CN118382642A

CN118382642A - 抗HSP90α抗体及其用途

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Publication number: CN118382642A
Application number: CN202180104363.8A
Authority: CN
Inventors: 黄智兴; 徐祖安; 洪慧贞; 柯屹又
Original assignee: Taiwan Institute Of Health
Current assignee: Taiwan Institute Of Health
Priority date: 2021-11-22
Filing date: 2021-11-22
Publication date: 2024-07-23
Also published as: WO2023091148A1; EP4437002A1

Abstract

本公开提供了一种分离的抗体，包括：能够与分别在氨基酸235至244以及氨基酸251至260区域中含有两个EDK位点的HSP90α表位结合的新颖互补决定区(CDR)。也本公开还提供了对应于上述抗体的核酸分子、包含上述抗体或对应核酸分子的医药组合物，以及使用上述抗体治疗和监测癌症的方法。

Description

抗HSP90α抗体及其用途

技术领域

本公开涉及一种抗HSP90α抗体及其用途。更具体地，本公开涉及一种分离的抗HSP90α抗体、包含该抗体的医药组合物以及使用该抗体治疗癌症的方法。

背景技术

癌症的发展和进展不仅取决于上皮细胞的遗传和表观遗传改变，还取决于其基质微环境的关键变化，基质微环境由细胞外基质(ECM)和基质细胞(如纤维母细胞和免疫细胞)组成。参见Pandol S,Edderkaoui M,Gukovsky I,Lugea A,Gukovskaya A.Desmoplasiaof pancreatic ductal adenocarcinoma.Clin Gastroenterol Hepatol 2009；7(11):S44–7。组织间质增生(desmoplasia)是许多恶性肿瘤(如胰管腺癌(PDAC)和大肠直肠癌(CRC))的共同特征，由大量ECM以及大量表达α-平滑肌动蛋白(α-SMA)为定义标记物的肌纤维母细胞(myofibroblasts)引起。这种肌纤维母细胞，也称为活化纤维母细胞或癌症相关纤维母细胞(CAF)，有助于肿瘤生长、免疫抑制和恶性进展。参见于下列文献:Orimo A,Gupta PB,Sgroi DC,Arenzana-Seisdedos F,Delaunay T,Naeem R,et al.Stromalfibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growthand angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion.Cell2005；121(3):335–48；Lakins MA,Ghorani E,Munir H,Carla P.Martins CP,Shields JD.Cancer-associated fibroblasts induce antigen-specific deletion of CD8+T cells toprotect tumour cells.Nat Commun 2018；9(1):948；Turley SJ,Cremasco V,AstaritaJL.Immunological hallmarks of stromal cells in the tumourmicroenvironment.Nat Rev Immunol 2015；15(11):669–82；以及Beacham DA,CukiermanE.Stromagenesis:the changing face of fibroblastic microenvironments duringtumor progression.Semin Cancer Biol2005；15(5):329–41。它们构成了大部分肿瘤的基质细胞，且来自于多种细胞来源，例如组织常驻型纤维母细胞、星状细胞、间质干细胞/前驱细胞和浸润性纤维细胞。参见Sugimoto H,Mundel TM,Kieran MW,KalluriR.Identification of fibroblast heterogeneity in the tumormicroenvironment.Cancer Biol Ther 2006；5(12):1640–6。此外，CAF也可由内皮细胞的内皮间质转化(EndoMT)产生。参见Zeisberg EM,Potenta S,Xie L,Zeisberg M,KalluriR.Discovery of endothelial to mesenchymal transition as a source forcarcinoma-associated fibroblasts.Cancer Res 2007；67(21):10123–8。在我们先前的研究中，在CRC组织样品中观察到表现骨桥蛋白(osteopontin，OPN)的巨噬细胞附近，检测到带有α-SMA+CD31+细胞的EndoMT衍生的CAF。参见Fan CS,Chen WS,Chen LL,Chen CC,HsuYT,Chua KV,et al.Osteopontin–integrin engagement induces HIF-1α–TCF12-mediated endothelial-mesenchymal transition to exacerbate colorectalcancer.Oncotarget2018；9(4):4998–5015。OPN诱导内皮细胞的EndoMT，由此产生的EndoMT衍生的CAF通过分泌HSP90α来促进CRC细胞干性，借此表现出有效的肿瘤促进作用。参见FanCS,Chen WS,Chen LL,Chen CC,Hsu YT,Chua KV,et al.Osteopontin–integrinengagement induces HIF-1α–TCF12-mediated endothelial-mesenchymal transitionto exacerbate colorectal cancer.Oncotarget2018；9(4):4998–5015。最近，我们还发现EndoMT衍生的CAF与PDAC细胞混合移殖入老鼠体内后，可以明显地招募骨髓衍生的巨噬细胞，阻止免疫T细胞并促进肿瘤生长。参见Fan CS,Chen LL,Hsu TA,et al.Endothelial-mesenchymal transition harnesses HSP90α-secreting M2-macrophages toexacerbate pancreatic ductal adenocarcinoma.J Hematol Oncol 2019；12:138。EndoMT衍生的CAF所分泌的HSP90α可以通过细胞表面受体CD91和TLR4以及下游的MyD88-JAK2/TYK2-STAT-3途径，进一步诱导巨噬细胞M2极化和更多HSP90α分泌。参见See Fan CS,Chen LL,Hsu TA,et al.Endothelial-mesenchymal transition harnesses HSP90α-secreting M2-macrophages to exacerbate pancreatic ductal adenocarcinoma.JHematol Oncol 2019；12:138。

HSP90α是一种众所周知的细胞伴侣蛋白(chaperone)，在细胞内帮助许多客户蛋白(client protein)的折叠、成熟和运输，包括癌症相关的Bcr-Abl、ErbB2/Neu、Akt,HIF-1α、突变的p53及Raf-1都是其辅助的对象。参见Trepel JB,Mollapour M,Giaccone G,Neckers L.Targeting the dynamic Hsp90 complex in cancer.Nat Rev Cancer 2010；10(8):537–49。除了在细胞内，HSP90α也可从受伤组织中的角质细胞和纤维母细胞分泌到胞外，另外，在不利的组织微环境下，癌细胞也会大量表达和分泌出HSP90α，以加速癌细胞上皮间质转化(EMT)、迁移、侵袭和转移。参见Li W,Li Y,Guan S,Fan J,Cheng C-F,BrightAM,et al.Extracellular heat shock protein-90α:linking hypoxia to skin cellmotility and wound healing.EMBO J 2007；26(5):1221–33；Xu A,Tian T,Hao J,Liu J,Zhang Z,Hao J,et al.Elevation of serum HSP90αcorrelated with the clinicalstage of non-small cell lung cancer.J Cancer Mol 2007；3(4):107–12；和Wang X,Song X,Zhuo W,Fu Y,Shi H,Liang Y,et al.The regulatory mechanism of HSP90αsecretion and its function in tumor malignancy.Proc Natl Acad Sci USA 2009；106(50):21288–93。临床上，包括CRC和PDAC在内的数种恶性肿瘤病人，在其癌症的前期即可检测到血清/血浆的HSP90α含量有升高的情形。参见Wang X,Song X,Zhuo W,Fu Y,ShiH,Liang Y,et al.The regulatory mechanism of HSP90αsecretion and its functionin tumor malignancy.Proc Natl Acad Sci USA 2009；106(50):21288–9；Wang X,SongX,Zhuo W,Fu Y,Shi H,Liang Y,et al.The regulatory mechanism of HSP90αsecretionand its function in tumor malignancy.Proc Natl Acad Sci USA 2009；106(50):21288–93；Chen JS,Hsu YM,Chen CC,Chen LL,Lee CC,Huang TS.Secreted heat shockprotein 90αinduces colorectal cancer cell invasion through CD91/LRP-1and NF-κB-mediated integrinαV expression.J Biol Chem 2010；285(33):25458–66；和Chen CC,Chen LL,Li CP,Hsu YT,Jiang SS,Fan CS,et al.Myeloid-derived macrophages andsecreted HSP90αinduce pancreatic ductal adenocarcinomadevelopment.OncoImmunology2018；7(5):e1424612。已知胰脏炎是罹患PDAC的高危险因子，而胰脏炎患者的血液样本也可检测到细胞外HSP90α(eHSP90α)含量有升高的现象，此意味着过量的eHSP90α可能与PDAC的形成有关，这个假说可以从实验鼠模型获得支持，在胰管表皮细胞表达活化型K-Ras的转基因鼠自发性发展出PDAC之前，eHSP90α可自浸润胰脏的骨髓衍生的巨噬细胞和所刺激的胰管上皮细胞产生，以促进PDAC的形成。参见Chen CC,ChenLL,Li CP,Hsu YT,Jiang SS,Fan CS,et al.Myeloid-derived macrophages andsecreted HSP90αinduce pancreatic ductal adenocarcinomadevelopment.OncoImmunology 2018；7(5):e1424612。此外，由EndoMT衍生的CAF分泌的HSP90α或重组HSP90α(rHSP90α)能够诱发巨噬细胞M2标记的表达和大量HSP90α分泌的前馈回路(feedforward loop)，因而可解释为什么M2极化的巨噬细胞不仅会引起免疫抑制和促进血管生成，还会造成一个富含eHSP90α的肿瘤微环境，以促进PDAC细胞的肿瘤生长和恶化。参见Fan CS,Chen LL,Hsu TA,et al.Endothelial-mesenchymal transitionharnesses HSP90α-secreting M2-macrophages to exacerbate pancreatic ductaladenocarcinoma.J Hematol Oncol 2019；12:138。总而言之，eHSP90α无论在肿瘤形成的开始阶段或是其后来的恶化过程都扮演了关键角色，可被视为是重要的治疗标靶。

