，这表明存在大量针对细菌OMP蛋白产生的血清抗体。
在本发明的特定实施方式中，可以通过插入来自相同或其他病原体的肽来改变衍生自不同于鲍曼不动杆菌的病原体的异源OMP蛋白的序列，目的是在OMP蛋白的结构域中添加额外的抗原序列，而本发明所教导的鲍曼不动杆菌外膜中的表达和最终定位不会因在基于原始OMP的最终融合蛋白中插入额外的抗原序列而受到阻碍。
在本发明的优选实施方式中，所选择的鲍曼不动杆菌细胞中表达的异源OMP衍生自最令人担忧的革兰氏阴性菌，特别是来自肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和/或大肠杆菌。在本发明的另一个优选实施方式中，异源OMP选自猪胸膜肺炎的致病因子胸膜肺炎放线杆菌。在本发明的另一个优选实施方式中，衍生自肺炎克雷伯菌的OMP蛋白是来自肺炎克雷伯菌的OMP蛋白OmpA和/或OmpK36。在本发明的另一个优选实施方式中，衍生自铜绿假单胞菌的OMP蛋白是来自铜绿假单胞菌的OMP蛋白OprF和/或来自铜绿假单胞菌的OMP蛋白OprI与铜绿假单胞菌3型分泌系统的蛋白PcrV的融合蛋白。在本发明的另一个优选实施方式中，衍生自大肠杆菌的OMP蛋白是参与铁吸收的外膜受体FuyA、HmA和IutA或OMP OmpA和OmpX。以及在本发明的另一个优选实施方式中，衍生自胸膜肺炎放线杆菌的OMP蛋白是OMP OmpA和OmpW、转铁蛋白结合蛋白A、TpbA，和/或IV型菌毛亚单位蛋白ApfA。
表达构建体的转录终止序列可以是本领域熟知的能够使得鲍曼不动杆菌中转录终止的任何转录终止序列。
第二，一旦鲍曼不动杆菌细胞用运载体(优选自杀运载体)转化，宿主中的靶基因座的特定选择序列与运载体中的同源序列之间的重组会导致产生运载体的序列已整合到鲍曼不动杆菌染色体上的靶基因座中的重组细胞。该重组事件可以通过本领域中众所周知的策略来辅助，例如使用基因组编辑工具(例如基于CRISPR方法的工具)在插入位点处诱导双链断裂。在本发明的优选实施方式中，第一重组事件导致插入包含选择性标记和表达构建体的运载体序列。选择性标记用于选择发生这种第一重组事件的细胞。第二重组事件可能导致只有表达构建体而不是编码选择性标记的序列保持整合在插入位点处的重组细胞，其中只有表达构建体而不是编码选择性标记的序列保持整合在插入位点。利用选择性标记的缺乏作为选择工具，可以选出已发生此类第二重组事件的鲍曼不动杆菌细胞。一旦选定，便使用PCR和DNA测序等常见技术检查运载体序列是否按预期整合到靶基因座中。
第三，可通过基本的蛋白质组学技术(如蛋白质印迹或ELISA)分析重组鲍曼不动杆菌细胞中表达构建体编码的蛋白质的表达。可通过本领域中先前描述的常见蛋白质组学方法(如实施例中描述的方法)分析重组鲍曼不动杆菌细胞外膜上编码的蛋白质的定位。
第四，一旦认为重组鲍曼不动杆菌细胞中分析的异源蛋白的表达令人满意，就在鲍曼不动杆菌细胞中诱导LPS的丢失。到目前为止执行的所有步骤，即用表达构建体转化鲍曼不动杆菌细胞和将表达构建体整合到染色体中，都是在野生型鲍曼不动杆菌细胞上执行的。本领域众所周知，鲍曼不动杆菌的任何菌株、克隆或变体都可以通过本发明到目前为止描述的技术进行转化。此外，本领域已知可以获得无法合成脂质A(即LPS的核心成分)的可存活的鲍曼不动杆菌突变体。在本发明的优选实施方式中，鲍曼不动杆菌细胞在含有抗生素粘菌素的平板上生长，并选择粘菌素抗性突变体。本领域众所周知，LPS的丢失使鲍曼不动杆菌细胞对粘菌素具有抗性。由于不影响LPS合成的其他突变也能导致粘菌素抗性，因此一旦分离出粘菌素抗性突变体，就使用特定的PCR反应和DNA测序来寻找LPS合成基因(包括选自由lpxA、lpxB、lpxC、lpxD、lpxK、lpxL和/或lpxM组成的列表中的基因)中的突变。一旦确认了LPS合成基因中的突变，就可以通过本领域众所周知的技术检查LPS的缺失，例如基于定量显色LAL的测定以检测细菌培养物中内毒素(即LPS)的存在，或确认无法通过抗LPS抗体检测到细菌细胞的粗提取物。如实施例中所教导的，不依赖于所用的鲍曼不动杆菌菌株、克隆或变体，可以诱导LPS的丢失，并且可以获得LPS无效鲍曼不动杆菌突变体。如实施例中所教导的，我们实验室已使用多种鲍曼不动杆菌菌株来诱导LPS的丢失，并且已发现LPS合成基因中的多种丢失是导致LPS丢失的原因。
除了上述方法，LPS的丢失可以通过其他方法来诱导，如对脂多糖合成基因进行定点诱变，从而导致LPS合成基因(包括选自由lpxA、lpxB、lpxC、lpxD、lpxK、lpxL和/或lpxM组成的列表中的基因)部分或完全失活。
在本发明的具体实施方式中，当上述重组事件插入的靶基因座是包含编码LPS合成基因(包括选自由lpxA、lpxB、lpxC、lpxD、lpxK、lpxL和/或lpxM组成的列表中的基因)的ORF的基因座，且重组导致此类ORF部分或完全失活时，所得重组鲍曼不动杆菌细胞为LPS阴性细胞，这是因为LPS合成基因(包括选自由lpxA、lpxB、lpxC、lpxD、lpxK、lpxL和/或lpxM组成的列表中的基因)的部分或完全失活。
应当理解，本发明中的“感染”是指不动杆菌属的任何生物(优选鲍曼不动杆菌)或候选疫苗所针对的任何其他细菌物种的任何生物(包括细菌物种肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌和胸膜肺炎放线杆菌)侵入或定植任何宿主组织而产生的病理。
本发明中的术语“抗原”是指可诱导抗体形成的分子(通常是蛋白质或多糖)。有许多不同类型的分子可以充当抗原，例如蛋白质、肽、多糖，以及更罕见的其他分子，例如核酸。
以下实施例仅用于说明，并不限制本发明的范围。
实施例
缩写
cysI：编码参与氨基酸L-半胱氨酸生物合成的亚硫酸盐还原酶的基因。
trpE：编码参与氨基酸色氨酸生物合成的邻氨基苯甲酸合酶(亚单位I)的基因。
lpxA：编码酰基-[酰基-载体-蛋白]—UDP-N-乙酰葡糖胺O-酰基转移酶的基因，该酶参与脂质A的生物合成，脂质A是一种将脂多糖锚定到细胞外膜的磷酸化糖脂。
lpxC：编码DP-3-O-酰基-N-乙酰葡糖胺脱乙酰酶的基因，该酶催化UDP-3-O-肉豆蔻酰基-N-乙酰葡糖胺水解形成UDP-3-O-肉豆蔻酰基葡糖胺和乙酸盐，这是脂质A生物合成的关键步骤。
lpxD：编码DP-3-O-酰基葡萄糖胺N-酰基转移酶的基因，该酶参与脂质A的生物合成，以3-羟基酰基-ACP为酰基供体，催化UDP-3-O-酰基葡萄糖胺的N-酰化。
lpxB：编码脂质-A-二糖合酶的基因，该酶参与UDP-2,3-二酰基葡萄糖胺和2,3-二酰基葡萄糖胺-1-磷酸的缩合以形成脂质A二糖，即脂质A的前体。
lpxK：编码四酰二糖4'-激酶的基因，该激酶将ATP的γ-磷酸转移到四酰二糖1-磷酸酯中间体(称为DS-1-P)的4'-位，形成四酰二糖1,4'-双-磷酸酯(脂质IVA)。该蛋白参与从(3R)-3-羟基十四烷酰基-[酰基-载体-蛋白]和UDP-N-乙酰基-α-D-葡萄糖胺合成脂质IV(A)的子途径的第6步。
lpxL：编码脂质A生物合成月桂酰转移酶的基因，该酶催化月桂酸酯从月桂酰-酰基载体蛋白(ACP)转移到Kdo2-脂质IV(A)，形成Kdo2-(月桂酰)-脂质IV(A)。
lpxM：编码脂质A生物合成肉豆蔻酰转移酶的基因，该酶参与从CMP-3-脱氧-D-甘露糖-辛酮糖酸酯和脂质IV(A)合成KDO(2)-脂质A的子途径的第4步。
Tn5/Tn7位点：转座子Tn5和Tn7要插入的鲍曼不动杆菌基因组的优先区域。
实施例1.可应用于任何鲍曼不动杆菌菌株并导致LPS合成基因的不同选定突变的选择鲍曼不动杆菌的LPS无效突变体的方法。
如Moffatt et al.2010、García-Quintanilla et al.2014、Pulido et al.2018和Carretero-Ledesma et al 2018等所示的，可以通过将这些亲本菌株直接铺到含有10mcg/ml硫酸粘菌素的Mueller-Hinton琼脂上来分离给定的鲍曼不动杆菌菌株的粘菌素抗性变体；经过一轮选择后，即可鉴定出粘菌素抗性菌落(频率为1/108至1/109)。还如Moffat et al.2010、García-Quintanilla et al.2014、Pulido et al.2018和Carretero-Ledesma et al2018等所示的，所选菌落的粘菌素抗性表型通常是由于任何LPS合成基因突变导致LPS丢失而获得的。表1显示了本发明作者使用上述粘菌素平板培养法选择的粘菌素抗性突变体的例子。表1提供了来自三种不同的无关鲍曼不动杆菌临床分离株的LPS无效粘菌素抗性衍生物的例子，具体是：旧临床分离株，现在可在ATCC以菌株ATCC19606获得，并在其他动物模型实验中用作参考鲍曼不动杆菌菌株；以及2002年塞维利亚Virgen del Rocío医院疫情的临床分离株，命名为IB001和Ab283。显示了不同的LPS无效衍生物，并指出了在LPS生物合成基因中发现的特定突变。
