CN118373758A - 化合物及用于肽纯化的方法 - Google Patents

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罗伯特·齐特巴特
奥利弗·赖曼
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Greros Protn Technologies
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Abstract

本发明涉及化合物及用于肽纯化的方法。本发明的化合物为式(1)：X‑Tb‑Va‑U‑Y‑Z(1)的化合物，其中，T是直链或支链间隔基；V是吸电子部分；U是苯基或五元或六元杂芳基部分；Y是‑(CH2)m‑C(＝O)‑或‑(CH2)m‑O‑C(＝O)‑；Z是吸电子离去基团。本发明还提供用于纯化肽的方法，所述方法包括以下步骤：提供接头修饰的粗肽，其中所述粗肽共价结合至所述化合物的接头分子；在偶联步骤中，将所述接头修饰的肽与固体载体偶联，产生固定的接头修饰的肽；在释放步骤中，特别地通过在酸性条件下添加还原剂来释放所述肽。

Description

化合物及用于肽纯化的方法
本申请是申请日为2019年8月27日发明名称为“用于肽纯化的无痕还原性可裂解接头分子”的申请号为2019800563229的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及纯化通过固相肽合成(SPPS)生产的肽或肽核酸的方法以及用于所述纯化的接头分子。
背景技术
固相肽合成是确定的合成肽的方法。标准程序是将第一个N-末端保护的氨基酸偶联至合成树脂，随后重复进行N-末端去保护、偶联下一个N-末端保护的氨基酸的循环，以及将未反应的肽序列封端。最后，将合成的肽从合成树脂上裂解下来并且纯化。
广泛使用的纯化肽的方法是制备型高效液相色谱法(HPLC)。该方法不利的是关于期望的生产量的可伸缩性差，因此不能用同一个系统生产不同的量。这导致对于相应的复杂装置的获得成本相对较高。另一个缺点是需要相对广泛的知识来正确地分析评估各个级分。另外，HPLC纯化包括在操作期间溶剂和偶尔柱材料(固相)的高消耗。
因此，更便宜且更不易于出现故障的方法将有利于降低肽生产的成本。
替代方法使用接头分子，该接头分子可以附连至肽，并其后偶联至在纯化期间使用的官能化的固相。
EP 0 552 368 A1描述了带有可以共价结合至纯化载体上的硫醇的接头分子。然而，该方法不适用于含硫醇的肽，诸如包括氨基酸半胱氨酸或青霉胺的肽。
EP 2 501 711 B1提出了类似的方法，其中接头经由叠氮基(-N3)和炔烃之间的1,3-偶极环加成结合至固相，其需要铜的存在。然而，包括甲硫氨酸、半胱氨酸；精氨酸或赖氨酸的肽可络合铜，使去除困难。由于铜的毒性，这样的肽不适于所有应用，诸如药物用途。
WO 2017129818(A1)公开了可以偶联至肽的接头分子，该肽在SPPS之后仍然结合至合成树脂。然后通过应用通常使用的TFA条件将肽从合成上裂解下来。然而，如WO2017129818(A1)中所公开，与肽形成氨基甲酸苄酯的接头分子的缺点是它们对酸处理(TFA>50％，在水存在下，pH<0)的不稳定性。接头分子的过早衰变导致纯化的肽的产率显著降低。
由于在用于释放肽的碱性条件(pH>9)下接头的磺基-乙烯基氨基甲酸酯(sulfo-ethyleneyl carbamate)部分(moiety)上的β-羟基或β-硫醇基团的亲核攻击，在肽的N-末端处包含Thr、Ser或Cys的肽也发生不想要的副反应。WO 2017129818(A1)中公开的接头分子的另外副反应是在碱性条件下天冬酰亚胺(aspartimide)形成和在Arg-Glu序列处精氨酸至瓜氨酸的转化，以及二硫化物形成和通过内部Cys残基的亲核副反应。
此外，WO 2017129818(A1)中描述的砜接头受到保留在固体载体上并且需要额外的淬灭步骤的反应性乙烯基砜部分的影响。
为了克服在碱性条件下的副反应和在酸性条件下接头的过早衰变的缺点，本发明提供了在TFA条件下稳定并且在温和的酸性条件下(特别是在pH≤7下)允许肽释放的接头分子。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供了一种式1：X-Tb-Va-U-Y-Z(1)的化合物，其中，
-X选自式2、2a、3、3a或4的部分(moiety)，特别是式2、2a、3或3a的部分，更特别是式2或2a的部分，
其中，
-每个R1和R2彼此独立地选自H或B，其中至少R1或R2是B，
-R3选自H或B，
-R4选自H、C1-C12-烷基或芳基，其中醛或酮基基团可被酸不稳定的保护基团保护，
-B是酸不稳定的胺保护基团，
-T是直链或支链间隔基，其包括以下部分中的至少一个，特别是1至5个，更特别是1至3个：-C1-12-烷基-、(-C2H4O-)1-12、-C(＝O)-、-C(＝O)-JR9-、-JR9-C(＝O)-、-JR9-、苯基、5元或6元杂芳基，特别是-C1-12-烷基-、(-C2H4O-)1-12、-C(＝O)-、-C(＝O)-JR9-、-JR9-C(＝O)-、-JR9-，其中，
J是CH或N，特别是N，
特别地T是选自以下的间隔基
-C1-C12-烷基-，特别是-C1-6-烷基-、更特别是-C1-3-烷基-，-R5-C(＝O)-，-R5-C(＝O)-NR9-R6-，-R5-C(＝O)-NR9-，-C(＝O)-NR9-R6-，-R5-NR9-C(＝O)-R6-，-R5-NR9-R5’-NR9’C(＝O)-R6-，-R5-C(＝O)-NR9-R5’-NR9’-C(＝O)-R6-，-R5-NR9-，-R5-NR9-R6-，-R5-NR9-R5’-NR9’-R6-，-R5-C(＝O)-NR9-R5’-NR9’-R6-，-R5-C(＝O)-O-R6-，-C(＝O)-O-R6-，-R5-苯基-R6-，-R5-苯基-，-苯基-R6-，-苯基-，-R5-吡咯基，-R5-吡唑基，-R5-咪唑基，R5-哌嗪基-，-R5-吡啶基，-R5-嘧啶基，-R5-吡嗪基，-R5-哒嗪基，-R5-吡咯基-R6-，-R5-吡唑基-R6-，-R5-咪唑基-R6-，-R5-哌嗪基-R6-，-R5-吡啶基-R6-，-R5-嘧啶基-R6-，-R5-吡嗪基-R6-，-R5-哒嗪基-R6-，吡咯基-R6-，吡唑基-R6-，咪唑基-R6-哌嗪基-R6-，吡啶基-R6-，嘧啶基-R6-，吡嗪基-R6-，哒嗪基-R6-，吡咯基，吡唑基，咪唑基，哌嗪基，吡啶基，嘧啶基，吡嗪基和哒嗪基，其中，
R5、R5’和R6彼此独立地选自C1-C12-烷基或(-C2H4O-)1-12，特别是C1-C6烷基，特别是C1-C3烷基，并且其中，
R9和R9’彼此独立地选自H、C1-4-烷基、-C1-6-烷基-NH2、-C1-6-烷基-NHB、-C1-6-烷基-NB2、-R15、-C1-6-烷基-R15、-C1-6-烷基-NH-R15，特别地选自H和C1-2-烷基，更特别地R9是H，其中，
B是独立选择的酸不稳定的胺保护基团，
R15是能与醛部分反应的封闭剂，特别地R15选自半胱氨酰基、苏氨酰基、2-巯基乙醇、半胱胺、乙二硫醇、羟胺、O-甲基羟胺、N-甲基羟胺、二硫苏糖醇、肼，特别是半胱氨酰基和N-甲基羟胺，更特别是半胱氨酰基，其中，
所述封闭剂的胺和/或硫醇部分可被独立选择的酸不稳定的胺保护基团B，特别是Boc，和/或酸不稳定的硫醇保护基团，特别是三苯甲基保护。
-b是0或1，特别是1，
-V是吸电子部分，其选自-NR11-C(＝O)-、-C(＝O)-NR11-、-S(＝O)-、-NR12-(CH2)p-、-哌嗪基-(CH2)p-、-吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、-C(＝O)-、-C(＝O)-O-，特别是-NR11-C(＝O)-、-C(＝O)-NR11-、-S(＝O)-、-NR12-(CH2)p-、-哌嗪基-(CH2)p-、-吡啶基-、嘧啶基，更特别地选自-NH-C(＝O)-、-C(＝O)-NH-、-N-(CH3)-、-哌嗪基-(CH2)p-、-吡啶基-、嘧啶基，其中，
R11选自H和C1-4-烷基，特别地选自H和C1-2-烷基，更特别地R11是H，
R12选自H和C1-4-烷基，特别地选自H和C1-2-烷基，更特别地R12是甲基，
p是0、1或2，特别是0或1，
-a是0或1，其中a和b之和是1或2，
-U是苯基或五元或六元杂芳基部分，特别是苯基或六元杂芳基部分，更特别是苯基，其结合至部分V、Wq和En中的至少一个并且可以任选地被C1-6-烷基，特别是C1-3-烷基取代，其中，
V如上所述定义，
W选自-N3、-NO2、-S(＝O)-R8、-S-S-R8、-O-CH2-N3、-O-C(＝O)-O-CH2-N3、-N＝N-苯基、-N＝N-R8、 特别是-N3、-N＝N-R8、-O-CH2-N3、-S-S-R8，其中，
R8是吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、-C1-C6-烷基或-(CH2)p-NMe2，特别是吡啶基或-C1-C6-烷基，其中p是1、2、3或4，
E在酸性条件下是吸电子基团，
n是0和4之间的整数，特别是0和2之间的整数，更特别是0或1，并且q是0和4之间的整数，特别是0和2之间的整数，更特别是0和1，其中n和q之和等于或小于4，并且其中，
在U是苯基部分且Y是-(CH2)m-O-C(＝O)-的情况下，在酸性条件下V、W、E的哈米特常数之和大于0.45，并且其中，
W相对于Y在邻位或对位，
-Y是-(CH2)m-C(＝O)-或-(CH2)m-O-C(＝O)-，其中m是1、2或3，特别是1或2，更特别是1，
-Z是吸电子离去基团。
在某些实施方式中，
-X选自式2、2a、3、3a或4的部分，特别是式2、2a、3或3a的部分，更特别是式2或2a的部分，
其中，
-每个R1和R2彼此独立地选自H或B，其中至少R1或R2是B，
-R3选自H或B，
-R4选自H、C1-C12-烷基或芳基，其中醛或酮基基团可被酸不稳定的保护基团保护，
-B是酸不稳定的胺保护基团，
-T是直链或支链间隔基，其包括以下部分中的至少一个：-C1-12-烷基-、(-C2H4O-)1-12、-C(＝O)-、-C(＝O)-JR9-、-JR9-C(＝O)-、-JR9-，其中，
J是C或N，特别是N，
特别地T是选自以下的间隔基
-C1-C12-烷基-(特别是C1-6-烷基、更特别是C1-3-烷基)、-R5-C(＝O)-、-R5-C(＝O)-NR9-R6-、-R5-C(＝O)-NR9-、-C(＝O)-NR9-R6-、-R5-NR9-C(＝O)-R6-、-R5-NR9-R5’-NR9’C(＝O)-R6-、-R5-C(＝O)-NR9-R5’-NR9’-C(＝O)-R6-、-R5-NR9-、-R5-NR9-R6-、-R5-NR9-R5’-NR9’-R6-、-R5-C(＝O)-NR9-R5’-NR9’-R6-、-R5-C(＝O)-O-R6-、-C(＝O)-O-R6-、-R5-苯基-R6-、-R5-苯基-、-苯基-R6-、-苯基-，其中，
R5、R5’和R6彼此独立地选自C1-C12-烷基或(-C2H4O-)1-12，特别是C1-C6烷基，特别是C1-C3烷基，并且其中，
R9和R9’彼此独立地选自H、C1-4-烷基、-C1-6-烷基-NH2、-C1-6-烷基-NHB、-C1-6-烷基-NB2、-R15、-C1-6-烷基-R15、-C1-6-烷基-NH-R15，特别地选自H和C1-2-烷基，更特别地R9是H，其中，
B是独立选择的酸不稳定的胺保护基团，
R15是能与醛部分反应的封闭剂，特别地R15选自半胱氨酰基、苏氨酰基、2-巯基乙醇、半胱胺、乙二硫醇、羟胺、O-甲基羟胺、N-甲基羟胺、二硫苏糖醇、肼，特别是半胱氨酰基和N-甲基羟胺，更特别是半胱氨酰基，其中，
所述封闭剂的胺和/或硫醇部分可被独立选择的酸不稳定的胺保护基团B，特别是Boc，和/或酸不稳定的硫醇保护基团，特别是三苯甲基保护，
-b是0或1，特别是1，
-V是吸电子部分，其选自-NR11-C(＝O)-、-C(＝O)-NR11-、-S(＝O)-、-NR12-、-哌嗪基-、-吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、-C(＝O)-、-C(＝O)-O-，特别是-NR11-C(＝O)-、-C(＝O)-NR11-、-S(＝O)-、-NR12-、-哌嗪基-、-吡啶基-、嘧啶基，更特别地选自-NH-C(＝O)-、-C(＝O)-NH-、-N-(CH3)-、-哌嗪基-、-吡啶基-、嘧啶基，其中，
R11选自H和C1-4-烷基，特别地选自H和C1-2-烷基，更特别地R11是H，
R12选自H和C1-4-烷基，特别地选自H和C1-2-烷基，更特别地R12是甲基，
-a是0或1，其中a和b之和是1或2，
-U是苯基或五元或六元杂芳基部分，特别是苯基或六元杂芳基部分，更特别是苯基，其结合至部分V、Wq和En中的至少一个并且可以任选地被C1-6-烷基，特别是C1-3-烷基取代，其中，
V如上所述定义，
W选自-N3、-S(＝O)-R8、-S-S-R8、-O-CH2-N3、-O-C(＝O)-O-CH2-N3、-N＝N-
苯基、-N＝N-R8、 特别是-N3、-N＝N-R8、-O-CH2-N3、-S-S-R8，其中，
R8是吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、-C1-C6-烷基或-(CH2)p-NMe2，特别是吡啶基或-C1-C6-烷基，其中p是1、2、3或4，
E在酸性条件下是吸电子基团，
n是0和4之间的整数，特别是0和2之间的整数，更特别是0或1，并且q是0和4之间的整数，特别是0和2之间的整数，更特别是0和1，其中n和q之和等于或小于4，并且其中，
在U是苯基部分且Y是-(CH2)m-O-C(＝O)-的情况下，在酸性条件下V、W、E的哈米特常数之和大于0.45，
-Y是-(CH2)m-C(＝O)-或-(CH2)m-O-C(＝O)-，其中m是1、2或3，特别是1或2，更特别是1，
Z是吸电子离去基团。
在某些实施方式中，
-X选自式2、2a、3、3a或4的部分，特别是式2、2a、3或3a的部分，更特别是式2或2a的部分，
其中，
-每个R1和R2彼此独立地选自H或B，其中至少R1或R2是B，
-R3选自H或B，
-R4选自H、C1-C12-烷基或芳基，其中醛或酮基基团可被酸不稳定的保护基团保护，
-B是酸不稳定的胺保护基团，
-T是选自以下的间隔基
-C1-C12-烷基-(特别是C1-6-烷基、更特别是C1-3-烷基)、-R5-C(＝O)-、-R5-C(＝O)-NR9-R6-、-R5-C(＝O)-NR9-、-C(＝O)-NR9-R6-、-R5-NR9-C(＝O)-R6-、-R5-NR9-R5’-NR9’C(＝O)-R6-、-R5-C(＝O)-NR9-R5’-NR9’-C(＝O)-R6-、-R5-C(＝O)-O-R6-、-C(＝O)-O-R6-、-R5-苯基-R6-、-R5-苯基-、-苯基-R6-、-苯基-，其中，
R5、R5’和R6彼此独立地选自C1-C12-烷基，特别是C1-C6烷基，特别是C1-C3烷基，并且，其中R9和R9’彼此独立地选自H和C1-4-烷基，特别地选自H和C1-2-烷基，更特别地R9是H，
-b是0或1，特别是1，
-V是吸电子部分，其选自-NR11-C(＝O)-、-C(＝O)-NR11-、-S(＝O)-、-NR12-、-哌嗪基-、-吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、-C(＝O)-、-C(＝O)-O-，特别是-NR11-C(＝O)-、-C(＝O)-NR11-、-S(＝O)-、-NR12-、-哌嗪基-、-吡啶基-、嘧啶基，更特别地选自-NH-C(＝O)-、-C(＝O)-NH-、-N-(CH3)-、-哌嗪基-、-吡啶基-、嘧啶基，其中，
R11选自H和C1-4-烷基，特别地选自H和C1-2-烷基，更特别地R11是H，
R12选自H和C1-4-烷基，特别地选自H和C1-2-烷基，更特别地R12是甲基，
-a是0或1，其中a和b之和是1或2，
-U是苯基或五元或六元杂芳基部分，特别是苯基或六元杂芳基部分，更特别是苯基，其结合至部分V、Wq和En中的至少一个并且可以任选地被C1-6-烷基，特别是C1-3-烷基取代，其中，
V如上所述定义，
W选自-N3、-S(＝O)-R8、-S-S-R8、-O-CH2-N3、-O-C(＝O)-O-CH2-N3、-N＝N-
苯基、-N＝N-R8、 特别是-N3、-N＝N-R8、-O-CH2-N3、-S-S-R8，其中，
R8是吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、-C1-C6-烷基或-(CH2)p-NMe2，特别是吡啶基或-C1-C6-烷基，其中p是1、2、3或4，
E在酸性条件下是吸电子基团，
n是0和4之间的整数，特别是0和2之间的整数，更特别是0或1，并且q是0和4之间的整数，特别是0和2之间的整数，更特别是0和1，其中n和q之和等于或小于4，并且其中，
在U是苯基部分且Y是-(CH2)m-O-C(＝O)-的情况下，在酸性条件下V、W、E的哈米特常数之和大于0.45，并且其中，
特别地W相对于Y在邻位或对位，
-Y是-(CH2)m-C(＝O)-或-(CH2)m-O-C(＝O)-，其中m是1、2或3，特别是1或2，更特别是1，
-Z是吸电子离去基团。
在某些实施方式中，
-X选自式2、2a、3、3a或4的部分，特别是式2、2a、3或3a的部分，更特别是式2或2a的部分，最特别地选自2的部分，
其中，
-每个R1和R2彼此独立地选自H或B，其中至少R1或R2是B，
-R3选自H或B，
-R4选自H、C1-C12-烷基或芳基，其中醛或酮基基团可被酸不稳定的保护基团保护，
-B是酸不稳定的胺保护基团，
-T是选自以下的间隔基
-C1-C12-烷基-(特别是C1-6-烷基、更特别是C1-3-烷基)、-R5-C(＝O)-NR9-R6-、-C(＝O)-NR9-R6-、-R5-NR9-R5-NR9C(＝O)-R6-、-R5-NR9-C(＝O)-R6-、-R5-C(＝O)-O-R6-、-C(＝O)-O-R6-、-R5-苯基-R6-、-R5-苯基-、-苯基-R6-、-苯基-，其中，
R5和R6彼此独立地选自C1-C12-烷基，特别是C1-C6烷基，特别是C1-C3烷基，并且其中R9选自H和C1-4-烷基，特别地选自H和C1-2-烷基，更特别地R9是H，
-b是0或1，特别是1，
-V是吸电子部分，其选自-NR11-C(＝O)-、-C(＝O)-NR11-、-S(＝O)-、-NR12-、-吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、-C(＝O)-、-C(＝O)-O-，特别是-NR11-C(＝O)-、-S(＝O)-、-NR12-、-吡啶基-、嘧啶基，其中，
R11选自H和C1-4-烷基，特别地选自H和C1-2-烷基，更特别地R11是H，
R12选自H和C1-4-烷基，特别地选自H和C1-2-烷基，更特别地R12是甲基，
-a是0或1，其中a和b之和是1或2，
-U是苯基或五元或六元杂芳基部分，特别是苯基或六元杂芳基部分，其结合至部分V、W和E中的至少一个，其中，
V如上所述定义，
W选自-N3、-S(＝O)-R8、-SSR8、-OCH2N3、-OC(＝O)OCH2-N3、
-N＝N-苯基、-N＝N-吡啶、 其中，
R8是吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、-C1-C6-烷基或-(CH2)p-NMe2，其中p是1、2、3或4，
E选自吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、-F、-Cl、-Br、-I、-CN、-NO2、-N3、-CF3、-SO3H、-CO2H、-C(＝O)NH2、-SO2Me、-SOMe、-SO2Et、-SOEt，特别是吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、-F、-Cl、-Br、-I、-CN、-NO2、-N3、-CF3、-SO3H、-CO2H，其中，
R13选自-F、-Cl、-Br、-I、-PF6，并且其中，
在U是苯基部分且Y是-(CH2)m-O-C(＝O)-的情况下，在酸性条件下V、W、E的哈米特常数之和大于0.45，并且其中，
特别地W相对于Y在邻位或对位，
-Y是-(CH2)m-C(＝O)-或-(CH2)m-O-C(＝O)-，其中m是1、2或3，特别是1或2，更特别是1，
-Z是吸电子离去基团。
