CN118340763A - Salvigenin在制备治疗急性髓系白血病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了Salvigenin在制备治疗急性髓系白血病药物中的应用，属于生物医药领域。所述Salvigenin是基于FF‑10101与FLT3的共结晶结构，以FLT3的ATP结合域为结合靶点区域，在天然化合物库中进行高通量筛选获得。实验证明，Salvigenin对伴或不伴FLT3突变的白血病细胞株的生长均有明显的抑制作用，其中对伴FLT3突变的细胞株的敏感性更高，可以作为FLT3激酶的抑制剂，发挥抗FLT3‑ITD突变型急性髓系白血病作用，有望为FLT3突变AML患者治疗带来更好选择。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别是涉及Salvigenin在制备治疗急性髓系白血病药物中的应用。
背景技术
急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia，AML)约占成人急性白血病的80％，是白血病中重要的类型。在过去的40多年，除AML中急性早幼粒细胞白血病因靶向治疗的引入显著提高治愈率外，其余类型AML的治疗进展颇缓，仍主要采用高剂量阿糖胞苷化疗或异基因造血干细胞移植的方案诱导化疗及后继的危险度分层巩固治疗。在此策略下，60岁以下AML患者5年生存率只有40％左右，而60岁以上AML患者5年生存率不足10％。在精准医学时代下，积极探索靶向治疗有望改善此类AML预后。
FLT3(Fms-like tyrosine kinase,FMS样的酪氨酸激酶3)是受体酪氨酸激酶III类(receptor tyrosine kinase III,RTK III)亚家族中的一员，在高达30％的成人AML中存在突变。FLT3在AML中主要有两种突变类型，即约占2/3的内部串联重复(ITD)突变和约占1/3的激酶结构域(TKD)点突变。两类突变均为功能获得性突变，可导致FLT3受体在不依赖FLT3配体的情况下，持续自身磷酸化，异常激活信号通路，参与白血病的发生发展并维持细胞异常增殖能力。同时，FLT3-ITD阳性AML患者与突变阴性患者相比，对诱导化疗反应更差，复发率更高，无复发生存和总生存时间更短。FLT3-TKD突变对AML患者预后影响尚有争议，但FLT3-ITD阳性AML患者经前期靶向治疗后部分继发FLT3-TKD突变，导致获得性耐药及治疗失败，为AML的后续治疗带来巨大挑战。由于FLT3突变是AML中最常见的分子突变，且突变患者在传统治疗策略下预后恶劣，FLT3自然成为AML中最具吸引力的治疗靶点之一，以望改善该类AML预后。
目前适用于FLT3受体激酶并进入临床试验或已获批的小分子抑制剂有十余个。然而，尽管FLT3突变型AML患者对靶向抑制剂有着较高的反应率，但短暂缓解后发生的耐药及复发等现象，日渐成为一个不容忽视的棘手问题。导致FLT3抑制剂使用后复发最常见的原因是FLT3自身获得了继发性突变。当FLT3出现TKD突变(如D835Y、Y842C等)时，由于FLT3的活化环结构发生变化导致对Ⅱ型FLT3抑制剂(如Sorafenib、AC220)发生耐药；而当FLT3出现守门员突变F691L时，由于突变导致的电荷屏障会导致对Ⅰ型(如Midostaurin、Gilteritinib)和Ⅱ型FLT3均耐药，导致疾病的复发。目前已上市的FLT3靶向抑制剂药物均无法免受F691L突变带来的影响。目前在研的FLT3靶向抑制剂FF-10101通过与ATP结合域中C695氨基酸进行共价结合发挥其稳定FLT3构象的作用，能够克服TKD和F691L突变带来的影响，并且Ⅰ期临床实验表明FF-10101单药在经其他FLT3抑制剂治疗后的复发或难治性伴FLT3突变的AML患者仍有药物活性，具有较强的临床潜力。
天然产物一直是药物研究和开发的重要来源。许多研究表明天然产物具有广泛的药理作用和多种生物活性，如抗炎、抗氧化、促进肿瘤细胞的凋亡等。而且天然产物往往具有更简单的获取途径和更高的安全性。因此，基于天然产物开发与FF-10101类似能够克服Ⅰ/Ⅱ型抑制剂耐药突变的FLT3抑制剂，具有十分重要的临床价值和广阔的应用前景，并有望为FLT3突变AML患者治疗带来更好选择。
发明内容
本发明的目的是提供Salvigenin在制备治疗急性髓系白血病药物中的应用，以解决上述现有技术存在的问题。本发明提供的天然产物Salvigenin对伴或不伴FLT3突变的白血病细胞株的生长均有明显的抑制作用，其中对伴FLT3突变的细胞株的敏感性更高，可以作为FLT3激酶的抑制剂，发挥抗FLT3-ITD突变型急性髓系白血病作用，有望为FLT3突变AML患者治疗带来更好选择。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供Salvigenin在制备治疗急性髓系白血病药物中的应用，所述Salvigenin的分子式为C18H16O6；CAS号为19103-54-9。