另外，表1显示了通过直接诱变LPS合成基因lpxA获得的一种Ab283 LPS无效衍生物。该衍生物被命名为K1或K1-Vax。为了构建K1-Vax，鲍曼不动杆菌Ab283细胞用自杀运载体(pVXD-40::K1-Vax)转化，该自杀运载体包含促进在lpxA靶基因座处重组至鲍曼不动杆菌基因组中的序列。pVXD-40::K1-Vax质粒是通过克隆表达构建体构建的，该表达构建体侧翼是与Ab283 lpxA基因相邻的同源区域(lpxA基因上游2000bp和下游2000bp)。自杀质粒(鲍曼不动杆菌中的非复制质粒)具有作为选择标记的诱导对四环素抗性的四环素抗性盒以及作为反选择标记的基因sacB。通过电穿孔、杂交(matting)或化学转化将pVXD-40::K1-Vax自杀质粒引入Ab283细胞中，然后进行两步等位基因交换。当在克隆到质粒中的上游区域与Ab283基因组的上游区域之间发生重组时，第一重组事件导致运载体的插入。在四环素琼脂平板上选择质粒整合到基因组中的成功重组细胞。PCR和DNA测序等常用技术用于检查质粒是否按照预期整合到靶基因座中。第二重组事件是通过在蔗糖存在下使选定的四环素抗性Ab283细胞生长来诱导的，这产生重组细胞，其中同源区域上游和下游的运载体骨架被去除并且仅表达构建体保留在重组Aab283细胞中。通过选择对蔗糖具有抗性并且对四环素敏感的重组Ab283细胞来获得发生了这种第二重组事件的Ab283细胞。选择后，使用PCR和DNA测序等常见技术来检查表达构建体是否按照预期整合到靶基因座中。第二重组还导致对于鲍曼不动杆菌中LPS的生物合成至关重要的lpxA完全失活。因此，第二重组直接导致重组LPS无效Ab283细胞。
实施例2.表达来自其他细菌物种的OMP蛋白的LPS无效鲍曼不动杆菌菌株的构建和验证
可以通过使用等位基因交换技术对鲍曼不动杆菌进行基因组编辑以产生重组菌株，来构建基于表达来自其他细菌物种的OMP蛋白的LPS无效鲍曼不动杆菌细胞的药物物质，该药物物质将用作针对不同细菌病原体感染的候选疫苗。简言之，我们选择了一种鲍曼不动杆菌载体菌株。具体地，我们筛选了一种可在不具有LPS的情况下存活的全敏感型鲍曼不动杆菌临床分离株，如EP2942389A1中所教导的。在筛选过程中选出的最终菌株名为Ab283。可以通过使用本领域众所周知的不同策略(例如自杀质粒或线性DNA片段)进行重组来评估表达构建体插入鲍曼不动杆菌基因组的情况。为了选择LPS阴性细胞，我们将菌株铺在粘菌素平板上(在粘菌素存在下培养Ab283并选择粘菌素抗性突变体)并选择粘菌素抗性突变体。然后，我们通过PCR筛选lpx基因处的大量插入或缺失。
cysI基因座处插入表达构建体来制备第一药物物质KapaVax2。
为了在cysI基因座处构建KapaVax2，在将构建体插入Ab283野生型菌株的cysI基因座处并证明异源抗原在外膜上表达和定位后，我们在铺于粘菌素上后选择了一种LPS阴性衍生体，并选择了一种在lpxC ORF处插入1Kb ISAba的LPS阴性突变体(见图3)。
该候选物KapaVax2包括选定的肺炎克雷伯菌抗原(OmpA和OmpK36)和三种铜绿假单胞菌抗原(OprF、OprI和PcrV)。每种抗原均在鲍曼不动杆菌OmpA启动子控制下由操纵子样构建体表达。PcrV融合到OprI的N末端作为融合蛋白。通过蛋白质印迹和ELISA证实了每 种抗原在外膜的表达和定位(见图8)。还使用抗原特异性抗体对全细胞裂解物和外膜提取物进行蛋白质印迹分析来确认鲍曼不动杆菌细胞中异源抗原的表达和定位。
在LPS无效突变体选择之前，将表达构建体整合到鲍曼不动杆菌Ab283的cysI基因位点处，用自杀运载体(pVXD-50::KapaVax2)转化鲍曼不动杆菌细胞，该自杀运载体包含促进在cysI靶基因座处重组到鲍曼不动杆菌基因组中的序列。该程序涉及设计自杀质粒以包含表达构建体，该表达构建体侧翼是与靶基因相邻的同源区以及选择标记和反选择标记。表达构建体中包含的ORF包含衍生自肺炎克雷伯菌外膜蛋白OmpA和OmpK36的序列以及衍生自铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF和OprI以及铜绿假单胞菌3型分泌系统蛋白PcrV的序列。oprI和pcrV编码序列组合成一个编码序列，产生新的嵌合基因oprI::pcrV。这四个编码序列在鲍曼不动杆菌OmpA启动子控制下由操纵子样构建体表达。表达构建体含有鲍曼不动杆菌外膜蛋白OmpA的信号序列，其位于每个编码序列的上游，以促进每个抗原定位在鲍曼不动杆菌外膜上。表达构建体还含有鲍曼不动杆菌蛋白OmpA的转录终止序列。
pVXD-50::KapaVax2质粒是通过克隆表达构建体构建的，该表达构建体侧翼是与Ab283 cysI基因相邻的同源区域(cysI基因上游600bp和下游600bp)。自杀质粒(鲍曼不动杆菌中的非复制质粒)具有作为选择标记的诱导对卡那霉素抗性的卡那霉素抗性基因以及作为反选择标记的基因sacB。
通过电穿孔、杂交或化学转化将pVXD-50::KapaVax2自杀质粒引入Ab283细胞中，然后进行两步等位基因交换。当在克隆到质粒中的上游区域与Ab283基因组的上游区域之间发生重组时，第一重组事件导致运载体的插入。在卡那霉素琼脂平板上选择质粒整合到基因组中的成功重组细胞。PCR和DNA测序等常用技术用于检查质粒是否按照预期整合到靶基因座中。
第二重组事件是通过在蔗糖存在下使选定的卡那霉素抗性Ab283细胞生长来诱导的，这产生重组细胞，其中同源区域上游和下游的运载体骨架被去除并且仅表达构建体保留在重组Ab283细胞中。通过选择对蔗糖具有抗性并且对卡那霉素敏感的重组Ab283细胞来获得发生了这种第二重组事件的Ab283细胞。选择后，使用PCR和DNA测序等常见技术来检查表达构建体是否按照预期整合到靶基因座中。
cysI基因座处插入表达构建体来制备第二药物物质K-Vax。
为了在cysI基因座处构建K-Vax，在将构建体插入Ab283野生型菌株的cysI基因座处并证明异源抗原在外膜上表达和定位后，我们在铺于粘菌素中后选择了一种LPS阴性衍生体，并选择了一种在lpxC ORF处插入1Kb ISAba的LPS阴性突变体(见图4)。
该候选物K-Vax包括选定的肺炎克雷伯菌抗原(OmpA和OmpK36)。每种抗原均在鲍曼不动杆菌OmpA启动子控制下由操纵子样构建体表达。通过蛋白质印迹和ELISA证实了每 种抗原在外膜的表达和定位(见图6)。还使用抗原特异性抗体对全细胞裂解物和外膜提取物进行蛋白质印迹分析来确认鲍曼不动杆菌细胞中异源抗原的表达和定位。
在LPS无效突变体选择之前，将表达构建体整合到鲍曼不动杆菌Ab283的cysI基因位点处，用自杀运载体(pVXD-50::K-Vax)转化鲍曼不动杆菌细胞，该自杀运载体包含促进在cysI靶基因座处重组到鲍曼不动杆菌基因组中的序列。该程序涉及设计自杀质粒以包含表达构建体，该表达构建体侧翼是与靶基因相邻的同源区以及选择标记和反选择标记。表达构建体中包含的ORF包含衍生自肺炎克雷伯菌的外膜蛋白OmpA和OmpK36的序列。这两个编码序列在鲍曼不动杆菌OmpA启动子控制下由操纵子样构建体表达。表达构建体含有鲍曼不动杆菌外膜蛋白OmpA的信号序列，其位于每个编码序列的上游，以促进每个抗原定位在鲍曼不动杆菌外膜上。表达构建体还含有鲍曼不动杆菌蛋白OmpA的转录终止序列。
pVXD-50::K-Vax质粒是通过克隆表达构建体构建的，该表达构建体侧翼是与Ab283 cysI基因相邻的同源区域(cysI基因上游600bp和下游600bp)。自杀质粒(鲍曼不动杆菌中的非复制质粒)具有作为选择标记的诱导对卡那霉素抗性的卡那霉素抗性基因以及作为反选择标记的基因sacB。
通过电穿孔、杂交或化学转化将pVXD-50::K-Vax自杀质粒引入Ab283细胞中，然后进行两步等位基因交换。当在克隆到质粒中的上游区域与Ab283基因组的上游区域之间发生重组时，第一重组事件导致运载体的插入。在卡那霉素琼脂平板上选择质粒整合到基因组中的成功重组细胞。PCR和DNA测序等常用技术用于检查质粒是否按照预期整合到靶基因座中。
第二重组事件是通过在蔗糖存在下使选定的卡那霉素抗性Ab283细胞生长来诱导的，这产生重组细胞，其中同源区域上游和下游的运载体骨架被去除并且仅表达构建体保留在重组Ab283细胞中。通过选择对蔗糖具有抗性并且对卡那霉素敏感的重组Ab283细胞来获得发生了这种第二重组事件的Ab283细胞。选择后，使用PCR和DNA测序等常见技术来检查表达构建体是否按照预期整合到靶基因座中(见图5)。
cysI基因座处插入表达构建体来制备第三药物物质P-Vax。
为了在cysI基因座处构建P-Vax，在将构建体插入Ab283野生型菌株的cysI基因座处并证明异源抗原在外膜上表达和定位后，我们在铺于粘菌素中后选择了一种LPS阴性衍生体，并选择了一种在lpxD ORF处插入1Kb ISAba的LPS阴性突变体(见图4)。
该候选物P-Vax包括三种铜绿假单胞菌抗原(OprF、OprI和PcrV)。每种抗原均在鲍曼不动杆菌OmpA启动子控制下由操纵子样构建体表达。PcrV融合到OprI的N末端作为融合蛋白。通过蛋白质印迹和ELISA证实了每种抗原在外膜的表达和定位(见图7)。还使用抗原特异性抗体对全细胞裂解物和外膜提取物进行蛋白质印迹分析来确认鲍曼不动杆菌细胞中异源抗原的表达和定位。