式1的接头分子适于纯化固相肽合成(SPPS)后的肽。
用于使用接头分子纯化SPPS后的肽的常用方法是在最后的偶联步骤中将接头分子偶联至肽的N-末端。在该偶联步骤中，肽的N-末端将亲核攻击接头分子以与接头的部分Y形成共价的氨基甲酸酯或酰胺键，同时释放吸电子离去基团Z。随后，通过添加TFA将肽-接头-构建体从合成树脂上裂解下来。
当肽-接头构建体例如通过使用TFA被裂解下来时，根据本发明的接头在酸性条件下是稳定的。
接头的部分X可以偶联至在纯化期间使用的官能化的固相，诸如树脂。部分X可以通过与官能化的固相的合适部分(诸如醛、酮、氨基-氧基或肼)反应形成腙键或肟键。
部分T表示在通常应用的纯化条件下是非反应性的间隔基。
部分T直接或经由部分V结合到部分U。
部分U有助于接头分子在酸性条件(特别地TFA>50％，在水存在下，pH<0)下的稳定性。这是通过使用结合至吸电子部分E、W和V中的至少一个的杂环部分或苯基部分来实现的。
如果将吸电子部分(E、W、V)附连至苯基部分，则与肽连接的接头分子的苄基位置获得较小的电子密度，并且因此较不容易受到酸催化的降解的影响。为了使本发明的接头分子在酸性条件下具有足够的稳定性，必须满足一定的吸电子阈值。该阈值表示为在酸性条件下V、W、E的哈米特常数(σm和σp)之和大于0.45。哈米特常数根据Hansch and Taft(1991),Chem.Rev.91:165-195计算。正的哈米特常数反映了取代基对苯基部分施加吸电子作用的能力，而负值表示取代基施加给电子作用。
哈米特常数是苯甲酸衍生物中间位(σm)和对位(σp)的苯基核的取代基导致不同的酸度(pKa)的凭经验确定的常数。在本发明的上下文中，相对于结合的部分Y确定位置。对于邻位的取代基，对位的哈米特值是良好的近似值，并且因此在本发明的上下文中用于计算取代基V、W和E的哈米特值之和。
值得注意的是，在酸性条件下计算取代基V、W和E的哈米特常数。例如，胺部分在中性pH下特征在于哈米特常数σm＝-0.16并且σp＝-0.66，并且因此为推电子取代基。在酸性条件下，胺部分被质子化。对于质子化的胺，哈米特常数是σm＝+0.86并且σp＝+0.60，表明质子化的胺是吸电子取代基，这还包括能够通过共轭π系统以其质子化形式从U吸出电子的芳香族胺，无论是直接作为U上的取代基还是在U的π共轭中。
哈米特常数之和的阈值大于0.45适用于U是苯基部分且Y是-(CH2)m-O-C(＝O)-，其中m＝1，因为-O-C(＝O)-构成苄基位置中的良好的离去基团，有助于酸催化的降解。因此，芳环中的电子密度应足够低，以防止Y中的苄基位置的阳离子稳定。
表1
取代基 σm [a] σp [a] 取代基 σm [a] σp [a]
-Br 0.39 0.23 -Cl 0.37 0.23
-N3 0.37 0.08 -NO2 0.71 0.78
-CONHMe 0.35 0.36 -N＝NC6H5 0.32 0.39
-SH 0.25 0.15 -S- -0.36 -1.21
-OH 0.12 -0.35 -O- -0.47 (-0.81)
-NH3 + 0.86 0.60 -NH2 -0.16 -0.66
-NMe3 +[b] 0.88 0.82 -NMe2 -0.16 -0.83
-CH2NH3 + 0.59 0.53 -CH2NH2 -0.03 -0.11
-CH2NMe2H+ 0.40 0.43 -CH2NMe2 0.00 0.01
-(4-嘧啶基) 0.30 0.63 -(4-吡啶基) 0.27 0.44
-SOMe 0.52 0.49 -SMe 0.15 0.00
-SO2Me 0.60 0.72 -SSMe 0.22 0.00
-OCH2CH3 0.10 -0.24 Et -0.07 -0.15
[a]σm表示相对于苄基碳的间位取代基的哈米特值和对位取代基的σp值，σp被认为是邻位取代基的σ值的良好的近似值(所有值均根据Hansch and Taft(1991),Chem.Rev.91:165-195)，[b]-NMe3+是-NMe2H+的良好近似
如果部分Y是-(CH2)m-C(＝O)-，则该阈值不是必需的，因为-C(＝O)-在苄基位置不是良好的离去基团。
为了包括杂环部分U的接头分子在酸性条件下的稳定性，选择特定部分V、W和E的这样的额外阈值不是必需的。由于杂环部分本身与苯基部分相比更加缺电子，因此V、W和E的任何组合似乎对于接头分子在酸性条件下的稳定性均足够。尤其是当U是含氮杂环时，在肽的酸性释放期间氮将被质子化，从而使U的芳香族系统的电子密度尤其低。因此，不能稳定苄基阳离子。
除了调节接头分子在酸性条件下的稳定性之外，部分V、W和E对于肽的释放机理也是重要的。此外，它们可能在酸性条件下有助于接头分子的溶解性。
部分W是可还原的取代基，其触发接头的衰变，并因此触发肽的释放。包括还原的部分W的接头也称为还原的中间体。与稳定的接头分子相反，还原的中间体是不稳定的。还原的中间体的不稳定性是pH依赖性的。如果部分W是可质子化的，例如吡啶基，则它也有助于接头分子在酸性条件下的溶解性。
部分E是吸电子取代基，其在酸性条件下显示出吸电子作用。例如，在酸性条件下具有正哈米特常数的部分是吸电子的，特别是在pH 3至6，更特别是在pH 4.5。如果部分E是可质子化的，则它也有助于接头分子在酸性条件下的溶解性。
除了部分E之外或替代部分E，部分V在酸性条件下可显示吸电子作用。部分V也可有助于接头在酸性条件下的稳定性和溶解性。
根据本发明的接头分子可以经由胺开关机理(参见图5、6和7)或经由氨基甲酸酯开关机理(参见图8)释放肽。
部分Y是-C(＝O)-或-O-C(＝O)-部分。在偶联接头分子时，在接头分子与肽的N-末端之间形成酰胺(-C(＝O)-NH-)或氨基甲酸酯(-O-C(＝O)-NH-)部分。纯化之后，肽通过1.4或1.6消除或亲核攻击在还原性条件下从接头分子中释放，并因此从纯化介质中释放。还原性刺激将W转化为其还原版本，现在起给电子基团和亲核试剂的作用，从而使肽能够释放。
在某些实施方式中，X选自式2或3的部分。
在某些实施方式中，X选自式2的部分。
通过形成腙或肟键而将部分X偶联至官能化的固相所需的反应时间比当使用具有式4的部分的接头时更长并且比当使用具有式2或3的部分的接头时更短。固体载体的醛或酮部分与式3的部分X之间的腙键的形成是可逆的。由于这种可逆性，诸位发明人观察到在纯化期间的每个洗涤步骤之后肽材料的损失最高达约10％。与此相反，当使用具有式2的部分的接头时，几乎没有观察到肽材料的损失。
在某些实施方式中，U被C1-6-烷基取代。
在某些实施方式中，U被C1-3-烷基取代。
在某些实施方式中，U被甲基取代。
如果U进一步被一个或多个烷基部分取代，则考虑烷基部分的哈米特值。在U进一步被苯基部分或杂原子取代的情况下，V、W、E和任选的烷基取代基的哈米特值之和大于0.45。在某些实施方式中，E选自哌啶基、哌嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、-N(C2H4)2NH2、-N(C2H4)2N-B、-N＝N-苯基、-N＝N-R8、-(CH2)r-NH-C1-6-烷基、-(CH2)r-N(C1-6-烷基)2-、-F、-Cl、-Br、-I、-CN、-NO2、-N3、-CF3、-SO3H、-CO2H、-C(＝O)NH2、-SO2Me、-SOMe、-SO2Et、-SOEt，其中，
R8是吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、-C1-C6-烷基或-(CH2)p-NMe2，特别是吡啶基或-C1-C6-烷基，其中p是1、2、3或4，并且
B是如本文定义的酸不稳定的胺保护基团，特别是-C(＝O)OtBu(Boc)或C(＝O)CPh3，并且
r是0、1、2、3或4，特别是0、1或2。在某些实施方式中，E选自哌啶基、哌嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、-(CH2)r-NH-C1-6-烷基、-(CH2)r-N(C1-6-烷基)2-、-N＝N-苯基、-N＝N-R8、-F、-Cl、-Br、-I、-CN、-NO2、-N3、-CF3、-SO3H、-CO2H，其中r是0、1、2、3或4，特别是0、1或2。
在某些实施方式中，E选自哌啶基、哌嗪基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、-NH-C1-6-烷基、-N(C1-6-烷基)2-、-N＝N-吡啶基或–Br。
在某些实施方式中，E选自哌啶基、哌嗪基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、-NH-C1-6-烷基、-N(C1-6-烷基)2-或–Br。
在某些实施方式中，E选自吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、-NH-C1-6-烷基、-N(C1-6-烷基)2-或–Br。
在某些实施方式中，E选自吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、-N＝N-苯基、-N＝N-R8、-F、-Cl、-Br、-I、-CN、-NO2、-N3、-CF3、-SO3H、-CO2H、-C(＝O)NH2、-SO2Me、-SOMe、-SO2Et、-SOEt，其中R8是吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、-C1-C6-烷基或-(CH2)p-NMe2，特别是吡啶基或-C1-C6-烷基，其中p是1、2、3或4。
在某些实施方式中，E选自吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、-N＝N-苯基、-N＝N-R8、-F、-Cl、-Br、-I、-CN、-NO2、-N3、-CF3、-SO3H、-CO2H，其中R8是吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、-C1-C6-烷基或-(CH2)p-NMe2，特别是吡啶基或-C1-C6-烷基，其中p是1、2、3或4。
在某些实施方式中，E选自哌啶基、哌嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、-(CH2)r-NH-C1-6-烷基、-(CH2)r-N(C1-6-烷基)2-，特别是-(CH2)r-NH-C1-3-烷基、-(CH2)r-N(C1-3-烷基)2-、-F、-Cl、-Br、-I、-CN、-NO2、-N3、-CF3、-SO3H、-CO2H、-C(＝O)NH2、-SO2Me、-SOMe、-SO2Et、-SOEt，其中r是0、1或2，特别是0。
在某些实施方式中，E选自吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、-F、-Cl、-Br、-I、-CN、-NO2、-N3、-CF3、-SO3H、-CO2H、-C(＝O)NH2、-SO2Me、-SOMe、-SO2Et、-SOEt。
在某些实施方式中，E选自哌啶基、哌嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、-(CH2)r-NH-C1-6-烷基、-(CH2)r-N(C1-6-烷基)2-，特别是-(CH2)r-NH-C1-3-烷基、-(CH2)r-N(C1-3-烷基)2-、-F、-Cl、-Br、-I、-CN、-NO2、-N3、-CF3、-SO3H、-CO2H。
在某些实施方式中，E选自哌啶基、哌嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、-F、-Cl、-Br、-I、-CN、-NO2、-N3、-CF3、-SO3H、-CO2H，其中r是0、1或2，特别是0。
在某些实施方式中，E选自吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、-F、-Cl、-Br、-I、-CN、-NO2、-N3、-CF3、-SO3H、-CO2H。
在某些实施方式中，E选自吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、-NH-C1-6-烷基、-N(C1-6-烷基)2-，特别是-NH-C1-3-烷基、-N(C1-3-烷基)2-或-Br。
在某些实施方式中，E选自吡啶基、嘧啶基、哒嗪基或-Br。
在某些实施方式中，n是0、1或2。
在某些实施方式中，E选自吡啶基、嘧啶基、哒嗪基并且n是1或者E是–Br并且n是1或2。
经由胺开关(图5、6和7)的肽释放需要可以被质子化的碱性氮。这样的碱性氮可以由部分E提供。
在某些实施方式中，E选自-(CH2)r-NH-C1-6-烷基、-(CH2)r-N(C1-6-烷基)2-，特别是-(CH2)r-NH-C1-3-烷基、-(CH2)r-N(C1-3-烷基)2-、哌啶基、哌嗪基、吡啶基、嘧啶基和哒嗪基，其中r是0、1或2，特别是0，其中特别地n是1。
在某些实施方式中，E选自-(CH2)r-NH-C1-6-烷基、-(CH2)r-N(C1-6-烷基)2-，特别是-(CH2)r-NH-C1-3-烷基、-(CH2)r-N(C1-3-烷基)2-、吡啶基、嘧啶基和哒嗪基，r是0、1或2，特别是0，并且n是1。
特别地，通过氨基甲酸酯开关(图8)释放肽的接头分子包括不被用于还原部分W的还原剂还原的吸电子部分。用于氨基甲酸酯开关的合适的取代基E可以是非可质子化的，诸如卤素或硝基取代基。同样，特征在于相应的酸的pKa＜0的取代基是用于氨基甲酸酯开关的合适的取代基E。
在某些实施方式中，E是–F、-Cl、-Br、-I、-NO2、-CF3、-CN、-NC、BF2、-PF4、-OCF3、-SOCF3、-SOR8、-SO2R8。
在某些实施方式中，E是-Br。
在某些实施方式中，E是–Br并且n是1或2。
如果接头在酸性条件下的溶解性应增加，例如用于纯化疏水性肽，则E可以选自可质子化的部分。在某些实施方式中，E选自哌啶基、哌嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、-N(C2H4)2NH2、-N(C2H4)2N-B、-N＝N-R8、-(CH2)r-NH-C1-6-烷基、-(CH2)r-N(C1-6-烷基)2-、-SO3H、-CO2H、-C(＝O)NH2、-SO2Me、-SOMe、-SO2Et、-SOEt，其中R8选自吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、-(CH2)p-NMe2，其中p是1、2、3或4，特别是1或2。
在某些实施方式中，B选自
-Boc(-C(＝O)OtBu)、Eei(＝CMeOEt、1-乙氧基乙亚基)、三苯甲基(-C(Ph)3)、-C(＝O)CPh3、Mmt(-C(Ph)2C6H4OMe)、DMT(-C(Ph)(C6H4OMe)2)、Cbz(-C(＝O)OCH2Ph)、苯甲亚基胺(＝CPh)、邻苯二甲酰亚胺(＝(CO)2C6H4)、对甲苯磺酰胺(-SO2C6H4Me)、苄胺(-CH2Ph)、乙酰胺(-COMe)、三氟乙酰胺(-COCF3)、Dde(1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)-3-乙基)和1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)-3-甲基丁基(ivDde)，其中特别地B是Boc或Eei，其中更特别地B是Boc，或者
-缩醛-或缩酮保护基团选自
其中r是0至12，特别是0至6，更特别是0、1或2，并且
R10是-C1-C12-烷基-，特别是C1-6-烷基，更特别是C1-3-烷基。
在某些实施方式中，B选自
-Boc(-C(＝O)OtBu)、Eei(＝CMeOEt、1-乙氧基乙亚基)、三苯甲基(-C(Ph)3)、Mmt(-C(Ph)2C6H4OMe)、DMT(-C(Ph)(C6H4OMe)2)、Cbz(-C(＝O)OCH2Ph)、苯甲亚基胺(＝CPh)、邻苯二甲酰亚胺(＝(CO)2C6H4)、对甲苯磺酰胺(-SO2C6H4Me)、苄胺(-CH2Ph)、乙酰胺(-COMe)、三氟乙酰胺(-COCF3)、Dde(1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)-3-乙基)和1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)-3-甲基丁基(ivDde)，其中特别地B是Boc或Eei，其中更特别地B是Boc，或者
-缩醛-或缩酮保护基团选自
其中r是0至12，特别是0至6，更特别是0、1或2，并且
R10是-C1-C12-烷基-，特别是C1-6-烷基，更特别是C1-3-烷基。
在某些实施方式中，B选自Boc(-C(＝O)OtBu)、Eei(＝CMeOEt、1-乙氧基乙亚基)、三苯甲基(-C(Ph)3)、Mmt(-C(Ph)2C6H4OMe)、DMT(-C(Ph)(C6H4OMe)2)、Cbz(-C(＝O)OCH2Ph)、苯甲亚基胺(＝CPh)、邻苯二甲酰亚胺(＝(CO)2C6H4)、对甲苯磺酰胺(-SO2C6H4Me)、苄胺(-CH2Ph)、乙酰胺(-COMe)、三氟乙酰胺(-COCF3)、Dde(1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)-3-乙基)和1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)-3-甲基丁基(ivDde)。
在某些实施方式中，B是Boc或Eei(＝CMeOEt、1-乙氧基乙亚基)。
在某些实施方式中，B是Boc。
在某些实施方式中，B选自缩醛-或缩酮保护基团，其选自
其中r是0至12，特别是0至6，更特别是0、1或2，并且R10是-C1-C12-烷基-，特别是C1-6-烷基。
在某些实施方式中，T是直链或支链间隔基，其包括以下部分中的至少一个：-C1-12-烷基-、(-C2H4O-)1-12、-C(＝O)-、-C(＝O)-JR9-、-JR9-C(＝O)-、-JR9-、苯基、5元或6元杂芳基，其中J是CH或N，特别是N，其中R9独立地选自H、C1-4-烷基、-C1-6-烷基-NH2、-C1-6-烷基-NHB、-C1-6-烷基-NB2，特别地选自H和C1-2-烷基，更特别地R9是H，其中B是独立选择的酸不稳定的胺保护基团。
在某些实施方式中，T是直链或支链间隔基，特别是直链间隔基，其包括1至5个独立地选自以下的部分：-C1-12-烷基-、(-C2H4O-)1-12、-C(＝O)-、-C(＝O)-JR9-、-JR9-C(＝O)-、-JR9-、苯基、5元或6元杂芳基，
在某些实施方式中，T是直链或支链间隔基，其包括以下部分中的至少一个，特别是1至5个：-C1-12-烷基-、-C(＝O)-、-C(＝O)-NR9-、-NR9-C(＝O)-、-NR9-、苯基、哌嗪基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基和哒嗪基，
在某些实施方式中，T是直链或支链间隔基，其包括以下部分中的至少一个，特别是1至5个：-C1-12-烷基-、-C(＝O)-、-C(＝O)-NR9-、-NR9-C(＝O)-、-NR9-、苯基、咪唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基和哒嗪基，
在某些实施方式中，T是直链间隔基。
在某些实施方式中，T是直链或支链间隔基，其包括以下部分中的至少一个：-C1-12-烷基-、(-C2H4O-)1-12、-C(＝O)-、-C(＝O)-JR9-、-JR9-C(＝O)-、-JR9-，其中J是C或N，特别是N，其中R9独立地选自H、C1-4-烷基、-C1-6-烷基-NH2、-C1-6-烷基-NHB、-C1-6-烷基-NB2，特别地选自H和C1-2-烷基，更特别地R9是H，其中B是独立选择的酸不稳定的胺保护基团。
在某些实施方式中，间隔基T的总长度是0.5和100nm之间。
