CN118339282A - 用突变的芳基磺基转移酶硫酸化底物的用途和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及实施非天然存在的突变的芳基磺基转移酶以硫酸化底物的用途和方法，该芳基磺基转移酶包含(i)选自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263、及其组合的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代，其中该位置是相对于大鼠芳基磺基转移酶IV的氨基酸序列SEQ ID NO:1，和(ii)与氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少60％序列同一性的氨基酸序列。该突变的芳基磺基转移酶可以具有与野生型酶相比增强的、将3',5'‑二磷酸腺苷(PAP)转化为3'‑磷酸腺苷‑5'‑磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性。
Description
[技术领域]
本发明涉及具有增强的特性的突变酶。本发明进一步涉及具有增强的硫酸化活性的突变的或非天然存在的芳基磺基转移酶。此外，本发明涉及使用这些突变体来硫酸化底物的方法。还提供了用于合成肝素化合物的方法和系统。
[背景技术]
硫酸化是涉及许多生物过程的缀合过程，这些生物过程包括蛋白质、肽或糖胺聚糖(GAG)的合成，解毒，激素调节，分子识别，细胞信号传导或病毒进入细胞。
硫酸化反应需要磺基转移酶(SULT)作为催化剂，需要共底物作为硫酰基(或磺基)供体。这些反应的通用供体是3′-磷酸腺苷5′-磷酰硫酸(PAPS)。磺基转移酶(SULTS)是一类酶，其将硫酸基团从PAPS转移到通常是目标底物的羟基基团上。
硫酸化过程产生的磺化糖胺聚糖(GAG)包括硫酸乙酰肝素(HS)和肝素。这些GAG是由与葡糖胺连接的葡糖醛酸或艾杜糖醛酸的重复二糖单元组成的密切相关的高度硫酸化多糖，参与许多重要的生物和药理活动。
HS是细胞表面和细胞外基质的组分，参与广泛的生理和病理生理功能，如凝血和病毒感染(Esko和Selleck(2002)Annu.Rev.Biochem.[生物化学年度评论]71,435-471；Liu和Thorp(2002)Med.Res.Rev.[医学研究评论]22,1-25)。HS是包含同时含有N-和O-磺基的1→4连接的葡糖胺和葡糖醛酸/艾杜糖醛酸单元的高电荷多糖。
肝素(硫酸乙酰肝素的一种特殊形式)主要存在于细胞内的肥大细胞颗粒中，并且是一种常用的抗凝药物。市场上可以找到三种形式的肝素：普通(UF)肝素(MWavg约14000Da)；低分子量肝素(MWavg约6000Da)；以及合成的ULMW肝素五糖(MW 1508.3Da)。UF肝素因其半衰期相对较短而用于手术和肾透析，而LMW肝素和ULMW肝素旨在预防高风险患者的静脉栓塞形成。
在体内，HS和肝素在内质网(ER)和高尔基室中生物合成。糖基转移酶催化UDP激活的β-D-葡糖醛酸(GlcA)和N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基的交替添加，以生成多糖链，然后将其通过N-脱乙酰酶、C5-差向异构酶和磺基转移酶修饰。N-脱乙酰酶/N-磺基转移酶(NDST)用N-磺基替代N-乙酰基，并且C5-差向异构酶和O-磺基转移酶(OST)协同作用以将GlcA转化为α-L-艾杜糖醛酸(IdoA)，然后转化为IdoA2S(添加2-O-磺基基团)。然后D-葡糖胺残基被6-O-磺基转移酶(6OST)，然后是3-O-磺基转移酶(3OST)修饰。不同酶亚型的组织特异性表达微调HP和HS的合成，以产生不同的结构，允许功能适应局部细胞环境(Fu等人,Adv DrugDeliv Rev.[先进药物递送评论]2016；97:237-249)。
随着重组肝素生物合成酶的成功表达，现在可以应用HS生物合成酶来生成具有所需生物活性的大肝素和HS寡糖(Fu等人,Adv Drug Deliv Rev.[先进药物递送评论]2016；97:237-249)。
在为合成HS和肝素而开发的生物过程中，OST在辅因子3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)存在下作用于N-磺基肝素前体(sulfoheparosan)(Fu等人,Adv Drug Deliv Rev.[先进药物递送评论]2016；97:237-249)。3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸(PAPS)是单磷酸腺苷的衍生物，其在3′位置被磷酸化，并具有与5′磷酸附接的硫酸基团。它是参与磺基转移酶反应的最常见的辅酶。
辅因子回收系统(涉及芳基磺基转移酶-IV(AST-IV))可用于通过将来自廉价的牺牲供体(对硝基苯硫酸盐(pNPS))的磺基转移到PAP来将昂贵的辅因子3'-磷酸腺苷-5'-磷酸(PAP)转化为PAPS，以再生PAPS(Burkart等人,J Org Chem.[有机化学杂志]2000；65(18):5565-5574；Xiong等人,J Biotechnol.[生物技术杂志]2013；167(3):241-247)。这样的系统已用于生产硫酸乙酰肝素(Chen等人,J Biol Chem.[生物化学杂志]2005；280(52):42817-42825)和肝素(WO 2010/040973)。该反应还产生可回收和化学磺化的对硝基苯酚(PNP)。这种辅因子再生系统节省了成本，因为PAPS比pNPS贵近1000倍(Fu等人,Adv DrugDeliv Rev.[先进药物递送评论]2016；97:237-249)。
PAPS(一种通用的硫酸根供体和所有磺基转移酶的硫酸根来源)是一种非常昂贵且不稳定的分子，其一直是大规模生产酶法硫酸化产品的障碍。
因此，需要优化PAP至PAPS的转化或回收率。
已知在酶的氨基酸序列中引入突变会对酶的催化活性产生负面或正面影响。