在LPS无效突变体选择之前，将表达构建体整合到鲍曼不动杆菌Ab283的cysI基因位点处，用自杀运载体(pVXD-50::P-Vax)转化鲍曼不动杆菌细胞，该自杀运载体包含促进在cysI靶基因座处重组到鲍曼不动杆菌基因组中的序列。该程序涉及设计自杀质粒以包含表达构建体，该表达构建体侧翼是与靶基因相邻的同源区以及选择标记和反选择标记。表达构建体中包含的ORF包含衍生自铜绿假单胞菌的OMP OprF和OprI以及铜绿假单胞菌3型分泌系统的蛋白质PcrV的序列。oprI和pcrV编码序列组合成一个编码序列，产生新的嵌合基因oprI::pcrV。这两个编码序列在鲍曼不动杆菌OmpA启动子控制下由操纵子样构建体表达。表达构建体含有鲍曼不动杆菌外膜蛋白OmpA的信号序列，位于每个编码序列的上游，以促进每个抗原定位在鲍曼不动杆菌外膜上。表达构建体还含有鲍曼不动杆菌蛋白OmpA的转录终止序列。
pVXD-50::P-Vax质粒是通过克隆表达构建体构建的，该表达构建体侧翼是与Ab283 cysI基因相邻的同源区域(cysI基因上游600bp和下游600bp)。自杀质粒(鲍曼不动杆菌中的非复制质粒)具有作为选择标记的诱导对卡那霉素抗性的卡那霉素抗性基因以及作为反选择标记的基因sacB。
通过电穿孔、杂交或化学转化将pVXD-50::P-Vax自杀质粒引入Ab283细胞中，然后进行两步等位基因交换。当在克隆到质粒中的上游区域与Ab283基因组的上游区域之间发生重组时，第一重组事件导致运载体的插入。在卡那霉素琼脂平板上选择质粒整合到基因组中的成功重组细胞。PCR和DNA测序等常用技术用于检查质粒是否按照预期整合到靶基因座中。
第二重组事件是通过在蔗糖存在下使选定的卡那霉素抗性Ab283细胞生长来诱导的，这产生重组细胞，其中同源区域上游和下游的运载体骨架被去除并且仅表达构建体保留在重组Ab283细胞中。通过选择对蔗糖具有抗性并且对卡那霉素敏感的重组Ab283细胞来获得发生了这种第二重组事件的Ab283细胞。选择后，使用PCR和DNA测序等常见技术来检查表达构建体是否按照预期整合到靶基因座中。
cysI基因座处插入表达构建体来制备第四药物物质K1-Vax。
该候选物包括在鲍曼不动杆菌OmpA启动子控制下的从肺炎克雷伯菌OmpA中选择的OMP。通过蛋白质印迹和ELISA证实了肺炎克雷伯菌OMP抗原的外膜处的表达和定位。还使用抗原特异性抗体对全细胞裂解物和外膜提取物进行蛋白质印迹分析来确认鲍曼不动杆菌细胞中异源抗原的表达和定位。
为了在lpxA基因座处构建K1-Vax，用自杀运载体(pVXD-40::K1-Vax)转化鲍曼不动杆菌Ab283细胞，该自杀运载体包含促进在lpxA靶基因座处重组至鲍曼不动杆菌基因组中的序列。LpxA蛋白对于鲍曼不动杆菌中LPS的生物合成至关重要。
该程序涉及设计自杀质粒，该质粒包含表达构建体，该表达构建体侧翼是与靶基因相邻的同源区以及选择标记和反选择标记。包含在表达构建体中的ORF包含衍生自鲍曼不动杆菌OmpA启动子控制的肺炎克雷伯菌的外膜蛋白OmpA的序列。使用鲍曼不动杆菌外膜蛋白OmpA的信号序列来促进鲍曼不动杆菌的OmpA在鲍曼不动杆菌外膜上的定位。
pVXD-40::K1-Vax质粒是通过克隆表达构建体构建的，该表达构建体侧翼是与Ab283 lpxA基因相邻的同源区域(lpxA基因上游2000bp和下游2000bp)。自杀质粒(鲍曼不动杆菌中的非复制质粒)具有作为选择标记的诱导对四环素抗性的四环素抗性盒以及作为反选择标记的基因sacB。
通过电穿孔、杂交或化学转化将pVXD-40::K1-Vax自杀质粒引入Ab283细胞中，然后进行两步等位基因交换。当在克隆到质粒中的上游区域与Ab283基因组的上游区域之间发生重组时，第一重组事件导致运载体的插入。在四环素琼脂平板上选择质粒整合到基因组中的成功重组细胞。PCR和DNA测序等常用技术用于检查质粒是否按照预期整合到靶基因座中。
第二重组事件是通过在蔗糖存在下使选定的四环素抗性Ab283细胞生长来诱导的，这产生重组细胞，其中同源区域上游和下游的运载体骨架被去除并且仅表达构建体保留在重组Aab283细胞中。可通过选择对蔗糖具有抗性并且对四环素敏感的重组Ab283细胞来获得发生了这种第二重组事件的Ab283细胞。选择后，使用PCR和DNA测序等常见技术来检查表达构建体是否按照预期整合到靶基因座中。
第二重组还导致对于鲍曼不动杆菌中LPS的生物合成至关重要的lpxA完全失活。因此，第二重组直接导致重组LPS无效Ab283细胞。因此，无需在粘菌素平板上进行LPS无效突变体选择的后续步骤。
通过基本蛋白质组学技术(如蛋白质印迹)分析重组Ab283细胞中由表达构建体编码的肺炎克雷伯菌异源蛋白OmpA的表达，以确认其表达。当样品用蛋白酶K处理时，通过蛋白质印迹分析肺炎克雷伯菌OmpA蛋白在重组鲍曼不动杆菌细胞外膜的定位。
cysI基因座处插入表达构建体来制备第五药物物质Eco1-Vax。
为了在cysI基因座处构建Eco1-Vax，在将构建体插入Ab283野生型菌株的cysI基因座处并证明异源抗原在外膜上表达和定位后，我们在铺于粘菌素中后选择了一种LPS阴性衍生体，并选择了一种在lpxC ORF处插入1Kb ISAba的LPS阴性突变体。
该候选物Eco1-Vax包含两种大肠杆菌抗原(OmpA和OmpX)。每种抗原均在鲍曼不动杆菌OmpA启动子控制下由操纵子样构建体表达。通过包括蛋白质印迹和ELISA的基本蛋白 质组学技术证实了每种抗原在外膜的表达和定位(见图9)。还使用抗原特异性抗体对全细胞裂解物和外膜提取物进行蛋白质印迹分析来确认鲍曼不动杆菌细胞中异源抗原的表达和定位。
在LPS无效突变体选择之前，将表达构建体整合到鲍曼不动杆菌Ab283的cysI基因位点处，用自杀运载体(pVXD-50::Eco1-Vax)转化鲍曼不动杆菌细胞，该自杀运载体包含促进在cysI靶基因座处重组到鲍曼不动杆菌基因组中的序列。该程序涉及设计自杀质粒以包含表达构建体，该表达构建体侧翼是与靶基因相邻的同源区以及选择标记和反选择标记。表达构建体中包含的ORF包含衍生自大肠杆菌的OMP OmpA和OmpX的序列。这两个编码序列在鲍曼不动杆菌OmpA启动子控制下由操纵子样构建体表达。表达构建体含有鲍曼不动杆菌外膜蛋白OmpA的信号序列，其位于每个编码序列的上游，以促进每个抗原定位在鲍曼不动杆菌外膜上。表达构建体还含有鲍曼不动杆菌蛋白OmpA的转录终止序列。
pVXD-50::Eco1-Vax质粒是通过克隆表达构建体构建的，该表达构建体侧翼是与Ab283 cysI基因相邻的同源区域(cysI基因上游600bp和下游600bp)。自杀质粒(鲍曼不动杆菌中的非复制质粒)具有作为选择标记的诱导对卡那霉素抗性的卡那霉素抗性基因以及作为反选择标记的基因sacB。
通过电穿孔、杂交或化学转化将pVXD-50::Eco1-Vax自杀质粒引入Ab283细胞中，然后进行两步等位基因交换。当在克隆到质粒中的上游区域与Ab283基因组的上游区域之间发生重组时，第一重组事件导致运载体的插入。在卡那霉素琼脂平板上选择质粒整合到基因组中的成功重组细胞。PCR和DNA测序等常用技术用于检查质粒是否按照预期整合到靶基因座中。
第二重组事件是通过在蔗糖存在下使选定的卡那霉素抗性Ab283细胞生长来诱导的，这产生重组细胞，其中同源区域上游和下游的运载体骨架被去除并且仅表达构建体保留在重组Ab283细胞中。通过选择对蔗糖具有抗性并且对卡那霉素敏感的重组Ab283细胞来获得发生了这种第二重组事件的Ab283细胞。选择后，使用PCR和DNA测序等常见技术来检查表达构建体是否按照预期整合到靶基因座中(见图5)。
cysI基因座处插入表达构建体来制备第六药物物质Eco2-Vax。
为了在cysI基因座处构建Eco2-Vax，在将构建体插入Ab283野生型菌株的cysI基因座处并证明异源抗原在外膜上表达和定位后，我们在铺于粘菌素中后选择了一种LPS阴性衍生体，并选择了一种在lpxC ORF处插入1Kb ISAba的LPS阴性突变体。
该候选物Eco2-Vax包含三种大肠杆菌抗原(FuyA、HmA、IutA)。每种抗原均在鲍曼不动杆菌OmpA启动子控制下由操纵子样构建体表达。通过包括蛋白质印迹和ELISA的基本 蛋白质组学技术证实了每种抗原在外膜的表达和定位(见图9)。还使用抗原特异性抗体对全细胞裂解物和外膜提取物进行蛋白质印迹分析来确认鲍曼不动杆菌细胞中异源抗原的表达和定位。
在LPS无效突变体选择之前，将表达构建体整合到鲍曼不动杆菌Ab283的cysI基因位点处，用自杀运载体(pVXD-50::Eco2-Vax)转化鲍曼不动杆菌细胞，该自杀运载体包含促进在cysI靶基因座处重组到鲍曼不动杆菌基因组中的序列。该程序涉及设计自杀质粒以包含表达构建体，该表达构建体侧翼是与靶基因相邻的同源区以及选择标记和反选择标记。表达构建体中包含的ORF包含衍生自大肠杆菌的OMP FuyA、HmA和IutA的序列。这三个编码序列在鲍曼不动杆菌OmpA启动子控制下由操纵子样构建体表达。表达构建体含有鲍曼不动杆菌外膜蛋白OmpA的信号序列，其位于每个编码序列的上游，以促进每个抗原定位在鲍曼不动杆菌外膜上。表达构建体还含有鲍曼不动杆菌蛋白OmpA的转录终止序列。