在某些实施方式中，T选自-C1-C12-烷基-，特别是C1-6-烷基、更特别是C1-3-烷基，-R5-C(＝O)-，-R5-C(＝O)-NR9-R6-，-R5-C(＝O)-NR9-，-C(＝O)-NR9-R6-，-R5-NR9-C(＝O)-R6-，-R5-NR9-R5’-NR9’C(＝O)-R6-，-R5-C(＝O)-NR9-R5’-NR9’-C(＝O)-R6-，-R5-NR9-，-R5-NR9-R6-，-R5-NR9-R5’-NR9’-R6-，-R5-C(＝O)-NR9-R5’-NR9’-R6-，-R5-C(＝O)-O-R6-，-C(＝O)-O-R6-，-R5-苯基-R6-，-R5-苯基-，-苯基-R6-，-苯基-，-R5-吡咯基，-R5-吡唑基，-R5-咪唑基，R5-哌嗪基-，-R5-吡啶基，-R5-嘧啶基，-R5-吡嗪基，-R5-哒嗪基，-R5-吡咯基-R6-，-R5-吡唑基-R6-，-R5-咪唑基-R6-，-R5-哌嗪基-R6-，-R5-吡啶基-R6-，-R5-嘧啶基-R6-，-R5-吡嗪基-R6-，-R5-哒嗪基-R6-，吡咯基-R6-，吡唑基-R6-，咪唑基-R6-哌嗪基-R6-，吡啶基-R6-，嘧啶基-R6-，吡嗪基-R6-，哒嗪基-R6-，吡咯基，吡唑基，咪唑基，哌嗪基，吡啶基，嘧啶基，吡嗪基和哒嗪基。
在某些实施方式中，T选自-C1-C12-烷基-(特别是C1-6-烷基、更特别是C1-3-烷基)、-R5-C(＝O)-、-R5-C(＝O)-NR9-R6-、-R5-C(＝O)-NR9-、-C(＝O)-NR9-R6-、-R5-NR9-C(＝O)-R6-、-R5-NR9-R5’-NR9’C(＝O)-R6-、-R5-C(＝O)-NR9-R5’-NR9’-C(＝O)-R6-、-R5-NR9-、-R5-NR9-R6-、-R5-NR9-R5’-NR9’-R6-、-R5-C(＝O)-NR9-R5’-NR9’-R6-、-R5-C(＝O)-O-R6-、-C(＝O)-O-R6-、-R5-苯基-R6-、-R5-苯基-、-苯基-R6-、-苯基-、-R5-咪唑基、-、-R5-咪唑基-R6-、咪唑基-R6-、咪唑基。
在某些实施方式中，T选自-C1-C12-烷基-(特别是C1-6-烷基、更特别是C1-3-烷基)、-R5-C(＝O)-、-R5-C(＝O)-NR9-R6-、-R5-C(＝O)-NR9-、-C(＝O)-NR9-R6-、-R5-NR9-C(＝O)-R6-、-R5-NR9-R5’-NR9’C(＝O)-R6-、-R5-C(＝O)-NR9-R5’-NR9’-C(＝O)-R6-、-R5-NR9-、-R5-NR9-R6-、-R5-NR9-R5’-NR9’-R6-、-R5-C(＝O)-NR9-R5’-NR9’-R6-、-R5-C(＝O)-O-R6-、-C(＝O)-O-R6-、-R5-咪唑基、-、-R5-咪唑基-R6-、咪唑基-R6-、咪唑基。
在某些实施方式中，T选自-C1-C12-烷基-(特别是C1-6-烷基、更特别是C1-3-烷基)、-R5-C(＝O)-、-R5-C(＝O)-NR9-R6-、-R5-C(＝O)-NR9-、-C(＝O)-NR9-R6-、-R5-NR9-C(＝O)-R6-、-R5-NR9-R5’-NR9’C(＝O)-R6-、-R5-C(＝O)-NR9-R5’-NR9’-C(＝O)-R6-、-R5-NR9-、-R5-NR9-R6-、-R5-NR9-R5’-NR9’-R6-、-R5-C(＝O)-NR9-R5’-NR9’-R6-、-R5-C(＝O)-O-R6-、-C(＝O)-O-R6-。
在某些实施方式中，T选自-C1-C12-烷基-(特别是C1-6-烷基、更特别是C1-3-烷基)、-R5-C(＝O)-、-R5-C(＝O)-NR9-、-R5-NR9-C(＝O)-R6-、-R5-C(＝O)-NR9-R6-、-R5-C(＝O)-NR9-R5’-NR9’C(＝O)-R6-，特别是C1-3-烷基、-R5-C(＝O)-NR9-、-R5-NR9-C(＝O)-R6-，更特别是C1-3-烷基或-R5-C(＝O)-NR9-，其中R5、R5*、R6、R9’和R9如以上定义。
在某些实施方式中，T是直链或支链间隔基，其包括以下部分中的至少一个，特别是1至5个：-C1-12-烷基-、-C(＝O)-、-C(＝O)-NR9-、-NR9-C(＝O)-、-NR9-、苯基、5元至6元杂芳基，其中R9独立地选自H、C1-4-烷基、-C1-6-烷基-NH2、-C1-6-烷基-NHB、-C1-6-烷基-NB2、-R15、-C1-6-烷基-R15、-C1-6-烷基-NH-R15，特别地选自H和C1-2-烷基，更特别地R9是H，其中B是独立选择的酸不稳定的胺保护基团，其中，
R15是能与醛部分反应的封闭剂，特别地R15选自半胱氨酰基、苏氨酰基、2-巯基乙醇、半胱胺、乙二硫醇、羟胺、O-甲基羟胺、N-甲基羟胺、二硫苏糖醇、肼，特别是半胱氨酰基和N-甲基羟胺，更特别是半胱氨酰基，其中，
所述封闭剂的胺和/或硫醇部分可被独立选择的酸不稳定的胺保护基团B，特别是Boc，和/或酸不稳定的硫醇保护基团，特别是三苯甲基保护。
在某些实施方式中，T是直链或支链间隔基，其包括以下部分中的至少一个，特别是1至5个：-C1-12-烷基-、-C(＝O)-、-C(＝O)-NR9-、-NR9-C(＝O)-、-NR9-、苯基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、哌嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基和哒嗪基，
在某些实施方式中，T是直链或支链间隔基，其包括以下部分中的至少一个，特别是1至5个：-C1-12-烷基-、-C(＝O)-、-C(＝O)-NR9-、-NR9-C(＝O)-、-NR9-、苯基、咪唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基和哒嗪基，
在某些实施方式中，T是直链或支链间隔基，其包括以下部分中的至少一个：-C1-12-烷基-、-C(＝O)-、-C(＝O)-NR9-、-NR9-C(＝O)-、-NR9-，其中R9独立地选自H、C1-4-烷基、-C1-6-烷基-NH2、-C1-6-烷基-NHB、-C1-6-烷基-NB2、-R15、-C1-6-烷基-R15、-C1-6-烷基-NH-R15，特别地选自H和C1-2-烷基，更特别地R9是H，其中B是独立选择的酸不稳定的胺保护基团，
R15是能与醛部分反应的封闭剂，特别地R15选自半胱氨酰基、苏氨酰基、2-巯基乙醇、半胱胺、乙二硫醇、羟胺、O-甲基羟胺、N-甲基羟胺、二硫苏糖醇、肼，特别是半胱氨酰基和N-甲基羟胺，更特别是半胱氨酰基，其中，
所述封闭剂的胺和/或硫醇部分可被独立选择的酸不稳定的胺保护基团B，特别是Boc，和/或酸不稳定的硫醇保护基团，特别是三苯甲基保护。
如上所述，间隔基T在通常应用的纯化条件下通常是非反应性的，除了在酸性条件下去除保护基团外。间隔基T可以增强接头分子的溶解性。特别地，在R9处包括受保护的或未保护的胺部分的支链间隔基有助于增强溶解性。在酸性条件下，去除胺保护基团B，并使胺质子化。
在某些实施方式中，T是直链或支链间隔基，其包括以下部分中的至少一个：-C1-12-烷基-、-C(＝O)-、-C(＝O)-NR9-、-NR9-C(＝O)-、-NR9-，其中R9独立地选自H、C1-4-烷基、-C1-6-烷基-NH2、-C1-6-烷基-NHB、-C1-6-烷基-NB2，特别地选自H和C1-2-烷基，更特别地R9是H，其中B是独立选择的酸不稳定的胺保护基团。
间隔基T也可以包括封闭功能。特别地，支链间隔基可以包括适于结合醛部分的封闭剂。当用于肽纯化的固相包括醛部分时，例如琼脂糖珠，接头化合物的部分X可以例如通过形成肟键共价结合到固相上。未反应的醛部分可能在后续纯化期间引起不想要的副反应。为防止这样的副反应，固相的未反应的醛部分可通过间隔基的封闭功能封闭，例如半胱氨酰基部分。
在某些实施方式中，T是直链或支链间隔基，其包括以下部分中的至少一个：-C1-12-烷基-、-C(＝O)-、-C(＝O)-NR9-、-NR9-C(＝O)-、-NR9-，其中R9独立地选自H、C1-4-烷基、-R15、-C1-6-烷基-R15、-C1-6-烷基-NH-R15，特别地选自H和C1-2-烷基，更特别地R9是H，其中B是独立选择的酸不稳定的胺保护基团，
R15是能与醛部分反应的封闭剂，特别地R15选自半胱氨酰基、苏氨酰基、2-巯基乙醇、半胱胺、乙二硫醇、羟胺、O-甲基羟胺、N-甲基羟胺、二硫苏糖醇、肼，特别是半胱氨酰基和N-甲基羟胺，更特别是半胱氨酰基，其中，
所述封闭剂的胺和/或硫醇部分可被独立选择的酸不稳定的胺保护基团B，特别是Boc，和/或酸不稳定的硫醇保护基团，特别是三苯甲基保护。
在某些实施方式中，T选自-C1-C12-烷基-(特别是C1-6-烷基、更特别是C1-3-烷基)、-R5-C(＝O)-NR9-R6-、-C(＝O)-NR9-R6-、-R5-NR9-C(＝O)-R6-、-R5-C(＝O)-O-R6-、-C(＝O)-O-R6-、-R5-NR9-R5-NR9C(＝O)-R6-，特别地选自-C1-C12-烷基-，特别是C1-6-烷基，更特别是C1-3-烷基、-R5-NR9-C(＝O)-R6-、-R5-C(＝O)-NR9-R6-、-R5-NR9-R5-NR9C(＝O)-R6-，最特别是-R5-NR9-C(＝O)-R6-，其中R5、R6和R9如以上定义。
如上所述，部分U、V、W和E有助于接头在酸性条件下的稳定性。例如，当胺或杂环被质子化时，包括部分U或V的接头在酸性条件下(特别地TFA＞50％，在水存在下，pH＜0)是稳定的，该部分U或V包括胺或杂环，诸如吡啶。此外，质子化的接头改善了接头-肽复合物的溶解性。如果pH高于接头的pKa，则接头将在所期望的肽释放期间中作为最后步骤迅速分解。
在某些实施方式中，V是吸电子部分，其选自-NR11-C(＝O)-、-C(＝O)-NR11-、-S(＝O)-、-NR12-(CH2)p-、-哌嗪基-(CH2)p-、-吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、-C(＝O)-、-C(＝O)-O-，其中，
R11选自H和C1-4-烷基，特别地选自H和C1-2-烷基，更特别地R11是H，
R12选自H和C1-4-烷基，特别地选自H和C1-2-烷基，更特别地R12是甲基，
p是0、1或2，特别是0或1。
在某些实施方式中，V是吸电子部分，其选自-NR11-C(＝O)-、-C(＝O)-NR11-、-S(＝O)-、-NR12-(CH2)p-、-哌嗪基-(CH2)p-、-吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、-C(＝O)-、-C(＝O)-O-，其中吡啶基部分在位置3处连接至U。
在某些实施方式中，V选自-NR11-C(＝O)-、-C(＝O)-NR11-、-S(＝O)-、-NR12-(CH2)p-、-哌嗪基-(CH2)p-。
在某些实施方式中，V选自-NR11-C(＝O)-、-C(＝O)-NR11-、-NR12-(CH2)p-、-哌嗪基-(CH2)p-。
在某些实施方式中，V选自-NH-C(＝O)-、-C(＝O)-NH-、-N-(CH3)-、-NH-、-哌嗪基-(CH2)p-。
在某些实施方式中，V选自-NH-C(＝O)-、-C(＝O)-NH-、-N-(CH3)-、-哌嗪基-(CH2)p-。
在某些实施方式中，V选自-NH-C(＝O)-、-C(＝O)-NH-、-N-(CH3)-、-哌嗪基-(CH2)p-，其中p是0或1。
在某些实施方式中，V选自-NH-C(＝O)-、-C(＝O)-NH-和-哌嗪基-(CH2)p-，其中p是0或1，特别地p是0。
特别地经由氨基甲酸酯开关(图8)释放肽的接头分子不包括碱性氮原子，其中这样的原子具有低于2的相应的酸的pKa。在某些实施方式中，V选自-NR11-C(＝O)-、-C(＝O)-NR11-和-S(＝O)-，特别地选自-NH-C(＝O)-和–C(O＝)-NH-，更特别地V是–NH-C(＝O)-。
V是吸电子部分，其选自-NR11-C(＝O)-、-C(＝O)-NR11-、-S(＝O)-、-NR12-、-哌嗪基-、-吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、-C(＝O)-、-C(＝O)-O-，其中R11选自H和C1-4-烷基，特别地选自H和C1-2-烷基，更特别地R11是H，R12选自H和C1-4-烷基，特别地选自H和C1-2-烷基，更特别地R12是甲基。
V是吸电子部分，其选自-NR11-C(＝O)-、-C(＝O)-NR11-、-S(＝O)-、-NR12-、-哌嗪基-、-吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、-C(＝O)-、-C(＝O)-O-，其中R11选自H和C1-4-烷基，特别地选自H和C1-2-烷基，更特别地R11是H，R12选自H和C1-4-烷基，特别地选自H和C1-2-烷基，更特别地R12是甲基。
V是吸电子部分，其选自-NR11-C(＝O)-、-C(＝O)-NR11-、-S(＝O)-、-NR12-、-哌嗪基-、-吡啶基-、嘧啶基，其中R11选自H和C1-4-烷基，特别地选自H和C1-2-烷基，更特别地R11是H，R12选自H和C1-4-烷基，特别地选自H和C1-2-烷基，更特别地R12是甲基。
V是吸电子部分，其选自-NR11-C(＝O)-、-C(＝O)-NR11-、-NR12-、-哌嗪基-、-吡啶基-、嘧啶基，其中R11选自H和C1-4-烷基，特别地选自H和C1-2-烷基，更特别地R11是H，R12选自H和C1-4-烷基，特别地选自H和C1-2-烷基，更特别地R12是甲基。
V是吸电子部分，其选自-NH-C(＝O)-、-C(＝O)-HN-、-N-(CH3)-、-哌嗪基-、-吡啶基-、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基。
V是吸电子部分，其选自-NH-C(＝O)-、-C(＝O)-HN-、-N-(CH3)-、-哌嗪基-、-吡啶基-、嘧啶基。
在某些实施方式中，V是吸电子部分，其选自-NR11-C(＝O)-、-C(＝O)-NR11-、-S(＝O)-、-NR12-、-吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、-C(＝O)-、-C(＝O)-O-。
在某些实施方式中，V选自-NR11-C(＝O)-、-C(＝O)-NR11-、-S(＝O)-、-NR12-和-吡啶基-、嘧啶基，其中R11选自H和C1-4-烷基，特别地选自H和C1-2-烷基，更特别地R11是H，并且R12选自H和C1-4-烷基，特别地选自H和C1-2-烷基，更特别地R12是甲基。
在某些实施方式中，V选自-NR11-C(＝O)-、S(＝O)-、-NR12-、-吡啶基-、嘧啶基，其中R11选自H和C1-4-烷基，并且R12选自H和C1-4-烷基。
在某些实施方式中，V选自-NR11-C(＝O)-、S(＝O)-、-NR12-、-吡啶基-、嘧啶基，其中R11选自H和C1-2-烷基，并且R12选自H和C1-2-烷基。
在某些实施方式中，V选自-NH-C(＝O)-、-N-(CH3)-、-吡啶基-、嘧啶基。
特别地，经由胺开关释放肽的接头分子需要碱性氮原子。碱性氮原子可以经由部分V、E或U(U＝杂芳基)提供。如果U是苯基，则碱性氮原子可以经由部分V或E提供。
在某些实施方式中，E和V如上所述选择，其中在U是苯基的情况下，至少一个部分E或V选自
-E：哌啶基、哌嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、-N(C2H4)2NH2、-N(C2H4)2N-B、-N＝N-R8、-(CH2)r-NH-C1-6-烷基、-(CH2)r-N(C1-6-烷基)2-、-N3、-SO3H、-CO2H、-C(＝O)NH2、-SO2Me、-SOMe、-SO2Et、-SOEt，其中R8选自吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、-(CH2)p-NMe2，p和B如本文所述定义，并且
-V：-NR12-(CH2)p-、-哌嗪基-(CH2)p-、-吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、特别是-NR12-(CH2)p-、-哌嗪基-(CH2)p-、-吡啶基-、嘧啶基，其中R12和p如本文所述定义。
如上所述，W是可还原部分。在W还原时，还原的中间体进一步以pH依赖性方式衰变以释放具有游离的N-末端的肽。
在某些实施方式中，W选自-N3、-NO2、-S(＝O)-R8、-S-S-R8、-O-CH2-N3、-O-C(＝O)-O-CH2-N3、-N＝N-苯基、-N＝N-R8、 其中，
R8是吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、-C1-C6-烷基或-(CH2)p-NMe2，特别是吡啶基或-C1-C6-烷基，其中p是1、2、3或4。C1-6-烷基可以是直链或支链的，例如，丁基或叔丁基。
在某些实施方式中，W选自-N3、-NO2、-S(＝O)-R8、-S-S-R8、-O-CH2-N3、-O-C(＝O)-O-CH2-N3、-N＝N-苯基、-N＝N-R8、
在某些实施方式中，W选自-N3、-S(＝O)-R8、-S-S-R8、-O-CH2-N3、-N＝N-R8，特别是-N3、-N＝N-R8、-O-CH2-N3、-S-S-R8，其中R8是吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、-C1-C6-烷基或-(CH2)p-NMe2，特别是吡啶基或-C1-C6-烷基，其中p是1、2、3或4。
在某些实施方式中，W选自-N3、-S(＝O)-R8、-S-S-R8、-O-CH2-N3、-N＝N-R8，特别是-N3、-N＝N-R8、-O-CH2-N3、-S-S-R8，其中R8是吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、-C1-C6-烷基或-(CH2)p-NMe2，特别是吡啶基或-C1-C6-烷基，其中p是1、2、3或4。
在R8是C1-6-烷基的情况下，烷基部分可以是直链或支链的，例如叔丁基。特别是在W是-S-S-R8的情况下，R8可以是吡啶基或-C1-C4-烷基，特别是吡啶基或叔丁基。
包括部分W＝-S-S-R8的接头可以用硫醇裂解。因此，当这样的接头用于肽纯化时，在酸性条件下(例如，TFA＞50％，在水存在下，pH＜0)从在SPPS期间使用的合成树脂上裂解肽-接头复合物可以在没有硫醇的情况下进行。
在某些实施方式中，W选自-N3、-S(＝O)-R8、-S-S-R8、-O-CH2-N3、-N＝N-R8，特别是-N3、-N＝N-R8、-O-CH2-N3、-S-S-R8，其中R8是吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基或-C1-C6-烷基，或者，特别是嘧啶基、吡啶基或-C1-C6-烷基，更特别是吡啶基或-C1-C6-烷基。
在某些实施方式中，W选自–N3、-S-S-R8，其中R8是-C1-C6-烷基和–NO2。
经由具有叠氮基还原性安全锁的胺开关(图5)或通过氨基甲酸酯开关(图8)释放肽的接头分子包括可还原部分–N3。在某些实施方式中，W是–N3。
经由具有没有叠氮基的还原性安全锁的胺开关(图6)释放肽的接头分子包括可还原部分，诸如–NO2或–S-S-叔丁基。在某些实施方式中，W选自–S-S-R8(其中R8是-C1-C6-烷基)、-NO2、--N＝N-R8(其中R8是吡啶基、嘧啶基、吡嗪基或哒嗪基)，
在某些实施方式中，W选自–S-S-R8(其中R8是-C1-C6-烷基)、-NO2、-N＝N-R8(其中R8是吡啶基、嘧啶基、吡嗪基或哒嗪基)，特别是-NO2或–S-S-R8(其中R8是-C1-C6-烷基)。
经由具有亲核释放的胺开关(图7)释放肽的接头分子包括可还原部分，诸如–N3、-S-S-R8，其中R8是C1-6-烷基，特别是叔丁基，或者R8是吡啶基。
如上所述，接头分子可以有助于接头-肽构建体在酸性条件下的溶解性，特别是在疏水性肽的纯化期间。溶解性还可以通过部分W来调节，即，W选自向将在0-7的pH范围内纯化的肽引入增强的溶解性的基团。
在某些实施方式中，W选自-S(＝O)-R8、-S-S-R8、-N＝N-R8、其中，
R8是吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、-(CH2)p-NHBoc或-(CH2)p-NMe2，特别是吡啶基或-(CH2)p-NHBoc-，其中p是1、2、3或4。
在某些实施方式中，U选自苯基或五元或六元杂环，其中五元或六元杂环包括1或2个杂原子。
在某些实施方式中，U选自苯基或五元或六元杂环，其中五元或六元杂环包括1个杂原子。
在某些实施方式中，U选自苯基或六元杂环。
在某些实施方式中，U选自苯基或六元杂环，其中六元杂环包括1或2个杂原子。
在某些实施方式中，U的五元或六元杂芳基部分包括1或2个杂原子，特别地部分U的五元杂芳基部分选自吡唑、咪唑，并且部分U的六元杂芳基部分选自吡啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪，特别是吡啶。