Guo等人(Chem Biol Interact.[化学-生物相互作用]1994；92(1-3):25-31)和Sheng等人(Drug Metab Dispos.[药物代谢与处置]2004；32(5):559-565)描述了突变的苯酚磺基转移酶IV，其中突变诱导其相对于不同底物的相对特异性活性或立体特异性变化。
Marshall等人(J Biol Chem.[生物化学杂志]1997；272(14):9153-9160)和Lin等人(Biochem Pharmacol.[生化药理学]2012；84(2):224-23)披露了具有各种氧化还原调节能力的大鼠苯酚磺基转移酶(rSULT1A1)突变体。
Berger等人(PLoS One.[公共科学图书馆综合]2011；6(11):e26794)和Zhou等人(3Biotech.[3生物技术]2019；9(6):246)描述了具有增强的催化活性的人芳基磺基转移酶SULTA1突变体。
磺基转移酶活性可以用本领域已知的各种测定来测量(Paul等人,Anal BioanalChem.[分析和生物分析化学]2012；403(6):1491-1500)。
需要可用于生物过程的酶以将PAP转化为PAPS。
需要具有增强的催化活性的酶来将PAP转化为PAPS。
需要具有增强的催化活性的芳基磺基转移酶(如大鼠芳基磺基转移酶IV)来将PAP转化为PAPS。
需要具有增强的热稳定性的芳基磺基转移酶(如大鼠芳基磺基转移酶IV)。
需要低成本和/或产率改善的用于硫酸化底物的方法。
需要低成本和/或产率改善的用于硫酸化N-硫酸化肝素前体、硫酸乙酰肝素或硫酸肝素前体的方法。
需要低成本和/或产率改善的用于生物合成肝素的方法。
需要用于生物合成肝素的方法，该方法可以使用将3'-磷酸腺苷-5'-磷酸(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的回收系统。
本发明的目的是满足全部或部分这些需求。
[发明内容]
根据其目的之一，本发明涉及一种非天然存在的突变的芳基磺基转移酶，该芳基磺基转移酶包含(i)选自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263、及其组合的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代，其中该位置是相对于大鼠芳基磺基转移酶IV的氨基酸序列SEQ ID NO:1，和(ii)与氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，条件是当所述芳基磺基转移酶是该大鼠芳基磺基转移酶IV时，突变不是F138A和/或Y236A。
如说明本披露的实例中所示，诸位发明人出人意料地获得了一系列突变的芳基磺基转移酶(其中一些氨基酸被取代)，这些突变的芳基磺基转移酶具有增强的将3’,5’-磷酸腺苷(3’,5’-adenosine-phosphate，PAP)转化为3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸(PAPS)的催化活性。
如本文披露的突变的芳基磺基转移酶具有增强的PAP→PAPS转化活性，该活性是野生型大鼠芳基磺基转移酶的相应活性的至少1.3倍至高达7倍。
如本文披露的突变的芳基磺基转移酶可以有利地用于硫酸化生物过程系统中。
如本文披露的突变的芳基磺基转移酶可以有利地用于硫酸化生物过程系统的回收系统中，以增强PAP至PAPS的转化活性，该PAPS用作其他磺基转移酶活性的辅酶辅因子。突变的芳基磺基转移酶可有利地用于硫酸化生物过程系统中，以减少PAP积累对其他磺基转移酶活性的抑制作用，同时还不断为系统提供主要的硫供体分子，PAPS。
如本文披露的突变的芳基磺基转移酶可以有利地用于肝素合成生物过程系统中，以增强PAP至PAPS的转化活性，该PAPS用作涉及其他磺基转移酶活性的回收系统中的辅酶辅因子。换句话说，如本文披露的突变的芳基磺基转移酶可有利地用于肝素合成生物过程系统中，以减少PAP积累对其他磺基转移酶活性的抑制作用，同时还不断为系统提供主要的硫供体分子，PAPS。
本披露有利地提供了低成本且高产率的PAPS来源，允许大规模合成硫酸化底物，如硫酸乙酰肝素和肝素。
此外，本披露提供了具有增强的活性的突变的芳基磺基转移酶，以将PAP转化为可以容易地重组获得的PAPS。
本文披露的突变的非天然存在的芳基磺基转移酶具有增强的热稳定性和/或结构稳定性，导致更可持续的和或增强的催化活性。
本披露有利地提供了以高产率和低成本获得硫酸化底物(如硫酸乙酰肝素和肝素)的方法，从而允许有效的工业规模扩大。
本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性是SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的所述活性的至少1.3倍。与SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的活性相比的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的活性至少约1.3倍的增加可以用如下文所述的比色法来测量。
根据其目的之一，本发明涉及一种非天然存在的突变的芳基磺基转移酶，该芳基磺基转移酶包含(i)选自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263、及其组合的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代，其中该位置是相对于大鼠芳基磺基转移酶IV的氨基酸序列SEQ ID NO:1，(ii)与SEQ ID NO:1具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，并且(iii)具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性是SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的所述活性的至少1.3倍。与SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的活性相比的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的活性至少约1.3倍的增加可以用如下文所述的比色法来测量。