pVXD-50::Eco2-Vax质粒是通过克隆表达构建体构建的，该表达构建体侧翼是与Ab283 cysI基因相邻的同源区域(cysI基因上游600bp和下游600bp)。自杀质粒(鲍曼不动杆菌中的非复制质粒)具有作为选择标记的诱导对卡那霉素抗性的卡那霉素抗性基因以及作为反选择标记的基因sacB。
通过电穿孔、杂交或化学转化将pVXD-50::Eco2-Vax自杀质粒引入Ab283细胞中，然后进行两步等位基因交换。当在克隆到质粒中的上游区域与Ab283基因组的上游区域之间发生重组时，第一重组事件导致运载体的插入。在卡那霉素琼脂平板上选择质粒整合到基因组中的成功重组细胞。PCR和DNA测序等常用技术用于检查质粒是否按照预期整合到靶基因座中。
第二重组事件是通过在蔗糖存在下使选定的卡那霉素抗性Ab283细胞生长来诱导的，这产生重组细胞，其中同源区域上游和下游的运载体骨架被去除并且仅表达构建体保留在重组Ab283细胞中。通过选择对蔗糖具有抗性并且对卡那霉素敏感的重组Ab283细胞来获得发生了这种第二重组事件的Ab283细胞。选择后，使用PCR和DNA测序等常见技术来检查表达构建体是否按照预期整合到靶基因座中。
cysI基因座处插入表达构建体来制备第七药物物质Eco3-Vax。
为了在cysI基因座处构建Eco3-Vax，在将构建体插入Ab283野生型菌株的cysI基因座处并证明异源抗原在外膜上表达和定位后，我们在铺于粘菌素中后选择了一种LPS阴性衍生体，并选择了一种在lpxC ORF处插入1Kb ISAba的LPS阴性突变体。
该候选物Eco3-Vax包含三种大肠杆菌抗原(FuyA、HmA、OmpA)。每种抗原均在鲍曼不动杆菌OmpA启动子控制下由操纵子样构建体表达。每种抗原在外膜的表达和定位通过蛋 白质印迹和ELISA来确认。还使用抗原特异性抗体对全细胞裂解物和外膜提取物进行蛋白质印迹分析来确认鲍曼不动杆菌细胞中异源抗原的表达和定位。
在LPS无效突变体选择之前，将表达构建体整合到鲍曼不动杆菌Ab283的cysI基因位点处，用自杀运载体(pVXD-50::Eco3-Vax)转化鲍曼不动杆菌细胞，该自杀运载体包含促进在cysI靶基因座处重组到鲍曼不动杆菌基因组中的序列。该程序涉及设计自杀质粒以包含表达构建体，该表达构建体侧翼是与靶基因相邻的同源区以及选择标记和反选择标记。表达构建体中包含的ORF包含衍生自大肠杆菌的OMP FuyA、HmA和OmpA的序列。这三个编码序列在鲍曼不动杆菌OmpA启动子控制下由操纵子样构建体表达。表达构建体含有鲍曼不动杆菌外膜蛋白OmpA的信号序列，其位于每个编码序列的上游，以促进每个抗原定位在鲍曼不动杆菌外膜上。表达构建体还含有鲍曼不动杆菌蛋白OmpA的转录终止序列。
pVXD-50::Eco3-Vax质粒是通过克隆表达构建体构建的，该表达构建体侧翼是与Ab283 cysI基因相邻的同源区域(cysI基因上游600bp和下游600bp)。自杀质粒(鲍曼不动杆菌中的非复制质粒)具有作为选择标记的诱导对卡那霉素抗性的卡那霉素抗性基因以及作为反选择标记的基因sacB。
通过电穿孔、杂交或化学转化将pVXD-50::Eco3-Vax自杀质粒引入Ab283细胞中，然后进行两步等位基因交换。当在克隆到质粒中的上游区域与Ab283基因组的上游区域之间发生重组时，第一重组事件导致运载体的插入。在卡那霉素琼脂平板上选择质粒整合到基因组中的成功重组细胞。PCR和DNA测序等常用技术用于检查质粒是否按照预期整合到靶基因座中。
第二重组事件是通过在蔗糖存在下使选定的卡那霉素抗性Ab283细胞生长来诱导的，这产生重组细胞，其中同源区域上游和下游的运载体骨架被去除并且仅表达构建体保留在重组Ab283细胞中。通过选择对蔗糖具有抗性并且对卡那霉素敏感的重组Ab283细胞来获得发生了这种第二重组事件的Ab283细胞。选择后，使用PCR和DNA测序等常见技术来检查表达构建体是否按照预期整合到靶基因座中。
cysI基因座处插入表达构建体来制备第八药物物质Appe1-Vax。
为了在cysI基因座处构建Appe1-Vax，在将构建体插入Ab283野生型菌株的cysI基因座处并证明异源抗原在外膜上表达和定位后，我们在铺于粘菌素中后选择了一种LPS阴性衍生体，并选择了一种在lpxC ORF处插入1Kb ISAba的LPS阴性突变体。
该候选物Appe1-Vax包含一种胸膜肺炎放线杆菌抗原(TpbA)。OMP抗原在鲍曼不动杆菌OmpA启动子控制下由操纵子样构建体表达。通过蛋白质印迹和ELISA证实了OMP抗原在 外膜的表达和定位。还使用抗原特异性抗体对全细胞裂解物和外膜提取物进行蛋白质印迹分析来确认鲍曼不动杆菌细胞中异源抗原的表达和定位。
在LPS无效突变体选择之前，将表达构建体整合到鲍曼不动杆菌Ab283的cysI基因位点处，用自杀运载体(pVXD-50::Appe1-Vax)转化鲍曼不动杆菌细胞，该自杀运载体包含促进在cysI靶基因座处重组到鲍曼不动杆菌基因组中的序列。该程序涉及设计自杀质粒以包含表达构建体，该表达构建体侧翼是与靶基因相邻的同源区以及选择标记和反选择标记。表达构建体中包含的ORF包含衍生自胸膜肺炎放线杆菌的OMP TpbA的序列。该编码序列在鲍曼不动杆菌OmpA启动子控制下由操纵子样构建体表达。表达构建体含有鲍曼不动杆菌外膜蛋白OmpA的信号序列，其位于每个编码序列的上游，以促进每个抗原定位在鲍曼不动杆菌外膜上。表达构建体还含有鲍曼不动杆菌蛋白OmpA的转录终止序列。
pVXD-50::Appe1-Vax质粒是通过克隆表达构建体构建的，该表达构建体侧翼是与Ab283 cysI基因相邻的同源区域(cysI基因上游600bp和下游600bp)。自杀质粒(鲍曼不动杆菌中的非复制质粒)具有作为选择标记的诱导对卡那霉素抗性的卡那霉素抗性基因以及作为反选择标记的基因sacB。
通过电穿孔、杂交或化学转化将pVXD-50::Appe1-Vax自杀质粒引入Ab283细胞中，然后进行两步等位基因交换。当在克隆到质粒中的上游区域与Ab283基因组的上游区域之间发生重组时，第一重组事件导致运载体的插入。在卡那霉素琼脂平板上选择质粒整合到基因组中的成功重组细胞。PCR和DNA测序等常用技术用于检查质粒是否按照预期整合到靶基因座中。
第二重组事件是通过在蔗糖存在下使选定的卡那霉素抗性Ab283细胞生长来诱导的，这产生重组细胞，其中同源区域上游和下游的运载体骨架被去除并且仅表达构建体保留在重组Ab283细胞中。通过选择对蔗糖具有抗性并且对卡那霉素敏感的重组Ab283细胞来获得发生了这种第二重组事件的Ab283细胞。选择后，使用PCR和DNA测序等常见技术来检查表达构建体是否按照预期整合到靶基因座中。
cysI基因座处插入表达构建体来制备第九药物物质Appe2-Vax。
为了在cysI基因座处构建Appe2-Vax，在将构建体插入Ab283野生型菌株的cysI基因座处并证明异源抗原在外膜上表达和定位后，我们在铺于粘菌素中后选择了一种LPS阴性衍生体，并选择了一种在lpxC ORF处插入1Kb ISAba的LPS阴性突变体。
该候选物Appe2-Vax包含一种胸膜肺炎放线杆菌抗原(ApfA)。OMP抗原在鲍曼不动杆菌OmpA启动子控制下由操纵子样构建体表达。通过蛋白质印迹和ELISA证实了每种抗原 在外膜的表达和定位。还使用抗原特异性抗体对全细胞裂解物和外膜提取物进行蛋白质印迹分析来确认鲍曼不动杆菌细胞中异源抗原的表达和定位。
在LPS无效突变体选择之前，将表达构建体整合到鲍曼不动杆菌Ab283的cysI基因位点处，用自杀运载体(pVXD-50::Appe2-Vax)转化鲍曼不动杆菌细胞，该自杀运载体包含促进在cysI靶基因座处重组到鲍曼不动杆菌基因组中的序列。该程序涉及设计自杀质粒以包含表达构建体，该表达构建体侧翼是与靶基因相邻的同源区以及选择标记和反选择标记。表达构建体中包含的ORF包含衍生自胸膜肺炎放线杆菌的OMP ApfA的序列。该编码序列在鲍曼不动杆菌OmpA启动子控制下由操纵子样构建体表达。表达构建体含有鲍曼不动杆菌外膜蛋白OmpA的信号序列，其位于每个编码序列的上游，以促进每个抗原定位在鲍曼不动杆菌外膜上。表达构建体还含有鲍曼不动杆菌蛋白OmpA的转录终止序列。
pVXD-50::Appe2-Vax质粒是通过克隆表达构建体构建的，该表达构建体侧翼是与Ab283 cysI基因相邻的同源区域(cysI基因上游600bp和下游600bp)。自杀质粒(鲍曼不动杆菌中的非复制质粒)具有作为选择标记的诱导对卡那霉素抗性的卡那霉素抗性基因以及作为反选择标记的基因sacB。
通过电穿孔、杂交或化学转化将pVXD-50::Appe2-Vax自杀质粒引入Ab283细胞中，然后进行两步等位基因交换。当在克隆到质粒中的上游区域与Ab283基因组的上游区域之间发生重组时，第一重组事件导致运载体的插入。在卡那霉素琼脂平板上选择质粒整合到基因组中的成功重组细胞。PCR和DNA测序等常用技术用于检查质粒是否按照预期整合到靶基因座中。
第二重组事件是通过在蔗糖存在下使选定的卡那霉素抗性Ab283细胞生长来诱导的，这产生重组细胞，其中同源区域上游和下游的运载体骨架被去除并且仅表达构建体保留在重组Ab283细胞中。通过选择对蔗糖具有抗性并且对卡那霉素敏感的重组Ab283细胞来获得发生了这种第二重组事件的Ab283细胞。选择后，使用PCR和DNA测序等常见技术来检查表达构建体是否按照预期整合到靶基因座中。