在我们先前的研究中，我们合成了一种不能通过细胞膜的小分子HSP90α抑制剂来针对eHSP90α。参见Chen CC,Chen LL,Li CP,Hsu YT,Jiang SS,Fan CS,et al.Myeloid-derived macrophages and secreted HSP90αinduce pancreatic ductaladenocarcinoma development.OncoImmunology2018；7(5):e1424612。虽然其对PDAC细胞生长成肿瘤及发生转移有一定的抑制效果，但由于容易自小鼠体内排出，频繁给药却引起了小鼠脾脏的肿大。另一方面，我们在使用HSP90α的小鼠单株抗体时获得了令人鼓励的成果，在我们先前发表的研究结果里，HSP90α的小鼠单株抗体对EndoMT所促进的、并有M2巨噬细胞参与的PDAC细胞的肿瘤生长具有明显的治疗效果，该抗体可减少eHSP90α与其细胞表面受体的连接，进而防止eHSP90α诱导的HSP90α表达和分泌的前馈回路。参见Fan CS,ChenLL,Hsu TA,et al.Endothelial-mesenchymal transition harnesses HSP90α-secretingM2-macrophages to exacerbate pancreatic ductal adenocarcinoma.J Hematol Oncol2019；12:138。我们的另一项研究成果也支持了这一发现，酸辛酯(octyl gallate，OG)是一种在食品和化妆品中安全使用的抗氧化剂和防腐剂，我们发现酸辛酯可以通过阻断eHSP90α与其细胞表面受体TLR4的连接，而抑制EndoMT衍生的CAF所诱导的巨噬细胞M2极化作用及相关的eHSP90α的前馈回路。参见Chua KV,Fan CS,Chen LL,Chen CC,Hsieh SC,HuangTS.Octyl gallate induces pancreatic ductal adenocarcinoma cell apoptosis andsuppresses endothelial-mesenchymal transition-promoted M2-macrophages,HSP90αsecretion,and tumor growth.Cells 2020；9(1):91。

总而言之，eHSP90α是组织间质增生及M2巨噬细胞有关的肿瘤恶化的潜在治疗靶点，开发出有效果的抗HSP90α抗体是发展对付eHSP90α的靶点治疗的有价值和有希望的策略。

发明内容

作为本公开的一个方面，本文描述一种分离的抗体。该分离的抗体包括：能够与在氨基酸235至244以及氨基酸251至260区域中含有氨基酸序列EDK的HSP90α表位专一性结合的新的互补决定区(CDR)。

在一些实施例中，HSP90α可以是eHSP90α。

在一些实施例中，该分离的抗体可包括：SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：12的重链可变区序列的重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3；以及SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：17的轻链可变区序列的轻链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3。

在一些实施例中，重链CDR1、CDR2和CDR3是来自SEQ ID NO:2，且轻链CDR1、CDR2和CDR3可来自SEQ ID NO:7。

在一些实施例中，分离的抗体可包含与SEQ ID NO:2序列至少80％(例如85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的一重链可变区，以及与SEQ ID NO：7序列至少80％(例如85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的一轻链可变区。

在一些实施例中，重链CDR1可具有SEQ ID NO:3序列，重链CDR2可具有SEQ ID NO:4序列，重链CDR3可具有SEQ ID NO:5序列，轻链CDR1可具有SEQ ID NO:8序列，轻链CDR2可具有SEQ ID NO:9序列，以及轻链CDR3可具有SEQ ID NO:10序列。

在一些实施例中，重链CDR1、CDR2和CDR3可来自SEQ ID NO:12，并且轻链CDR1、CDR2和CDR3是来自SEQ ID NO:17。

在一些实施例中，分离的抗体可包含与SEQ ID NO:12序列至少80％(例如85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的一重链可变区，以及与SEQ ID NO:17序列至少80％(例如85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的一轻链可变区。

在一些实施例中，重链CDR1可具有SEQ ID NO:13序列，重链CDR2可具有SEQ IDNO:14序列，重链CDR3可具有SEQ ID NO:15序列，轻链CDR1可具有SEQ ID NO:18序列，轻链CDR2可具有SEQ ID NO:19序列，以及轻链CDR3可具有SEQ ID NO:20序列。

在一些实施例中，分离的抗体可为一包含Fc区的抗体、一Fab片段、一Fab’片段、一F(ab')2片段、一单链抗体、一scFV多聚体、一单株抗体、一单价抗体、一多特异性抗体、一人源化抗体或一嵌合抗体。

本文还描述了核酸分子，其包含编码本文公开的抗体的核酸序列。

在一些实施例中，本文提供一种宿主细胞，其包含该核酸分子。

本文还描述了一种医药组合物，其包含本文所述的抗体或包含编码本文公开的抗体的核酸序列的核酸分子。医药组合物可进一步包括医药可接受的载体和/或另一种治疗剂(例如另一种癌症药物、细胞毒剂或免疫调节剂)。治疗剂的示例可包括但不限于吉西他滨(gemcitabine)。

eHSP90α可用于组织间质增生(特别是癌组织间质增生)的治疗策略，因此，本文还描述了用于治疗主体的癌组织间质增生的方法，包括：向该所需主体施用一靶向eHSP90α的治疗剂。

在一些实施例中，本文所述的抗体还可用于抑制癌细胞生长或癌细胞转移。因此，本文描述的是治疗主体中癌症的方法，包括：向所需主体施用有效量的本文所述的抗体或含有编码本文公开的抗体的核酸序列的核酸分子。

在一些实施例中，本文所述的抗体还可用于减少组织间质增生或防止组织间质增生。因此，本文描述的是用于治疗主体中组织间质增生的方法，包括：向所需主体施用有效量的本文所述的抗体或含有编码本文公开的抗体的核酸序列的核酸分子。在此，组织间质增生可以是癌组织间质增生。

在一些实施例中，该方法还可以包括向主体施用另一种治疗剂。给予治疗剂的时间没有特别限制。在一些实施例中，可以在施用抗体或核酸分子时施用治疗剂。在一些实施例中，可以在施用抗体或核酸分子之后施用治疗剂。

在一些实施例中，可以使用本文所述的分离抗体检测主体的血液HSP90α含量，以监测在治疗癌症或组织间质增生的方法中主体的肿瘤缩小。在一些实施例中，主体的血液HSP90α含量可以是主体的全血或血清中的血液HSP90α含量。

在一些实施例中，癌症可具有组织间质增生特征。

在一些实施例中，癌症可具有M2巨噬细胞恶化特征。

癌症的示例可包括但不限于胰脏癌、结肠癌、乳癌、肝癌或肺癌。

本文还提供了一种评估主体肿瘤缩小的方法，包括：获取主体的血液样品；并确定血液样品中的HSP90α含量。在一些实施例中，血液样品可以是全血或血清。

在一些实施例中，用于评估主体中肿瘤缩小的方法可包括：获取施用了IgG的主体的血液样品以及施用了如本文所述的抗体或包含编码本文公开的抗体的核酸序列的核酸分子的另一主体的另一血液样品；测定施用如本文所述的IgG、抗体或核酸分子的主体的血液样品中的HSP90α含量。当施用本文公开的抗体或核酸分子的主体的血液样品中的HSP90α含量低于施用IgG的主体的血液样品中的HSP90α含量时，表示本文所述的抗体或核酸分子可有效地抑制肿瘤的生长或缩小肿瘤体积。

本公开的一或多个实施例的细节在以下描述中阐述。本公开的其他特征、目的和优点从描述和权利要求中显而易见。

附图说明

图1是一组显示小鼠抗HSP90α单株抗体特性分析的图表；(a)以西方墨点法分析源自rHSP90α免疫小鼠的六个融合瘤殖株的培养上清液的HSP90α结合能力；(b)以ELISA分析以上六个融合瘤殖株的培养上清液的HSP90α结合活性；(c)亚型特性分析Clone-2和Clone-6抗体，鉴定其为含有κ轻链的IgG2b同型免疫球蛋白；(d)以邻位连接测试(proximityligation assay，PLA)分析Clone-2和Clone-6抗体对HSP90α与CD91的分子结合及CD91与IKKα的分子结合的影响，测试条件为胰管腺癌PANC-1细胞株以rHSP90α(15μg/ml)刺激的同时存在有10μg/ml的对照IgG或Clone-2或Clone-6抗体；(e)细胞侵袭能力测试(Transwellinvasion assay)显示rHSP90α能够诱发癌细胞侵袭能力，测试条件为SW620、LoVo和BxPC-3癌细胞株经PBS或rHSP90α(15μg/ml)预处理16小时；(f)以细胞侵袭能力测试法分析Clone-2或Clone-6抗体对rHSP90α诱发癌细胞侵袭能力的影响，测试条件为SW620和PANC-1癌细胞株经15μg/ml的rHSP90α加10μg/ml的对照IgG或Clone-2或Clone-6抗体预处理16小时；(g)以细胞类球体形成能力测试法分析Clone-2或Clone-6抗体对rHSP90α诱发癌细胞干性的影响，测试条件为SW620、PANC-1和Panc 02癌细胞株分别种植入含15μg/ml的rHSP90α加10μg/ml的对照IgG或Clone-2或Clone-6抗体的类球体形成培养基；

图2是人源化抗HSP90α抗体的特性分析的图表；(a)使用Biacore T200测定分析人源化HSP90α抗体Clone-2-chimera、Clone-2-hA、Clone-2-hB和Clone-2-hC对HSP90α的结合动力学；(b)由(a)的分子结合感测图并套用简易1:1交互模式计算出Clone-2-chimera、Clone-2-hA、Clone-2-hB和Clone-2-hC抗体的平衡解离常数(KD)值；(c)以细胞侵袭能力测试法分析Clone-2-chimera、Clone-2-hA、Clone-2-hB和Clone-2-hC抗体对rHSP90α诱发癌细胞侵袭能力的影响，测试条件为PANC-1癌细胞株经15μg/ml的rHSP90α加10μg/ml的对照IgG、Clone-2、Clone-2-chimera、Clone-2-hA、Clone-2-hB或Clone-2-hC抗体预处理16小时；(d)以细胞类球体形成能力测试法分析Clone-2-chimera、Clone-2-hA、Clone-2-hB和Clone-2-hC抗体对rHSP90α诱发癌细胞干性的影响，测试条件为PANC-1细胞种植入含15μg/ml的rHSP90α加10μg/ml的对照IgG、Clone-2、Clone-2-chimera、Clone-2-hA、Clone-2-hB或Clone-2-hC抗体的类球体形成培养基；(e)分析17-AAG和人源化HSP90α抗体HH01(即Clone-2-hA)对视网膜色素上皮细胞的毒性，测试条件为人类视网膜色素上皮细胞株ARPE-19细胞分别用系列浓度的17-AAG和HH01抗体处理72小时，然后评估其存活率；(f)人源化HSP90α抗体HH01的药物动力学研究，测试条件为单一剂量10mg/kg的HH01抗体经静脉(IV)注射入5只公小鼠中；