根据其目的之一，本发明涉及一种非天然存在的突变的芳基磺基转移酶，该芳基磺基转移酶包含(i)选自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263、及其组合的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代，其中该位置是相对于大鼠芳基磺基转移酶IV的氨基酸序列SEQ ID NO:1，(ii)与SEQ ID NO:1具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，并且(iii)具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于具有选自SEQ ID NO:5至23、25-35、41、45-47、和49-56的氨基酸序列的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的所述活性。
如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含选自位置6、7、8、9、11、33、62、97、195、和/或263的至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个、或至少6个、或至少7个、或至少8个、或至少9个、或10个氨基酸位置的氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含选自位置6、7、8、9、11、33、62、97、195、和/或263的不超过2个、或不超过3个、或不超过4个、或不超过5个、或不超过6个、或不超过7个、或不超过8个、或不超过9个氨基酸位置的氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含氨基酸位置6、7、8、9、和11的氨基酸取代。在这样的实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以进一步包含选自位置33、62、97、195、和/或263的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含氨基酸位置33、62、97、195、和263的氨基酸取代。在这样的实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以进一步包含选自位置6、7、8、9、和/或11的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含氨基酸位置6、7、8、9、11、33、62、97、195、和263(以及任选地位置236)的氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含氨基酸位置6、7、8、9、11、33、62、97、263、和236的氨基酸取代。在这样的实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以不包含氨基酸位置195的氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以进一步包含选自位置17、20、138、236、239、和/或244的至少1个、或至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5、或6个氨基酸位置的氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以进一步包含选自位置17、20、138、236、239、和/或244的不超过1个、或不超过2个、或不超过3个、或不超过4个、或不超过5个氨基酸位置的氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含：
-谷氨酰胺(Q)或天冬酰胺(N)作为位置6的取代氨基酸，并且在一些实施例中，位置6的取代氨基酸可以是谷氨酰胺(Q)，
-天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)作为位置7的取代氨基酸，并且在一些实施例中，位置7的取代氨基酸可以是天冬氨酸(D)，
-丙氨酸(A)、甘氨酸(G)或缬氨酸(V)作为位置8的取代氨基酸，并且在一些实施例中，位置8的取代氨基酸可以是丙氨酸(A)，
-甘氨酸(G)、丙氨酸(A)或缬氨酸(V)作为位置9的取代氨基酸，并且在一些实施例中，位置9的取代氨基酸可以是甘氨酸(G)，
-亮氨酸(L)、缬氨酸(V)或异亮氨酸(I)作为位置11的取代氨基酸，并且在一些实施例中，位置11的取代氨基酸可以是亮氨酸(L)，
-苯丙氨酸(F)或酪氨酸(Y)作为位置17的取代氨基酸，
-异亮氨酸(I)或亮氨酸(L)作为位置20的取代氨基酸，
-精氨酸(R)、组氨酸(H)或赖氨酸(K)作为位置33的取代氨基酸，并且在一些实施例中，位置33的取代氨基酸可以是精氨酸(R)，
-天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)作为位置62的取代氨基酸，并且在一些实施例中，位置62的取代氨基酸可以是天冬氨酸(D)，
-丝氨酸(S)或苏氨酸(T)作为位置97的取代氨基酸，并且在一些实施例中，位置97的取代氨基酸可以是丝氨酸(S)，
-组氨酸(H)、赖氨酸(K)或精氨酸(R)作为位置138的取代氨基酸，并且在一些实施例中，位置138的取代氨基酸可以是组氨酸(H)，