cysI基因座处插入表达构建体来制备第十药物物质Appe3-Vax。
为了在cysI基因座处构建Appe3-Vax，在将构建体插入Ab283野生型菌株的cysI基因座处并证明异源抗原在外膜上表达和定位后，我们在铺于粘菌素中后选择了一种LPS阴性衍生体，并选择了一种在lpxC ORF处插入1Kb ISAba的LPS阴性突变体。
该候选物Appe3-Vax包含一种胸膜肺炎放线杆菌抗原(OmpA)。OMP抗原在鲍曼不动杆菌OmpA启动子控制下由操纵子样构建体表达。通过包括蛋白质印迹和ELISA的基本蛋白 质组学技术证实了每种抗原在外膜的表达和定位(见图9)。还使用抗原特异性抗体对全细胞裂解物和外膜提取物进行蛋白质印迹分析来确认鲍曼不动杆菌细胞中异源抗原的表达和定位。
在LPS无效突变体选择之前，将表达构建体整合到鲍曼不动杆菌Ab283的cysI基因位点处，用自杀运载体(pVXD-50::Appe3-Vax)转化鲍曼不动杆菌细胞，该运载体包含促进在cysI靶基因座处重组到鲍曼不动杆菌基因组中的序列。该程序涉及设计自杀质粒，该质粒包含表达构建体，该表达构建体侧翼是与靶基因相邻的同源区以及选择标记和反选择标记。表达构建体中包含的ORF包含衍生自胸膜肺炎放线杆菌的OMP OmpA的序列。该编码序列在鲍曼不动杆菌OmpA启动子控制下由操纵子样构建体表达。表达构建体含有鲍曼不动杆菌外膜蛋白OmpA的信号序列，位于每个编码序列的上游，以促进每个抗原定位在鲍曼不动杆菌外膜上。表达构建体还含有鲍曼不动杆菌蛋白OmpA的转录终止序列。
pVXD-50::Appe3-Vax质粒是通过克隆表达构建体构建的，该表达构建体侧翼是与Ab283 cysI基因相邻的同源区域(cysI基因上游600bp和下游600bp)。自杀质粒(鲍曼不动杆菌中的非复制质粒)具有作为选择标记的诱导对卡那霉素抗性的卡那霉素抗性基因以及作为反选择标记的基因sacB。
通过电穿孔、杂交或化学转化将pVXD-50::Appe3-Vax自杀质粒引入Ab283细胞中，然后进行两步等位基因交换。当在克隆到质粒中的上游区域与Ab283基因组的上游区域之间发生重组时，第一重组事件导致运载体的插入。在卡那霉素琼脂平板上选择质粒整合到基因组中的成功重组细胞。PCR和DNA测序等常用技术用于检查质粒是否按照预期整合到靶基因座中。
第二重组事件是通过在蔗糖存在下使选定的卡那霉素抗性Ab283细胞生长来诱导的，这产生重组细胞，其中同源区域上游和下游的运载体骨架被去除并且仅表达构建体保留在重组Ab283细胞中。通过选择对蔗糖具有抗性并且对卡那霉素敏感的重组Ab283细胞来获得发生了这种第二重组事件的Ab283细胞。选择后，使用PCR和DNA测序等常见技术来检查表达构建体是否按照预期整合到靶基因座中。
cysI基因座处插入表达构建体来制备第十一药物物质Appe4-Vax。
为了在cysI基因座处构建Appe4-Vax，在将构建体插入Ab283野生型菌株的cysI基因座处并证明异源抗原在外膜上表达和定位后，我们在铺于粘菌素中后选择了一种LPS阴性衍生体，并选择了一种在lpxC ORF处插入1Kb ISAba的LPS阴性突变体。
该候选物Appe4-Vax包含一种胸膜肺炎放线杆菌抗原(OmpW)。OMP抗原在鲍曼不动杆菌OmpA启动子控制下由操纵子样构建体表达。通过蛋白质印迹和ELISA证实了每种抗原 在外膜的表达和定位。还使用抗原特异性抗体对全细胞裂解物和外膜提取物进行蛋白质印迹分析来确认鲍曼不动杆菌细胞中异源抗原的表达和定位。
在LPS无效突变体选择之前，将表达构建体整合到鲍曼不动杆菌Ab283的cysI基因位点处，用自杀运载体(pVXD-50::Appe4-Vax)转化鲍曼不动杆菌细胞，该自杀运载体包含促进在cysI靶基因座处重组到鲍曼不动杆菌基因组中的序列。该程序涉及设计自杀质粒以包含表达构建体，该表达构建体侧翼是与靶基因相邻的同源区以及选择标记和反选择标记。表达构建体中包含的ORF包含衍生自胸膜肺炎放线杆菌的OMP OmpW的序列。该编码序列在鲍曼不动杆菌OmpA启动子控制下由操纵子样构建体表达。表达构建体含有鲍曼不动杆菌外膜蛋白OmpA的信号序列，其位于每个编码序列的上游，以促进每个抗原定位在鲍曼不动杆菌外膜上。表达构建体还含有鲍曼不动杆菌蛋白OmpA的转录终止序列。
pVXD-50::Appe4-Vax质粒是通过克隆表达构建体构建的，该表达构建体侧翼是与Ab283 cysI基因相邻的同源区域(cysI基因上游600bp和下游600bp)。自杀质粒(鲍曼不动杆菌中的非复制质粒)具有作为选择标记的诱导对卡那霉素抗性的卡那霉素抗性基因以及作为反选择标记的基因sacB。
通过电穿孔、杂交或化学转化将pVXD-50::Appe4-Vax自杀质粒引入Ab283细胞中，然后进行两步等位基因交换。当在克隆到质粒中的上游区域与Ab283基因组的上游区域之间发生重组时，第一重组事件导致运载体的插入。在卡那霉素琼脂平板上选择质粒整合到基因组中的成功重组细胞。PCR和DNA测序等常用技术用于检查质粒是否按照预期整合到靶基因座中。
第二重组事件是通过在蔗糖存在下使选定的卡那霉素抗性Ab283细胞生长来诱导的，这产生重组细胞，其中同源区域上游和下游的运载体骨架被去除并且仅表达构建体保留在重组Ab283细胞中。通过选择对蔗糖具有抗性并且对卡那霉素敏感的重组Ab283细胞来获得发生了这种第二重组事件的Ab283细胞。选择后，使用PCR和DNA测序等常见技术来检查表达构建体是否按照预期整合到靶基因座中。
实施例2.对蛋白酶K敏感的OMP的方案
目的：测试其他细菌病原体的异源性OMP抗原在缺乏LPS的鲍曼不动杆菌外膜中的位置。
简要描述：用蛋白酶K处理表达来自其他细菌病原体的OMP抗原的鲍曼不动杆菌LPS-全细胞或不表达OMP抗原的鲍曼不动杆菌菌株的亲本LPS-版本。来自处理或未处理(对照)样品的膜制备物跑入12％丙烯酰胺凝胶。接下来，使用针对特定异源OMP蛋白产生的多克隆抗体或单克隆抗体进行蛋白质印迹。位于膜表面的蛋白质在蛋白酶K处理后被降解。该部分方案还使用全细胞裂解物进行，结果表明，由于两个样品(经过蛋白酶K处理和未经过蛋白酶K处理)中的交叉反应，多克隆抗体识别胞质蛋白。而预期在外膜处定位的OMP仅在未处理的样品中检测到。
方法：
蛋白酶K处理：
1.来自单菌落的预接种物在30℃下过夜振荡培养。
2.将培养物稀释至OD 0.05，然后在30℃下振荡培养直至OD为2。
3.将25ml培养物离心浓缩，并弃去上清液。
4.将沉淀悬浮于10ml PBS中，处理样品中蛋白酶K含量为250μg/ml。
5.37℃下振荡孵育2小时。
6.通过离心浓缩沉淀，然后将其悬浮在10ml PBS或PBS+3mM PMFS(蛋白酶抑制剂)中，以终止用蛋白酶K处理的样品中的反应。
7.室温下孵育10分钟。
膜制备
8.超声处理如下：20％振幅10秒，暂停30秒。该循环重复7次。
9.4000rpm，8℃超速离心1小时。
10.弃去上清液并重悬于250μl PBS triton 1％中。
11.4℃下过夜孵育以溶解膜。
SDS-PAGE和WB
12.样品制备：25μl膜制备物+25μl上样缓冲液4x+50μl milliQ水。
13.98℃煮20分钟。
14.将10μl上样到12％丙烯酰胺凝胶上
15.170V运行1小时。
16.360mA湿转至硝酸纤维素膜1小时30分
17.用于上样对照的丽春红染色。
18.用PBS吐温1％牛奶5％封闭1小时
19.4℃下过夜孵育，一抗按1:5000溶于PBS吐温1％牛奶5％
20.用PBS tween 1％清洗膜。重复洗涤2次以上。
21.用1:5000二抗在PBS tween 1％牛奶5％中于室温孵育1小时。
22.用PBS tween 1％清洗膜。重复洗涤5次以上。
23.用化学发光试剂处理5分钟并可视化。
用本发明的技术递送的一些药物物质的最终结果的示例如图6、7和8所示。该技术
用于确认为构建实施例1中提到的药物物质而表达的所有异源抗原的外膜定位。
实施例3.鲍曼不动杆菌中产生的药物物质对由其他细菌病原体引起的感染的保
护功效。
通过在实验室规模下发酵药物物质细胞并随后热灭活，由不同药物物质制备候选疫苗。
对于体内概念验证研究，我们采用了一种鼠脓毒症模型，该模型在先前开发用于测试我们针对鲍曼不动杆菌的单价疫苗Acineto Vax的体内效力，如García-Quintanillaet al.2014所述的。简而言之，6-8周龄C57BL/6动物(每组8-12只动物)通过肌肉注射2剂灭活药物物质细胞(以0.83mg/剂的氢氧化铝作为佐剂配制)进行免疫。两次给药间隔2周。第二次免疫后7天，通过腹膜内注射待测试细菌病原体参考菌株接种物对动物进行攻击。接种物相当于之前针对该模型中每种菌株确定的最低致死剂量(MLD)。我们在针对每种靶病原体的独立攻击实验中测试了体内功效。对动物进行7-12天的监测以确定存活率。在退出后或随访期结束时，确定肺、脾和肾中的细菌负荷作为细菌扩散的定量值，以及确定血液中的细菌负荷，以评估与实验性脓毒症相关的菌血症。感染后12(或18)小时处死另一组动物(每组8-10只动物)，以评估不同器官中的细菌负荷和血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平，以表征接种疫苗的动物与未接种疫苗的对照动物相比在感染期间产生的炎症反应。