在某些实施方式中，U选自苯基或六元杂环，其中六元杂环包括1个杂原子。在某些实施方式中，部分U的五元杂环选自吡唑、咪唑，并且部分U的六元杂环选自吡啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪。
在某些实施方式中，U选自苯基、吡啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪，特别是苯基或吡啶，更特别是苯基。
根据本发明的接头可以通过胺开关(图5至图7)或氨基甲酸酯开关(图8)释放肽。这些释放机理需要可还原取代基W在相对于部分Y的邻位或对位，
在某些实施方式中，U选自式5或6的部分，
其中，
T、V、Y、W和E如上所述定义，
U结合至部分T或V，
A1、A2、A3、A4和D1、D2、D3、D4彼此独立地选自C、N、S和O，特别地选自C和N，并且
n是0和3之间的整数，特别是0、1或2。
在某些实施方式中，A1、A2、A3和A4或D1、D2、D3和D4中的2至4个部分是C，特别地A1、A2、A3和A4或D1、D2、D3和D4中的3或4个部分是C。
在某些实施方式中，所有部分A1、A2、A3和A4或D1、D2、D3和D4是C，
在某些实施方式中，U选自式5、6、7或8的部分，
其中，
T、V、Y、W和E如上所述定义，
在式5和6的情况下，U结合至所述部分T或V，
在式7和8的情况下，U结合至所述部分V，
A1、A2、A3、A4和D1、D2、D3、D4彼此独立地选自C、N、S和O，特别地选自C和N，其中A1、A2、A3和A4或D1、D2、D3和D4中的2至4个部分是C，特别地A1、A2、A3和A4或D1、D2、D3和D4中的3或4个部分是C，更特别地所有部分A1、A2、A3和A4或D1、D2、D3和D4是C，n是
在式5和6的情况下，0和3之间的整数，
在式7和8的情况下，0和4之间的整数，
q是0和4之间的整数，其中n和q之和等于或小于4。
在某些实施方式中，U选自式5或6的部分。
在某些实施方式中，U选自式5、6、7或8的部分，其中，
T、V、Y、W和E如上所述定义，
在式5和6的情况下，U结合至所述部分T或V，
在式7和8的情况下，U结合至所述部分V，
A1、A2、A3、A4和D1、D2、D3、D4彼此独立地选自C、N、S和O，特别地选自C和N，
n是
在式5和6的情况下，0和2之间的整数，
在式7和8的情况下，0和2之间的整数，特别是0和1，
q是0和2之间的整数，特别是0和1。
在某些实施方式中，U选自式9、10、11或12的部分，特别是式9或10的部分，
其中，
T、V、Y、W、E、q和n如上所述定义，
在式9和10的情况下，U结合至所述部分T或V，
在式11和12的情况下，U结合至所述部分V，
所有部分A2、A3和A4是C或A2、A3和A4中的两个是C并且A2、A3和A4中的其他两个是N，特别地A2和A3均是C，并且
D2是C或N，特别是C。
在某些实施方式中，U选自式9、10、11或12的部分，特别是式9或10的部分，
其中，
T、V、Y、W、E、q和n如上所述定义，
在式9和10的情况下，U结合至所述部分T或V，
在式11和12的情况下，U结合至所述部分V，
A2和A3均是C或A2和A3中的一个是C并且A2和A3中的另一个是N，D2是C或N。
如果部分U包括含N的杂芳基，则N原子在酸性条件下被质子化并因此增加了接头分子的溶解性。
在某些实施方式中，U选自式13、14、15、16、17、18、19、20或21的部分，特别是式13至19的部分，更特别是式15或19的部分，
其中，
T、V、Y、W、E、q和n如上所述定义，
在式13、14和15的情况下，U结合至所述部分T或V，
在式16、17和18的情况下，U结合至所述部分V，
A2、A3和A4是C、N或N+Me，特别是C，
D2是C或N。
在某些实施方式中，U选自式13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的部分，
其中T、V、Y、W、E、q和n如上所述定义，
在式13、14、15、19、20、21和22的情况下，U结合至部分T或V，
在式16、17和18的情况下，U结合至所述部分V，
A2、A3和A4是C或N，特别是C，
D2是C或N。在某些实施方式中，U选自式13、14、15、16、17或18的部分，
其中，
T、V、Y、W、E、q和n如上所述定义，
在式13、14和15的情况下，U结合至所述部分T或V，
在式16、17和18的情况下，U结合至所述部分V，
A3是C或N，
D2是C或N。
在某些实施方式中，U选自式13、14、15、21或22的部分，其中，
T、V、Y、W、E和n如上所述定义，
U结合至部分T或V，
A3和A4是C或N，特别是C，
D2是C或N。
在某些实施方式中，U选自式13、21或22的部分。
特别是对于经由氨基甲酸酯开关释放肽的接头分子，U是苯基。在某些实施方式中，U如上所述选择并且所有A和所有D都是C。
对于具有还原性安全锁的胺开关(图5和6)和氨基甲酸酯开关(图8)，部分Y特别是-(CH2)m-O-C(＝O)-以允许当接头的衰变被pH变化触发以释放具有游离的N-末端的肽时释放CO2。
在某些实施方式中，U是式13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的部分并且Y是-(CH2)m-O-C(＝O)-。
在某些实施方式中，U是式13、14、15、21或22的部分，并且Y是-(CH2)m-O-C(＝O)-。
在某些实施方式中，U是式13或21的部分，并且Y是-(CH2)m-O-C(＝O)-。
对于具有亲核释放的胺开关(图7)，如果部分Y与肽形成酰胺键，接头仅在酸性条件下稳定。在某些实施方式中，Y是-(CH2)m-C(＝O)-。
如果接头分子以–COOH结束，则肽可以经由普通氨基酸偶联偶联至肽。在某些实施方式中，Y是-(CH2)m-C(＝O)-并且Z是–OH。
对于具有亲核释放的胺开关，特别地U是式22的部分，Y是-(CH2)m-C(＝O)-并且Z是–OH。
在某些实施方式中，Z选自：-F、-Cl、-Br、-I、-N3、-OH、-O(C＝O)CH2(C＝O)OH-SR14、-OCF3、-OCH2CF3、-OSO2CF3、-SO2C6H4CH3、-SO2CF3、-SO2CH3
特别是-OH、-Cl、特别是-OH、
其中R14是C1-C6-烷基-、芳基-或苄基取代基。
适用于通过具有叠氮基还原性安全锁的胺开关(图5)释放肽的类型1的接头分子可以由以下部分构成：
U是苯基或嘧啶基，特别地U是式13、14、15、21或22，
W是–N3，
E的n是1并且E选自吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、-N(CH3)2、-N＝N-吡啶基或n是0，特别地n是0，
V的a是1并且V选自–哌嗪基-、-哌嗪基-CH2-、-N(CH3)-、嘧啶基、吡啶基，特别地选自–哌嗪基-、-哌嗪基-CH2-、-N(CH3)-，并且
Y是-(CH2)m-O-C(＝O)-，其中m是1、2或3，特别是1或2，更特别是1。
吡啶基部分在位置3或5处连接至U。
在某些实施方式中，U选自式13、14、15、21或22的部分，
适用于通过没有叠氮基的胺开关(图6)释放肽的类型2的接头分子可以由以下部分构成：
U是吡啶基或苯基，特别地U是式13、14或21，
W选自–S-S-叔丁基、-NO2、-N＝N-吡啶基、特别地选自–S-S-叔丁基、-NO2，
E的n是0，
V的a是1并且V选自–C(＝O)-NH-和哌嗪基，并且
Y是-(CH2)m-O-C(＝O)-，其中m是1、2或3，特别是1或2，更特别是1。
在某些实施方式中，U选自式13、14或21的部分，
适用于通过具有亲核释放的胺开关(图7)释放肽的类型3的接头分子可以由以下部分构成：
U是苯基或吡啶基，特别是苯基，更特别地U是式13或14的部分，
W是–N3、-S-S-叔丁基、-S-S-吡啶基，特别是–N3，
E的n是0，
V的a是1并且V是哌嗪基、-NH-、-C(＝O)-NH-，特别是哌嗪基，并且
Y是-(CH2)m-C(＝O)-，其中m是1、2或3，特别是1或2，更特别是1。
在某些实施方式中，U选自式13或14的部分，其中特别地所有部分D和A是C。
适用于通过氨基甲酸酯开关(图8)释放肽的类型4的接头分子可以由以下部分构成：
U是苯基，特别地U是式13或15，其中特别地部分A是C，
W是–N3，
E的n是1或2并且E是–Br，
V的a是1并且V是–NH-C(＝O)-，并且
Y是-(CH2)m-O-C(＝O)-，其中m是1、2或3，特别是1或2，更特别是1。
在某些实施方式中，U选自式13或15的部分，其中特别地部分A是C，
在某些实施方式中，Z选自：-F、-Cl、-Br、-I、-N3、-OH、-SR14、-OCF3、-OCH2CF3、-OSO2CF3、-SO2C6H4CH3、-SO2CF3、-SO2CH3
特别是-OH、-Cl、特别是-OH、
其中R14是C1-C6-烷基-、芳基-或苄基取代基。
在Z是–OH的情况下，–OH部分被如通常用于例如固相肽合成的偶联试剂活化，并且用作离去基团。
在某些实施方式中，式1的化合物选自式X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23、X24、X25、X26、X27、x28、X29、X30、X31、X32、X33、X34、X35、X36、X37、X38、X39、X40、X41、X42、X43、X44、X45、X46或X47的化合物。
本发明的第二方面旨在用于纯化肽的方法。
根据本发明的第二方面，提供了一种用于纯化肽的方法。所述方法包括以下步骤：
-提供接头修饰的粗肽，其中所述粗肽共价结合至根据本发明的第一方面的接头分子，
-在偶联步骤中，将所述接头修饰的肽与固体载体偶联，产生固定的接头修饰的肽，
-在释放步骤中，通过在酸性条件下添加还原剂来释放所述肽。
根据本发明的第一方面的接头分子可以用于纯化肽的方法。在第一步骤中，使粗肽混合物与根据本发明的第一方面的接头分子接触，并将粗肽偶联至接头分子，产生接头修饰的粗肽。通过化学、生物化学或药学领域的普通专家通常已知的标准方法将粗肽偶联至接头分子。
在纯化期间，可以通过调节pH来解决接头分子的稳定性。在酸性条件下(特别是在pH低于接头分子最碱性杂原子的pKa下)，由于该杂原子被质子化并吸出电子的事实，因此接头分子是稳定的(图5、6、7)。当将接头结合至肽并且固定在固体载体上时，在还原条件下经由还原的中间体释放肽，例如在酸性条件下添加还原剂，诸如三苯基膦。还原的中间体特征在于还原的接头部分，例如azalide。还原的中间体的接头部分随时间推移或经触发(诸如增加pH，特别是至pH＞还原的中间体的接头部分的最碱性杂原子的pKa)衰变。因此，肽释放之前的所有步骤(偶联、任选的洗涤和接头的还原)在酸性条件下进行。当pH增加到高于还原的中间体的接头部分的最碱性杂原子的pKa的pH时，还原的中间体接头部分通过1.4/1.6消除反应或亲核攻击而衰变并且释放肽。
还原的中间体的接头分子/接头部分的最碱性杂原子涉及以下：例如，部分U由被-N3取代的吡啶组成。吡啶的杂原子N具有～5的pKa，其高于-N3部分或还原的-N3部分的pKa(-NH3的pKa为约4.6)。因此，最碱性杂原子是吡啶部分的N。通过将pH变换为pH>5，还原的中间体的接头部分经历消除反应并释放肽。该机理称为胺开关。
替代地，接头分子可以通过氨基甲酸酯开关(图8)而衰变。合适的接头分子包括吸电子部分(诸如-Br)和可还原部分(例如–N3)。由于吸电子，接头分子在TFA条件下是稳定的。经还原，接头分子在pH高于氨基甲酸酯的pKa时是稳定的。最后，通过将pH降低至pH<氨基甲酸酯的pKa，经由1.6消除来释放肽。
在某些实施方式中，在添加还原剂之前的所有步骤中的pH是pH<接头部分的最碱性杂原子的pKa。
在某些实施方式中，肽经由中间体释放。
在某些实施方式中，通过在酸性条件下添加还原剂，肽经由还原的中间体释放，该还原的中间体特征在于固定的接头修饰的肽的还原的接头部分。
在某些实施方式中，在释放步骤中，实现了特征在于固定的接头修饰的肽的还原的接头部分的还原的中间体，并且通过触发使肽从所述还原的中间体释放，该触发特别是温度和/或pH的变化，更特别地，在胺开关的情况下，通过将pH增加至pH>还原的中间体的接头部分的最碱性杂原子的pKa，或者在氨基甲酸酯开关的情况下，通过将pH降低至pH<氨基甲酸酯的pKa。
在某些实施方式中，在释放步骤中，实现了特征在于固定的接头修饰的肽的还原的接头部分的还原的中间体，并且通过触发使肽从所述还原的中间体释放，该触发特别是温度和/或pH的变化，更特别地，通过将pH增加至pH>还原的中间体的接头部分的最碱性杂原子的pKa。
肽自发地或通过触发从中间体释放。
在某些实施方式中，触发是温度和/或pH的变化。
在某些实施方式中，温度的变化是将温度从环境温度(20℃至30℃)增加至较高温度，其中较高温度不超过100℃，特别是70℃，更特别是50℃。
如上所述，当pH增加至高于最碱性杂原子的pKa的pH时，适用于胺开关的接头如果它们被还原则衰变。
在某些实施方式中，触发是pH的变换，特别是增加pH。
在某些实施方式中，通过将pH增加至pH>还原的中间体的接头部分的最碱性杂原子的pKa，使肽从还原的中间体释放。
当pH降低至低于氨基甲酸酯的pKa的pH时，适用于氨基甲酸酯开关的接头如果它们被还原则衰变。
在某些实施方式中，触发是pH的变换，特别是降低pH。
在某些实施方式中，通过将pH降低至pH<接头部分的氨基甲酸酯的pKa，使肽从还原的中间体释放。
如果还原的中间体在酸性条件下(胺开关)或在pH>氨基甲酸酯的pKa下(氨基甲酸酯开关)是稳定的，可以进行额外的洗涤步骤以去除过量的还原剂。因为还原剂可以不仅与接头部分反应而且还与肽反应，所以通过额外的洗涤步骤减少了还原剂和肽之间的不想要的副反应。此外，非挥发性还原剂或其使用产物也是杂质，其将必须通过额外的纯化步骤来去除。
在某些实施方式中，在形成还原的中间体之后且在使肽从还原的中间体释放之前，通过洗涤去除还原剂。
在某些实施方式中，使用MeCN去除还原剂。
在某些实施方式中，根据本发明的第一方面的接头分子包括部分W和/或E，其包括叠氮基(-N3)部分。
在某些实施方式中，将接头修饰的肽另外结合至合成树脂，并且在进行偶联步骤之前将合成树脂裂解下来，特别是在pH<接头分子的最碱性杂原子的pKa下。
通过使用TFA实现了将肽从合成载体上裂解下来，通过从TFA混合物中沉淀肽(例如2-8h后)来提供粗肽混合物来结束。对于沉淀，可以使用冷醚(Et2O、iPr2O、MeOtBu、THF/己烷(1:1))。
将粗肽混合物溶解在合适的有机溶剂，特别是DMSO中，并且添加缓冲系统，特别是10体积百分比的pH 4.5的0.1M柠檬酸钠缓冲液。
用于偶联步骤的固体载体是醛修饰的固体载体，特别是琼脂糖珠、聚赖氨酸、聚乙二醇、聚酰胺、聚苯乙烯及它们的共聚物，将溶解的粗肽混合物添加至其中。
在某些实施方式中，固体载体包括醛部分。
在某些实施方式中，在进行偶联步骤之后，使用封闭剂封闭固体载体的未反应的醛部分。
在某些实施方式中，封闭剂与固体载体的醛部分反应，并且包括硫醇和/或胺部分。
在某些实施方式中，封闭剂选自半胱氨酸、苏氨酸、2-巯基乙醇、半胱胺、乙二硫醇、羟胺、O-甲基羟胺、N-甲基羟胺、二硫苏糖醇、肼。
在某些实施方式中，封闭剂选自半胱氨酸和N-甲基羟胺。
特别地，用DMSO、6M盐酸胍(guanidium hydrochloride)、具有0.1MNaCl的EtOH/水(7:3)、水、MeCN洗涤偶联产物。
在某些实施方式中，在pH<接头分子的最碱性杂原子的pKa下进行释放步骤。
在某些实施方式中，在pH<接头分子的氨基甲酸酯的pKa下进行释放步骤。
在某些实施方式中，还原剂选自三苯基膦、三甲基膦、三乙基膦、三丁基膦或三(2-羧基乙基)膦、亚磷酸三甲酯、亚磷酸三乙酯、三丁基膦、亚磷酸二乙酯、5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)、连二亚硫酸钠(Na2S2O4)、乙二硫醇、丙二硫醇、二硫赤藓糖醇、二硫苏糖醇、Na2S、NaSH、谷胱甘肽、2,2'-二硫二吡啶、BH3、4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷、儿茶酚硼烷、硼烷四氢呋喃、硼烷二甲基硫醚、硼烷二甲基胺络合物、硼烷三苯基膦络合物、硼烷叔丁基胺、LiAlH4、LiBH4、NaBH4、NaBH3CN、NaBH(OMe)3、NaBH(OCCH3)3、LiAlH(OCMe3)3、氢醌、抗坏血酸钠、抗坏血酸、具有KI的抗坏血酸、肼、NH＝NH、甲醛。
在某些实施方式中，还原剂选自二硫赤藓糖醇、二硫苏糖醇、三苯基膦、具有KI的抗环血酸、三丁基膦、三甲基膦、三(2-羧基乙基)膦、连二亚硫酸钠(Na2S2O4)、硼烷二甲基硫醚、硼烷三苯基膦络合物、NaBH4、抗坏血酸
在某些实施方式中，还原剂选自二硫赤藓糖醇、二硫苏糖醇、具有KI的抗环血酸、三苯基膦和三甲基膦。
在某些实施方式中，还原剂选自三苯基膦、三甲基膦、三乙基膦、三丁基膦或三(2-羧基乙基)膦、亚磷酸三甲酯、亚磷酸三乙酯、三丁基膦、亚磷酸二乙酯、5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)、连二亚硫酸钠(Na2S2O4)、乙二硫醇、丙二硫醇、二硫苏糖醇、Na2S、NaSH、谷胱甘肽、2,2'-二硫二吡啶、BH3、4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷、儿茶酚硼烷、硼烷四氢呋喃、硼烷二甲基硫醚、硼烷二甲基胺络合物、硼烷三苯基膦络合物、硼烷叔丁基胺、LiAlH4、LiBH4、NaBH4、NaBH3CN、NaBH(OMe)3、NaBH(OCCH3)3、LiAlH(OCMe3)3、氢醌、抗坏血酸钠、抗坏血酸、肼、NH＝NH、甲醛。
在某些实施方式中，还原剂选自三苯基膦、三丁基膦、三甲基膦、三乙基膦或三(2-羧基乙基)膦、连二亚硫酸钠(Na2S2O4)、硼烷二甲基硫醚、硼烷三苯基膦络合物、NaBH4、抗坏血酸。
在某些实施方式中，还原剂选自三苯基膦、三甲基膦、三乙基膦或三(2-羧基乙基)膦、连二亚硫酸钠(Na2S2O4)、硼烷二甲基硫醚、硼烷三苯基膦络合物、NaBH4、抗坏血酸。
在某些实施方式中，还原剂选自三苯基膦、连二亚硫酸钠(Na2S2O4)、硼烷二甲基硫醚、硼烷三苯基膦络合物、NaBH4、抗坏血酸。
在某些实施方式中，还原剂选自三苯基膦和三甲基膦。
在某些实施方式中，还原剂是三苯基膦。
在某些实施方式中，方法包括以下步骤：
-提供接头修饰的粗肽，其中所述粗肽共价结合至根据本发明的第一方面的接头分子，其中所述接头分子包括包含叠氮基部分的部分W和/或E，
-在偶联步骤中，将所述接头修饰的肽与固体载体偶联，产生固定的接头修饰的肽，
-在释放步骤中，通过在酸性条件下添加还原剂来释放所述肽。
在某些实施方式中，方法包括以下步骤：
-提供接头修饰的粗肽，其中所述粗肽共价结合至根据本发明的第一方面的接头分子，其中所述接头分子包括包含叠氮基部分的部分W和/或E，
-在偶联步骤中，将所述接头修饰的肽与固体载体偶联，产生固定的接头修饰的肽，
-在释放步骤中，通过在酸性条件下添加还原剂产生还原的中间体，随后将pH增加至pH>所述还原的中间体的接头部分的最碱性杂原子的pKa来释放所述肽。
在某些实施方式中，方法包括以下步骤：
-提供接头修饰的粗肽，其中所述粗肽共价结合至根据本发明的第一方面的接头分子，其中所述接头分子包括包含叠氮基部分的部分W和/或E，
-在偶联步骤中，将所述接头修饰的肽与固体载体偶联，产生固定的接头修饰的肽，
-在释放步骤中，通过在酸性条件下添加三苯基膦、三甲基膦、三乙基膦或三(2-羧基乙基)膦，特别是三苯基膦产生还原的中间体，随后将pH增加至pH>所述还原的中间体的接头部分的最碱性杂原子的pKa来释放所述肽。
根据本发明的第二方面的子方面，提供了用于纯化通过固相肽合成制备的粗肽的方法。
在某些实施方式中，用于纯化肽的方法包括以下步骤：
a)提供结合至合成树脂的肽，其中肽另外共价结合至根据本发明的第一方面所述的接头分子，其中接头分子包括包含叠氮基部分的部分W和/或E，
b)将肽从合成树脂上裂解下来
c)将裂解的肽混合物与固体载体偶联
d)用三苯基膦或三甲基膦、三乙基膦或三(2-羧基乙基)膦，特别是三苯基膦释放肽。
通过使用TFA实现了将肽从合成载体上裂解下来，通过从TFA混合物中沉淀肽(例如2-8h后)来提供粗肽混合物来结束。对于沉淀，可以使用冷醚(Et2O、iPr2O、MeOtBu、THF/己烷(1:1))。
将粗肽混合物溶解在合适的有机溶剂，特别是DMSO中，并且添加缓冲系统，特别是10体积百分比的pH 4.5的0.1M柠檬酸钠缓冲液。