-天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)作为位置195的取代氨基酸，并且在一些实施例中，位置195的取代氨基酸可以是天冬氨酸(D)，
-苯丙氨酸(F)或色氨酸(W)作为位置236的取代氨基酸，并且在一些实施例中，位置236的取代氨基酸可以是苯丙氨酸(F)，
-天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)作为位置239的取代氨基酸，并且在一些实施例中，位置239的取代氨基酸可以是天冬氨酸(D)，
-天冬酰胺(N)或谷氨酰胺(Q)作为位置244的取代氨基酸，和/或并且在一些实施例中，位置244的取代氨基酸可以是天冬酰胺(N)，
-组氨酸(H)、赖氨酸(K)或精氨酸(R)作为位置263的取代氨基酸，并且在一些实施例中，位置263的取代氨基酸可以是组氨酸(H)。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含选自P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、I17F、I17Y、F20L、F20I、W33R、K62D、A97S、F138H、N195D、Y236F、I239D、M244N、T263H、及其组合的至少一个氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以至少包含氨基酸取代P6Q。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以进一步包含选自W33R、K62D、及其组合的氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含氨基酸取代W33R、K62D、A97S、N195D、和T263H。在这样的实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以进一步包含选自P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、及其组合的至少一个氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以至少包含氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D、和T263H。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以至少包含氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、和T263H。任选地，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶不包含取代N195D。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以进一步包含氨基酸取代Y236F。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以至少包含或可以仅包含氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、Y236F、和T263H。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有选自SEQ ID NO:5至23、25-35、41、45-47、和49-56的氨基酸序列。非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有与选自SEQID NO:5至23、25-35、41、45-47、和49-56的序列具有至少60％同一性的氨基酸序列，并且具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性是SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的所述活性的至少约1.3倍。与SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的活性相比的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的活性至少约1.3倍的增加可以用如下文所述的比色法来测量。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有与选自SEQ ID NO:5至23、25-35、41、45-47、和49-56的序列具有至少60％同一性的氨基酸序列，并且具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性基本上类似于或高于具有选自SEQ ID NO:5至23、25-35、41、45-47、和49-56的氨基酸序列的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的所述活性。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性是SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的所述活性的至少1.5倍，或至少1.8、或至少1.9、或至少2.0、或至少2.2、或至少2.5、或至少3.0、或至少3.2、或至少3.5、或至少4.0、或至少4.5、或至少5.0、或至少5.5、或至少6.0、或至少6.5、或至少7.0倍。
根据其目的之一，本发明涉及一种编码如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的分离的核酸。
根据其目的之一，本发明涉及一种包含如本文披露的核酸的重组表达载体。
根据其目的之一，本发明涉及一种包含如本文披露的核酸或重组表达载体的体外或重组宿主细胞。