评估每种候选疫苗功效的主要变量是接种疫苗的小鼠与接种疫苗溶媒的对照小鼠(仅佐剂)在攻击后时期的存活率。作为次要变量，对药物物质“外膜上表达异源OMP抗原的LPS无效鲍曼不动杆菌Ab283”和药物物质“外膜上不具有异源OMP抗原的LPS无效鲍曼不动杆菌Ab283载体细胞”之间的保护作用进行了比较，以评估异源OMP抗原对针对其针对靶病原体的保护作用的贡献。
KapaVax对肺炎克雷伯菌引起的致命脓毒症的保护作用的实施例
KapaVax2(KapaVax)由表达来自肺炎克雷伯菌OmpA和OmpK36以及铜绿假单胞菌OprF和融合蛋白OprI::PcrV的OMP抗原的LPS无效鲍曼不动杆菌Ab283细胞制成。
如图10所示，与单独接种佐剂(溶媒)的小鼠相比，接种KapaVax2(KapaVax)的小鼠对高毒性、高荚膜化的肺炎克雷伯菌临床分离株ATCC43816引起的致命脓毒症具有显著的保护作用。此外，仅用载体细胞(LPS无效鲍曼不动杆菌Ab283)接种的小鼠显示出部分交叉保护。KapaVax的保护明显高于Ab283LPS-获得的保护，因此需要异源OMP抗原的存在来增强针对靶病原体肺炎克雷伯菌的保护。
KapaVax对铜绿假单胞菌引起的致命脓毒症的保护作用的实施例
KapaVax2(KapaVax)由表达来自肺炎克雷伯菌OmpA和OmpK36以及铜绿假单胞菌OprF和融合蛋白OprI::PcrV的OMP抗原的LPS无效鲍曼不动杆菌Ab283细胞制成。
如图11所示，与单独接种佐剂(溶媒)的小鼠相比，接种KapaVax2(KapaVax)的小鼠对铜绿假单胞菌临床分离株PA14引起的致命脓毒症具有显著的保护作用。
K-Vax对肺炎克雷伯菌引起的致命脓毒症的保护作用的实施例
K-Vax由表达来自肺炎克雷伯菌OmpA和OmpK36的OMP抗原的LPS无效鲍曼不动杆菌Ab283细胞制成。
如图12所示，与单独接种佐剂(溶媒)的小鼠相比，接种K-Vax(DS3)的小鼠对高毒性、高荚膜化的肺炎克雷伯菌临床分离株ATCC43816引起的致命脓毒症具有显著的保护作用。此外，仅用载体细胞(LPS无效鲍曼不动杆菌Ab283)接种的小鼠显示出部分交叉保护。K-Vax的保护显著高于Ab283 LPS-获得的保护，因此需要异源OMP抗原的存在来增强针对靶病原体肺炎克雷伯菌的保护。
P-Vax对铜绿假单胞菌引起的致命脓毒症的保护作用的实施例
P-Vax由表达来自铜绿假单胞菌OprF和融合蛋白OprI::PcrV的OMP抗原的LPS无效鲍曼不动杆菌Ab283细胞制成。
如图13所示，与单独接种佐剂(溶媒)的小鼠相比，接种P-Vax(DS4)的小鼠对致命铜绿假单胞菌临床分离株PA14引起的致命脓毒症具有显著的保护作用。此外，仅用载体细胞(LPS无效鲍曼不动杆菌Ab283)接种的小鼠显示出部分交叉保护。P-Vax的保护明显高于Ab283 LPS-获得的保护，因此需要异源OMP抗原的存在来增强针对靶病原体铜绿假单胞菌的保护。
实施例4.表达来自其他细菌病原体的OMP抗原的LPS无效鲍曼不动杆菌中构建的
药物物质保留了LPS无效鲍曼不动杆菌保护免受鲍曼不动杆菌引起的感染的能力
AcinetoVax对由多样鲍曼不动杆菌临床分离株引起的致命脓毒症的保护作用
用VXD001(AcinetoVax，一种基于LPS缺乏鲍曼不动杆菌菌株灭活全细胞的疫苗，其特征是lpxC完全失活，如EP2942389A1中所述)进行接种导致了对由多样鲍曼不动杆菌临床分离株引起的致命脓毒症的保护作用。第1剂后建立的快速体液反应支持了保护作用，并检测到第1剂后建立的T细胞介导的反应(Th1、Th2、Th17)，并在第2剂后显著增强(见图2)。
如图1所示，VXD001(AcinetoVax)保护免受鲍曼不动杆菌临床分离株的感染。使用实施例3中描述的相同脓毒症模型。在用Acineto Vax二次免疫后7天(第21天)，使小鼠感染所示鲍曼不动杆菌菌株(ATCC 19606，Ab-154和Ab-113-16)，并监测了7天的存活率。ATCC19606是一种尿液感染临床分离株，用作小鼠脓毒症和肺炎感染模型的参考菌株。Ab-154是一种对碳青霉烯类药物敏感的临床分离株，来自2002年塞维利亚Virgen del Rocío医院疫情。Ab-113-16是一种全耐药临床分离株，来自2002年疫情中死亡的患者。
KapaVax鲍对曼不动杆菌引起的致命脓毒症的保护作用
AcinetoVax由LPS无效鲍曼不动杆菌AB-001细胞制成。如上所述，AcinetoVax引起的免疫力能够预防鲍曼不动杆菌感染。随着LPS从外膜被消除，作者发现负责AcinetoVax引起的保护性免疫的免疫显性OMP蛋白是鲍曼不动杆菌蛋白OmpA和Omp22。作者还通过对不同遗传背景下产生的AcinetoVax和其他鲍曼不动杆菌LPS-菌株的外膜进行质谱分析发现，OmpA和Omp22是外膜中最丰富的OMP蛋白。构建了基于在外膜表达来自其他细菌病原体的异源OMP抗原的LPS-鲍曼不动杆菌细胞的药物物质后，问题是异源OMP抗原的存在是否会影响针对鲍曼不动杆菌引起的免疫力。
如图14所示，相对于之前AcinetoVax描述的情况，药物物质KapaVax中来自肺炎克雷伯菌OmpA和OmpK36以及来自铜绿假单胞菌OprF和融合蛋白OprI::PcrV的OMP抗原的存在，并不影响疫苗保护小鼠免受鲍曼不动杆菌引起的致命脓毒症的能力。结果与以下发现一致：尽管建立在与AcinetoVax(AB001)不同的鲍曼不动杆菌(Ab283)菌株上，但KapaVax外膜的质谱分析表明鲍曼不动杆菌OmpA和Omp22仍然是外膜中最丰富的蛋白质。对如实施例1中所示构建的所有药物物质都发现了相同的结果。
实施例5.免疫原性分析显示出用表达来自其他细菌病原体的OMP抗原的LPS无效
鲍曼不动杆菌中构建的药物物质进行疫苗接种引起了针对其他细菌病原体以及针对鲍曼
不动杆菌的特异性免疫力
KapaVax引起针对肺炎克雷伯菌攻击菌株和KapaVax中包含的肺炎克雷伯菌抗原
的特异性免疫力的实施例
KapaVax2(KapaVax)由表达来自肺炎克雷伯菌OmpA和OmpK36以及铜绿假单胞菌OprF和融合蛋白OprI::PcrV的OMP抗原的LPS无效鲍曼不动杆菌Ab283细胞制成。
通过在第0天和第14天对C57BL/6小鼠(每组8-10只小鼠)肌肉注射2剂进行免疫来确定免疫原性。KapaVax候选物使用氢氧化铝为佐剂。
评估免疫原性的评价的主要变量是针对疫苗细胞、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌(靶病原体)的全细胞、针对鲍曼不动杆菌的全细胞以及针对通过间接ELISA测量的每种抗原的总IgG。所有测定均包括在相同时间点仅用溶媒免疫的对照小鼠。
如图15和16所示，KapaVax引起了针对肺炎克雷伯菌ATCC43816攻击菌株和针对KapaVax中包含的肺炎克雷伯菌抗原(即肺炎克雷伯菌OMP OmpA和OmpK36)的特异性免疫力。免疫原性数据支持肺炎克雷伯菌抗原的贡献以及针对肺炎克雷伯菌ATCC43186的全面保护的要求，如实施例3中所述。
KapaVax引起针对铜绿假单胞菌攻击菌株和KapaVax中包含的肺炎克雷伯菌抗原
的特异性免疫力的实施例
KapaVax2(KapaVax)由表达来自肺炎克雷伯菌OmpA和OmpK36以及铜绿假单胞菌OprF和融合蛋白OprI::PcrV的OMP抗原的LPS无效鲍曼不动杆菌Ab283细胞制成。
图17显示针对铜绿假单胞菌细胞的IgG水平。用KapaVax(N＝5)或单独的溶媒(N＝5)免疫的动物的在第21天(第二次免疫后7天)取样的抗血清对铜绿假单胞菌PA14细胞进行ELISA识别。统计显著性：ns，p＞0.05；*p＜0.05；**p＜0.005；***p＜0.001。红色虚线表示检测限。
图18显示了针对铜绿假单胞菌抗原OprF、OprI和PcrV的IgG水平。用2剂KapaVax(N＝4)或单独的溶媒(N＝4)免疫的动物的在第21天(第二次免疫后7天)取样的抗血清对重组蛋白进行ELISA识别。统计显著性：ns，p＞0.05；*p＜0.05；**p＜0.005；***p＜0.001。红色虚线表示检测限。
KapaVax提高针对鲍曼不动杆菌的特异性免疫力的实施例
KapaVax2(KapaVax)由表达来自肺炎克雷伯菌OmpA和OmpK36以及铜绿假单胞菌OprF和融合蛋白OprI::PcrV的OMP抗原的LPS无效鲍曼不动杆菌Ab283细胞制成。
图19显示针对鲍曼不动杆菌细胞的IgG水平。用2剂KapaVax(N＝9)或单独的溶媒(N＝9)免疫的动物的在第21天(第二次免疫后7天)取样的抗血清对鲍曼不动杆菌ATCC19606细胞进行ELISA识别。方框显示IQR，水平线和十字分别显示中位数和平均值。误差棒延伸至CI95％。通过非配对双尾Mann-Whitney检验进行统计分析(ns，p＞0.05；*p＜0.05；**p＜0.005；***p＜0.001)。红色虚线表示检测限。
实施例6.一组总体分离株的ELISA检测支持总体菌株覆盖率