用于偶联步骤的固体载体是醛修饰的固体载体，特别是琼脂糖珠、聚赖氨酸、聚乙二醇、聚酰胺、聚苯乙烯及它们的共聚物，将溶解的粗肽混合物添加至其中。
特别地，用DMSO、6M盐酸胍、具有0.1M NaCl的EtOH/水(7:3)、水、MeCN洗涤偶联产物。
在某些实施方式中，将三苯基膦、三甲基膦、三乙基膦或三(2-羧基乙基)膦，特别是三苯基膦添加在MeCN/AcOH(9:1)中。在某些实施方式中，添加进行15min。
在某些实施方式中，将三苯基膦、三甲基膦、三乙基膦或三(2-羧基乙基)膦添加在MeCN/AcOH/H2O(90:5:5)中，和/或其中在添加三苯基膦、三甲基膦、三乙基膦或三(2-羧基乙基)膦，特别是三苯基膦之后，特别用MeCN或MeCN/H2O(9:1)洗去形成的azaylide。
在某些实施方式中，将三苯基膦、三甲基膦、三乙基膦或三(2-羧基乙基)膦，特别是三苯基膦添加在MeCN/AcOH/H2O(90:5:5)中。在某些实施方式中，添加进行15min。
在某些实施方式中，在添加三苯基膦、三甲基膦、三乙基膦或三(2-羧基乙基)膦之后，特别用MeCN或MeCN/H2O(9:1)洗涤形成的azaylide。
在某些实施方式中，在添加三苯基膦、三甲基膦、三乙基膦或三(2-羧基乙基)膦之后，特别用MeCN洗涤形成的azaylide。
在某些实施方式中，特别用H2O/TFA使形成的azaylide水解。定量可以是99.95％水至50％水。
当接头，特别是U、E、W或V是含氮杂环时，pH应高于杂环部分的pKa，在TFA-水水解混合物中或通过添加具有所期望的pH的缓冲溶液已经可能是这种情况。
在某些实施方式中，在水解之后进行洗脱步骤，特别是用TFA/H2O，更特别地以9:1的比率。
在某些实施方式中，在水解之后进行洗脱步骤，特别是用TFA/H2O，更特别地以95:5的比率。
在某些实施方式中，水解产物沉淀，特别是通过添加冷醚，更特别地是Et2O、iPr2O、MeOtBu、THF/己烷(1:1)。
术语和定义
在本发明的上下文中，“吸电子基团”或“EWG”是能够通过诱导效应或中介效应将电子从其连接的原子或芳基体系中吸走的任何化学基团。
在本发明的上下文中，哈米特常数是如Hansch and Taft(1991),Chem.Rev.91:165-195中计算和描述的常量。正的哈米特常数反映了取代基对苯基部分施加吸电子作用的能力，而负值表示取代基施加给电子作用。吸电子作用越强，哈米特常数越大。哈米特常数是苯基部分在间位(σm)和对位(σp)的取代基的凭经验确定的常数。在本发明的上下文中，相对于结合的部分Y确定位置。对于邻位的取代基，对位的哈米特值是良好的近似值，并且因此在本发明的上下文中用于计算取代基V、W和E的哈米特值之和。
在本发明的上下文中，术语“在酸性条件下”涉及pH低于pH 7，特别地pH低于接头的pKa，更特别地TFA>50％，在水存在下，pH<0。
在本发明的上下文中，术语烷基是指直链或支链饱和烃。例如，术语C1-12烷基表示具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个碳原子的饱和的直链或支链烃。C1-C4烷基的非限制性实例是甲基、乙基、丙基、正丁基、2-甲基丙基和叔丁基。
附图说明
图1示出了通过使用类型X-Tb-Va-U(W)-Y-Z的接头的本发明的肽纯化的图示，其中W是N3，并且该方法描述于本发明的第二方面中。SR＝合成树脂，PB＝纯化珠；1.)4当量的X-Tb-Va-U(W)-Y-Z，6当量的Oxyma，6当量的DIEA，2h。3.)用DMSO溶解粗肽并且添加10体积％的柠檬酸钠pH4.5，90min。4.)洗涤。5.)PPh3在MeCN/AcOH 9:1中，15min。6.)用MeCN洗涤。7)用H2O/TFA水解。8.)1,6-或1,4-消除。9.)最终醚沉淀。
图2A和图2B示出了肽P1(H-ARTKQTARKSTGGKA-OH)通过使用本发明的接头分子X1和X2进行本发明的肽纯化的实例。A＝吸收(210nm)，B＝时间/min；1.)接头偶联至P1之前的粗肽样品的色谱图。2.)通过使用接头X1和如本发明的第二方面所述的方法纯化之后的P1的色谱图。3.)通过使用接头X2和如本发明的第二方面所述的方法纯化之后的P1的色谱图。
图3A和图3B示出了肽P2(H-AKADEVSLHKWYG-NH2)通过使用本发明的接头分子X2进行本发明的肽纯化的实例。A＝吸收(210nm)，B＝时间/min；1.)接头偶联至P2之前的粗肽样品的色谱图。2.)通过使用接头X2和如本发明的第二方面所述的方法纯化之后的P2的色谱图。～3-氨基苯甲酸用作肽定量的内标。
图4A至图4D示出了肽P3(H-YFTGSEVENVSVNVH-NH2)、P4(H-PSNPFYEALST-NH2)、P5(H-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFF-NH2)和P6(H-CKADEVSMHKWYG-NH2)通过使用本发明的接头分子X1进行本发明的肽纯化的四个实例。A＝吸收(210nm)，B＝时间/min；1.)接头偶联至肽之前的粗肽样品的色谱图。2.)通过使用接头X1和如本发明的第二方面所述的方法纯化之后的肽的色谱图。
对图5至8的一般说明：
在图5-8中，使用以下缩写：P＝肽，E＝箭头示出吸电子或给电子的方向，a)TFA裂解合成树脂(SR)以得到接头修饰的肽，b)与醛官能化的固体载体一起孵育以将接头修饰的肽固定在那些纯化珠(PB)上，c)洗涤珠以去除合成杂质，d)通过添加还原剂还原，e)洗去还原剂，f)调节pH以产生释放的电子结构，g)通过1,6-、1,4-消除或亲核攻击自发地分解接头分子。
图5示出了具有叠氮基还原性安全锁的胺开关(类型1)。与可裂解的芳香族核共轭的碱性氮原子在其被质子化时吸电子(E：箭头)。结构1中的正电荷在合成树脂(SR)的接头-肽构建体的酸性裂解期间增强溶解性并提供TFA稳定性。肽释放以两个步骤进行。首先，将叠氮基(部分W)还原为–NH2，因此去除了用于释放的安全锁。如果pH低于最碱性氮的pKa，则由于质子化的胺基团的吸电子，接头的稳定性在结构2的还原之后仍然保持。这允许在酸性条件下去除还原剂并洗涤。在第二步骤中，通过将pH增加至pH>最碱性氮的pKa来释放纯化的肽。pH增加引起了1,6-消除反应。接头在释放CO2下衰变。获得的肽具有游离的N-末端。
图6示出了具有还原性安全锁的胺开关，其没有叠氮基，但有具有其他可还原部分，诸如硝基、二硫基团或偶氮基团(类型2)。与可裂解的芳香族核共轭的碱性氮原子在其被质子化时吸电子(E：箭头)。结构1中的正电荷在合成树脂(SR)的接头-肽构建体的酸性裂解期间增强溶解性并提供TFA稳定性。肽释放以两个步骤进行。首先，将硝基(部分W)还原为–NH2，因此去除了用于释放的安全锁。如果pH低于最碱性氮的pKa，则由于质子化的胺基团的吸电子，接头的稳定性在结构2的还原之后仍然保持。这允许在酸性条件下去除还原剂并洗涤。在第二步骤中，通过将pH增加至pH>最碱性氮的pKa来释放纯化的肽。pH增加引起了1,6-消除反应。接头在释放CO2下衰变。获得的肽具有游离的N-末端。
图7示出了具有亲核释放的胺开关(类型3)。能够经由亲核释放来释放肽的接头包括羧酸酯(Y＝C(＝O)，Z＝OH)而不是碳酸酯部分(Y＝-O-C(＝O)，Z＝O-R)。在没有碳酸酯的情况下，接头在溶液和储存中显示出增强的稳定性。至肽的偶联可以如常见的氨基酸偶联进行，产生酰胺键而不是氨基甲酸酯键。由于缺少氨基甲酸酯键，因此接头在酸性条件下(诸如TFA)是稳定的。同样在此，肽释放以两个步骤进行。首先，将可还原部分(-N3)还原为胺，因此去除了用于释放的安全锁。如果pH高于最碱性氮的pKa，则接头的稳定性在还原之后仍然保持。这允许在酸性条件下去除还原剂并洗涤。在第二步骤中，通过将pH增加至pH>最碱性氮的pKa来释放纯化的肽。pH的增加引起亲核释放，并且获得的肽具有游离的N-末端。
如果pH高于氨基甲酸酯的pKa，则接头的稳定性在还原之后仍然保持。
图8示出了氨基甲酸酯开关(类型4)。能够经由氨基甲酸酯开关释放肽的接头包括部分Y＝-O-(＝O)-。此外，接头包括吸电子部分E(例如–Br)和可还原部分W(例如–N3)。TFA-稳定性通过以下调节：TFA裂解期间的吸电子部分-Br，接头-肽构建体在固体载体(例如纯化树脂)上的固定，以及在酸性条件下的后续洗涤步骤。在将可还原部分–N3还原为-NH2时，去除了用于释放的安全锁。接头在pH高于氨基甲酸酯的pKa时是稳定的。这允许去除还原剂并洗涤。最终，通过将pH降低至pH<氨基甲酸酯的pKa通过1,6-或1,4-消除和CO2的释放而释放纯化的肽。获得的肽具有游离的N-末端。
图9示出了肽P2(H-AKADEVSLHKWYG-NH2)通过使用3种本发明的接头分子进行本发明的肽纯化的每个实例。2.)X9为具有叠氮基还原性安全锁的类型1胺开关，3.)X13为具有其他还原性安全锁的类型2胺开关，以及4.)X22为具有亲核释放的类型3胺开关。A＝吸收(210nm)，B＝时间/min；始终通过UPLC-ESI/MS分析来确认分离的肽的身份。鉴定的P2产物标有*。1.)接头偶联至P2(*)之前的粗肽样品的色谱图。2.)通过使用类型1的接头X9和如以下实施例部分中描述的相应方法纯化之后的P2(*)的色谱图。3.)通过使用类型2的接头X13和如以下实施例部分中描述的相应方法纯化之后的P2(*)的色谱图。4.)通过使用类型3的接头X22和如以下实施例部分中描述的相应方法纯化之后的P2(*)的色谱图。
具体实施方式
接头类型4的实施例1：纯化天然存在的和研究的肽P1和P2
将本发明的用于纯化肽的方法应用于两种不同极性的肽，这些是H-ARTKQTARKSTGGKA-OH(SEQ ID NO:1)(P1)(组蛋白H3蛋白的片段2-16)和H-AKADEVSLHKWYG-NH2(SEQ ID NO:2)(P2)(旨在用于研究的肽序列)。
在标准固相肽合成条件下合成肽序列，由此在每个氨基酸偶联之后用乙酸酐和吡啶处理合成树脂以封闭未反应的氨基基团。通过使用DMF中的4当量的接头、6当量的oxyma和6当量的二异丙胺(DIEA)持续2h，将接头X1偶联至树脂上的P1。本发明的方法显示在图1中。通过使用4当量的接头、6当量的oxyma和6当量的DIEA持续2h，将接头X2偶联至树脂上的P1和P2。此后，通过TFA/PhOH/PhSH/H2O/乙二硫醇(EDT，82.5:5:5:2.5)的混合物将肽从合成树脂上裂解下来。将粗肽混合物溶解于二甲基亚砜(DMSO)。将醛修饰的琼脂糖珠用水和pH 4.5的0.1M柠檬酸钠缓冲液各自洗涤3次。向这些肽的DMSO溶液中添加10vol.％的柠檬酸钠缓冲液，然后将该溶液施加于琼脂糖珠上90分钟，将所期望的肽定量地固定在琼脂糖珠上。随后用8M脲、DMSO、EtOH/水(7:3)、0.1M NaCl、水、MeCN各自洗涤3次，以去除任何乙酰化的终止序列和其他杂质。通过用50mg PPh3/mL MeCN/AcOH(9:1)处理琼脂糖树脂来进行固定的接头的裂解。之后，将载体用MeCN冲洗4次，并且添加H2O/MeCN/TFA(70:29:1)的溶液持续180min。此后，将上清液过滤到离心管中，并且用TFA/H2O(9:1)将载体冲洗3次到同一管中。添加10倍Et2O以引起沉淀，并且通过离心管和处理有机上清液获得肽。
UPLC-MS用于验证各相的纯度。未纯化的(无接头分子)和纯化的肽的UPLC-色谱图显示在图2A至图2B和图3A至3B中，另外结果总结在表2中。通过ESI-MS确认了肽的身份。在纯化100μmol P1时，通过使用X1获得26mg(回收率62％)的量的肽P1，93％纯度(最初41％)。通过使用X2接头，获得21mg(回收率50％)，93％纯度。通过使用X2接头以5μmol规模纯化P2，由此获得4mg(回收率73％)，95％的纯度(最初55％)。
表2
在应用根据本发明的纯化方法之后，各种肽的纯度和回收率
接头类型4的实施例2:纯化天然存在的和研究的肽(P3、P4、P5和P6)
在第二组中，合成了五种肽。这些是H-YFTGSEVENVSVNVH-NH2(SEQ ID NO:3)(P3)(人巨细胞病毒低基质磷蛋白(CMV)的片段81-95)、H-PSNPFYEALST-NH2(SEQ ID NO:4)(P4)(人源化狐猴酪氨酸激酶3(LMTK3)的片段510-520)、H-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFF-NH2(SEQ ID NO:5)(P5)(人源化β淀粉样蛋白的片段1-20)和H-CKADEVSMHKWYG-NH2(SEQ ID NO:6)(P6)(旨在用于研究的肽序列)。
在标准固相肽合成条件下以100μmol规模合成肽序列P3、P4、P5和P6，由此在每个氨基酸偶联之后用乙酸酐和吡啶处理合成树脂以封闭未反应的氨基基团。通过使用1.3mLDMF中的4当量的接头X1(301mg)、6当量的oxyma(86mg)和6当量的二异丙胺(DIEA，105μL)持续2h，将接头X1偶联至树脂上的P3、P4、P5和P6。此后，通过TFA/PhOH/PhSH/H2O/乙二硫醇(EDT，82.5:5:5:2.5)的混合物将肽从合成树脂上裂解下来，并且在冷二乙醚中沉淀。将粗肽混合物溶解于4.5mL二甲基亚砜(DMSO)。将醛修饰的琼脂糖珠(1.5mL沉降的珠)用水和pH4.5的0.1M柠檬酸钠缓冲液各自洗涤3次。向肽的DMSO溶液中添加10vol.％(500μL)的具有8M盐酸胍的柠檬酸钠缓冲液。然后将溶液施加于琼脂糖珠上90分钟，将所期望的肽定量地固定在琼脂糖珠上。随后，将L-半胱氨酸在pH 4.5的0.1M柠檬酸钠缓冲液中的1w％溶液直接添加到固定混合物中15min，以封闭未反应的醛基团。之后，将纯化介质用DMSO、6M盐酸胍、具有0.1M NaCl的EtOH/水(7:3)、水和MeCN各洗涤3次，以去除任何乙酰化的终止序列和其他杂质。通过用10mL的50mg PPh3/mL MeCN/AcOH/H2O(90:5:5)处理琼脂糖树脂来进行固定的接头的裂解。之后，将载体用MeCN/H2O(9:1)冲洗3次，并且添加2mL的H2O/TFA(60:40)的溶液持续60min。此后，向上清液中添加2mL TFA并且将得到的混合物过滤到离心管中，并且用TFA/H2O(95:5)将载体冲洗2次到同一管中。相对于TFA-水量添加5倍Et2O以引起沉淀，并且通过离心管和处理有机上清液获得肽。
UPLC-MS用于验证各相的纯度。未纯化的(无接头分子)和纯化的肽的UPLC-色谱图显示在图4A至图4D中。通过ESI-MS确认了肽的身份。冻干之后产生的肽量、纯化之前和之后计算的回收率和UV纯度在表3中给出。
表3
在应用根据本发明的纯化方法之后，各种肽的纯度和回收率。
类型1接头的实施例1：纯化研究的肽P2
将本发明的用类型1接头纯化肽的方法应用于肽H-AKADEVSLHKWYG-NH2(SEQ ID NO:2)(P2)，其是旨在用于研究的肽序列。
在标准固相肽合成条件下合成肽，由此在每个氨基酸偶联之后用乙酸酐和吡啶处理合成树脂以封闭未反应的氨基基团。使用二甲基甲酰胺(DMF)中的4当量的接头、6当量的oxyma和6当量的二异丙胺(DIEA)持续2h，将类型1的接头X9偶联至树脂上的P2。此后，通过TFA/TIS/DTT/H2O(84:2:6:8)的混合物将肽从合成树脂上裂解下来，并且在二乙醚中沉淀。获得30mg的接头修饰的肽。本发明的该接头类型1的方法显示在图5中。将1.9mg的粗肽混合物溶解于100μL二甲基亚砜(DMSO)。将醛修饰的琼脂糖珠添加到筒中，均为75μL 50％珠悬浮在H2O/EtOH(4:1)浆料中，此后将珠用水和pH 4.5的0.1M柠檬酸钠缓冲液洗涤3次。向肽的DMSO溶液中添加10vol.％(10μL)的具有7M盐酸胍的柠檬酸钠缓冲液。然后将110μL的该溶液施加于琼脂糖珠上90分钟，将所期望的肽定量地固定在琼脂糖珠上(固定上清液的UPLC分析)。随后，在将固定混合物过滤掉15min之后，将100uL的L-半胱氨酸在pH 4.5的0.1M柠檬酸钠缓冲液中的2w％溶液添加到珠中，以封闭未反应的醛基团并且逆转亚胺形成。之后，将纯化介质用500μL的具有0.9M盐酸胍的DMSO、具有0.1M NaCl的EtOH/水(7:3)各洗涤3次，以去除任何乙酰化的终止序列和其他杂质。通过用每个反应器200μL TCEP(25mg/mL)处理琼脂糖树脂30min来进行固定的接头肽的裂解。之后，用包含0.1％TFA的H2O冲洗载体3次。通过使用胺开关将肽从琼脂糖中释放出来，因此将200μL的pH 9的0.2M NH4HCO3溶液添加到珠中持续15min。这使哌嗪基部分去质子化并且释放肽。通过ESI/MS确认了所期望的肽的身份(图9，表4)。
表4
在应用根据本发明的纯化方法之后，肽的纯度和回收率
类型2接头的实施例1：纯化研究的肽P2
将本发明的用类型2接头纯化肽的方法应用于肽H-AKADEVSLHKWYG-NH2(SEQ ID NO:2)(P2)，其是旨在用于研究的肽序列。
在标准固相肽合成条件下合成肽，由此在每个氨基酸偶联之后用乙酸酐和吡啶处理合成树脂以封闭未反应的氨基基团。使用二甲基甲酰胺(DMF)中的4当量的接头、6当量的oxyma和6当量的二异丙胺(DIEA)持续3h将接头X13偶联至树脂上的P2。本发明的该接头类型2的方法显示在图6中。此后，通过TFA/TIS/DTT/H2O(84:2:6:8)的混合物将肽从合成树脂上裂解下来。将粗肽混合物溶解于二甲基亚砜(DMSO)。将醛修饰的琼脂糖珠用水和pH 4.5的0.1M柠檬酸钠缓冲液各自洗涤3次。将柠檬酸钠缓冲液中的10vol.％的6M GdmCl添加到肽的DMSO溶液中。将得到的溶液添加到琼脂糖珠中并且将混合物摇动90分钟，以将所期望的肽定量地固定到琼脂糖珠上。去除上清液并且将残余物用1w.％L-Cys的柠檬酸钠缓冲液处理15min。随后，将珠用DMSO、6M GdmCl水溶液、EtOH/0.1M NaCl(7:3)、水、MeCN、EtOH中的0.1vol.％TFA各自洗涤3次，以去除任何乙酰化的终止序列和其他杂质。通过用EtOH中的10当量的SnCl2(0.5M)处理琼脂糖树脂3h来进行固定的接头的裂解。之后，将载体用EtOH中的0.1vol.％TFA、H2O中的0.1vol.％TFA、MeCN/H2O(9:1)各自冲洗3次。添加pH 8.85的0.2MNH4HCO2水溶液/MeCN(1:1)，持续15min。将上清液过滤到离心管中，并且将载体用H2O冲洗2次到同一管中。通过冻干残余物获得纯化的肽。
UPLC-MS用于验证各步骤的纯度。未纯化的(无接头分子)和纯化的肽的UPLC-色谱图显示在图9中。通过ESI-MS确认了肽的身份(表5)。在纯化实验中，使用X13和50μmol粗P2获得36mg(回收率73％)肽P2，最终纯度为97％(最初77％)。
表5
在应用根据本发明的纯化方法之后，肽的纯度和回收率
类型3接头的实施例1：纯化研究的肽P2
将本发明的用类型3接头纯化肽的方法应用于肽H-AKADEVSLHKWYG-NH2(SEQ ID NO:2)(P2)，其是旨在用于研究的肽序列。
在标准固相肽合成条件下合成肽，由此在每个氨基酸偶联之后用乙酸酐和吡啶处理合成树脂以封闭未反应的氨基基团。使用二甲基甲酰胺(DMF)中的4当量的接头、3.6当量的2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲-六氟磷酸酯(2-(6-Chlor-1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium-hexafluorophosp hat)(HCTU)、4当量的Oxyma和8当量的二异丙胺(DIEA)持续2h，将类型3的接头X22偶联至树脂上的P2。此后，通过TFA/TIS/DTT/H2O(84:2:6:8)的混合物将肽从合成树脂上裂解下来，并且在二乙醚中沉淀。获得27mg的接头修饰的肽。本发明的该接头类型3的方法显示在图7中。将2.1mg的粗粗肽混合物溶解于100μL二甲基亚砜(DMSO)。将醛修饰的琼脂糖珠添加到筒中，均为75μL50％珠悬浮在H2O/EtOH(4:1)浆料中，此后将珠用水和pH 4.5的0.1M柠檬酸钠缓冲液洗涤3次。向肽的DMSO溶液中添加10vol.％(10μL)的具有7M盐酸胍的柠檬酸钠缓冲液。然后将110μL的该溶液施加于琼脂糖珠上90分钟，将所期望的肽定量地固定在琼脂糖珠上(固定上清液的UPLC分析)。随后，在将固定混合物过滤掉15min之后，将100uL的L-半胱氨酸在pH 4.5的0.1M柠檬酸钠缓冲液中的2w％溶液添加到珠中，以封闭未反应的醛基团并且逆转亚胺形成。之后，将纯化介质用500μL的具有0.9M盐酸胍的DMSO、具有0.1M NaCl的EtOH/水(7:3)各洗涤3次，以去除任何乙酰化的终止序列和其他杂质。通过用每个反应器200μL TCEP(25mg/mL)处理琼脂糖树脂30min来进行固定的接头肽的裂解。之后，用包含0.1％TFA的H2O冲洗载体3次。通过使用具有亲核释放的胺开关将肽从琼脂糖中释放出来，因此将200μL的pH 7的0.2M NEt3的水溶液添加到珠中，持续100h。这使哌嗪基和苯胺-NH3 +部分去质子化，然后通过苯胺-NH2的亲核攻击释放肽。通过ESI/MS确认了所期望的肽的身份(图9，表6)。