根据其目的之一，本发明涉及一种用于硫酸化底物的试剂盒，该试剂盒至少包含：
第一容器中的一种如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶；以及
第二容器中的磺基供体。
在一些实施例中，在如本文披露的试剂盒中，磺基供体可以是芳基硫酸盐化合物。
在一些实施例中，在如本文披露的试剂盒中，芳基硫酸盐化合物是对硝基苯硫酸盐(pNPS)。
在一些实施例中，如本文披露的试剂盒可以进一步包含缓冲液。
在一些实施例中，在如本文披露的试剂盒中，缓冲液可以选自包含以下的组：TRIS缓冲液、磷酸钠缓冲液和磷酸钾缓冲液。
根据其目的之一，本发明涉及一种选择非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的方法，该芳基磺基转移酶至少包含一个氨基酸取代并且具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性是SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的所述活性的至少1.3倍或至少基本上相同于或高于具有选自包含SEQ IDNO:5至23、25-35、41、45-47、和49-56的组的氨基酸序列的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的所述活性，所述方法至少包括以下步骤：
a)使包含至少一个氨基酸取代的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶候选物与磺基供体在适用于将磺基从该磺基供体转移到PAP以获得PAPS的条件下接触，
b)检测PAPS的形成速率或量，
c)将步骤b)获得的PAPS的形成速率或量与用SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV获得的或用具有选自包含SEQ ID NO:5至23、25-35、41、45-47、和49-56的组的氨基酸序列的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶获得的参考速率或量进行比较，以及
d)选择任何非天然存在的突变的芳基磺基转移酶候选物，该候选物至少包含一个氨基酸取代并且具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性是SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的所述活性的至少1.3倍或至少基本上相同于或高于具有选自包含SEQ ID NO:5至23、25-35、41、45-47、和49-56的组的氨基酸序列的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的所述活性。
与SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的活性相比的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的活性至少约1.3倍的增加可以用如下文所述的比色法来测量。
在一些实施例中，在如本文披露的方法中，磺基供体可以是对硝基苯硫酸盐。
根据其目的之一，本发明涉及一种非天然存在的突变的芳基磺基转移酶，该芳基磺基转移酶至少包含一个氨基酸取代并且具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性是SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的所述活性的至少1.3倍或至少基本上相同于或高于具有选自包含SEQ ID NO:5至23、25-35、41、45-47、和49-56的组的氨基酸序列的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的所述活性，该活性通过如本文披露的方法鉴定。与SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的活性相比的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的活性至少约1.3倍的增加可以用如下文所述的比色法来测量。
根据其目的之一，本发明涉及非天然存在的突变的芳基磺基转移酶用于硫酸化底物的用途，该芳基磺基转移酶包含(i)选自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263、及其组合的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代，其中该位置是相对于大鼠芳基磺基转移酶IV的氨基酸序列SEQ ID NO:1，和(ii)与氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，条件是当所述芳基磺基转移酶是大鼠芳基磺基转移酶IV时，突变不是F138A和/或Y236A。
在如本文披露的用途中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性是SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的所述活性的至少1.3倍。与SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的活性相比的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的活性至少约1.3倍的增加可以用如下文所述的比色法来测量。