本发明的许多寻求的特征之一是克服细菌疫苗的主要问题之一，通常基于来自LPS或荚膜多糖的特定糖抗原。这些疫苗是市场或临床开发中的主要疫苗类型，引起针对有限数量的细菌菌株(血清型)的特异性免疫力，而其他菌株则逃避疫苗所引起的免疫力。如先前实施例中广泛显示的，本发明的技术能够引起针对不同细菌OMP抗原的免疫力。OMP是特定细菌物种的所有细菌菌株中甚至跨细菌物种中非常保守的蛋白质。实施例1中所示的所有药物物质的疫苗等位基因的选择(也参见疫苗等位基因的序列，SEQ ID NO：2-16，不包括N-末端信号肽)是基于各病原体的所有流行菌株中最流行的高度保守的OMP等位基因进行的。不过假设是，由本发明制造的疫苗产生的免疫力将在各病原体的所有流行菌株多样性中具有高覆盖率，即，将是普遍性的。以下实施例是用KapaVax产生的抗血清制成的，示出了作者正在获得支持这一假设的结果。KapaVax2(KapaVax)由表达来自肺炎克雷伯菌OmpA和OmpK36以及铜绿假单胞菌OprF和融合蛋白OprI::PcrV的OMP抗原的LPS无效鲍曼不动杆菌Ab283细胞制成。
图20示出了，KapaVax2抗血清显示对一组15种多样肺炎克雷伯菌总体临床分离株中的93％具有特异性识别(73％的ELISA滴度高于或类似于针对攻击菌株肺炎克雷伯菌ATCC43816的滴度)。此外，KapaVax2抗血清显示对一组15种多样铜绿假单胞菌总体临床分离株中的100％具有特异性识别(93％的ELISA滴度高于或类似于针对攻击菌株PA14的滴度)。
图20中使用的菌株组多样性信息用于确认疫苗抗血清的普遍性，如表2和表3所示。菌株组涵盖了目前在全球范围内流行的肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌临床分离株的所有主要类型。
图21还示出了，针对肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌的KapaVax抗血清所表现出的普遍性也适用于应用本发明制成的多病原体疫苗所靶向的第三病原体，即鲍曼不动杆菌。图21中使用的菌株组多样性信息用于确认疫苗抗血清的普遍性，如表4所示。
表2
表2.肺炎克雷伯菌临床分离株的收集。图中显示了临床分离株的原产国、序列类型、每种细菌菌株的K基因座(荚膜)类型和O型(O多糖血清型)。
表3.
| 分离株编号 | 分离株产地 | ST | O血清型 |
| 攻击菌株 | PA14 | 253 | O10 |
| #1 | 科特迪瓦 | 235 | O11 |
| #2 | 尼日利亚 | 235 | O11 |
| #3 | 中非共和国 | 235 | O11 |
| #4 | 瑞士 | 235 | O11 |
| #5 | 尼日利亚 | 235 | O11 |
| #6 | 瑞士 | 235 | O11 |
| #7 | 瑞士 | 235 | O11 |
| #8 | 法国 | 235 | O11 |
| #9 | 西班牙 | 235 | O11 |
| #10 | 法国 | 111 | O12 |
| #11 | 尼日利亚 | 111 | O12 |
| #12 | 法国 | 111 | O12 |
| #13 | 法国 | 111 | O12 |
| #14 | 西班牙 | 111 | O12 |
| #15 | 西班牙 | 175 | O4 |
| #16 | 西班牙 | 175 | O4 |
| #17 | 西班牙 | 274 | O3 |
| #18 | 西班牙* | 1089 | O3 |
| #19 | 英格兰* | 146 | O6 |
| #20 | 加纳 | 233 | O6 |
| #21 | 突尼斯 | 654 | O4 |
| #22 | 泰国 | 260 | O6 |
| #23/#24/#28 | USA | 298 | O11 |
| #25/#26/#27 | USA | 446 | O11 |
表3.铜绿假单胞菌临床分离株的收集。该图显示了临床分离株的原产国、序列类型和每种细菌菌株的O型(O多糖血清型)。
表4.
| 分离株编号 | 分离株产地 | ST | K基因座 | OC基因座 |
| 攻击菌株 | ATCC19606 | 52 | KL3 | OCL1 |
| #1 | USA | 1 | KL4 | OCL2 |
| #2 | 阿根廷 | 1 | KL1 | OCL1 |
| #3 | 印度 | 1 | KL15 | OCL3 |
| #4 | 巴基斯坦 | 1 | KL125 | OCL2 |
| #5 | 波多黎各 | 1 | KL1 | OCL1 |
| #6 | 澳大利亚 | 2 | KL2 | OCL1 |
| #7 | 中国 | 2 | KL34 | OCL1 |
| #8 | 韩国 | 2 | KL2 | OCL1 |
| #9 | 南非 | 2 | KL2 | OCL1 |
| #10 | USA | 780 | KL1 | OCL1 |
| #11 | 南非 | 3 | KL1 | OCL1 |
| #12 | USA | 79 | KL124 | OCL10 |
| #13 | 阿根廷 | 79 | KL22 | OCL10 |
| #14 | 哥伦比亚 | 79 | KL12 | OCL10 |
| #15 | 墨西哥 | 422 | KL7 | OCL10 |
| #16 | 新加坡 | 25 | KL10 | OCL7 |
| #17 | 阿根廷 | 25 | KL14 | OCL7 |
| #18 | 墨西哥 | 25 | KL7 | OCL7 |
| #19 | 西班牙 | 2 | KL2 | OCL1 |
| #20 | 西班牙 | 2 | KL2 | OCL1 |
| #21 | 西班牙 | 745 | KL2 | OCL1 |
| #22 | 西班牙 | 3 | KL1 | OCL1 |
| #23 | 西班牙 | 79 | KL3 | OCL10 |
| #24 | 西班牙 | 79 | KL3 | OCL10 |
表4.鲍曼不动杆菌临床分离株的收集。图中显示了临床分离株的原产国、序列类型、每种细菌菌株的K基因座(荚膜)类型和OC类型。
实施例7.鲍曼不动杆菌免疫显性抗原OmpA和Omp22在KapaVax2外膜上的暴露
KapaVax2(KapaVax)由表达来自肺炎克雷伯菌OmpA和OmpK36以及铜绿假单胞菌OprF和融合蛋白OprI::PcrV的OMP抗原的LPS无效鲍曼不动杆菌Ab283细胞制成。通过蛋白质印迹从KapaVax疫苗批次的粗提物中检测到来自鲍曼不动杆菌OmpA和Omp22的免疫显性OMP。
图22显示KapaVax2和AcinetoVax疫苗批次(来自疫苗批次的总裂解物制剂(2x1010个细胞/ml))中鲍曼不动杆菌抗原的表达。样品在具有4％-16％丙烯酰胺梯度的凝胶上运行。图中显示使用针对OmpA(左)和Omp22(右)产生的单克隆抗体获得的信号。
图23显示鲍曼不动杆菌Omp22在KapaVax和载体细胞Ab283 LPS-的外模处的表面暴露。培养物生长后洗涤，在PBS中重悬，并在37℃下用0.5mg/ml蛋白酶K处理1小时。使用针对Ab-Omp22产生的单克隆抗体进行蛋白质印迹。每个样品中用蛋白酶K处理以+(处理)或–(不处理)表示。Mb：外膜提取物；S：提取物上清液。方案示于实施例2中。
实施例8.也可以从鲍曼不动杆菌的LPS无效细胞中纯化外膜囊泡，并且含有来自其他细菌病原体的OMP异源抗原。
如EP2942389A1的作者所教导的以及此处所示的，可以从鲍曼不动杆菌LPS无效衍生体的培养物中纯化外膜囊泡(OMV)，并且可以替代地取代全细胞用作药物物质。作者发现，当来自其他细菌病原体的异源OMP抗原在LPS无效鲍曼不动杆菌细胞的外膜上表达时，释放OMV的能力不会受到损害。作者从实施例1中描述的药物物质的细胞中纯化了OMV。
用于OMV纯化的方案如下：从在Müeller Hilton II中于30℃和150rpm摇动下生长的200ml过夜培养物中获得OMV。生长后，将培养物在4℃下以10000xg离心15分钟，保存上清液并丢弃沉淀。此步骤重复3次。首先使用0.22微米过滤器过滤来浓缩OMV。将过滤的OMV重悬于10-15ml耐溶剂缓冲液中。然后，将OMV在4℃下以100000xg超速离心6小时。小心弃去超速离心的上清液，并将沉淀重悬于2ml无菌PBS中。通过尺寸排阻色谱(SEC)进行OMV的纯化，收集级分并通过蛋白质印迹评估每个级分中OMV的存在。
例如，从DS3(K-Vax)和载体细胞LPS无效鲍曼不动杆菌Ab283中纯化OMV的结果如图24所示。K-Vax是在外膜上表达来自肺炎克雷伯菌的OMP OmpA和OmpK36的LPS无效鲍曼不动杆菌Ab283细胞。
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Claims (17)
1.一种组合物，包含：
a.缺乏脂多糖(LPS)的鲍曼不动杆菌(A.baumannii)菌株，其特征在于编码内源LPS生物合成基因的一种或多种细胞核酸分子部分或完全失活；其中所述缺乏脂多糖(LPS)的鲍曼不动杆菌菌株的特征在于选自由以下组成的列表中的基因部分或完全失活：lpxA、lpxB、lpxC、lpxD、lpxK、lpxL和/或lpxM；并且其中所述缺乏脂多糖(LPS)的鲍曼不动杆菌菌株表达被靶向位置位于外膜处的一种或多种异源抗原或蛋白；和/或