表6
在应用根据本发明的纯化方法之后，肽的纯度和回收率
化学合成氨基甲酸酯开关(类型4)接头分子X1和X2
用于合成(4-硝基苯基)碳酸2-((2-(2-双-(叔丁氧基羰基)-(氨基氧基)乙酰胺 基)乙基)氨基甲酰基)-4-叠氮基-3-溴苄基酯(X1)的合成步骤
6-氨基-7-溴苯酞
向6-氨基苯酞(5.13g，34.05mmol)在THF(80mL)的冷却溶液(0℃)中添加N-溴代琥珀酰亚胺(6.12g，34.05mmol，1当量)。移除冷却浴并且将溶液搅拌1h，然后在减压下去除溶剂。将黄色残余物吸收在乙酸乙酯(400ml)中，并用水洗涤三次(每次200mL)。将有机相经硫酸镁干燥、过滤并且在减压下去除溶剂，得到呈褐色固体的6-氨基-7-溴苯酞(6.53g，28.63mmol，84％)。Rf＝0.2(环己烷/乙酸乙酯2:1)；UPLC-MS:tR＝1.45min(梯度10-90％B，5min内)；UPLC-纯度(210nm)＝83.1％；ESI-MS:(计算值MH+：227.97,229.96,实测值：228.01,230.01)。
6-叠氮基-7-溴苯酞
将6-氨基-5-溴苯酞(5.54g，24.17mmol)添加到0℃冷盐酸(1M，100mL)中。向冷却的悬浮液中逐滴添加浓硫酸，同时搅拌直到固体完全溶解(25mL)，将溶液进一步冷却直到其再次达到0℃。缓慢添加亚硝酸钠(3.34g，48.34mmol，2当量)在水(17mL)中的溶液(如果溶液太暖则形成亚硝气)。搅拌10分钟之后，缓慢逐滴添加叠氮化钠(3.14g，48.34mmol，2当量)在水(20mL)中的溶液(注意：形成叠氮酸)。30min之后，用乙酸乙酯(200mL)萃取悬浮液。过滤水相并且将滤饼用水洗涤三次(每次100mL)并且用环己烷洗涤一次(150mL)。获得呈黄色固体的6-叠氮基-7-溴苯酞(6.58g(94％)，24.17mmol，定量)。Rf＝0.3(环己烷/乙酸乙酯2:1)；UPLC-MS:tR＝2.24min(梯度10-90％ B，5min内)；UPLC-纯度(210nm)＝50.3％
N-(2-(2-双-(叔丁氧基羰基)-(氨基氧基)乙酰胺基)乙基)-3-叠氮基-2-溴-6-(羟基甲基)苯甲酰胺
将6-叠氮基-7-溴苯酞(5.54g(94％)，24.17mmol)吸收在乙腈(150mL)中，并且在搅拌下将悬浮液加热至50℃。添加乙二胺(23.4mL，350.47mmol，14.5当量)，因此10分钟之后固体完全溶解。在50℃下搅拌1h之后，在减压下去除溶剂和过量乙二胺，得到红色油状物作为残余物(8.49g)。添加饱和盐水(80mL)，将得到的悬浮液超声处理30min，在40℃下搅拌30min，并且过滤。将滤饼用饱和盐水(50mL)洗涤一次并且用环己烷(100mL)洗涤一次。干燥滤饼之后，获得呈黄色固体的标题化合物(3.84g，12.2mmol，50.6％)。通过用乙酸乙酯(六次，每次150ml)萃取还从滤液中获得产物3(4.79g，15.22mmol，63.1％)。Rf＝0.1(DCM/MeOH8:2)；UPLC-MS:tR＝1.03min(梯度10-90％ B，5min内)；UPLC-纯度(210nm)＝83.5％；ESI-MS:(计算值MNa+:336.01,338.01g/mol,实测值:335.95,337.96m/z)。
N-(2-(2-双-(叔丁氧基羰基)-(氨基氧基)乙酰胺基)乙基)-3-叠氮基-2-溴-6-(羟基甲基)苯甲酰胺
向双-(叔丁氧基羰基)-(氨基氧基)乙酸((Boc)2AOAc-OH，4.71g，15.86mmol，1.3当量)和NHS(1.84g，15.86mmol，1.3当量)在乙腈(40mL)中的搅拌溶液中添加二环己基碳二亚胺(DCC，3.30g，15.86mmol，1.3当量)。搅拌1h之后，通过过滤将溶液与得到的白色沉淀物分离，并且用乙腈(40mL)洗涤滤饼。将滤液用乙腈稀释至120mL。将N-(2-(2-双-(叔丁氧基羰基)-(氨基氧基)乙酰胺基)乙基)-3-叠氮基-2-溴-6-(羟基甲基)苯甲酰胺(3.79g，12.06mmol，1当量)吸收在乙腈(30mL)中并且将悬浮液超声处理50min。然后将具有(Boc)2AOAc-NHS的滤液添加至该悬浮液中，并且将反应混合物搅拌2.5小时。在减压下去除溶剂之后，将乙酸乙酯(150ml)添加至得到的橙色油状物(10.47g)中，并且将悬浮液超声处理10分钟并且在50℃下搅拌10分钟。洗涤悬浮液(用80mL 5w％NaHCO3溶液(pH 8)洗涤三次、用80mL2％柠檬酸溶液(pH 4.5)洗涤一次和用80mL盐水洗涤两次)之后，将有机相分离并用硫酸镁干燥，并在减压下去除溶剂，获得黄色泡沫作为粗产物(6.84g)。在高真空下干燥粗产物之后，获得呈黄色固体的产物(6.43g，75.89％纯度(用UV/vis确定)，8.31mmol，68.91％产率)。Rf＝0.15(DCM/MeOH 95:5)；UPLC-MS:tR＝2.60min(10-90％ MeCN，3min内),UPLC-纯度(21nm)＝79.1％,ESI-MS:(计算值MNa+:609.13,611.13g/mol,实测值:609.03,611.06m/z)。
(4-硝基苯基)碳酸2-((2-(2-双-(叔丁氧基羰基)-(氨基氧基)乙酰胺基)乙基)氨基甲酰基)-4-叠氮基-3-溴苄基酯
将N-(2-(2-双-(叔丁氧基羰基)-(氨基氧基)乙酰胺基)乙基)-3-叠氮基-2-溴-6-(羟基甲基)苯甲酰胺(6.39g(79％)，8.26mmol)溶解于DCM(20mL)并且冷却至0℃。在搅拌下向溶液中首先添加无水吡啶(1.00mL，12.48mmol，1.5当量)，并且然后缓慢添加对硝基苯基氯甲酸酯(2.52g，12.48mmol，1.5当量)在DCM(20mL)中的溶液。将反应混合物温热至室温并且搅拌1h。在减压下，去除溶剂，并且将得到的橙色油状物(9.99g)溶解于150mL乙酸乙酯。过滤悬浮液，并且从滤液中在减压下去除溶剂，得到黄色泡沫状固体作为粗产物(8.85g)。通过柱色谱法(硅胶，环己烷:乙酸乙酯2:1至1:1)纯化之后，将产物(3.82g)吸收在100mL二乙醚，用超声处理10min，在40℃下搅拌30min，并然后在-20℃下储存过夜。将产物过滤并且用100mL-20℃冷二乙醚洗涤，并高真空干燥，呈淡黄色固体(2.47g，3.29mmol，39.5％)。
Rf＝0.25(乙酸乙酯/环己烷2:1),UPLC-MS:tR＝3.18min(10-90％MeCN，5min内),UPLC-纯度(278nm)＝88.4％,ESI-MS:(计算值MNa+:774.13,776.13g/mol,实测值:773.91,775.88m/z)。
1H NMR(500MHz,DMSO)δ8.71(s,1H),8.32(d,J＝9.2Hz,2H),7.95(s,1H),7.62(d,J＝8.3Hz,1H),7.57(d,J＝9.2Hz,1H),7.52(d,J＝8.3Hz,1H),5.25(s,2H),4.36(s,2H),3.33(m,4H),1.46(s,18H)。
用于合成(4-硝基苯基)碳酸2-((2-(2-双-(叔丁氧基羰基)-(氨基氧基)乙酰胺 基)乙基)氨基甲酰基)-4-叠氮基-3,5-二溴苄基酯(X2)的合成步骤
5,7-二溴-6-氨基苯酞
在具有搅拌棒和550mL THF的1L圆底烧瓶中提供6-氨基苯酞(20.00g，132.75mmol)，并且在0℃添加30mL MeCN。向溶液中通过漏粉斗缓慢添加呈固体的N-溴代琥珀酰亚胺，之后溶液变成带褐色的。然后去除冰浴，一段时间之后溶液变成黄色。室温下搅拌2h之后，UPLC-MS和TLC表明完全转化为二溴化物。在旋转蒸发器上在减压下去除溶剂。剩余的固体溶解于600ml乙酸乙酯并且用水洗涤3次。将有机相用MgSO4干燥，并且蒸发之后获得39.86g(129.86mmol，98％)的呈淡黄色固体的期望产物。Rf＝0.6(环己烷/乙酸乙酯2:1),UPLC-MS:tR＝2.36min(10-90％ MeCN，3min内),UPLC-纯度(254nm)＝87.0％,ESI-MS:(计算值MH+:307.95g/mol,实测值:307.76m/z)。
5,7-二溴-6-叠氮基苯酞
在2L烧瓶中将5,7-二溴-6-氨基苯酞(38.50g，124.18mmol)溶解于200mL浓H2SO4，将褐色溶液用大冰桶冷却，然后将其缓慢添加235mL 1MHCl，在添加HCl期间形成沉淀物。将NaNO2(17.31g，248.35mmol，2当量)溶解于32mL水，并且在其达到5℃之后缓慢添加至悬浮液中。此后沉淀物溶解。将溶液在0℃进一步搅拌15min，并随后通过巴氏移液管(Pasteurpipette)逐滴添加75mL水中的NaN3(16.31g，248.35mmol，2当量)。观察到强烈形成气体(N2，HN3)。将泡沫状溶液搅拌1h，此后在冰冷却下添加500ml水。在已经停止泡沫构建并且溶液已经达到室温之后，通过使用布氏漏斗过滤悬浮液，同时使用2L的水将固体转移到漏斗中并由此洗涤固体。将湿产物在结晶皿中在减压下干燥之后，产生呈略微带褐色的固体的产物(36.01g，108.16mmol，87.1％)。Rf＝0.45(环己烷/乙酸乙酯2:1),UPLC-MS:tR＝2.89min(10-90％ MeCN，3min内),UPLC-纯度(254nm)＝95.3％，
N-(2-氨基乙基)-3-叠氮基-2,4-二溴-6-(羟基甲基)苯甲酰胺
将5,7-二溴-6-叠氮基苯酞(18.00g，53.52mmol)溶解于乙酸乙酯(490mL)，过滤掉不溶的杂质，并且在0℃添加乙二胺(52.73mL，749.32mmol，14当量)。将反应在室温下搅拌1h，之后UPLC-MS显示定量转化。将反应混合物转移到分液漏斗中，向其添加100mL盐水。分离水相之后，将有机相用MgSO4干燥，并且在旋转蒸发器上蒸发有机溶剂后，得到呈橙色固体的期望产物。(20.50g，52.16mmol，97.4％)。Rf＝0.25(DCM/MeOH 8:2),UPLC-MS:tR＝1.80min(10-90％ MeCN，3min内),UPLC-纯度(254nm)＝84.2％,ESI-MS:(计算值MH+:393.93g/mol,实测值:393.87m/z)。
N-(2-(2-双-(叔丁氧基羰基)-(氨基氧基)乙酰胺基)乙基)-3-叠氮基-2,4-二溴-6-(羟基甲基)苯甲酰胺
将双-(叔丁氧基羰基)-(氨基氧基)乙酸((Boc)2AOAcOH，17.30g，58.18mmol，1.1当量)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，6.76g，58.18mmol，1.1当量)溶解于350mL乙腈。向该溶液中添加呈固体的二环己基碳二亚胺(DCC，12.13g，58.18mmol，1.1当量)，DCC溶解之后形成白色沉淀物。将反应混合物在室温下搅拌1h，其中根据UPLC-MS，(Boc)2AOAc-NHS酯定量形成。此后，将混合物过滤到1L烧瓶中以去除DCC-脲。将N-(2-氨基乙基)-3-叠氮基-2,4-二溴-6-(羟基甲基)苯甲酰胺(20.5g，52.90mmol)溶解于530mL乙酸乙酯，并随后添加到(Boc)2AOAc-NHS的溶液中。将混合物在室温下搅拌1h，之后通过TLC和UPLC-MS确认反应完成。过滤掉额外形成的沉淀物，并且将有机相用5％ NaHCO3洗涤2次(每次200mL)，用盐水洗涤1次并且用2％柠檬酸溶液(pH 4.5)/盐水1:1洗涤2次(每次150mL)。将有机相用MgSO4干燥，并因此在真空中去除有机溶剂，并获得呈淡黄色油状物的标题化合物(37.70g，56.58mmol，定量)。Rf＝0.4(DCM/MeOH 95:5),UPLC-MS:tR＝2.97min(10-90％ MeCN，3min内),UPLC-纯度(254nm)＝54.2％,ESI-MS:(计算值MH+:667.05,MNa+:689.04g/mol,实测值:688.95m/z)。
(4-硝基苯基)碳酸2-((2-(2-双-(叔丁氧基羰基)-(氨基氧基)乙酰胺基)乙基)氨基甲酰基)-4-叠氮基-3,5-二溴苄基酯
在CH2Cl2(170mL)中提供N-(2-(2-双-(叔丁氧基羰基)-(氨基氧基)乙酰胺基)乙基)-3-叠氮基-2,4-二溴-6-(羟基甲基)苯甲酰胺(37.70g(94％)，52.90mmol)，并且添加(干燥的，经分子筛储存)吡啶(4.72mL，58.50mmol，1.1当量)。此后，在室温下缓慢添加呈固体的4-硝基苯基氯甲酸酯(12.03g，58.50mmol，1.1当量)，通过使用水浴保持温度恒定。反应可以引起DCM在烧瓶的中心处蒸发。LCMS和TLC表明1h之后完全反应。在真空中去除二氯甲烷，产生52g粗褐色油状物，并将残余物溶解于500mL乙酸乙酯并且用2％柠檬酸溶液(pH4.5)/盐水1:1洗涤2次(每次250mL)并用盐水150mL洗涤1次。通过使用MgSO4干燥有机相。之后，将该悬浮液经玻璃料中的50g二氧化硅塞过滤，而橙色和微红色杂质保留在二氧化硅上。从滤液中在减压下去除有机溶剂，直到剩余高度粘性的略微琥珀色的油状物。向该油状物中添加70ml的Et2O，并且将两相乳液在45℃的旋转蒸发器上旋转10min，直到形成一个均相。将小砂粒级(sand)玉米作为结晶引发剂添加到烧瓶中，并且将烧瓶放入冰箱过夜(16h)。在烧瓶中已经形成缓慢沉淀物。将另外200mL的冷(-25℃)醚添加到烧瓶中，并且将烧瓶在冰浴中轻微摇动并搅拌。将白色星状晶体转移并且用额外的200mL冷Et2O洗入填充在布氏漏斗中的过滤纸中。因此，产生呈白色固体的标题化合物(29.95g，36.02mmol，68.1％)。Rf＝0.6(乙酸乙酯/环己烷2:1),UPLC-MS:tR＝2.86min(30-95％ MeCN，3min内),UPLC-纯度(278nm)＝93.5％,ESI-MS:(计算值MH+:832.06,MNa+:854.04g/mol,实测值:853.87m/z)。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.73(s,1H),8.33(d,J＝9.1Hz,2H),7.93(s,1H),7.57(d,J＝9.1Hz,2H),5.24(s,2H),4.36(s,2H),3.40–3.32(m,4H),1.46(s,18H)。
化学合成具有叠氮基还原性安全锁的胺开关(类型1)接头分子X6和X9
用于合成(4-硝基苯基)碳酸3-((4-(2-双-(叔丁氧基羰基)-(氨基氧基)乙酰基) 哌嗪-1-基)甲基)-4-叠氮基苄基酯(X6)的合成步骤
4-硝基-3-(哌嗪-1-基甲基)苯甲酸
在具有搅拌棒的500mL圆底烧瓶中，将4-硝基-3-甲基苯甲酸甲酯(5.03g，25.50mmol)溶解于170mL干燥的苯。添加N-溴代琥珀酰亚胺(5.27g，29.33mmol)和过氧化苯甲酰(0.62g，2.55mmol)，并且将溶液加热至回流。12h之后，UPLC-UV/vis表明仅10％转化成溴化的起始材料。再次，添加N-溴代琥珀酰亚胺(3.66g，20.56mmol)和过氧化苯甲酰(0.62g，2.55mmol)。36h之后，UPLC-UV/vis表明转化80％。在真空中浓缩混合物，并且添加85mL氯仿。在具有搅拌棒的500mL圆底烧瓶中，将其缓慢过滤至哌嗪(8.87g，102.00mmol)和K2CO3(4.63g，33.15mmol)在85mL氯仿中的混合物中。2h之后，UPLC-UV/vis表明完全转化成期望产物。用旋转蒸发器去除溶剂。向残余物中添加250mL乙酸乙酯，并且将混合物过滤至分液漏斗。将有机相用100mL饱和NaHCO3洗涤三次并且用100mL盐水洗涤三次。将有机相经MgSO4干燥和蒸发之后，获得7.3g(不完全干燥)呈黄色油状物的期望产物。UPLC-MS:tR＝1.602min(10-90％ MeCN，3min内),UPLC-纯度(278nm)＝68.3％,ESI-MS:(计算值MH+:280.12g/mol,实测值:280.11m/z)。
(4-硝基-3-(哌嗪-1-基甲基)苯基)甲醇
在250mL圆底烧瓶中，将4-硝基-3-(哌嗪-1-基甲基)苯甲酸(1.10g，假定3.00mmol)溶解于8mL THF，并且用磁性搅拌棒在室温搅拌。依次添加LiCl(0.77g，18.00mmol)、NaBH4(0.69g，18.00mmol)和16mL乙醇。12h之后，UPLC-UV/vis表明起始材料的完全转化。在真空中浓缩反应混合物并且将残余物悬浮在60mL乙酸乙酯中。在快速搅拌混合物时，逐滴添加25mL 1M NH4Cl。2h之后，缓慢添加25mL 1M NaOH，并且将混合物转移至分液漏斗。分离各层，并且将水相用50mL乙酸乙酯萃取两次并且用50mL氯仿萃取两次。将合并的有机层经MgSO4干燥，并且在蒸发有机溶剂之后，获得呈黄色固体的期望产物(0.59g，2.35mmol，88％)。UPLC-MS:tR＝1.27min(10-90％ MeCN，3min内),UPLC-纯度(278nm)＝50.4％,ESI-MS:(计算值MH+:252.29g/mol,实测值:252.17m/z)。
2-双-(叔丁氧基羰基)-(氨基氧基)-1-(4-(5-(羟基甲基)-2-硝基苄基)哌嗪-1-基)乙-1-酮
在100mL圆底烧瓶中，将双-Boc-保护的氨基氧基乙酸(0.78g，2.63mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(0.31g，2.63mmol)溶解于25mL乙腈，并且用磁性搅拌棒搅拌。添加二环己基碳二亚胺(0.55g，2.63mmol)，并且将混合物在室温搅拌1.5h。过滤到滴液漏斗之后，将其缓慢添加至在250mL圆底烧瓶中的4-硝基-3-(哌嗪-1-基甲基)苄醇(0.59g，2.35mmol)在25mL氯仿中的溶液中。1h之后，UPLC-UV/vis表明起始材料的完全转化。用旋转蒸发器去除溶剂，并且将残余物悬浮在100mL乙酸乙酯中并转移至分液漏斗。将有机相用50mL水洗涤三次、用50mL饱和NaHCO3溶液洗涤三次并且用50mL盐水洗涤三次，并且经MgSO4干燥。蒸发有机溶剂之后，获得呈黄色固体的期望产物(1.8g，不完全干燥)。UPLC-MS:tR＝2.24min(10-90％MeCN，3min内),UPLC-纯度(278nm)＝19.8％,ESI-MS:(计算值MH+:525.14g/mol,实测值:525.25m/z)
1-(4-(2-氨基-5-(羟基甲基)苄基)哌嗪-1-基)-2-双-(叔丁氧基羰基)-(氨基氧基)乙-1-酮
在圆底烧瓶中，将2-双-(叔丁氧基羰基)-(氨基氧基)-1-(4-(5-(羟基甲基)-2-硝基苄基)哌嗪-1-基)乙-1-酮溶解于16mL水/乙醇(1:4)。此后，将铁粉(0.23g，4mmol)和氯化铵(0.25g，4mmol)添加至溶液中。将反应混合物在室温下搅拌过夜。经由UPLC-MS确认起始材料完全消耗之后，将反应混合物经硅藻土过滤以去除过量铁。尽可能在真空中浓缩溶剂。添加50mL的CHCl3之后，将有机相用50mL饱和NaHCO3溶液洗涤3次、用50mL盐水洗涤3次，经MgSO4干燥，并且在旋转蒸发器上在减压下去除有机溶剂。获得呈褐色油状物的最终产物(0.19g，0.4mmol)。UPLC-MS:tR＝2.05min(10-90％ MeCN，3min内),UPLC-纯度(278nm)＝24.7％,ESI-MS:(计算值MH+:495.28,MNa+:517.26g/mol,实测值:517.29m/z)。
2-双-(叔丁氧基羰基)-(氨基氧基)-1-(4-(2-叠氮基-5-(羟基甲基)苄基)哌嗪-1-基)乙-1-酮