图3是一组鉴定结果显示Clone-2-chimera和HH01(即Clone-2-hA)抗体所辨识的HSP90α表位；(a)以蛋白质区域扫描测定法(domain scanning assay)大致勾勒出Clone-2抗体所结合的HSP90α区域；(b)以胜肽扫描测定法(peptide scanning assay)进一步推断出Clone-2-chimera抗体所结合的HSP90α位点的氨基酸序列；(c)以胜肽扫描测定法推断出HH01抗体所结合的HSP90α位点的氨基酸序列；(d)以丙胺酸扫描测定法(alanine scanningassay)推断出Clone-2-chimera和HH01抗体所结合的HSP90α位点的关键性氨基酸；(e)以细胞侵袭能力测试法分析HSP90α表位对rHSP90α诱发癌细胞侵袭能力的影响，测试条件为PANC-1癌细胞株经15μg/ml的rHSP90α加15μg/ml的对照胜肽(P-ctrl)或含表位胜肽(P-46)预处理16小时；(f)以细胞类球体形成能力测试法分析HSP90α表位对rHSP90α诱发癌细胞干性的影响，测试条件为PANC-1细胞种植入含15μg/ml的rHSP90α加15μg/ml的对照胜肽(P-ctrl)或含表位胜肽(P-46)的类球体形成培养基。

图4是一组实验鼠数据显示HH01抗体在具有组织间质增生的小鼠PDAC模型中的预防功效；(a)马森三色染色法(Masson's trichrome stain)揭示了在EndoMT细胞参与下，Panc 02癌细胞长出的肿瘤具有组织间质增生的现象；(b)在EndoMT细胞参与Panc 02癌细胞长出肿瘤的小鼠PDAC模型中，HH01抗体用以预防组织间质增生性肿瘤长成的给药时间；(c)由体表测量表面肿瘤体积，显示用HH01抗体处理的小鼠的肿瘤生长曲线与处理IgG的对照组比起来有明显受到压制；(d)接种后第30天牺牲小鼠的肿瘤重量；(e)经对照IgG或HH01抗体处理的小鼠的肿瘤组织切片的马森三色染色；(f)用对照IgG或HH01抗体处理的小鼠的血清HSP90α含量；

图5是一组实验鼠数据显示HH01抗体在具有组织间质增生的小鼠PDAC模型中的治疗功效；(a)在EndoMT细胞参与Panc 02癌细胞长出肿瘤的小鼠模型中，HH01抗体用以治疗组织间质增生性肿瘤生长的给药时间；(b)由体表测量长宽并估算出皮下肿瘤体积，显示使用HH01抗体治疗的小鼠的肿瘤生长曲线与使用IgG的对照组比起来有明显受到压制；(c)接种后第41天牺牲小鼠的肿瘤重量；(d)经对照IgG或HH01抗体治疗的小鼠的肿瘤切片的马森三色染色；(e)用对照IgG或HH01抗体治疗的小鼠的血清HSP90α含量；

图6是一组实验鼠数据显示HH01抗体在具有组织间质增生的人源化小鼠PDAC模型中的治疗功效；(a)在EndoMT细胞参与PANC-1癌细胞长出肿瘤的人源化小鼠模型中，HH01抗体用以治疗组织间质增生性肿瘤生长的给药时间；(b)由体表测量长宽并估算出皮下肿瘤体积以绘制分别经对照IgG、对照IgG加吉西他滨(gemcitabine)、和HH01抗体加吉西他滨处理的小鼠的肿瘤生长曲线；(c)接种后第39天牺牲小鼠的肿瘤重量；(d)来自不同治疗组别的小鼠的肿瘤切片的马森三色染色；(e)经对照IgG、对照IgG加吉西他滨、或HH01抗体加吉西他滨处理的小鼠的血清HSP90α含量；

图7是一组实验鼠数据显示HH01抗体在胰管细胞K-RasG12D突变所诱导的组织间质增生性小鼠PDAC模型中的治疗功效；(a)在胰管细胞K-RasG12D突变的转基因鼠(即LSL-KrasG12D/Pdx1-Cre鼠，以下简称KC鼠)模型中，HH01抗体用以治疗组织间质增生性PDAC的给药时间；(b)分别用对照IgG和HH01抗体治疗的KC鼠的Kaplan-Meier存活曲线；(c)用对照IgG或HH01抗体治疗的KC鼠的胰脏和肝脏外观及组织间质增生情形的示例；(d)用对照IgG或HH01抗体治疗的KC鼠的血清HSP90α含量；

图8是一组实验鼠数据显示eHSP90α所诱导的M2型巨噬细胞具有显著的促进肿瘤生长的能力；(a)经rHSP90α处理过的巨噬细胞能够促进Panc 02癌细胞生长出肿瘤；C57BL/6小鼠皮下注射单独的Panc 02细胞或一起注射经PBS、100ng/ml的LPS或15μg/ml的rHSP90α预处理24小时的BMDM(每组n＝6)；使用游标卡尺从鼠体表面测量生长中的肿瘤大小，并用1/2×长×宽²的公式估算出肿瘤的体积；(b)接续(a)，不同组别的实验鼠在Panc 02癌细胞接种后第28天牺牲小鼠并取出肿瘤称重；^@当与“Panc 02”或“Panc 02+BMDM”组别相比时p<0.01；(c)实验鼠的肿瘤组织的F4/80、CD163、CD4和CD8的免疫组织化学染色分析；H/E为苏木精和伊红染色；(d)实验鼠的肿瘤组织的染DAPI荧光分析；

图9是一组实验鼠数据显示HH01抗体在M2巨噬细胞促进恶化的小鼠PDAC模型中的治疗功效；(a)HH01抗体在治疗M2巨噬细胞促进Panc02癌细胞长出肿瘤的小鼠模型中的给药时间；(b)由体表测量长宽并估算出皮下肿瘤体积以绘制分别经对照IgG和HH01抗体处理的小鼠的肿瘤生长曲线；(c)Panc 02癌细胞加上M2巨噬细胞接种后第42天，牺牲小鼠取出其肿瘤并称得重量；(d)对照IgG或HH01抗体处理的小鼠的血清HSP90α含量；(e)用对照IgG或HH01抗体治疗的小鼠肿瘤的CD163、CD204、CD4和CD8的免疫组织化学染色分析。H/E为苏木精和伊红染色；

图10是一组延续图9的数据显示来自经对照IgG和HH01抗体处理的小鼠的肿瘤的F4/80、iNOS、Arginase 1、CD4、CD8和TNF-α的免疫组织荧光染色分析的结果。(a和b)在经HH01处理的小鼠的肿瘤组织中观察到F4/80⁺iNOS⁺的M1巨噬细胞的增加(如白色箭头所示)和F4/80⁺Arginase 1⁺的M2巨噬细胞的明显消失(如对照IgG组别的黄色箭头所示)；(c)从经HH01治疗的小鼠的肿瘤组织中观察到CD4⁺TNF-α⁺细胞的增加(如箭头所示)；(d)从经HH01治疗的小鼠的肿瘤组织中观察到CD8⁺TNF-α⁺细胞的增加(如箭头所示)。

具体实施方式

本文描述了结合HSP90α，例如eHSP90α，的新抗体。

分离的抗体可包括能够特异性结合HSP90α表位的新CDR，该表位包含₂₃₅AEEKEDKEEE₂₄₄和₂₅₁ESEDKPEIED₂₆₀区域中的氨基酸序列EDK。

分离的抗体可包括：SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：12的重链可变区序列的重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3；以及SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：17的轻链可变区序列的轻链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3。

在一实施方式中，重链CDR1、CDR2和CDR3可来自SEQ ID NO:2，轻链CDR1、CDR2和CDR3可来自SEQ ID NO:7。在一些实施例中，分离的抗体可包含与SEQ ID NO:2序列至少80％(例如85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的一重链可变区，以及与SEQ ID NO：7序列至少80％(例如85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的一轻链可变区。在一些实施例中，重链CDR1可具有SEQ ID NO:3序列，重链CDR2可具有SEQID NO:4序列，重链CDR3可具有SEQ ID NO:5序列，轻链CDR1可具有SEQ ID NO:8序列，轻链CDR2可具有SEQ ID NO:9序列，以及轻链CDR3可具有SEQ ID NO:10序列。在一些实施例中，也可提供一种核酸分子，该核酸分子含有核酸序列，该核酸序列编码了包含与SEQ ID NO:2序列至少80％相同的一重链可变区、以及与SEQ ID NO：7序列至少80％相同的一轻链可变区。在一些实施例中，该核酸分子可包含与SEQ ID NO:1序列至少80％(例如85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的一序列以编码重链可变区、以及与SEQ ID NO:6序列至少80％(例如85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的一序列以编码轻链可变区。

于下表1列出SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10序列。

表1：Clone-2抗HSP90α抗体

粗体字:CDR

在一实施方式中，重链CDR1、CDR2和CDR3可来自SEQ ID NO:12，轻链CDR1、CDR2和CDR3可来自SEQ ID NO:17。在一些实施例中，分离的抗体可包含与SEQ ID NO:12序列至少80％(例如85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的一重链可变区，以及与SEQ ID NO：17序列至少80％(例如85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的一轻链可变区。在一些实施例中，重链CDR1可具有SEQ ID NO:13序列，重链CDR2可具有SEQID NO:14序列，重链CDR3可具有SEQ ID NO:15序列，轻链CDR1可具有SEQ ID NO:18序列，轻链CDR2可具有SEQ ID NO:19序列，以及轻链CDR3可具有SEQ ID NO:20序列。在一些实施例中，也可提供一种核酸分子，该核酸分子含有核酸序列，该核酸序列编码了包含与SEQ IDNO:12序列至少80％相同的一重链可变区、以及与SEQ ID NO：17序列至少80％相同的一轻链可变区。在一些实施例中，该核酸分子可包含与SEQ ID NO:11序列至少80％(例如85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的一序列以编码重链可变区、以及与SEQID NO:16序列至少80％(例如85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的一序列以编码轻链可变区。