进一步地，所述急性髓系白血病为伴FLT3突变的急性髓系白血病。
进一步地，所述FLT3突变包括FLT3-ITD突变、FLT3-TKD突变、FLT3-ITD-TKD突变和FLT3-ITD-F691L突变。
进一步地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
进一步地，所述药物的剂型包括注射剂、片剂、丸剂和颗粒剂。
进一步地，所述Salvigenin靶向抑制伴或不伴FLT3突变的白血病细胞生长。
进一步地，所述Salvigenin靶向抑制伴FLT3突变的白血病细胞生长。
进一步地，所述Salvigenin通过抑制FLT3的磷酸化、促进细胞凋亡和周期阻滞抑制伴FLT3突变的白血病细胞生长。
本发明公开了以下技术效果：
本发明基于FF-10101与FLT3的共结晶结构(PDB：5xuf)，以FLT3的ATP结合域为结合靶点区域，在天然化合物库中进行高通量筛选，获得十余种先导小分子化合物，经细胞水平多次筛选和挑选得到天然产物Salvigenin。本发明的实验验证，天然产物Salvigenin对伴或不伴FLT3突变的白血病细胞株的生长均有明显的抑制作用，其中对伴FLT3突变的细胞株的敏感性更高，可以作为FLT3激酶的抑制剂，发挥抗FLT3-ITD突变型急性髓系白血病作用，有望为FLT3突变AML患者治疗带来更好选择。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为Salvigenin的化学结构式图；
图2为Salvigenin对32D亲本株与32D-ITD稳转株的细胞活力抑制图，其中IC50代表半抑制浓度；
图3为Salvigenin对伴或不伴FLT3突变的白血病细胞株、FLT3突变的复发AML患者的原代细胞及CD34+PBMCs的半抑制浓度(IC50)检测图，其中***代表p<0.001；
图4为Salvigenin与FLT3蛋白的结合模式三维示意图(A)和二维示意图(B)；
图5为小分子AC220(A)和Salvigenin(B)在体外条件对FLT3蛋白激酶活性的药物抑制的EC50浓度，显示了Salvigenin在生化水平能有效抑制FLT3激酶活性，EC50可达微摩尔级别；
图6为对32D-ITD稳转株分别使用不同浓度的AC220和Salvigenin作用6h后Western Blot检测FLT3及其下游STAT5、AKT、ERK及其磷酸化水平，使用GADPH作为上样量控制，显示了Salvigenin能有效抑制FLT3自身磷酸化及其下游信号通路；
图7为Salvigenin对32D-ITD细胞的促进凋亡(A)和周期阻滞(B)效应。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
发明人经过广泛而深入的研究，基于FF-10101(CAS号：1472797-69-5)与FLT3的共结晶结构(PDB：5xuf)，利用FLT3的ATP结合域为结合靶点区域，在天然化合物库中进行高通量筛选获得十余种先导小分子化合物，经细胞水平和生化多次筛选挑选得到天然产物三裂鼠尾草素(Salvigenin，C18H16O6；CAS：19103-54-9)。经验证，天然产物Salvigenin可以作为FLT3激酶的抑制剂，发挥抗FLT3-ITD及耐药突变型急性髓系白血病(伴或不伴FLT3-ITD突变型)作用。实验证明，Salvigenin在体外和体内均可以抑制FLT3-ITD突变的白血病细胞的生长，抑制其FLT3的磷酸化水平、促进细胞凋亡及导致周期阻滞。
本发明实施例中用到的实验材料：
实验细胞：
人Molm-13、MV4-11、THP-1、K562、HL60、Kasumi-1、293T细胞与小鼠32D细胞均购自北纳生物公司。小鼠32D-ITD稳转株细胞为内部构建。
实验试剂：
AC220、Salvigenin购自上海陶素生化科技有限公司；Recombinant Murine IL-3购于PEPROTECH公司(美国)；CCK8试剂购自同仁化学公司(日本)；Annexin V-APC凋亡检测试剂盒购于biogems(美国)；Anti-pFLT3、p-STAT5、STAT5、p-AKT和AKT抗体购于CellSignaling Technology公司(USA)；p-ERK和ERK抗体购于santa cruz公司(美国)；HAtagmouse mAb购于金斯瑞公司(中国)；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)购于Beyotime公司(中国)。
实验方法：
1.FLT3-ITD突变体质粒的构建