根据其目的之一，本发明涉及非天然存在的突变的芳基磺基转移酶用于硫酸化底物的用途，该芳基磺基转移酶包含(i)选自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263、及其组合的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代，其中该位置是相对于大鼠芳基磺基转移酶IV的氨基酸序列SEQ ID NO:1，(ii)与氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，并且(iii)具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性是SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的所述活性的至少1.3倍。与SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的活性相比的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的活性至少约1.3倍的增加可以用如下文所述的比色法来测量。
可替代地，在如本文披露的用途中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性基本上类似于或高于具有选自SEQ ID NO:5至23、25-35、41、45-47、和49-56的氨基酸序列的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的所述活性。
根据其目的之一，本发明涉及一种用于硫酸化底物的方法，该方法至少包括使所述待硫酸化的底物与：
a)非天然存在的突变的芳基磺基转移酶，该芳基磺基转移酶包含(i)选自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263、及其组合的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代，其中该位置是相对于大鼠芳基磺基转移酶IV的氨基酸序列SEQ ID NO:1，和(ii)与氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，条件是当所述芳基磺基转移酶是该大鼠芳基磺基转移酶IV时，突变不是F138A和/或Y236A，以及
b)磺基供体在适用于将磺基从该磺基供体转移到所述底物的条件下接触的步骤。
根据其目的之一，本发明涉及一种用于硫酸化底物的方法，该方法至少包括使所述待硫酸化的底物与：
a)非天然存在的突变的芳基磺基转移酶，该芳基磺基转移酶包含(i)选自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263、及其组合的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代，其中该位置是相对于大鼠芳基磺基转移酶IV的氨基酸序列SEQ ID NO:1，(ii)与氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，并且(iii)具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性是SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的所述活性的至少1.3倍，以及
b)磺基供体在适用于将磺基从该磺基供体转移到所述底物的条件下接触的步骤。与SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的活性相比的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的活性至少约1.3倍的增加可以用如下文所述的比色法来测量。
可替代地，在如本文披露的方法中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性基本上类似于或高于具有选自SEQ ID NO:5至23、25-35、41、45-47、和49-56的氨基酸序列的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的所述活性。
根据其目的之一，本发明涉及一种用磺基转移酶和PAPS硫酸化底物的方法，该方法在适合将磺基从PAPS转移到待硫酸化的底物并获得硫酸化底物和PAP的条件下进行，该方法至少包括通过以下来将如此获得的PAP转化为PAPS的步骤：使该PAP与
(i)非天然存在的突变的芳基磺基转移酶，该芳基磺基转移酶包含(1)选自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263、及其组合的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代，其中该位置是相对于大鼠芳基磺基转移酶IV的氨基酸序列SEQ ID NO:1，和(2)与氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，以及
(ii)磺基供体
在适用于将该磺基从该磺基供体转移到PAP以获得PAPS的条件下接触。
在如本文披露的用途或方法中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性为SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的所述活性的至少1.3倍。与SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的活性相比的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的活性至少约1.3倍的增加可以用如下文所述的比色法来测量。
可替代地，在如本文披露的用途或方法中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性基本上类似于或高于具有选自SEQ ID NO:5至23、25-35、41、45-47、和49-56的氨基酸序列的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的所述活性。