于下表2列出SEQ ID NO:11至SEQ ID NO:20序列。

表2：HH01抗HSP90α抗体

粗体字:CDR

该抗体可与HSP90α专一性结合。更具体地说，该抗体对HSP90α的结合比起对其他非HSP90α蛋白具有很高的亲和力。此外，可通过本领域已知的任何方法确定重链或轻链可变区的CDR。

本文所述的抗体表达出对eHSP90α的高结合亲和力。因此，本文所述的抗体可以抑制肿瘤内的组织间质增生，以进一步抑制肿瘤生长或缩小肿瘤大小。

根据本文公开的抗体序列及其CDR，技术人员可使用本领域已知的任何方法产生各种形式的抗HSP90α抗体，并且产生的抗HSP90α抗体可以专一性结合至在氨基酸235至244和氨基酸251至260区域中含有两个EDK位点的HSP90α表位。

根据HSP90α表位的序列，合成的胜肽可以竞争性地抑制eHSP90α的促癌功能。

本文所用的术语“抗体”包含具有抗原结合活性的各种抗体结构。举例而言，抗体可包含但不限于：一包含Fc区的抗体、一Fab片段、一Fab’片段、一F(ab’)2片段、一单链抗体、一scFV多聚体、一单株抗体、一单价抗体、一多专一性抗体、一人源化抗体或一嵌合抗体。在一些实施例中，抗体是一人源化抗体。

本文还描述了一种含有本文所述抗体的医药组合物。该医药组合物包括：如本文所述的分离抗体和医药可接受的载体。

本文还描述了含有能够编码如本文所述的抗体的核酸分子的一种医药组合物。该医药组合物包括：能够编码如本文所述的抗体的核酸分子和医药可接受的载体。

术语“药学上可接受的载体”是指载体必须与活性成分相容(例如，能够稳定抗体)并且对于待治疗的主体无害。载体可为选自由活性剂、佐剂、分散剂、润湿剂和悬浮剂所组成的群组中的至少一种。载体的示例可为但不限于微晶纤维素、甘露醇、葡萄糖、脱脂奶粉、聚乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉或其组合。

抗体、核酸分子或含有它们之中的一或多种的医药组合物可口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、直肠、鼻腔、口腔或通过植入的储药器施用于主体。本文所用的术语”肠胃外”包含皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。

本文还描述了抗体或核酸分子用于制备治疗癌症药物的用途。

本文还描述了用于治疗主体中的癌症的方法，包括：向主体施用一有效量的如本文所述的抗体或核酸分子。

癌症的示例可包括但不限于膀胱癌、骨癌、脑癌、乳癌、子宫颈癌、大肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、白血病、肝癌、淋巴瘤、肾癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰脏癌、前列腺癌、皮肤癌(包括基底细胞癌和鳞状细胞癌和黑色素瘤)、胃癌、胸腺癌和甲状腺癌。在一些实施例中，癌症具有组织间质增生特征，并且具体而言，组织间质增生可在肿瘤内或肿瘤周围发现。在一些实施例中，癌症可为胰脏癌、大肠直肠癌、乳癌、肝癌或肺癌。

本文所述的抗体可抑制癌组织间质增生、免疫抑制、生长和转移。

术语“主体”是指人类或非人类动物。

术语“治疗(treating)”、“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”是指向主体施用抗体、核酸分子或医药组合物，其目的是治愈、减轻、缓解、改变、补救、改善或影响疾病、症状、或染病倾向。“有效量”是指为了给主体所欲效果所需的抗体或核酸分子的量。如本领域技术人员所知，有效量取决于给药途径、赋形剂的使用以及与其他治疗方法共同使用的可能性，例如使用其他活性剂。

本公开的一或多个实施例的细节在以下描述中阐述。本公开的其他特征、目的和优点将从描述和权利要求中显而易见。

实施例

无需进一步详细说明，本领域技术人员可根据以上的叙述，充分利用本公开。因此，以下具体实施例应被解释为仅是说明性的，并且不以任何方式限制本公开的其余部分。本文引用的所有出版物均通过引用完整并入本文。

材料及方法

细胞培养

人类PDAC细胞株PANC-1在37℃和5％ CO₂的加湿培养箱中培养，与添加了10％胎牛血清(FBS)以及100units/ml的青霉素、100μg/ml的链霉素和2mM的L-麸胺酸(1×PSG)的Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM)中一起培养。人类PDAC细胞株BxPC-3、人类CRC细胞株SW620和小鼠PDAC细胞株Panc 02在37℃下在5％ CO₂和95％空气环境中，与添加了10％ FBS和1×PSG的RPMI-1640培养基一起培养。在相同的生长条件下，人类CRC细胞株LoVo维持在含有20％FBS和1×PSG的Ham's F-12培养基中，人类视网膜色素上皮细胞株ARPE-19(ATCC CRL-2302TM；American Type Culture Collection,Manassas,VA,USA)在添加有10％ FBS和1×PSG的ATCC配制的DMEM:F12培养基(型号#30-2006，ATCC)中培养。分离人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，并在37℃和5％ CO₂的加湿培养箱中培养，与含有20％ FBS、100units/ml的青霉素、100μg/ml的链霉素、30μg/ml的内皮细胞生长补充剂(EMDMillipore,Billerica,MA,USA)的M199培养基一起培养。参见Fan CS,Chen LL,Hsu TA。Endothelial-mesenchymal transition harnesses HSP90α-secreting M2-macrophagesto exacerbate pancreatic ductal adenocarcinoma.J Hematol Oncol 2019；12:138。对于EndoMT诱导，HUVEC与含2％ FBS的M199培养基预培养16小时，然后加入0.3μg/ml的OPN并再培养24小时。小鼠内皮细胞株3B-11(ATCC CRL-2160TM)在添加有10％ FBS和1×PSG的RPMI-1640培养基中生长。对于EndoMT诱导，除了使用含有1％ FBS的RPMI-1640培养基外，3B-11细胞的处理方式与HUVEC相同。小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)的制备方法如先前发表所述，并在添加10％ FBS和1×PSG的DMEM中培养。参见Fan CS,Chen LL,Hsu TA,etal.Endothelial-mesenchymal transition harnesses HSP90α-secreting M2-macrophages to exacerbate pancreatic ductal adenocarcinoma.J Hematol Oncol2019；12:138。

小鼠模型

小鼠实验是在中国台湾卫生研究院动物护理和使用机构委员会的许可下进行的(IACUC-106031-A,109022-M2-S02,and 109196-A)。为了建立组织间质增生性肿瘤移植模型，对12周龄的C57BL/6小鼠皮下接种了Panc 02癌细胞和EndoMT衍生的CAF(即经OPN处理的3B-11细胞)的混合物。参见Fan CS,Chen LL,Hsu TA,et al.Endothelial-mesenchymaltransition harnesses HSP90α-secreting M2-macrophages to exacerbate pancreaticductal adenocarcinoma.J Hematol Oncol 2019；12:138；和Chua KV,Fan CS,Chen LL,Chen CC,Hsieh SC,Huang TS.Octyl gallate induces pancreatic ductaladenocarcinoma cell apoptosis and suppresses endothelial-mesenchymaltransition-promoted M2-macrophages,HSP90αsecretion,and tumor growth.Cells2020；9(1):91。进一步的小鼠治疗模式的图示呈现于图中及其相关说明与内容。治疗效果的监测包括用游标卡尺从体表测量皮下生长中的肿瘤大小，用公式1/2×长×宽²估算肿瘤体积，最后小鼠牺牲后也会摘取肿瘤并予以秤重。为了在人源化小鼠中建立组织间质增生性肿瘤移植模型，将植入了人类造血干细胞(human hematopoietic stem cells；hHSC)的NOD-SCID IL2R^null(ASID)小鼠的皮下接种了PANC-1细胞和经OPN处理的HUVEC的混合物。此所使用的人源化小鼠(即移植有hHSC的ASID小鼠)由中国台湾实验动物中心(Taipei,Taiwan,China)提供，每只小鼠含有人类CD45⁺细胞量超过总淋巴细胞的38％。为了建立M2巨噬细胞促进恶化的小鼠PDAC模型，对C57BL/6小鼠皮下接种了Panc 02癌细胞和经rHSP90α处理过的BMDM的混合物。进一步的小鼠治疗模式的图示呈现于图中及其相关说明与内容。此外，采用LSL-KrasG12D/Pdx1-Cre转基因小鼠(即一般简称的KC鼠)作为自发性发生PDAC的小鼠模型，以评估HH01抗体的治疗效果。LSL-KrasG12D和Pdx1-Cre育种小鼠是来自美国国家癌症研究所(Frederick,Maryland,USA)的人类癌症联盟库的小鼠模型，LSL-KrasG12D小鼠与Pdx1-Cre小鼠交配以产生LSL-KrasG12D/Pdx1-Cre小鼠，并如图式和相关内容所示，对此转基因小鼠进行了进一步的处理。

西方墨点法分析

根据一般常用的技术流程，使用732-氨基酸(a.a.)全长的重组人类HSP90α(rHSP90α；PeproTech Co.,Cranbury,NJ,USA)免疫小鼠以产生小鼠融合瘤。参见YokoyamaWM.Production of monoclonal antibody supernatant and ascites fluid.CurrProtoc Mol Biol 2008；83:11.10.1-11.10.10。接着，采用西方墨点法的一般程序初步筛选融合瘤。参见Fan CS,Chen LL,Hsu TA,et al.Endothelial-mesenchymal transitionharnesses HSP90α-secreting M2-macrophages to exacerbate pancreatic ductaladenocarcinoma.J Hematol Oncol 2019；12:138。收集融合瘤培养基以与含有从电泳胶印渍而来的HSP90α和分子量标记蛋白的膜条作反应。用加有0.05％ Tween-20的PBS(即PBST)洗涤三次后，将膜条与辣根过氧化氢酶偶联的二级抗体培养1小时。再用PBST洗涤3次后，与0.3mg/ml的3,3',5,5'-四甲基联苯胺在0.015％ H₂O₂(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)中反应后可看到免疫反应蛋白条带(band)。

酶联免疫吸附测定(ELISA)