pLenti-III-EF1α(LV043)质粒载体购于Applied Biological Materials(abm)Inc.公司(加拿大)，经两端酶切位点设计(5'端BamHI-3'端XbaI)、扩增目的序列、连接、转化进行目的质粒构建，构建完成的质粒经过基因测序验证为构建成功的目的FLT3-ITD突变体质粒。
2.小鼠32D-FLT3-ITD稳转株细胞、293T-FLT3-ITD稳转株细胞的构建
(1)FLT3-ITD突变体慢病毒包装
1)选用293T细胞于10cm细胞培养皿铺板传代生长至对数生长期，调整细胞株状态为佳后，待细胞均匀生长至占据70％～80％皿底体积(细胞数为5～7×106个/皿)。
2)病毒开始包装前2小时，弃去原培养基，用新鲜的DMEM完全培养基5mL进行换液。
3)慢病毒包装体系如表1，取两个1.5mL EP管，标记管A、B后分别加入无血清培养基DMEM 500μL，先在管B中加入40μL脂质体Lipo 2000，轻柔吹打混匀。取管A分别加入表1所示包装体系，轻吹混匀。
表1慢病毒包装体系
4)吸取管B液体，逐滴缓慢滴加入管A，至所有液体滴入，轻柔吹洗混匀三次，放置在37℃培养箱中孵育30分钟。将A，B两管的混合液轻柔逐滴缓慢滴加到细胞培养皿中，十字法混合均匀，放置于培养箱培养。
5)培养6～8小时后，将原培养基全部弃于含有消毒液的废液处理器中，加入5mL新鲜DMEM完全培养基完成细胞换液。
6)培养24小时后，第一次收集含有慢病毒的培养基于15mL离心管，密封4℃保存，并加入5mL新鲜DMEM完全培养基。
7)分别培养48小时和72小时后，收集第二次，第三次病毒。将所收集的全部病毒液，以1500转/分钟转速，4℃低温离心15分钟，用0.22μm的滤器过滤离心上清，去除细胞碎片等杂质，分装后-80℃冰箱保存。
(2)FLT3-ITD慢病毒侵染小鼠32D细胞及稳转株筛选
1)在完成上述FLT3-ITD突变体慢病毒包装后，取适量慢病毒侵染小鼠32D细胞。
2)侵染72小时后开始加入含有嘌呤霉素的培养基进行培养至所有阴性对照细胞全部死亡。
3)取生长良好的32D细胞进行裂解，利用Western Blot检测HA-tag是否表达来鉴定细胞是否稳定表达FLT3突变型蛋白，能够稳定表达FLT3野生型/突变型蛋白的细胞鉴定为小鼠32D-FLT3-ITD稳转株细胞。
3.CCK8法检测细胞活力
CCK8法是一种可靠而灵敏检测细胞活力的方法。CCK-8试剂中的会在电子载体1-Methoxy PMS存在的情况下反应生成水溶性的甲臜染料通过检测其在450nm处的吸光度可以反映细胞存活状况。
4.Salvigenin与FLT3蛋白分子对接
FLT3蛋白结构来自PDB数据库(PDB：5xuf)，Salvigenin结构来自Pub Chem数据库(cid：94381)。使用Maestro进行对接，对接结果展示为最佳打分的构型(docking score：-8.53)。使用Protein-Ligand Interaction Profiler(PLIP)进行蛋白-分子间作用力分析，使用pymol进行图片编辑及输出。
5.基于ADP-ATP转化的激酶活性检测
使用Promega公司ADP-GloTMKinaseAssay试剂盒进行系统构建，原理为将FLT3蛋白与不同浓度梯度的小分子药物、ATP、MBP磷酸化底物、激酶缓冲液共孵育。若小分子药物与FLT3有结合，则随着小分子药物浓度的增高，FLT3消耗ATP将MBP磷酸化的量将减少，生成的ADP量随之减少。后续通过检测生成ADP的量反映小分子药物对FLT3的抑制效果，通过GraphPad软件拟合计算可以得到小分子对FLT3的EC50。
实施例1Salvigenin的靶向抑制能力
1.Salvigenin在细胞水平对于伴ITD突变的细胞株较不伴FLT3突变的细胞株更加敏感
通过前期在天然化合物库中虚拟筛选结果，本发明构建了数十种天然化合物药物。根据这些天然化合物药物对32D亲本株和32D-ITD突变株的抑制情况，经过多浓度梯度的药敏试验，确认Salvigenin(图1)对于32D-ITD突变株在多浓度梯度中表现出更明显的抑制效果，且此差异具有统计学意义(图2)。
随后，本发明检测了Salvigenin对伴或不伴FLT3突变的细胞株的生长抑制能力。选取伴FLT3突变的白血病细胞株(MV-4-11和Molm13)，不伴FLT3突变的细胞株(THP-1、HL60、K562和Kasumi-1)、伴FLT3突变的复发AML患者的原代细胞(AML-Blast)及CD34阳性的PBMC细胞(CD34+PBMCs)进行CCK8药敏试验，检测Salvigenin的杀伤特异性。