在圆底烧瓶中，将1-(4-(2-氨基-5-(羟基甲基)苄基)哌嗪-1-基)-2-双-(叔丁氧基羰基)-(氨基氧基)乙-1-酮(0.19g，0.4mmol)溶解于干燥的乙腈。将溶液经冰浴冷却，同时在搅拌下，缓慢添加叔丁基腈(236μL，2mmol)，以及然后叠氮基三甲基硅烷(351μL，1.6mmol)。将溶液在密封烧瓶中进一步在冰冷却下搅拌2h。UPLC-MS示出不完全转化叔丁基腈(572μL，4mmol)之后，并然后再次缓慢添加叠氮基三甲基硅烷(702μL，3.2mmol)。将反应混合物进一步搅拌2h。然后在旋转蒸发器上在减压下去除溶剂。在将粗产物溶解于50mL乙酸乙酯之后，将有机相用50mL NaHCO3洗涤3次、用50mL盐水溶液洗涤3次，并且用硫酸镁干燥。蒸发有机溶剂之后，获得期望产物(0.14g，0.20mmol)。UPLC-MS:tR＝2.34min(10-90％MeCN，3min内),UPLC-纯度(278nm)＝20.4％,ESI-MS:(计算值MH+:521.27,实测值:521.30m/z)。
(4-硝基苯基)碳酸3-((4-(2-双-(叔丁氧基羰基)-(氨基氧基)乙酰基)哌嗪-1-基)甲基)-4-叠氮基苄基酯(X6)
使用0.2mL的干燥的DCM将2-双-(叔丁氧基羰基)-(氨基氧基)-1-(4-(2-叠氮基-5-(羟基甲基)苄基)哌嗪-1-基)乙-1-酮(149mg，0.2mmol)溶解于圆底烧瓶。添加吡啶(19.2μL，0.24mmol)，并且使用冰浴冷却溶液。向该混合物中，缓慢添加对硝基苯基氯甲酸酯(32.9mg，0.16mmol)在0.2mL的干燥的DCM中的溶液，并且将反应混合物在室温下搅拌过夜。在真空中去除有机溶剂，并获得呈深褐色油状物的期望产物(0.21g，不完全干燥)UPLC-MS:tR＝10.72min(0-60％ MeCN，11min内),UPLC-纯度(278nm)＝8.39％,ESI-MS:(计算值MH+:686.28,MNa+:708.26g/mol,实测值:686.38m/z)。
用于合成(4-硝基苯基)碳酸3-(4-(2-双-(叔丁氧基羰基)-(氨基氧基)乙酰基)哌 嗪-1-基)-4-叠氮基苄基酯(X9)的合成步骤
1-(4-(2-氨基-5-(羟基甲基)苯基)哌嗪-1-基)-2-双-(叔丁氧基羰基)-(氨基氧基)乙-1-酮
将2-双-(叔丁氧基羰基)-(氨基氧基)-1-(4-(5-(羟基甲基)-2-硝基苯基)哌嗪-1-基)乙-1-酮(1.00g，1.96mmol)溶解于圆底烧瓶中的78mL的甲醇中。向该溶液中添加镁粉(1.28g，19.6mmol)。然后在搅拌下添加呈固体的甲酸铵(1.23g，19.6mmol)。将溶液在室温下进一步搅拌20min，同时观察到气体形成。立即过滤掉溶液以去除镁，并且在旋转蒸发器上在减压下去除溶剂。使用1:1水/乙腈的溶剂混合物冷冻干燥粗产物。不经任何进一步纯化使用粗产物(2.20g)。UPLC-MS:tR＝2.21min(10-90％ MeCN，3min内),UPLC-纯度(278nm)＝53.2％,ESI-MS:(计算值MH+:481.27g/mol,MNa+:503.25g/mol,实测值:477.30m/z)。
2-双-(叔丁氧基羰基)-(氨基氧基)-1-(4-(2-叠氮基-5-(羟基甲基)苯基)哌嗪-1-基)乙-1-酮
在圆底烧瓶中，将1-(4-(2-氨基-5-(羟基甲基)苯基)哌嗪-1-基)-2-双-(叔丁氧基羰基)-氨基氧基)乙-1-酮(1.00g，2.08mmol)溶解于干燥的乙腈。将溶液经由冰浴冷却，同时在搅拌下，缓慢添加叔丁基腈(1.37mL，10.4mmol)以及然后叠氮基三甲基硅烷(1.16mL，8.32mmol)。将溶液在密封烧瓶中进一步在冰冷却下搅拌2h。UPLC-MS示出不完全转化叔丁基腈(1.37mL，10.4mmol)之后，并然后再次缓慢添加叠氮基三甲基硅烷(1.16mL，8.32mmol)。将反应混合物进一步搅拌过夜。然后在旋转蒸发器上在减压下去除溶剂。在将粗产物溶解于50mL乙酸乙酯之后，将有机相用50mL NaHCO3洗涤3次、用50mL盐水溶液洗涤3次，并且用硫酸镁干燥。在蒸发有机溶剂并且经由快速柱(3:2EtOAC/环己烷)纯化之后，获得期望产物(0.2g，0.39mmol)。Rf＝0.5(EtOAc/环己烷4:1),UPLC-MS:tR＝2.92min(10-90％MeCN，3min内),UPLC-纯度(278nm)＝84.2％,ESI-MS:(计算值MH+:507.26g/mol,MNa+:529.24g/mol,实测值:529.30m/z)。
(4-硝基苯基)碳酸3-(4-(2-双-(叔丁氧基羰基)-(氨基氧基)乙酰基)哌嗪-1-基)-4-叠氮基苄基酯(X9)
使用1mL的干燥的DCM将2-双-(叔丁氧基羰基)-(氨基氧基)-1-(4-(2-叠氮基-5-(羟基甲基)苯基)哌嗪-1-基)乙-1-酮(76mg，0.15mmol)溶解于圆底烧瓶。添加吡啶(12.2μL，0.15mmol)，并且使用冰浴冷却溶液。向该溶液中，缓慢添加呈固体的对硝基苯基氯甲酸酯(20.3mg，0.15mmol)。10min之后，移除冰浴，并且将反应混合物在室温下搅拌过夜。在真空中去除有机溶剂，并且将粗产物再溶解于30mL EtOAc。然后将有机相用饱和NaHCO3溶液洗涤3次，用盐水洗涤3次，经MgSO4干燥，并且再次在真空中去除有机溶剂。最终将粗产物经由快速柱使用EtOAc/环己烷(1:1)溶剂混合物来纯化。获得呈淡黄色油状物的期望化合物(30mg，0.05mmol)。Rf＝0.54(EtOAC/环己烷1:1),UPLC-MS:tR＝3.53min(10-90％ MeCN，3min内),UPLC-纯度(278nm)＝93.6％,ESI-MS:(计算值MH+:671.66,MNa+:694.24g/mol,实测值:694.40m/z)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3,25℃):δ[ppm]＝8.28(d,J＝9.0Hz,2H),7.38(d,J＝9.0Hz,2H),7.22–7.06(m,3H),5.22(s,2H),4.62(s,2H),3.94(t,J＝3.93,2H),3.81(t,J＝3.81,2H),3.12(t,J＝3.12,2H),3.07(t,J＝3.07,2H),1.54(s,18H)。
化学合成具有其他还原性安全锁的胺开关(类型2)接头分子X12、X13和X43
合成(4-硝基苯基)碳酸(5-(2-(2-双-(叔丁氧基羰基(氨基氧基)乙酰胺基)-6-(叔丁基二硫烷基)吡啶-3-基)甲酯(X12)
合成6-巯基-5-硝基吡啶-3-甲酸甲酯
向6-氯-5-硝基吡啶-3-甲酸甲酯(1.6gm，7.037mmol)在甲醇(25ml)中的冷却溶液中以小份添加70％硫氢化钠水合物(1.115，14.127mmol)。将混合物搅拌放置30min-1h。随后，过滤固体材料。使用旋转蒸发器将剩余溶液减少至5ml。通过在0℃缓慢添加1M HCI将剩余溶液酸化至pH 2。通过过滤收集得到的黄色固体材料，并且将材料不经纯化用于另外步骤。UPLC-MS:tR＝1.80min(10-90％ MeCN，3min内),UPLC-纯度(278nm)＝95.0％,ESI-MS:(计算值MH+:215.01g/mol,实测值:215.20m/z。
合成6-巯基-5-氨基吡啶-3-甲酸甲酯
将6-巯基-5-硝基吡啶-3-甲酸甲酯(1.00gm，4.537mmol)和1.85gm(32.48mmol)的铁粉放置在包含50mL的75％甲醇和25％水的反应烧瓶中。然后添加氯化钙(0.41gm，3.63mmol)，并将混合物在油浴上回流直到起始材料完全转化成产物。回流周期结束时，硅藻土过滤混合物以去除过量的铁。将滤液浓缩至近干燥，并随后添加水(25ml)，并且使用乙酸乙酯(3x 25ml)萃取化合物。在减压下去除溶剂，且获得的粗残余物足够纯以进一步进行(3.49mmol，77％)。UPLC-MS:tR＝1.26min(10-90％ MeCN，3min内),UPLC-纯度(278nm)＝93％,ESI-MS:(计算值MH+:185.04g/mol,实测值:185.14m/z)。
合成(5-氨基-6-巯基吡啶-3-基)甲醇
将6-巯基-5-氨基吡啶-3-甲酸甲酯(0.7gm，3.68mmol)溶解于干燥的THF(20mL)，并且将溶液冷却至0℃。在N2气氛下，将氢化铝锂(1.42gm，36.89mmol)分批添加至反应混合物，持续10min。将得到的溶液在室温下搅拌24h。如通过UPLC表明的反应完成之后，通过在0℃同时添加1.4ml的水、1.4ml 10％ NaOH、4.2ml的水淬灭过量的LiAlH4。过滤掉所有盐，并且将固体材料用水和MeOH(1:1，100ml)洗涤。蒸发溶剂，并使用异丙醇(3x 50ml)从固体饼中萃取化合物。在减压下去除异丙醇以获得醇形式的期望产物(1.92mmol，52％)。UPLC-MS:tR＝1.01min(10-90％ MeCN，3min内),UPLC-纯度(278nm)＝96％,ESI-MS:(计算值MH+:157.04g/mol,实测值:157.11m/z)
合成(2-(2-双-(叔丁氧基羰基)(氨基氧基))-N-(2-(叔丁基二硫烷基)-5-(羟基甲基)吡啶-3-基)乙酰胺)
在N2气氛下，向装有6-巯基-5-氨基吡啶-3-甲酸(1.3gm，8.03mmol)的施兰克(Schlenk)烧瓶中添加CH2Cl2(20mL)、2-甲基-2-丙硫醇(0.91ml，8.03mmol)和TBHP(1.13gm，8.83mmol，70％的水溶液)。30秒之后，以一批添加NIS(0.19gm，0.18mmol)。然后允许施兰克烧瓶在25℃反应1h。反应完成之后，将其通过水(20.0mL)淬灭，并且用乙酸乙酯(3×30mL)萃取。将有机层合并并且在真空下蒸发，并且将化合物不经进一步纯化用于接下来的步骤。UPLC-MS:tR＝1.68min(10-90％ MeCN，3min内),UPLC-纯度(278nm)＝93％,ESI-MS:(计算值MH+:245.08g/mol,实测值:245.18m/z)。
合成(4-硝基苯基)碳酸(5-(2-(2-双-(叔丁氧基羰基)(氨基氧基)乙酰胺基))-6-(叔丁基二硫烷基)吡啶-3-基)甲酯(X12)
在CH2Cl2(2mL)中提供(5-氨基-6-(叔丁基二硫烷基)吡啶-3-基)甲醇(83.5mg，0.156mmol mmol)，并且添加干燥的吡啶(0.161mL，0.19mmol)。此后，添加4-硝基苯基氯甲酸酯(31.9mg，0.154mmol)。通过LCMS和TLC表明12h之后反应已经完成。在真空中去除二氯甲烷，产生淡黄色/橙色粗油状物，并且将残余物再溶解于10mL乙酸乙酯并且用水和盐水1:1洗涤(每次5mL)。最终在减压下去除EtoAc以获得期望产物(0.08mmol，75％)。UPLC-MS:tR＝12.59min(10-60％ MeCN，11.50min内,60-90％，11.51-13min内),UPLC-纯度(＝nm)＝70％,ESI-MS:(计算值MNa+:705.19g/mol,实测值:705.41m/z)。
用于合成(4-硝基苯基)碳酸3-(4-(2-双-(叔丁氧基羰基)-((氨基氧基)乙酰基) 哌嗪-1-基)-4-硝基苄基酯(X13)的合成步骤
3-氟-4-硝基苯甲酸甲酯
将3-氟-4-硝基苯甲酸(5.00g，27.01mmol)溶解于具有搅拌棒的250mL圆底烧瓶中的100mL甲醇，并且添加3mL(54.02mmol)H2SO4。在50℃搅拌42h之后，UPLC-UV/vis表明完全转化为甲酯。用旋转蒸发器将反应混合物浓缩至10mL。添加100mL乙酸乙酯和100mL H2O之后，搅拌混合物，并随后分批添加K2CO3(7.00g)。将混合物转移至分液漏斗，分离各层并且将水相用100mL乙酸乙酯萃取三次。将合并的有机层经MgSO4干燥，并且蒸发之后，获得4.81g(24.15mmol，89％)的呈橙色固体的期望产物。UPLC-MS:tR＝2.53min(10-90％ MeCN，3min内),UPLC-纯度(210nm)＝99.4％,ESI-MS:(计算值MH+:200.14g/mol,实测值:-)。
4-硝基-3-(哌嗪-1-基)苯甲酸甲酯
将哌嗪(4.07g，47.20mmol)和K2CO3(4.24g，30.68mmol)悬浮在具有搅拌棒的250mL圆底烧瓶中的50mL氯仿中。在室温下经由滴液漏斗缓慢添加溶解于50mL氯仿的3-氟-4-硝基苯甲酸甲酯(4.7g，23.60mmol)，历时1h，并且将混合物快速搅拌。66h之后，UPLC-UV/vis表明仅10％的起始材料被转化。添加哌嗪(4.07g，47.20mmol)，并且2h之后，UPLC-UV/vis表明完全转化。15分钟之后，添加100mL氯仿和150mL饱和NaHCO3溶液，并且将混合物转移至分液漏斗。分离各层，并且将有机相用100mL饱和NaHCO3溶液洗涤两次，并且用100mL盐水洗涤一次。经MgSO4干燥之后，在旋转蒸发器上蒸发有机溶剂之后获得呈红色固体的期望产物(7.87g，不完全干燥)。UPLC-MS:tR＝1.72min(10-90％ MeCN，3min内),UPLC-纯度(210nm)＝87.2％,ESI-MS:(计算值MH+:266.27g/mol,实测值:266.23m/z)。
(4-硝基-3-(哌嗪-1-基)苯基)甲醇
将4-硝基-3-(哌嗪-1-基)苯甲酸甲酯(5.85g，不完全干燥，假定20.00mmol)溶解于500mL圆底烧瓶中的40mL THF，并且用磁性搅拌棒搅拌。依次添加LiCl(5.09g，120.00mmol)、NaBH4(4.54g，120.00mmol)和80mL乙醇。15h之后，UPLC-UV/vis表明完全转化。将反应混合物在真空中浓缩，添加20mL氯仿，并且将混合物快速搅拌，同时逐滴添加30mL的2MNH4Cl溶液。1h之后，缓慢添加120mL 1M NaOH和80mL氯仿，并且将混合物转移至分液漏斗。分离各层，并且将水相用100mL氯仿萃取三次。将合并的有机层经MgSO4干燥，并且在蒸发有机溶剂之后，获得呈橙色固体的期望产物(3.97g，16.73mmol，84％)。UPLC-MS:tR＝1.27min(10-90％MeCN，3min内),UPLC-纯度(210nm)＝70.0％,ESI-MS:(计算值MH+:238.26g/mol,实测值:238.24m/z)。
2-双-(叔丁氧基羰基)-(氨基氧基)-1-(4-(5-(羟基甲基)-2-硝基苯基)哌嗪-1-基)乙-1-酮
将双-(叔丁氧基羰基)-(氨基氧基)乙酸((Boc)2AOAcOH，2.96g，9.96mmol，1.2当量)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，1.15g，9.96mmol，1.2当量)溶解于10mL乙腈。向该溶液中添加呈固体的二环己基碳二亚胺(DCC，2.07g，9.96mmol，1.2当量)，DCC溶解之后形成白色沉淀物。将反应混合物在室温下搅拌1h，其中根据UPLC-MS，(Boc)2AOAc-NHS酯定量形成。此后，将混合物过滤到圆底烧瓶中，其圆底烧瓶中在83mL氯仿中提供了(4-硝基-3-(哌嗪-1-基)苯基)甲醇(1.98g，8.30mmol)。将混合物在室温下搅拌1h，之后通过TLC和UPLC-MS确认反应完成。过滤掉额外形成的沉淀物，并且将有机相用水洗涤3次，用饱和NaHCO3洗涤3次，并且用盐水溶液洗涤3次。将有机相用MgSO4干燥，并因此在真空中去除有机溶剂，并获得呈黄色油状物的标题化合物(4.35g，8.52mmol，定量，不完全干燥)。UPLC-MS:tR＝3.00min(10-90％ MeCN，3min内),UPLC-纯度(278nm)＝48.2％,ESI-MS:(计算值MH+:511.24,MNa+:534.23g/mol,实测值:-)。
(4硝基苯基)碳酸3-(4-(2-双-(叔丁氧基羰基)-((氨基氧基)乙酰基)哌嗪-1-基)-4-硝基苄基酯(X13)
在具有搅拌棒的8mL圆底烧瓶中提供2-双-(叔丁氧基羰基-氨基氧基)-1-(4-(5-(羟基甲基)-2-硝基苯基)哌嗪-1-基)乙-1-酮(2.06g，4mmol)。向溶液中添加干燥的吡啶。此后，在室温下缓慢添加呈固体的4-硝基苯基氯甲酸酯(0.86g，4.2mmol)。反应是放热的并且可能引起DCM冒泡。室温下搅拌2h之后，UPLC-MS和TLC表明完全转化为碳酸酯。在旋转蒸发器上在减压下去除溶剂。将产物经由柱色谱法(环己烷/乙酸乙酯1:1)纯化，并且得到黄色固体(410mg，0.61mmol)。UPLC-MS:tR＝3.44min(10-90％MeCN，3min内),UPLC-纯度(278nm)＝92.4％,ESI-MS:(计算值MH+:676.25g/mol,MNa+:698.23g/mol,实测值:698.51m/z)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3,25℃):δ[ppm]＝8.29(d,J＝9.2Hz,2H),7.84(d,J＝8.3Hz,1H),7.39(d,J＝9.2Hz,2H),7.19(s,1H),7.16(d,J＝9.7Hz,1H),5.29(s,2H),4.61(s,2H),3.89(t,J＝3.90,2H),3.78(t,J＝3.78,2H),3.15(t,J＝3.15,2H),3.10(t,J＝3.10,2H),1.54(s,18H)。
用于合成(4-硝基苯基)碳酸3-((4-(2-(氨基氧基)乙酰基)哌嗪-1-基)甲基)-4- 硝基苄基酯(X43)的合成步骤
将2-双-(叔丁氧基羰基)-(氨基氧基)-1-(4-(5-(羟基甲基)-2-硝基苄基)哌嗪-1-基)乙-1-酮(1.27g，不完全干燥，假定1.86mmol)溶解于具有磁性搅拌棒的50mL圆底烧瓶中的5mL氯仿，并且用冰浴冷却至0℃。依次添加干燥的吡啶(0.23mL，0.23g，2.88mmol)和对硝基苯基氯甲酸酯(0.59g，2.88mmol)。x h之后，UPLC-UV/vis表明起始材料的完全转化。用旋转蒸发器去除溶剂，并且将残余物溶解于5mL乙酸乙酯/环己烷(1:1)。经由使用乙酸乙酯/环己烷(1:1)的快速柱色谱法纯化之后，获得期望产物(0.02g，0.03mmol)。UPLC-MS:tR＝2.96min(10-90％ MeCN，3min内),UPLC-纯度(278nm)＝55.6％,ESI-MS:(计算值MNa+:712.24g/mol,实测值:712.41m/z)。
化学合成具有亲核释放的胺开关(类型3)接头分子X22和X42
合成2-(2-叠氮基-5-(4-(2-((2-双-(叔丁氧基羰基)氨基)氧基)乙酰基)哌嗪-1- 基)苯基)乙酸(X22)
合成2-(5-氟-2-硝基苯基)乙酸甲酯
将5-氟-2-硝基苯基乙酸(3.00gm，14.92mmol)放入具有搅拌棒的100ml圆底烧瓶中。将化合物溶解于40ml的MeOH，并且在室温下缓慢添加1.62ml(29.84mmol)的H2SO4。将得到的反应混合物回流6h。通过UPLC-MS和TLC监测反应的进程。反应完成之后，在旋转蒸发器上在减压下去除甲醇。向得到的粗品中添加20ml水，并且将溶液通过用饱和K2CO3溶液(50ml)中和。将沉淀的固体过滤并用水洗涤并且在减压下干燥，获得呈白色固体的期望产物(129.86mmol，98％)。UPLC-MS:tR＝2.41min(10-90％ MeCN，3min内),UPLC-纯度(278nm)＝97％,ESI-MS:(计算值MH+:214.05g/mol,实测值:…)。
合成4-(3-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-4-硝基苯基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将2-(5-氟-2-硝基苯基)乙酸甲酯(0.70gm，3.25mmol)溶解于干燥的DMF。在室温下向该溶液中添加1-Boc-哌嗪(0.83gm，4.39mmol)和Na2CO3(0.71gm，6.5mmol)，并且将得到的反应混合物加热至80℃过夜。通过UPLC-MS和TLC监测反应进程。反应完成之后，过滤溶液以去除固体副产物，并且使用旋转蒸发器在减压下去除DMF。将冰冷水(25ml)添加至粗材料中，并将得到的固体过滤并用水(50ml)洗涤并且在减压下干燥，获得呈黄色固体的预期产物(1.01gm，2.66mmol，82％)。UPLC-MS:tR＝3.01min(10-90％ MeCN，3min内),UPLC-纯度(278nm)＝96.0％,ESI-MS:(计算值MH+:380.18g/mol,实测值:324.10(M2H+-tbu)。
合成4-(4-氨基-3-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