为了量化所制备的抗体对HSP90α的结合活性，用含12.5ng/ml rHSP90α的捕捉缓冲液(BioLegend,San Diego,CA,USA)涂覆96孔盘，在4℃下隔夜培养。用PBST洗涤涂覆的孔盘两次，然后用加有3％牛血清白蛋白(BSA)的PBST进行阻塞作用。投入制备的抗体并在室温下培养2小时，在用PBST洗涤3次后，加入辣根过氧化氢酶偶联的二级抗体，并在37℃下再培养1小时。洗涤3次后，将含有0.3mg/ml3,3',5,5'-四甲基联苯胺的0.015％ H₂O₂加入每个孔中，且在室温下避光培养10分钟。通过添加H₂SO₄(0.5M)停止反应后以Infinite M200微量盘分析仪(TECAN,Switzerland)测量OD₄₅₀值。此外，抗HSP90α抗体的免疫球蛋白(IgG)同型特性分析乃使用小鼠Ig同型ELISA Ready-Set-Go！^TM试剂盒(eBioscience^TM,Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)来进行。如前所述，ELISA检测流程还用于测定小鼠血清样品中分泌的HSP90α含量。参见Chen JS,Hsu YM,Chen CC,Chen LL,Lee CC,Huang TS.Secreted heat shock protein 90αinduces colorectal cancer cellinvasion through CD91/LRP-1and NF-κB-mediated integrinα_V expression.J BiolChem 2010；285(33):25458–66。

邻位连接试验(PLA)

以2×10⁵个细胞(每22×22mm盖玻片)的密度接种到玻璃盖玻片上的PANC-1细胞与含0.5％血清的培养基在37℃和5％ CO₂湿润环境下培养16小时。然后在不存在或存在10μg/ml对照IgG或测试的抗HSP90α抗体的情况下，将细胞加入PBS或15μg/ml的rHSP90α，再培养24小时。然后用3％多聚甲醛固定处理过的细胞，并用Duolink原位PLA试剂盒(OlinkBioscience,Uppsala,Sweden)中提供的阻塞溶液进行阻塞作用。此外，在4℃下将细胞样品与和HSP90α抗体(1:80,cat.#AHP-1339,AbD Serotec,Raleigh,NC,USA)或IKKα抗体(1:80,cat.#3285,Epitomics Co.,Burlingame,CA,USA)做混合的CD91抗体(1:80,cat.#550495,BD Biosciences,San Jose,CA,USA)一起培养。用加有Tween20(0.05％)的Tris缓冲液洗涤三次后，根据Duolink原位PLA试剂盒的厂商说明书，将细胞样品与PLA探针一起培养，以进行随后的连接和扩增程序。最后，用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；Sigma-Aldrich)对细胞核进行复染。使用Leica TCS SP5 II共聚焦显微镜和LAS AF Lite 4.0软件(Leica,Wetzlar,Germany)对图像进行拍照和分析。

癌细胞侵袭性测定

在37℃和5％ CO₂的加湿培养箱中，癌细胞在含0.5％ FBS的培养基中进行血清饥饿16小时，然后在10μg/ml的对照IgG或测试的抗HSP90α抗体不存在或存在的情况下，加入PBS或15μg/ml的rHSP90α。再过24小时后，收集经处理的细胞并分为等分试样(每试样1×10⁵个细胞)在含有0.5％ FBS的培养基中，然后将每个等分试样种到预先涂有5倍稀释的基质胶(Matrigel)(BD Biosciences)的Transwell^TM上层腔室中。允许癌细胞进行16小时侵袭作用穿过基质胶移向含有培养基和10％ FBS的下层腔室。然后将留在Transwell^TM筛板上的癌细胞固定并用Giemsa染色。使用Axiovert S100/AxioCam HR显微镜系统(Carl Zeiss,Oberkochen,Germany)对筛板下侧的侵袭性癌细胞进行拍照，并通过Image-Pro Plus软件(Media Cybernetics,Inc.,Silver Spring,MD,USA)做量化。

细胞类球体形成能力测定(细胞干性测定)

将一千个癌细胞种到24孔盘的每个孔中，该孔盘预涂有4mm厚的0.5％琼脂糖层。在37℃和5％ CO₂湿润环境下用无血清培养基培养24小时后，在10μg/ml的对照IgG或测试的抗HSP90α抗体不存在或存在的情况下，向细胞添加PBS或15μg/ml的rHSP90α，持续培养10～14天，每3天补充一些新鲜的无血清培养基。最后，在Olympus IX 71倒置显微镜(CenterValley,PA,USA)下对紧密、非固着性、及直径>100μm为特征的细胞类球体进行拍照和计数，并以公式(细胞类球体数/1000)×100％计算细胞类球体形成百分比。

融合瘤细胞抗体基因的克隆与测序

从产生抗HSP90αIgG的小鼠融合瘤细胞中分离总RNA，并通过反转录酶(reversetranscriptase)和随机六聚体引物转化为cDNA。小鼠Ig-引子套组(Sigma-Aldrich)用于PCR扩增IgG重(H)和轻(L)链的可变结构域(即V_H和V_L结构域)。将PCR产物转殖到CloneJETPCR克隆试剂盒(Thermo Fisher Scientific)中提供的pJET1.2/blunt转殖载体中，然后进行殖株选择和DNA测序分析。

重组抗体的建构与表达

IgG V_H和V_L结构域的cDNA序列由GeneDireX Inc.(Taoyuan,Taiwan,China)合成，并且分别被插入到pFUSEss-CHIg-hG1e1和pFUSE2ss-CLIg-hk质体(InvivoGen,San Diego,CA,USA)中的编码H和L链的恒定结构域的区域之前的位点。在使用pFUSEss-CHIg-hG1e1当载体的克隆方面，将V_H cDNA序列插入人类IL-2讯号序列后面的EcoR I-Nhe I位点以表达含有在Q250T、E356D、M358L和L428M残基处具有突变的Fc片段的重组蛋白。另一方面，V_L结构域的cDNA在用EcoR I和BsiW I切割后，插入pFUSE2ss-CLIg-hk质体。使用hIgHG-F/hIgHG-R和CLIg-F/CLIg-R引子进一步扩增编码重组IgG H和L链的重组DNA序列，然后分别插入pcDNA3.4-TOPO质体(Thermo Fisher Scientific)。最后，用编码H链和L链的重组pcDNA3.4-TOPO质体以2:3的比例共转染ExpiCHO细胞。培养8～10天后收取转染的ExpiCHO细胞的培养基，利用Gibco^TM ExpiCHO^TM Expression System(Thermo Fisher Scientific)的蛋白A管柱来纯化重组抗体。

抗体人源化与优化

借助电脑模拟计算方法对小鼠单株抗体的F(ab’)2区域进行人源化，所有计算均由Discovery Studio 2018软件(BIOVIA Inc.,San Diego,CA,USA)进行。通过已发表的方法鉴定互补决定区(CDR)。参见Kabat EA,Wu TT,Perry HM,Gottesman KS,FoellerC.Sequences of proteins of immunological interest.U.S.Department of Healthand Human Services,NIH,Bethesda,MD,1991。分别通过PdbID:4X0K和PdbID:4Y5X的X射线模板对V_L和V_H结构域的三维(3D)结构建模。参见Johnson JL,Entzminger KC,Hyun J,Kalyoncu S,Heaner DP,Morales Jr IA,Sheppard A,Gumbart JC,Maynard JA,LiebermanRL.Structural and biophysical characterization of an epitope-specificengineered Fab fragment and complexation with membrane proteins:implicationsfor co-crystallization.Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 2015；71:896-906；和Moraga I,Wernig G,Wilmes S,Gryshkova V,Richter CP,Hong WJ,Sinha R,Guo F,Fabionar H,Wehrman TS,Krutzik P,Demharter S,Plo I,Weissman IL,Minary MajetiPR,Constantinescu SN,Piehler J,Garcia KC.Tuning cytokine receptor signalingby re-orienting dimer geometry with surrogate ligands.Cell 2015；160:1196-1208。将小鼠抗体的CDR移植到内部的人类模板中，以进一步计算3D结构。计算包括聚集性、翻译后修饰、蛋白水解酶切割、药代动力学和稳定性等方面的突变建议，以改善重组抗体。

HSP90α结合亲和力测定

为了测量抗HSP90α抗体对HSP90α的结合特性，使用Biacore T200(Cytiva Co.,Marlborough,MA,USA)进行结合动力学测定。将感兴趣的抗HSP90α抗体当做基团施加到Protein A Series S感测器晶片上，以达到大约3000～5000个回应单位。将含一系列浓度的rHSP90α(1.5625-100nM)的HBS-EP+缓冲液注入晶片表面，监测该结合60秒，最终解离时间为1500秒。

视网膜细胞毒性试验

以每孔4000个细胞的密度将ARPE-19细胞接种到96孔盘上，然后用不同浓度的17-AAG或抗HSP90α抗体HH01处理细胞72小时，然后加入3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑(MTS；Sigma-Aldrich)做反应，最后测量OD₄₉₀以评估细胞存活率。

药代动力学测定

使用Bltw:CD1(ICR)公小鼠(BioLASCO Taiwan Co.,Taipei,Taiwan,China)研究抗HSP90α抗体HH01的药代动力学。实验鼠保持在任何时候都可以随意获得食物和水的状态下进行测试，首先对体重为25～30g的小鼠(n＝5)静脉注射10mg/kg的HH01抗体，为了测定HH01抗体的血清暴露量，在给HH01第0.04、0.08、0.25、1、2、3、7、9、14、16、18、21、23、25、35、42、49、56和63天后收集血液样品，使用ELISA试剂组(Cayman Chemical Co.,Michigan,USA)测量这些样品的人类IgG1含量，以代表小鼠血清中剩余的HH01含量。

全长和截短HSP90α的克隆、表达和纯化

克隆、表达和纯化全长HSP90α(a.a.1-732)及其3个截短片段，包括N端加连接子的区域(a.a.1-272)、N端到中间的区域(a.a.1-629)和C端区域(a.a.630-732)。简而言之，每个带有8×His标签的cDNA序列通过PCR从人类ORF殖株(NM_005348)中扩增，引子包含Xho I和BamH I位点。纯化PCR产物，用限制酶切割，然后插入pET-23a质体(Sigma-Aldrich)。然后将重组质体转化到大肠杆菌接容细胞(competent cells,Lucigen Co.,Middleton,WI,USA)中，并通过添加异丙基-D-硫代半乳糖-吡喃糖苷来刺激重组DNA的表达。根据厂商的说明书，使用Ni-NTA管柱(Qiagen,Germantown,MD,USA)进一步纯化表达出的8×His标签的全长和截短的HSP90α。最后将纯化的蛋白质对由25mM Tris-HCl(pH,7.0)、50mM NaCl、0.1％ Triton X-100、50％甘油、1mM EDTA和1mM DTT组成的储存缓冲液进行透析，并且通过Bradford蛋白质试验(Bio-Rad Laboratories,Hercules,USA)决定蛋白质浓度。