b.衍生自如上a)段中所定义的缺乏脂多糖(LPS)的鲍曼不动杆菌菌株的外膜囊泡(OMV)；
其中所述被靶向位置位于外膜处的一种或多种异源抗原的特征在于包含：
I.位于所述一种或多种异源抗原的N末端的衍生自外膜蛋白(OMP)的信号序列，所述信号序列被鲍曼不动杆菌加工以将表达的蛋白定位至鲍曼不动杆菌的外膜；
II.整合OMP蛋白的典型OMP跨膜结构域或细菌脂蛋白的典型OMP跨膜结构域，其允许所述表达的蛋白插入在鲍曼不动杆菌的外膜处；和
III.免疫原性结构域；
并且其中所述菌株通过在鲍曼不动杆菌染色体中在能够通过重组来掺入插入物的基因座处插入表达构建体而被修饰以表达所述被靶向位置位于外膜处的一种或多种异源抗原，所述表达构建体包含至少一个或多个转录启动子序列、编码一个或多个异源抗原的一个或多个ORF(开放阅读框)和一个或多个转录终止序列，以及所述基因座选自由以下组成的列表：cysI、trpE、lpxA、lpxC、lpxD、lpxB、lpxK、lpxL、lpxM和/或Tn5/Tn7位点。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述信号序列是鲍曼不动杆菌的外膜蛋白OmpA(SEQ ID NO：1)或与SEQ ID NO：1的全长序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的任何信号序列，前提是这些一致的序列能够被鲍曼不动杆菌细胞加工以促进所述表达的蛋白在鲍曼不动杆菌的所述外膜中定位。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中，所述鲍曼不动杆菌染色体中所述能够通过重组来掺入插入物的基因座是cysI。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中，所述缺乏脂多糖(LPS)的鲍曼不动杆菌菌株的所述外膜处表达的所述异源抗原或蛋白至少衍生自肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、大肠杆菌(E.coli)和/或胸膜肺炎放线杆菌(A.pleuropneumoniae)。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中，所述缺乏脂多糖(LPS)的鲍曼不动杆菌菌株的所述外膜处表达的所述异源抗原或蛋白至少衍生自肺炎克雷伯菌并且选自由以下组成的列表：Kp-OmpA(SEQ ID NO：31或17)和Kp-Ompk36(SEQ ID No：32或18)，或与SEQ ID NO：31、32、17或18中任一个的全长序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的任何序列，所述序列在通过使用能够被鲍曼不动杆菌细胞加工以促进表达的蛋白在鲍曼不动杆菌的外膜中定位的信号序列而在鲍曼不动杆菌的外膜中以一个或多个拷贝表达或暴露时并且在被接种到有需要的对象、优选人类对象中后，产生免疫、优选保护性免疫反应，所述免疫不仅针对鲍曼不动杆菌感染而且还针对肺炎克雷伯菌引起的感染。
6.根据权利要求4所述的组合物，其中，所述缺乏脂多糖(LPS)的鲍曼不动杆菌菌株的所述外膜处表达的所述异源抗原至少衍生自铜绿假单胞菌并且选自由以下组成的列表：Pa-OprF(SEQ ID NO：33或19)、Pa-OprI(SEQ ID NO：35或21)、Pa-PcrV(SEQ ID NO：45)、或Pa-OprI:PcrV(SEQ ID NO：34或20)、或与SEQ ID NO：33-35、19-21或45中任一个的全长序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的任何序列，所述序列在通过使用能够被鲍曼不动杆菌细胞加工以促进表达的蛋白在鲍曼不动杆菌的外膜中定位的信号序列而在鲍曼不动杆菌的外膜中以一个或多个拷贝表达或暴露时并且在被接种到有需要的对象、优选人类对象中后，产生免疫、优选保护性免疫反应，所述免疫不仅针对鲍曼不动杆菌感染而且还针对铜绿假单胞菌引起的感染。
7.根据权利要求4所述的组合物，其中，所述缺乏脂多糖(LPS)的鲍曼不动杆菌菌株的所述外膜处表达的所述异源抗原至少衍生自大肠杆菌并且选自由以下组成的列表：Ec-OmpA(SEQ ID NO：36或22)、Ec-OmpX(SEQ ID NO：37或23)、Ec-FuyA(SEQ ID NO：38或24)、Ec-Hma(SEQ ID NO：39或25)或Ec-IutA(SEQ ID NO：40或26)，包括与SEQ ID NO：22-26或36-40中任一个的全长序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的任何序列，所述序列在通过使用能够被鲍曼不动杆菌细胞加工以促进表达的蛋白在鲍曼不动杆菌的外膜中定位的信号序列而在鲍曼不动杆菌的外膜中以一个或多个拷贝表达或暴露时并且在被接种到有需要的对象、优选人类对象中后，产生免疫、优选保护性免疫反应，所述免疫不仅针对鲍曼不动杆菌感染而且还针对大肠杆菌引起的感染。
8.根据权利要求4所述的组合物，其中，所述缺乏脂多糖(LPS)的鲍曼不动杆菌菌株的所述外膜处表达的所述异源抗原至少衍生自胸膜肺炎放线杆菌并且选自由以下组成的列表：Ap-OmpA(SEQ ID NO：27或41)、Ap-OmpW(SEQ ID NO：28或42)、Ap-TbpA(SEQ ID NO：29或43)、或Ap-ApfA(SEQ ID NO：30或44)，包括与SEQ ID NO：27-30或41-44中任一个的全长序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的任何序列，所述序列在通过使用能够被鲍曼不动杆菌细胞加工以促进表达的蛋白在鲍曼不动杆菌的外膜中定位的信号序列而在鲍曼不动杆菌的外膜中以一个或多个拷贝表达或暴露时并且在被接种到有需要的对象、优选人类对象中后，产生免疫、优选保护性免疫反应，所述免疫不仅针对鲍曼不动杆菌感染而且还针对胸膜肺炎放线杆菌引起的感染。
9.根据权利要求4所述的组合物，其中，所述缺乏脂多糖(LPS)的鲍曼不动杆菌菌株的所述外膜处表达的所述异源抗原至少：根据权利要求5所述衍生自肺炎克雷伯菌并且选自由Kp-OmpA和/或Kp-OmpK36和/或其任何一致序列组成的列表；和/或根据权利要求6所述衍生自铜绿假单胞菌并且选自由Pa-OprF和/或Pa-OprI、和/或融合蛋白Pa-OprI::PcrV、和/或其任何一致序列组成的列表；和/或根据权利要求7所述衍生自大肠杆菌并且选自由Ec-OmpA和/或Ec-OmpX和/或Ec-FuyA和/或Ec-Hma和/或Ec-IutA，和/或其任何一致序列组成的列表；和/或根据权利要求8所述衍生自胸膜肺炎放线杆菌并且选自由Ap-OmpA和/或Ap-OmpW和/或Ap-TbpA和/或Ap-ApfA，和/或其任何一致序列组成的列表，并且优选地，所述缺乏脂多糖(LPS)的鲍曼不动杆菌菌株还包含鲍曼不动杆菌抗原Ab-OmpA和Ab-Omp22的表达。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中，所述缺乏脂多糖(LPS)的鲍曼不动杆菌菌株还包含鲍曼不动杆菌抗原Ab-OmpA和Ab-Omp22的表达。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中，所述缺乏脂多糖(LPS)的鲍曼不动杆菌菌株的特征在于选自由lpxA、lpxB、lpxC组成的列表中的基因部分或完全失活。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其用于治疗。
13.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其用于递送细菌外膜抗原至有需要的对象、优选人类对象中。
14.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其用于递送细菌外膜抗原，以在有需要的对象、优选人类对象中诱导至少针对肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌和/或胸膜肺炎放线杆菌和可选的鲍曼不动杆菌的免疫保护反应。
15.一种疫苗组合物，包含权利要求1至11中任一项所定义的缺乏脂多糖(LPS)的鲍曼不动杆菌菌株。
16.根据权利要求15所述的疫苗，其中，所述疫苗包含约106至约1012个缺乏脂多糖(LPS)的鲍曼不动杆菌菌株，优选约109个缺乏脂多糖(LPS)的鲍曼不动杆菌菌株。
17.根据权利要求15或16中任一项所述的疫苗，其中，所述疫苗包含佐剂，优选Al(OH)3。
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