在室温下向4-(3-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-4-硝基苯基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(1.00gm，2.58mmol)在二噁烷/H2O(25mL，3:1)中的溶液中添加NH4Cl(1.23gm，1.01gm，18.50mmol)和Zn粉(1.23gm，18.50mmol)。将反应混合物在相同的温度下搅拌3h，此后将其通过硅藻土床过滤。将得到的溶液蒸发，并且将粗材料在H2O(100mL)和EtOAc(300mL)之间分配。将有机层分离、干燥(MgSO4)浓缩，以得到黄色固体的期望产物(1.75mmol，68％)。UPLC-MS:tR＝2.12min(10-90％ MeCN，3min内),UPLC-纯度(278nm)＝94.0％,ESI-MS:(计算值MH+:350.21g/mol,实测值:350.19m/z)。
合成4-(4-叠氮基-3-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将4-(4-氨基-3-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(0.35gm，0.99mmol)溶解于干燥的乙腈(25mL)并且冷却至0℃。将90％亚硝酸叔丁酯(0.837gm，7.94mmol)逐滴添加至反应混合物中，并然后添加TMSN3(0.722g，5.95mmol)，历时10分钟。将得到的红色混合物搅拌3h。通过UPLC-MS监测反应的进程。反应完成之后，在减压下去除过量的TMSN3、t-BuONO和溶剂，将获得的红色残余物溶解于50mL乙酸乙酯并且用(2×50mL)水洗涤。将乙酸乙酯层经MgSO4干燥并且在减压下去除，得到橙色固体(0.33gm，0.88mmol)，其不经进一步纯化继续使用。UPLC-MS:tR＝3.01min(10-90％ MeCN，3min内),UPLC-纯度(278nm)＝95.0％,ESI-MS:(计算值MH+:376.20g/mol,实测值:376.28m/z)。
合成2-(2-叠氮基-5-(4-(叔丁氧基羰基)哌嗪-1-基)苯基)乙酸
在室温下搅拌4-(4-叠氮基-3-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(0.314gm，0.83mmol)、LiOH(0.102gm，4.14mmol)、MeOH(5mL)和H2O(0.2mL)的溶液3h。起始材料完全转化成产物(通过UPLC-MS监测)之后,将反应混合物蒸发并且向得到的粗材料中添加饱和NH4Cl直到溶液PH达到6。将得到的溶液用EtOAc(2x 25mL)萃取、经MgSO4干燥并且浓缩以得到呈黄色固体的产物(0.65mmol，78％)。UPLC-MS:tR＝2.55min(10-90％ MeCN，3min内),UPLC-纯度(278nm)＝95.0％,ESI-MS:(计算值MH+:362.18g/mol,实测值:306.04m/z)。
合成4-(4-叠氮基-3-(羧基甲基)苯基)哌嗪-1-鎓2,2,2-三氟乙酸盐
将纯三氟乙酸(0.6ml，6.14mmol)逐滴添加至包含2-(2-叠氮基-5-(4-(叔丁氧基羰基)哌嗪-1-基)苯基)乙酸(0.22gm，0.61mmol)的圆底烧瓶，并且将得到的溶液在室温下搅拌1小时。在反应完成(通过UPLC-MS监测)之后，添加冷醚(25mL)，并且将得到的固体过滤并用冷醚洗涤。将得到的淡褐色固体(0.30gm，85％)干燥，并且不经纯化继续用于另外步骤。UPLC-MS:tR＝2.80min(10-90％ MeCN，3min内),UPLC-纯度(278nm)＝87.0％,ESI-MS:(计算值MH+:262.13g/mol,实测值:262.11m/z)错误的质量。
合成2-(2-叠氮基-5-(4-(2-((((2-双-(叔丁氧基羰基)氨基)氧基)乙酰基)哌嗪-1-基)苯基)乙酸(X22)
将双-(叔丁氧基羰基)-(氨基氧基)乙酸((Boc)2AOAcOH，88.4mg，0.30mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，34.6g，0.30mmol)溶解于2mL干燥的乙腈。向该溶液中添加呈固体的二环己基碳二亚胺(DCC，62.0mg，0.30mmol)，DCC溶解之后形成白色沉淀物。将反应混合物在室温下搅拌1h，其中根据UPLC-MS，(Boc)2AOAc-NHS酯定量形成。此后，将混合物用滤纸过滤以去除DCC-脲，直接进入包含干燥的DMF(2ml)和DIEPA(155μL，0.89mmol)中的4-(4-叠氮基-3-(羧基甲基)苯基)哌嗪-1-鎓2,2,2-三氟乙酸盐(100mg，0.20mmol)的反应烧瓶中。将混合物在室温下进一步搅拌1-2h。反应完成之后，将溶剂在减压下蒸发，并且通过添加NH4Cl(25ml)中和反应混合物。将化合物用EtOAc(2x 25mL)萃取、经MgSO4干燥并且浓缩以得到呈深褐色固体的产物(0.19mmol，97％)。UPLC-MS:tR＝2.80min(10-90％ MeCN，3min内),UPLC-纯度(278nm)＝87.0％,ESI-MS:(计算值MNa+:557.23g/mol,实测值:557.28m/z)。
1H NMR(400MHz,)δ7.06(d,J＝8.7Hz,1H),6.90(d,J＝8.8Hz,1H),6.83(s,1H),4.60(s,2H),3.90–3.84(m,2H),3.77–3.72(m,2H),3.59(s,2H),3.24–3.11(m,4H),1.54(s,18H)。
合成2-(5-(4-(2-((2-双-)叔丁氧基羰基)氨基)氧基)乙酰基)哌嗪-1-基)-2-硝 基苯基)乙酸(X42)
合成2-(5-(4-(叔丁氧基羰基)哌嗪-1-基)-2-硝基苯基)乙酸
向4-(3-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-4-硝基苯基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(0.50gm，1.30mmol)在MeOH:H2O(21.2mL，16:1)中的溶液中添加LiOH，并且在室温下搅拌过夜。起始材料完全转化成产物(通过UPLC-MS监测)之后,将反应混合物蒸发并且向得到的粗材料中添加饱和NH4Cl(25mL)直到溶液PH达到6。将化合物用EtOAc(4x 25mL)萃取、经MgSO4干燥并且在减压下浓缩以得到呈黄色固体的期望产物(0.78mmol，59％)。UPLC-MS:tR＝2.36min(10-90％ MeCN，3min内),UPLC-纯度(278nm)＝97.0％,ESI-MS:(计算值MH+:380.18g/mol,实测值:310.04m/z(2H+-tbu m/z))。
合成4-(3-(羧基甲基)-4-硝基苯基)哌嗪-1-鎓2,2,2-三氟乙酸盐
将纯三氟乙酸(0.73ml，7.59mmol)在室温下逐滴添加至包含2-(5-(4-(叔丁氧基羰基)哌嗪-1-基)-2-硝基苯基)乙酸(0.28gm，0.76mmol)的圆底烧瓶，并且将得到的溶液搅拌1小时。在反应完成(通过UPLC-MS监测)之后，添加冷醚(25mL)，并且将得到的固体过滤并用冷醚洗涤。将得到的黄色固体(88％)干燥，并且不经纯化继续用于另外步骤。UPLC-MS:tR＝1.35min(10-90％ MeCN，3min内),UPLC-纯度(278nm)＝88.9％,ESI-MS:(计算值MH+:266.11g/mol,实测值:266.11m/z)。
合成2-(5-(4-(2-((2-双-)叔丁氧基羰基)氨基)氧基)乙酰基)哌嗪-1-基)-2-硝基苯基)乙酸(X42)
将双-(叔丁氧基羰基)-(氨基氧基)乙酸((Boc)2AOAcOH，88.4mg，0.30mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，34.6g，0.30mmol)溶解于2mL干燥的乙腈。向该溶液中添加呈固体的二环己基碳二亚胺(DCC，62.0mg，0.30mmol)，DCC溶解之后形成白色沉淀物。将反应混合物在室温下搅拌1h，其中根据UPLC-MS，(Boc)2AOAc-NHS酯定量形成。此后，将混合物用滤纸过滤以去除DCC-脲，直接进入包含干燥的DMF(2ml)和DIEPA(155μL，0.89mmol)中的4-(3-(羧基甲基)-4-硝基苯基)哌嗪-1-鎓2,2,2-三氟乙酸盐(100mg，0.20mmol)的反应烧瓶中。将混合物在室温下搅拌1-2h，之后通过UPLC-MS确认反应完成。反应完成之后，将溶剂在减压下蒸发，并且通过添加NH4Cl(25ml)中和反应混合物。将得到的溶液用EtOAc(2x 25mL)萃取并且浓缩以得到呈深褐色固体的产物(0.19mmol，97％)。UPLC-MS:tR＝2.74min(10-90％MeCN，3min内),UPLC-纯度(278nm)＝87.0％,ESI-MS:(计算值MNa+:561.22g/mol,实测值:561.28m/z)。

Claims (10)

1.一种式1：X-Tb-Va-U-Y-Z(1)的化合物，其中，
-X选自式2、2a、3、3a或4的部分，特别是式2、2a、3或3a的部分，更特别是式2或2a的部分，
其中，
-每个R1和R2彼此独立地选自H或B，其中至少R1或R2是B，
-R3选自H或B，
-R4选自H、C1-C12-烷基或芳基，其中醛或酮基基团可被酸不稳定的保护基团保护，
-B是酸不稳定的胺保护基团，
-T是直链或支链间隔基，其包括以下部分中的至少一个，特别是1至5个：-C1-12-烷基-、(-C2H4O-)1-12、-C(＝O)-、-C(＝O)-JR9-、-JR9-C(＝O)-、-JR9-、苯基、5元或6元杂芳基，其中，
J是CH或N，特别是N，
特别地T是选自以下的间隔基
-C1-C12-烷基-，特别是C1-6-烷基、更特别是C1-3-烷基，-R5-C(＝O)-，-R5-C(＝O)-NR9-R6-，-R5-C(＝O)-NR9-，-C(＝O)-NR9-R6-，-R5-NR9-C(＝O)-R6-，-R5-NR9-R5’-NR9’C(＝O)-R6-，-R5-C(＝O)-NR9-R5’-NR9’-C(＝O)-R6-，-R5-NR9-，-R5-NR9-R6-，-R5-NR9-R5’-NR9’-R6-，-R5-C(＝O)-NR9-R5’-NR9’-R6-，-R5-C(＝O)-O-R6-，-C(＝O)-O-R6-，-R5-苯基-R6-，-R5-苯基-，-苯基-R6-，-苯基-，-R5-吡咯基，-R5-吡唑基，-R5-咪唑基，R5-哌嗪基-，-R5-吡啶基，-R5-嘧啶基，-R5-吡嗪基，-R5-哒嗪基，-R5-吡咯基-R6-，-R5-吡唑基-R6-，-R5-咪唑基-R6-，-R5-哌嗪基-R6-，-R5-吡啶基-R6-，-R5-嘧啶基-R6-，-R5-吡嗪基-R6-，-R5-哒嗪基-R6-，吡咯基-R6-，吡唑基-R6-，咪唑基-R6-哌嗪基-R6-，吡啶基-R6-，嘧啶基-R6-，吡嗪基-R6-，哒嗪基-R6-，吡咯基，吡唑基，咪唑基，哌嗪基，吡啶基，嘧啶基，吡嗪基和哒嗪基，其中，
R5、R5’和R6彼此独立地选自C1-C12-烷基或(-C2H4O-)1-12，特别是C1-C6烷基，特别是C1-C3烷基，并且其中，
R9和R9’彼此独立地选自H、C1-4-烷基、-C1-6-烷基-NH2、-C1-6-烷基-NHB、-C1-6-烷基-NB2、-R15、-C1-6-烷基-R15、-C1-6-烷基-NH-R15，特别地选自H和C1-2-烷基，更特别地R9是H，其中，
B是独立选择的酸不稳定的胺保护基团，
R15是能与醛部分反应的封闭剂，特别地R15选自半胱氨酰基、苏氨酰基、2-巯基乙醇、半胱胺、乙二硫醇、羟胺、O-甲基羟胺、N-甲基羟胺、二硫苏糖醇、肼，特别是半胱氨酰基和N-甲基羟胺，更特别是半胱氨酰基，其中，
所述封闭剂的胺和/或硫醇部分可被独立选择的酸不稳定的胺保护基团B，特别是Boc，和/或酸不稳定的硫醇保护基团，特别是三苯甲基保护，
-b是0或1，特别是1，
-V是吸电子部分，其选自-NR11-C(＝O)-、-C(＝O)-NR11-、-S(＝O)-、-NR12-(CH2)p-、-哌嗪基-(CH2)p-、-吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、-C(＝O)-、-C(＝O)-O-，特别是-NR11-C(＝O)-、-C(＝O)-NR11-、-S(＝O)-、-NR12-(CH2)p-、-哌嗪基-(CH2)p-、-吡啶基-、嘧啶基，更特别地选自-NH-C(＝O)-、-C(＝O)-NH-、-N-(CH3)-、-哌嗪基
-(CH2)p-、-吡啶基-、嘧啶基，其中，
R11选自H和C1-4-烷基，特别地选自H和C1-2-烷基，更特别地R11是H，
R12选自H和C1-4-烷基，特别地选自H和C1-2-烷基，更特别地R12是甲基，
p是0、1或2，特别是0或1，
-a是0或1，其中a和b之和是1或2，
-U是苯基或五元或六元杂芳基部分，特别是苯基或六元杂芳基部分，更特别是苯基，其结合至部分V、Wq和En中的至少一个并且可以任选地被C1-6-烷基，特别是C1-3-烷基取代，其中，
V如上所述定义，
W选自-N3、-NO2、-S(＝O)-R8、-S-S-R8、-O-CH2-N3、
-O-C(＝O)-O-CH2-N3、-N＝N-苯基、-N＝N-R8、 特别是
-N3、-N＝N-R8、-O-CH2-N3、-S-S-R8，其中，
R8是吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、-C1-C6-烷基或-(CH2)p-NMe2，特别是吡啶基或-C1-C6-烷基，其中p是1、2、3或4，
E在酸性条件下是吸电子基团，
n是0和4之间的整数，特别是0和2之间的整数，更特别是0或1，并且q是0和4之间的整数，特别是0和2之间的整数，更特别是0和1，其中n和q之和等于或小于4，并且其中，
在U是苯基部分且Y是-(CH2)m-O-C(＝O)-的情况下，在酸性条件下V、W、E的哈米特常数之和大于0.45，并且其中，
W相对于Y在邻位或对位，
-Y是-(CH2)m-C(＝O)-或-(CH2)m-O-C(＝O)-，其中m是1、2或3，特别是1或2，更特别是1，
-Z是吸电子离去基团。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中，E选自哌啶基、哌嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、-N(C2H4)2NH2、-N(C2H4)2N-B、-N＝N-苯基、
-N＝N-R8、-(CH2)r-NH-C1-6-烷基、-(CH2)r-N(C1-6-烷基)2-、-F、-Cl、-Br、
-I、-CN、-NO2、-N3、-CF3、-SO3H、-CO2H、-C(＝O)NH2、-SO2Me、
-SOMe、-SO2Et、-SOEt，特别是吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、
-N＝N-苯基、-N＝N-R8、-F、-Cl、-Br、-I、-CN、-NO2、-N3、-CF3、-SO3H、
-CO2H，更特别是吡啶基、嘧啶基、哒嗪基或-Br，其中，
R8是吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、-C1-C6-烷基或-(CH2)p-NMe2，特别是吡啶基或-C1-C6-烷基，其中p是1、2、3或4，并且
B是酸不稳定的胺保护基团，并且
r是0、1、2、3或4，特别是0、1或2。
3.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中，
-B选自Boc(-C(＝O)OtBu)、Eei(＝CMeOEt、1-乙氧基乙亚基)、三苯甲基(-C(Ph)3)、-C(＝O)CPh3、Mmt(-C(Ph)2C6H4OMe)、DMT(-C(Ph)(C6H4OMe)2)、Cbz(-C(＝O)OCH2Ph)、苯甲亚基胺(＝CPh)、邻苯二甲酰亚胺(＝(CO)2C6H4)、对甲苯磺酰胺(-SO2C6H4Me)、苄胺(-CH2Ph)、乙酰胺(-COMe)、三氟乙酰胺(-COCF3)、Dde(1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)-3-乙基)和1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)-3-甲基丁基(ivDde)，其中特别地B是Boc或Eei，其中更特别地B是Boc，和/或
-缩醛-或缩酮保护基团选自
其中r是0至12，特别是0至6，更特别是0、1或2，并且
R10是-C1-C12-烷基-，特别是C1-6-烷基，更特别是C1-3-烷基。
4.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中，T选自
-C1-C12-烷基-，特别是C1-6-烷基、更特别是C1-3-烷基，-R5-C(＝O)-，-R5-C(＝O)-NR9-，-R5-NR9-C(＝O)-R6-，-R5-C(＝O)-NR9-R6-，-R5-C(＝O)-NR9-R5’-NR9’C(＝O)-R6-，特别是C1-3-烷基、-R5-C(＝O)-NR9-、-R5-NR9-C(＝O)-R6-，更特别是C1-3-烷基或-R5-C(＝O)-NR9-，其中R5、R5*、R6、R9’和R9如以上定义。
5.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中，U的所述五元或六元杂芳基部分包括1或2个杂原子，特别地所述部分U的五元杂芳基部分选自吡唑、咪唑，并且所述部分U的六元杂芳基部分选自吡啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪，特别是吡啶。
6.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中，U选自式5、6、7或8的部分，特别是式5或6的部分，
其中，
T、V、Y、W和E如上所述定义，
在式5和6的情况下，U结合至所述部分T或V，
在式7和8的情况下，U结合至所述部分V，
A1、A2、A3、A4和D1、D2、D3、D4彼此独立地选自C、N、S和O，特别地选自C和N，其中A1、A2、A3和A4或D1、D2、D3和D4中的2至4个部分是C，特别地A1、A2、A3和A4或D1、D2、D3和D4中的3或4个部分是C，更特别地所有部分A1、A2、A3和A4或D1、D2、D3和D4是C，
n是
在式5和6的情况下，0和3之间的整数，特别是0和2之间的整数，
在式7和8的情况下，0和4之间的整数，特别是0和2之间的整数，更特别是0和1，
q是0和4之间的整数，特别是0和2之间的整数，更特别是0和1，其中n和q之和等于或小于4。
7.根据权利要求5所述的化合物，其中，U选自式9、10、11或12的部分，特别是式9或10的部分，
其中，
T、V、Y、W、E、q和n如上所述定义，
在式9和10的情况下，U结合至所述部分T或V，
在式11和12的情况下，U结合至所述部分V，
所有部分A2、A3和A4是C或A2、A3和A4中的两个是C并且A2、A3和A4中的其他两个是N，特别地A2和A3均是C，并且
D2是C或N，特别是C。
8.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中，U选自式13、14、15、16、17、18、19、20或21的部分，特别是式13至19的部分，更特别是式15或19的部分，
其中，
T、V、Y、W、E、q和n如上所述定义，
在式13、14和15的情况下，U结合至所述部分T或V，
在式16、17和18的情况下，U结合至所述部分V，
A2、A3和A4是C或N，特别是C，
D2是C或N。
9.根据权利要求1至3中任一项所述的化合物，其中，Z选自：-F、-Cl、-Br、-I、-N3、-OH、-O(C＝O)CH2(C＝O)OH、-SR14、-OCF3、-OCH2CF3、-OSO2CF3、-SO2C6H4CH3、-SO2CF3、-SO2CH3
特别是-OH、-Cl、特别是-OH、
其中R14是C1-C6-烷基-、芳基-或苄基取代基。
10.一种用于纯化肽的方法，所述方法包括以下步骤：
-提供接头修饰的粗肽，其中所述粗肽共价结合至根据权利要求1所述的接头分子，
-在偶联步骤中，将所述接头修饰的肽与固体载体偶联，产生固定的接头修饰的肽，
-在释放步骤中，特别地通过在酸性条件下添加还原剂来释放所述肽。
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