抗HSP90α抗体的HSP90α表位的鉴定

首先，区域扫描策略用于初步决定出负责与我们制备的抗体结合的HSP90α区域。将上述全长HSP90α及其3个截短片段用于涂覆96孔ELISA盘，以用于测定受试小鼠单株抗体的结合活性。结果显示受试小鼠单株抗体与HSP90α的a.a.1-272区域结合，因此，在胜肽扫描策略中，由Mimotopes Pty.Ltd.(Melbourne,Victoria,Australia)合成了一个132胜肽库，其是由一系列位移2a.a.的10-a.a.胜肽所组成，以横跨HSP90α的a.a.21～272区域的序列。该系列胜肽用于涂覆96孔ELISA盘，以测定被测试抗体的结合活性。胜肽扫描分析结果表示HSP90α的₂₃₅AEEKEDKEEE₂₄₄和₂₅₁ESEDKPEIED₂₆₀为与被测试抗体结合的表位，因此进一步采用丙胺酸扫描策略来研究哪个氨基酸残基对被测试抗体的结合至关重要。用丙胺酸依序替换每个氨基酸，合成了19个胜肽(Genozyme Biotech Inc.,Taipei,Taiwan,China)，然后如上所述进行ELISA以测定被测试抗体的结合活性。

马森三色染色法

用二甲苯对小鼠石蜡包埋的组织切片进行脱蜡，并经过一系列乙醇稀释液进行再水合作用。使用Trichrome Stain Kit(ScyTek Laboratories Inc.,Utah,USA)并根据厂商所提供的步骤进行马森三色染色。切片染色后用系列渐浓的乙醇溶液和二甲苯脱水，最后在室温下、黑暗中用封片液(mounting solution)封片过夜。使用Axiovert S100/AxioCamHR显微镜系统对切片进行观察和拍照。

免疫组织化学染色

用二甲苯对4-μm厚的小鼠组织切片进行脱蜡，并在逐渐稀释的乙醇溶液中进行再水合作用。通过在10mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)及高压下加热切片15分钟来进行抗原构形回复。内源性过氧化物酶活性利用加入0.3％ H₂O₂来抑制。染色前，切片用PBS加3％ BSA在室温下进行30分钟的阻塞作用。随后，抗F4/80抗体(1:100,cat.#MCA497R,AbD Serotec)、抗CD163抗体(1:80,cat.#sc-33560,Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA)、抗CD204抗体(1:100,cat.#GTX51749,GeneTex Inc.,Hsinchu City,Taiwan,China)、抗CD4抗体(1:100,cat.#GTX44531,GeneTex Inc.)、或抗CD8抗体(1:100,cat.#GTX16696,GeneTexInc.)被加入并且在4℃反应过夜。洗涤后，加入二级抗体并在室温下反应30分钟。使用DAKOREAL EnVision Detection System(Produktionsvej 42,DK-2600Glostrup,Denmark)来检测切片，并用苏木精复染。将染色后切片脱水，用封片液封片，最后使用Axiovert S100/AxioCam HR显微镜系统进行观察和拍照。

免疫组织荧光染色

如上所述，对小鼠组织切片进行脱蜡、再水合和抗原构形回复。切片在室温下用PBS加5％ BSA进行30分钟的阻塞作用。随后，分别加入3组抗体并在4℃下反应过夜。抗体组1是由抗F4/80抗体(1:100,cat.#MCA497R,AbD Serotec)、抗iNOS抗体(1:100,cat.#GTX15323,GeneTex Inc.)、和抗Arginase 1抗体(1:50,cat.#sc-271430,Santa CruzBiotechnology)所组成。抗体组2包含抗CD4抗体(1:100,cat.#GTX44531,GeneTex Inc.)和抗TNF-α抗体(1:75,cat.#sc-52746,Santa Cruz Biotechnology)。抗体组3由抗CD8抗体(1:100,cat.#GTX16696,GeneTex Inc.)和抗TNF-α抗体(1:75,cat.#sc-52746,Santa CruzBiotechnology)所组成。洗涤后，分别加入荧光标记的二级抗体并在室温下进行反应1小时，细胞核则用DAPI做复染，最后使用Leica TCS SP5 II共聚焦显微镜和LAS AF Lite 4.0软件对切片进行观察、拍照和分析。

结果

小鼠抗HSP90α单株抗体的制备和特性分析

六个融合瘤殖株来自用人类HSP90α的重组蛋白质(rHSP90α)免疫的小鼠。收集它们的培养上清液用于在使用标准的西方墨点法和ELISA流程中测定与HSP90α的结合活性。除了clone-5外，这些融合瘤产生的抗体均可与抗原rHSP90α发生结合(图1(a))。通过ELISA进一步量化结合活性，Clone-2和Clone-6表现出前两高的HSP90α结合含量(图1(b))，因此被选择用于以下进一步的测定。纯化两个殖株的抗体，且两者均被鉴定为含有κ轻链的IgG2b同型免疫球蛋白(图1(c))。它们可以有效地阻断eHSP90α与其细胞表面受体CD91的结合以及CD91与下游IKKα的结合(图1(d))。鉴于eHSP90α通过多种机制发挥其促癌作用，例如诱导癌细胞EMT、迁移、侵袭和细胞干性的获得(gain-of-stemness)，与之前的研究一致，我们的Transwell侵袭试验显示rHSP90α可作为癌细胞侵袭力的有效诱发剂(图1(e))，然而rHSP90α的诱发可以被Clone-2和Clone-6抗HSP90α抗体大幅消除(图1(f))。此外，rHSP90α也可以诱发癌细胞的细胞干性(通过增加的细胞类球体形成能力反映出来)，此诱发也可以被Clone-2和Clone-6抗体显著抑制(图1(g))。综合这些数据，表明抗HSP90α单株抗体可以被开发并用于抑制eHSP90α促进肿瘤细胞的恶化。

Clone-2抗HSP90α抗体的人源化

接下来，我们分别克隆并分析了Clone-2和Clone-6抗HSP90α抗体的IgG H和L链的可变结构域(即V_H和V_L)的cDNA序列。cDNA序列和编码氨基酸序列表列于表1和表2中。进一步选择Clone-2进行人源化。合成V_H和V_L DNA序列并插入到质体载体中，分别在表达人类IgG H链和L链恒定结构域(即CH和CL)的区域之前，以表达名为“Clone-2-chimera”的重组IgG1抗体。此外，根据电脑辅助结构建模和计算的建议，我们建构了3个Clone-2-chimera的突变体，命名为Clone-2-hA、Clone-2-hB和Clone-2-hC，旨在改善抗体在聚集、蛋白酶切割、翻译后修饰、药代动力学和稳定性等方面的特性。突变位点列于表3中。这些工程化的人源化重组抗体由ExpiCHO细胞表达，并在纯化后分析HSP90α结合亲和力。使用Biacore T200进行动力学分析以确定Clone-2-chimera、Clone-2-hA、Clone-2-hB和Clone-2-hC抗体对rHSP90α的结合特性(图2(a))。进一步计算出Clone-2-chimera、Clone-2-hA、Clone-2-hB和Clone-2-hC抗体的平衡解离常数(KD)值，分别为0.94×10-10、1.87×10-10、1.48×10-10、和1.47×10-10M(图2(b))，表示Clone-2-hA、Clone-2-hB和Clone-2-hC抗体中的突变没有显著降低其对HSP90α结合亲和力。

表3

为了初步评估这些人源化抗HSP90α抗体的抗癌功效，我们测定了它们对rHSP90α诱发的PDAC细胞侵袭和类球体形成的抑制活性。Transwell侵袭试验结果显示，在抑制rHSP90α诱发人类PDAC PANC-1细胞侵袭性方面，Clone-2-chimera和Clone-2-hA优于Clone-2-hB、Clone-2-hC及其母株Clone-2(图2(c))。在类球体形成试验中，Clone-2-hA在抑制rHSP90α诱发的PANC-1细胞类球体形成方面仍然表现出最突出的功效(图2(d))。因此，最终选择Clone-2-hA并将其命名为HH01抗体，用于进一步的体外和体内测定。HH01抗体在PBS中的溶解度>10mg/ml，动态光散射测定(Dynamic Light Scattering assay)显示HH01抗体是直径落在10～50nm范围内、取平均值就是直径约为19.33nm大小的分子，表示HH01抗体不易形成聚集体。考量到临床应用上，格尔德霉素(geldanamycin)和间苯二酚衍生物等小分子HSP90抑制剂在视网膜上累积到一定程度时会导致视网膜感光细胞损伤，我们通过研究HH01抗体对于ARPE-19视网膜色素上皮细胞存活率的影响来进一步评估HH01抗体对于非癌性视网膜细胞是否表现出任何毒性。如图2(e)所示，17-AAG对ARPE-19细胞表现出细胞毒性，IC50为64.7nM，然而，HH01抗体即使在其浓度达到594.3nM(100μg/ml)，也没有对ARPE-19细胞造成任何明显的细胞毒性。此外，在雄性小鼠中研究了HH01抗体的药代动力学，结果显示在小鼠血液内，HH01抗体的清除速率为3×10^-3ml/min/kg，稳定状态下体积为80ml/kg，测得HH01抗体的半衰期(T_1/2)约为18.4天(图2(f))。显示HH01抗体在静脉注射给药后，具有长的T_1/2和高血清暴露量，适合进一步开发成为一治疗药物。