在如本文披露的方法中，可以将底物用一种或多种磺基转移酶硫酸化，以进行多次硫酸化。
在如本文披露的方法中，多次硫酸化可以同时或依次进行。
在如本文披露的方法中，将PAP转化为PAPS的步骤可以与硫酸化同时进行或单独进行。
在如本文披露的方法中，硫酸化的步骤和将PAP转化为PAPS的步骤可以在同一反应混合物中同时进行。
如本文披露的方法可以进一步包括回收硫酸化底物的步骤。
在如本文披露的用途或方法中，底物可以选自包含以下的组：3',5'-二磷酸腺苷(PAP)、多糖、乙酰肝素、硫酸肝素前体、化学脱硫的N-硫酸化(CDSNS)肝素、糖胺聚糖(GAG)、硫酸乙酰肝素或硫酸化肝素。
如本文披露的用途或方法可以用于将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)。
如本文披露的用途或方法可以用于制备肝素。
根据其目的之一，本发明涉及一种用于将PAP回收为PAPS的方法，该方法至少包括使所述PAP与：
a)非天然存在的突变芳基磺基转移酶，该非天然存在的突变芳基磺基转移酶包含(i)选自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263、及其组合的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代，其中该位置是相对于大鼠芳基磺基转移酶IV的氨基酸序列SEQ ID NO:1，和(ii)与氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，以及
b)磺基供体在适用于将磺基从该磺基供体转移到PAP以获得PAPS的条件下接触的步骤。
在如本文披露的方法中，磺基供体可以是芳基硫酸盐化合物。
芳基硫酸盐化合物可以是对硝基苯硫酸盐(pNPS)。
在如本文披露的用途或方法中，可以将突变的非天然存在的芳基磺基转移酶接枝至支持物上。
在如本文披露的用途或方法中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有选自SEQ ID NO:5至23、25-35、41、45-47、和49-56的氨基酸序列。
在如本文披露的用途或方法中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有与选自SEQ ID NO:5至23、25-35、41、45-47、和49-56的序列具有至少60％同一性的氨基酸序列，并且具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性是SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的所述活性的至少约1.3倍。与SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的活性相比的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的活性至少约1.3倍的增加可以用如下文所述的比色法来测量。
可替代地，在如本文披露的用途或方法中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有与选自SEQ ID NO:5至23、25-35、41、45-47、和49-56的序列具有至少60％同一性的氨基酸序列，并且具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于具有选自SEQ ID NO:5至23、25-35、41、45-47、和49-56的氨基酸序列的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的所述活性。
[附图说明]
图1：图1A表示反应开始后10分钟的将PAP转化为PAPS的大鼠AST IV硫酸化活性，该活性通过pNP产生的404nm处的吸光度测量，并且是用野生型(AST IV)和突变体Var01至Var09获得的。图1B表示反应开始后30分钟的将PAP转化为PAPS的大鼠AST IV硫酸化活性，该活性通过pNP产生的404nm处的吸光度测量，并且是用野生型(AST IV)和突变体Var01至Var09获得的。
图2：表示反应开始后90分钟的将PAP转化为PAPS的大鼠AST IV硫酸化活性，该活性通过pNP产生的404nm处的吸光度测量，并且是用野生型(AST IV)和突变体Var09-1至Var09-10以及Var09获得的。
图3：表示反应开始后10分钟的将PAP转化为PAPS的大鼠AST IV硫酸化活性，该活性通过pNP产生的404nm处的吸光度测量，并且是用野生型(AST IV)和突变体Var09-P6Q、Var09-P7D、Var09-L8A、Var09-V9G、Var09-V11L、Var09-W33R、Var09-K62D、Var09-A97S、Var09-N195D、Var09-T263H、VAR09-K62D-T263H、VAR09-K62D-N195D-T263H、和Var09获得的。
图4：表示反应开始后10分钟的将PAP转化为PAPS的大鼠AST IV硫酸化活性，该活性通过pNP产生的404nm处的吸光度测量，并且是用野生型(AST IV)和突变体Var09+I17F、Var09+I17Y、Var09+F20I、Var09+F20L、Var09+F138H、Var09+Y236F、Var09+I239D、Var09+M244N、和Var09获得的。
图5：表示反应开始后10分钟的将PAP转化为PAPS的大鼠AST IV硫酸化活性，该活性通过pNP产生的404nm处的吸光度测量，并且是用野生型(AST IV)和突变体Var09、Var5A(P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L)、Var5B(W33R、K62D、A97S、N195D、T263H)、Var5A+W33R、Var5A+K62D、Var5A+A97S、Var5A+N195D、Var5A+T263H、Var5B+P6Q、Var5B+P7D、Var5B+L8A、Var5B+V9G、和Var5B+V11L获得的。