结果表明，Salvigenin对32D-ITD突变稳转株的抑制作用要显著优于对无FLT3突变正常细胞32D的抑制作用。在无FLT3突变正常32D细胞、32D-ITD突变稳转株、FLT3突变白血病细胞株(MV-4-11和Molm13)、无FLT3突变白血病细胞株(THP-1、HL60、K562和Kasumi-1)、AML患者的原代细胞及CD34+PBMCs中，Salvigenin对于伴FLT3突变的髓系白血病细胞株(MV-4-11和Molm13)的半抑制浓度(IC50)整体低于不伴FLT3突变的髓系白血病细胞株(THP-1、HL60和K562)，而且FLT3突变的复发AML患者的原代细胞的IC50较低且对CD34+PBMCs毒性较小(图3)。总体而言，Salvigenin对伴或不伴FLT3突变的白血病细胞株的生长均有明显的抑制作用，其中对伴FLT3突变的细胞株的敏感性更高。
2.Salvigenin与FLT3蛋白的特异性结合
靶向抑制剂通过与靶蛋白特异性结合从而影响其生物功能。本发明使用Maestro进行虚拟分子对接，结果如图4，图4显示，Salvigenin能与FLT3蛋白进行特异性的结合(与FLT3蛋白Cys694形成2个氢键作用)，这种结合可以通过竞争性占据FLT3蛋白的ATP结合口袋，抑制FLT3激酶的活化。
实施例2Salvigenin在生化水平能有效抑制FLT3激酶活性
FLT3为受体酪氨酸激酶，与ATP结合后磷酸化下游信号通路的蛋白底物发挥其作用。本发明基于ADP-ATP转化构建激酶活性检测系统，通过检测生成ADP的量反映小分子药物对FLT3的抑制效果。设置小分子AC220组作为阳性对照，设定Salvigenin的浓度梯度检测FLT3激酶活性，计算药物抑制的EC50浓度。经检测，Salvigenin在体外条件对FLT3蛋白激酶活性有明显的抑制效果，EC50可达微摩尔级别(图5)。
实施例3Salvigenin可以抑制FLT3的磷酸化及其下游通路的激活
FLT3为酪氨酸激酶家族中的一员，通过发挥自身的激酶活性磷酸化下游通路信号蛋白来促进细胞的增殖与生存。FLT3的磷酸化能力部分反映了其对下游信号通路的激活能力。本发明检测了不同浓度的Salvigenin对于FLT3下游通路的影响情况。对32D-ITD稳转株分别使用Salvigenin(10μM、20μM和50μM)及AC220(10nM、20nM和50nM)作用6h后收取细胞，蛋白裂解后Western Blot检测FLT3及其下游STAT5、AKT和ERK及其磷酸化水平，结果如图6，图6显示：Salvigenin对32D-ITD细胞株的效果与AC220类似，能够显著抑制FLT3及下游STAT5、AKT和ERK的磷酸化。
实施例4Salvigenin对于FLT3突变的细胞有明显的促凋亡及周期阻滞作用
本发明利用流式细胞术对Salvigenin对32D-ITD稳转细胞株的凋亡诱导和周期阻滞作用进行了检测。结果如图7所示，Salvigenin与FLT3靶向抑制剂AC220效应相似，可诱导32D-ITD稳转株细胞一定程度的凋亡效应，Salvigenin对32D-ITD细胞的杀伤效应十分显著(图7的A)。周期检测结果表明Salvigenin与AC220的影响相似，可以引起32D-ITD细胞的G0/G1期阻滞(图7的B)。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (8)
1.Salvigenin在制备治疗急性髓系白血病药物中的应用，其特征在于，所述Salvigenin的分子式为C18H16O6；CAS号为19103-54-9。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述急性髓系白血病为伴FLT3突变的急性髓系白血病。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述FLT3突变包括FLT3-ITD突变、FLT3-TKD突变、FLT3-ITD-TKD突变和FLT3-ITD-F691L突变。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括注射剂、片剂、丸剂和颗粒剂。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Salvigenin靶向抑制伴或不伴FLT3突变的白血病细胞生长。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述Salvigenin靶向抑制伴FLT3突变的白血病细胞生长。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述Salvigenin通过抑制FLT3的磷酸化、促进细胞凋亡和周期阻滞抑制伴FLT3突变的白血病细胞生长。
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| CN118340763A true CN118340763A (zh) | 2024-07-16 |
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