HH01抗体所辨识表位的鉴定

如表3所列，HH01抗体能够专一性结合人类HSP90α，其互补决定区(CDR)中具有崭新的氨基酸(a.a.)序列，因此我们欲鉴定HSP90α的哪个区域被HH01抗体结合。在初步的鉴定工作中，我们采用HSP90α区域扫描的策略来界定出负责与Clone-2抗体结合的HSP90α区域。全长HSP90α(a.a.1～732)及其3个截短片段，包括N端加连接子的区域(a.a.1～272)、N端到中间的区域(a.a.1～629)和C端区域(a.a.630～732)被克隆、表达和纯化。随后，通过ELISA方法测定Clone-2抗体与全长和截短的三段HSP90α片段的结合活性。结果显示，Clone-2抗体与a.a.1～272区域的结合能力相若于与全长蛋白的结合(图3(a))，表示Clone-2抗体的结合表位可能在HSP90α的N端到连接子的区域内(a.a.1～272)。进一步地，我们采用胜肽扫描策略来鉴定Clone-2-chimera和HH01抗体所结合的HSP90α表位。建立了一个胜肽库，由一系列10-a.a.胜肽组成，任两个连续的胜肽之间有8-a.a.重迭以扫描HSP90α的a.a.21～272区域的序列。通过ELISA测定Clone-2-chimera和HH01抗体对这一系列10-a.a.胜肽的结合活性。结果显示，Clone-2-chimera抗体的可能表位位点是HSP90α的₂₃₅AEEKEDKEEE₂₄₄和₂₅₁ESEDKPEIED₂₆₀(图3(b))。一致地，这两个位点也可以作为HH01抗体的结合表位(图3(c))。基于这两个位点的序列，我们合成了两个系列的10-a.a.胜肽，以丙胺酸(alanine)依序取代氨基酸残基。丙胺酸扫描策略用于鉴识Clone-2-chimera和HH01抗体与表位位点结合的关键氨基酸。结果显示，当用丙胺酸替换E237、E239、K241、E253和K255时，Clone-2-chimera抗体与表位位点的结合活性急剧下降(图3(d))。此外，另一D240也负责与HH01抗体的结合(图3(d))。根据上述表位定位结果，我们合成了一个有HSP90α的a.a.227～272区域序列的胜肽。该胜肽竞争性抑制了rHSP90α诱发的PANC-1细胞侵袭(图3(e))以及类球体形成(图3(f))，证实含有表位位点的HSP90α区域可能是新颖的抗癌策略的标靶。

HH01抗体在组织间质增生性小鼠PDAC移植模型中的预防和治疗效果的评估

HH01抗体用于进一步的体内抗癌试验。在我们之前的研究中，EndoMT衍生的CAF显著促进了胰管腺癌Panc 02细胞在实验鼠体内的肿瘤生长。我们的马森三色染色结果进一步揭示了EndoMT细胞参与的Panc02肿瘤表现出显著程度的组织间质增生，这在仅源自Panc02细胞的肿瘤中未观察到(图4(a))。为了研究HH01抗体的体内抗癌活性，我们按照先前使用小鼠单株抗体的给药方式，并在EndoMT参与的小鼠PDAC模型中测定了它的癌症预防活性。对C57BL/6小鼠皮下接种Panc 02细胞+EndoMT细胞。在接种后第4天，进一步每隔3天对小鼠静脉内施用每剂5mg/kg的对照IgG或HH01抗体，共8剂(图4(b))。如图4(c)所示，HH01抗体有效抑制了EndoMT参与的Panc 02癌细胞在小鼠皮下的肿瘤生长。在接种后第30天牺牲所有小鼠，取其肿瘤秤重。正如预期，HH01抗体显著抑制了Panc 02加EndoMT细胞的肿瘤生长能力(p<0.001，图4(d))。HH01抗体也显著预防了肿瘤的组织间质增生(图4(e))。此外，在组织间质增生的小鼠PDAC模型的血清中，我们检测到增加的eHSP90α含量，并且小鼠在处理过HH01抗体后，其血清HSP90α含量显著降低(图4(f))。这些数据表明，HH01抗体是一种可防止组织间质增生性的PDAC细胞肿瘤生长的有效药剂。

为了评估HH01抗体在组织间质增生性的小鼠PDAC模型中的治疗效果，对C57BL/6小鼠皮下接种Panc 02加EndoMT细胞移植物。在接种后第20天，小鼠患有平均大小为75mm³的肿瘤，并开始以每剂为5mg/kg的对照IgG或HH01抗体对小鼠静脉内注射，每间隔7天一次，共三次(图5(a))。体表测量结果显示HH01治疗完全抑制了皮下肿瘤生长动力(图5(b))。在第41天取肿瘤秤重，数据显示在HH01治疗的小鼠组中肿瘤生长确实受到抑制(图5(c))。HH01治疗还显著降低肿瘤的组织间质增生程度(图5(d))和血清HSP90α含量(图5(e))。总之，这些数据表明HH01抗体可开发为有效治疗组织间质增生性PDAC的治疗剂。

HH01抗体在组织间质增生性的人源化小鼠PDAC移植模型中的治疗效果的评估

我们还评估了HH01抗体在组织间质增生性的人源化小鼠PDAC模型中的治疗效果。对hHSC移植的ASID小鼠皮下接种人类胰管腺癌PANC-1细胞与EndoMT衍生细胞的混合物。在接种后第20天，将小鼠分成3组进行进一步处理(图6(a))。对A组小鼠(n＝3)静脉注射每剂5mg/kg、间隔7天共三剂的对照IgG。对B组小鼠(n＝5)注射三次对照IgG加两次吉西他滨，而C组小鼠(n＝5)注射三次HH01抗体加两次吉西他滨。小鼠在接种PANC-1+EndoMT细胞后第20天接受第一剂5mg/kg的IgG(B组)或HH01(C组)，4天后，进一步静脉注射第一剂100mg/kg的吉西他滨。其他两剂的对照IgG或HH01抗体以及另一剂的吉西他滨各自以7天间隔施用(图6(a))。直到第39天，每3天对皮下生长中的肿瘤进行体表测量，并将肿瘤生长曲线绘制为图6(b)。与单独用IgG治疗的小鼠相比，用IgG加吉西他滨治疗的小鼠在第二次施用吉西他滨后显著抑制了肿瘤。然而，在用HH01加吉西他滨治疗的小鼠中，仅在首剂HH01注射后4天就观察到有效的肿瘤生长停止，在施用第二剂吉西他滨和第三剂HH01后，肿瘤进一步缩小(图6(b))。在第39天牺牲所有小鼠，用HH01加吉西他滨治疗的小鼠的肿瘤被显著抑制(图6(c))。HH01抗体与吉西他滨的组合在抑制肿瘤的组织间质增生(图6(d))以及血清HSP90α含量(图6(e))方面也表现出显著的功效。这些数据指出，HH01抗体与其它药剂如吉西他滨组合可以更有效对付组织间质增生性的PDAC。

HH01抗体在K-RasG12D诱发的组织间质增生性的小鼠PDAC模型中的治疗效果的评估

接下来，我们评估HH01抗体在自发性发展PDAC的小鼠模型中的治疗效果。临床上，大于90％的PDAC患者在其腺癌细胞中含有活化的K-Ras突变体。在转基因小鼠模型中，胰管上皮细胞含有活化的突变K-RasG12D即可经由胰腺细胞管化病变(ADM)、胰管上皮内瘤病变(PanIN)自发性发展出PDAC。这些胰管上皮细胞表达K-RasG12D的转基因鼠(即LSL-KrasG12D/Pdx1-Cre鼠，简称KC鼠)早在出生后3个月就出现ADM，3～6个月是PanIN演进期，然后在6个月月龄发展出PDAC病兆。马森三色染色结果显示，从3月龄KC小鼠的胰脏组织即可检测到少量的组织间质增生，到6月龄以上整个胰脏就呈现广泛的组织间质增生现象，然而此情形并未在LSL-KrasG12D对照小鼠中检测到。为了评估HH01抗体的治疗效果，KC小鼠在6个月大发展出PDAC病兆后开始接受治疗，从静脉内注射每剂5mg/kg的对照IgG或HH01抗体，开始时一周一剂，施用4剂，接下来每两周一剂，施用4剂，最后每个月一剂，施用2剂，总共是10剂的疗程(图7(a))。整个实验以第450天为终点，用Kaplan-Meier法绘制IgG或HH01治疗的小鼠的存活曲线(图7(b))。结果显示7只IgG治疗的小鼠有6只在450天内死亡，但9只HH01治疗小鼠中有7只在第450天仍然存活。IgG和HH01治疗的小鼠的中位存活时间分别为344天和>450天(通过等级检定(Log rank)分析，p＝0.004)。与正常C57BL/6小鼠或LSL-KrasG12D对照小鼠的光滑胰脏外观不同，无论KC小鼠是否接受HH01治疗，其胰脏都呈现结节、硬化的现象(图7(c))。然而，马森三色染色显示，使用HH01治疗并且在第450天仍然存活的KC鼠的胰脏组织间质增生现象明显复元(图7(c))。观察到一只IgG治疗的KC鼠和一只HH01治疗的KC鼠在肝脏外观上出现小肿瘤结节，但在数目上，经HH01治疗的小鼠明显比IgG治疗的小鼠减少(图7(c))。马森三色染色进一步显示了HH01治疗的小鼠的肝脏组织间质增生的现象明显获得改善(图7(c))。此外，无论是IgG或HH01治疗的KC鼠，其牺牲前所收集的最后一次血清样品的HSP90α含量与其在IgG或HH01治疗之前所收集的样品含量进行比较(即治疗后对治疗前比较)。我们的数据显示，可以通过HH01治疗有效压制KC小鼠血清中HSP90α含量的上升(图7(d))。

M2巨噬细胞促进恶化的小鼠PDAC模型中HH01抗体治疗功效的评估

为了建立M2巨噬细胞参与的小鼠PDAC模型，我们将rHSP90α处理过的BMDM与Panc02癌细胞混合，然后接种于C57BL/6小鼠的皮下。为了与M1巨噬细胞进行比较，将Panc 02细胞和LPS处理过的BMDM接种到另一组小鼠中。“Panc 02+rHSP90α处理的BMDM”组别在接种后第6天开始生长，并且肿瘤继续比其它组别生长更快(图8(a))。接种后第30天，牺牲所有小鼠，取肿瘤秤重。如图8(b)所示，rHSP90α处理的BMDM显著促进Panc 02肿瘤的生长，这与LPS处理的BMDM产生的肿瘤抑制作用形成对比。免疫组织化学染色分析结果显示，与取自其它小鼠组别的肿瘤块相比，来自“Panc 02+rHSP90α处理的BMDM”组别的肿瘤组织含有更多CD163⁺细胞，但CD4⁺和CD8⁺细胞的含量显著较少(图8(c))。在LPS处理的BMDM小鼠组别中，被抑制的肿瘤组织含有相对较高含量的CD4⁺和CD8⁺细胞。用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)进行的核染色也显示染色质凝聚和核碎裂程度升高(图8(d))，这表明LPS诱导的M1巨噬细胞招召募CD4⁺和CD8⁺免疫细胞并引起更多的细胞凋亡以抑制Panc 02肿瘤的生长。因此，由这些结果印证eHSP90α所诱导的M2型巨噬细胞可以表现出有效的免疫抑制和肿瘤促进能力。进一步地，我们评估了HH01抗体在这种M2巨噬细胞促进的小鼠PDAC模型中的治疗效果。对C57BL/6小鼠皮下接种Panc 02加rHSP90α处理过的BMDM细胞移植物。在接种后第27天，每只小鼠长出大约0.1-cm³的肿瘤并开始用5mg/kg的对照IgG或HH01抗体治疗(图9(a))。由于HH01在小鼠血液中的半衰期约18.4天，在间隔7天后追加第二剂加强HH01抗体的作用。如图9(b)所示，3天后立即观察到HH01治疗后肿瘤急剧缩小。在第42天牺牲所有小鼠，结果显示与对照组的小鼠的持续生长的肿瘤相比，HH01治疗的小鼠的肿瘤显著缩小(p＝0.001，图9(c))。一致地，在HH01治疗后，血清HSP90α含量的升高也被显著抑制(图9(d))。肿瘤样品的免疫组织化学分析还显示，由于HH01治疗后M2巨噬细胞的减少，M2巨噬细胞所抑制的CD4⁺和CD8⁺细胞量得以有效地提高(图9(e))。最后，免疫组织荧光染色结果证实了这些结果。从HH01治疗的小鼠肿瘤组织中观察到F4/80⁺iNOS⁺细胞(M1巨噬细胞)的增加和F4/80⁺Arginase1⁺细胞(M2巨噬细胞)的减少(图10(a)和10(b))。一致地，回应HH01抗体治疗，CD4⁺TNF-α⁺细胞(效应性T细胞)和CD8⁺TNF-α⁺细胞(细胞毒杀性T细胞)的含量皆增加(图10(c)和10(d))。这些数据表示，HH01抗体是抑制M2巨噬细胞促进PDAC恶化以及提高肿瘤微环境免疫性的有效药剂。

结论

组织间质增生是许多恶性肿瘤的标志，与肿瘤快速生长、转移发生和治疗结果不佳有着密切相关性。能够抑制组织间质增生来缓解肿瘤的恶性进展并提高治疗效果的试剂和策略，一直以来都是癌症患者急迫的医疗需求。癌症相关纤维母细胞(CAF)的大量产生是组织间质增生的主要原因之一，内皮细胞的内皮间质转化(EndoMT)为CAF提供了丰富的来源。EndoMT衍生的CAF将大量骨髓衍生的巨噬细胞召集到肿瘤中，并促进这些巨噬细胞向M2型极化。M2型巨噬细胞不仅分泌IL-10和TGF-β以有效抑制细胞毒性T细胞，还产生VEGF、bFGF和PDGF以刺激肿瘤血管生成。此外，这些M2型巨噬细胞表达和分泌大量的eHSP90α，创造了一个富含eHSP90α的肿瘤微环境，能促进癌细胞的扩散和获得细胞干性。因此，eHSP90α和富含eHSP90α的肿瘤微环境可被视为新型癌症治疗的标靶。在我们之前发表的小鼠肿瘤模型结果中，EndoMT衍生的CAF显著促进了胰管腺癌细胞移植物的肿瘤生长。然而，自癌细胞接种后第4天起，当小鼠接受小鼠抗HSP90α单株抗体静脉内注射时，EndoMT促进肿瘤生长的现象被显著抑制。我们已经对这种小鼠抗HSP90α单株抗体的基因进行了测序。经过电脑辅助分析和建议，我们进一步建构了人源化和改良的抗体基因。已将重组基因导入ExpiCHO细胞以表达人源化抗HSP90α抗体HH01。通过一系列的分析，我们知道HH01抗体的CDR有一个崭新的氨基酸序列，对eHSP90α表现出很高的结合亲和力，KD值为1.87×10^-10M。HH01抗体不易形成聚集体。其水溶性好，但不易从小鼠体内排出，在血液中的半衰期>18.4天。对视网膜色素上皮细胞无细胞毒性，也不会引起小鼠脾脏肿大。HH01抗体在抗癌功能方面也表现出优越性。它有效地抑制胰管腺癌和大肠直肠癌细胞株的侵袭性和细胞类球体形成能力。我们三个小鼠癌症模型的结果表明，单独使用HH01抗体即可以消除EndoMT促进的组织间质增生性的肿瘤生长，并且还可以与吉西他滨联合使用以发挥协同作用。在自发性PDAC形成的转基因小鼠模型中，它可以有效抑制K-Ras突变引起的组织间质增生性的和胰管腺癌的发展及其肝转移，从而延长实验小鼠的存活时间。此外，在M2巨噬细胞恶化的小鼠PDAC模型中，HH01抗体能有效抑制肿瘤生长并提高肿瘤微环境的免疫性。

本说明书中公开的所有特征可以任何组合方式组合。本说明书中公开的每个特征可使用于相同、等同或类似目的的其他特征代替。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅是等同或类似特征的通用系列的示例。

此外，根据以上描述，本领域技术人员可轻易确定所描述的基本特征，并且在不脱离其精神和范围的情况下，可对本公开进行各种改变和修改以使其适应各种用途和情况。因此，其他实施例也在权利要求范围内。

Claims

1.一种分离的抗体，包括：

能够与在氨基酸235至244以及氨基酸251至260区域中含有氨基酸序列EDK的HSP90α表位专一性结合的互补决定区(CDR)。

2.如权利要求1所述的分离的抗体，其中该分离的抗体包括：

SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：12的重链可变区序列的重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3；以及

SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：17的轻链可变区序列的轻链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3。

3.如权利要求2所述的分离的抗体，其中重链CDR1、CDR2和CDR3是来自SEQ ID NO:2，且轻链CDR1、CDR2和CDR3是来自SEQ ID NO:7。

4.如权利要求3所述的分离的抗体，其中该分离的抗体包含与SEQ ID NO：2序列至少80％相同的一重链可变区，以及与SEQ ID NO：7序列至少80％相同的一轻链可变区。

5.如权利要求3所述的分离的抗体，其中该重链CDR1具有SEQ ID NO:3序列，该重链CDR2具有SEQ ID NO:4序列，该重链CDR3具有SEQ ID NO:5序列，该轻链CDR1具有SEQ IDNO:8序列，该轻链CDR2具有SEQ ID NO:9序列，以及该轻链CDR3具有SEQ ID NO:10序列。

6.如权利要求2所述的分离的抗体，其中该重链CDR1、CDR2和CDR3是来自SEQ ID NO:12，并且该轻链CDR1、CDR2和CDR3是来自SEQ ID NO:17。

7.如权利要求6所述的分离的抗体，其中该分离的抗体包含与SEQ ID NO:12序列至少80％相同的一重链可变区，以及与SEQ ID NO:17序列至少80％相同的一轻链可变区。

8.如权利要求6所述的分离的抗体，其中该重链CDR1具有SEQ ID NO:13序列，该重链CDR2具有SEQ ID NO:14序列，该重链CDR3具有SEQ ID NO:15序列，该轻链CDR1具有SEQ IDNO:18序列，该轻链CDR2具有SEQ ID NO:19序列，以及该轻链CDR3具有SEQ ID NO:20序列。

9.如权利要求1所述的抗体，其中，该分离的抗体是一包含Fc区的抗体、一Fab片段、一Fab’片段、一F(ab')2片段、一单链抗体、一scFV多聚体、一单株抗体、一单价抗体、一多特异性抗体、一人源化抗体或一嵌合抗体。

10.一种核酸分子，包含编码如权利要求1至9中任一项所述的分离的抗体的核酸序列。

11.一种医药组合物，包括如权利要求1至9中任一项所述的分离的抗体或权利要求10所述的核酸分子；以及一医药可接受的载体。

12.如权利要求11所述的医药组合物，其中该分离的抗体包括具有SEQ ID NO:13序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO:14序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:15序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO:18序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO:19序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO:20序列的轻链CDR3。

13.一种治疗一主体中一癌症的方法，包括：向主体施用一有效量的如权利要求1至9中任一项所述的分离的抗体或如权利要求10所述的核酸分子。

14.如权利要求13所述的方法，其中该分离的抗体包括具有SEQ ID NO:13序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO:14序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:15序列的重链CDR3、具有SEQ IDNO:18序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO:19序列的轻链CDR2，具有SEQ ID NO:20的序列轻链CDR3。

15.如权利要求13所述的方法，其中该癌症具有一组织间质增生特征。

16.如权利要求13所述的方法，其中该癌症具有一M2巨噬细胞所恶化特征。

17.如权利要求13所述的方法，其中该癌症是胰脏癌、大肠直肠癌、乳癌、肝癌或肺癌。

18.如权利要求13所述的方法，还包括向该主体施用一治疗剂。

19.如权利要求18所述的方法，其中该治疗剂是吉西他滨(gemcitabine)。

20.如权利要求13所述的方法，其中使用如权利要求1至9中任一项所述的分离的抗体检测该主体的血液HSP90α含量以监测该主体的肿瘤缩小。

21.一种治疗一主体中组织间质增生的方法，包括：向该主体施用一有效量的如权利要求1至9中任一项所述的分离的抗体或如权利要求10所述的核酸分子。

22.如权利要求21所述的方法，其中该分离的抗体包含具有SEQ ID NO:13序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO:14序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:15序列的重链CDR3、具有SEQ IDNO:18序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO:19序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO:20序列的轻链CDR3。

23.如权利要求21所述的方法，其中使用如权利要求1至9中任一项所述的分离的抗体检测该主体的血液HSP90α含量以监测该主体的肿瘤缩小。

24.一种治疗一主体中癌组织间质增生的方法，包括：向该主体施用一靶向eHSP90α的治疗剂。