图6：表示来自红原鸡(Gallus gallus)(SEQ ID NO:3)、褐家鼠(Rattusnorvegicus)(SEQ ID NO:1)、智人(Homo sapiens)(SEQ ID NO:2)和家牛(Bos taurus)(SEQ ID NO:4)的芳基磺基转移酶(AST)的序列比对。在来自大鼠的AST序列中，可以通过氨基酸取代突变的位置以粗体和下划线表示。
图7：表示在使用两种不同AST-IV酶量(分别为0.1g/L(图7A)和0.03g/L(图7B))的两个实验中，在C5-差向异构酶和不同AST-IV WT以及变体[“Var09”(SEQ ID NO:13)、“Var09-N195D”(SEQ ID NO:32)、和“Var09+Y236F”(SEQ ID NO:41)]存在下，对N-硫酸化肝素前体(NS肝素前体)的2-O硫酸化活性。
[序列说明]
序列ID NO:1代表大鼠芳基磺基转移酶IV的氨基酸序列。
序列ID NO:2代表来自智人的芳基磺基转移酶的氨基酸序列。
序列ID NO:3代表来自红原鸡的芳基磺基转移酶的氨基酸序列。
序列ID NO:4代表来自家牛的芳基磺基转移酶的氨基酸序列。
序列ID NO:5代表包含突变I17F的大鼠芳基磺基转移酶IV(Var01)的氨基酸序列。
序列ID NO:6代表包含突变F20L的大鼠芳基磺基转移酶IV(Var04)的氨基酸序列。
序列ID NO:7代表包含突变F20I的大鼠芳基磺基转移酶IV(Var03)的氨基酸序列。
序列ID NO:8代表包含突变F138H的大鼠芳基磺基转移酶IV(Var05)的氨基酸序列。
序列ID NO:9代表包含突变Y236F的大鼠芳基磺基转移酶IV(Var06)的氨基酸序列。
序列ID NO:10代表包含突变M244N的大鼠芳基磺基转移酶IV(Var07)的氨基酸序列。
序列ID NO:11代表包含突变I17Y的大鼠芳基磺基转移酶IV(Var02)的氨基酸序列。
序列ID NO:12代表包含突变I239D的大鼠芳基磺基转移酶IV(Var08)的氨基酸序列。
序列ID NO:13代表包含突变P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D、和T263H的大鼠芳基磺基转移酶IV(Var09)的氨基酸序列。
序列ID NO:14代表包含突变P6Q的大鼠芳基磺基转移酶IV(Var09-1)的氨基酸序列。
序列ID NO:15代表包含突变P7D的大鼠芳基磺基转移酶IV(Var09-2)的氨基酸序列。
序列ID NO:16代表包含突变L8A的大鼠芳基磺基转移酶IV(Var09-3)的氨基酸序列。
序列ID NO:17代表包含突变V9G的大鼠芳基磺基转移酶IV(Var09-4)的氨基酸序列。
序列ID NO:18代表包含突变V11L的大鼠芳基磺基转移酶IV(Var09-5)的氨基酸序列。
序列ID NO:19代表包含突变W33R的大鼠芳基磺基转移酶IV(Var09-6)的氨基酸序列。
序列ID NO:20代表包含突变K62D的大鼠芳基磺基转移酶IV(Var09-7)的氨基酸序列。
序列ID NO:21代表包含突变A97S的大鼠芳基磺基转移酶IV(Var09-8)的氨基酸序列。
序列ID NO:22代表包含突变N195D的大鼠芳基磺基转移酶IV(Var09-9)的氨基酸序列。
序列ID NO:23代表包含突变T263H的大鼠芳基磺基转移酶IV(Var09-10)的氨基酸序列。
序列ID NO:24代表包含突变P7D-L8A-V9G-V11L-W33R-K62D-A97S-N195D-T263H的大鼠芳基磺基转移酶IV(Var09少突变P6Q：“Var09-P6Q”)的氨基酸序列。
序列ID NO:25代表包含突变P6Q-L8A-V9G-V11L-W33R-K62D-A97S-N195D-T263H的大鼠芳基磺基转移酶IV(Var09少突变P7D：“Var09-P7D”)的氨基酸序列。
序列ID NO:26代表包含突变P6Q-P7D-V9G-V11L-W33R-K62D-A97S-N195D-T263H的大鼠芳基磺基转移酶IV(Var09少突变L8A：“Var09-L8A”)的氨基酸序列。
序列ID NO:27代表包含突变P6Q-P7D-L8A-V11L-W33R-K62D-A97S-N195D-T263H的大鼠芳基磺基转移酶IV(Var09少突变V9G：“Var09-V9G”)的氨基酸序列。
序列ID NO:28代表包含突变P6Q-P7D-L8A-V9G-W33R-K62D-A97S-N195D-T263H的大鼠芳基磺基转移酶IV(Var09少突变V11L：“V11L”)的氨基酸序列。
序列ID NO:29代表包含突变P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-A97S-N195D-T263H的大鼠芳基磺基转移酶IV(Var09少突变W33R：“Var09-W33R”)的氨基酸序列。
序列ID NO:30代表包含突变P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-W33R-A97S-N195D-T263H的大鼠芳基磺基转移酶IV(Var09少突变K62D：“Var09-K62D”)的氨基酸序列。
序列ID NO:31代表包含突变P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-W33R-K62D-N195D-T263H的大鼠芳基磺基转移酶IV(Var09少突变A97S：“Var09-A97S”)的氨基酸序列。
序列ID NO:32代表包含突变P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-W33R-K62D-A97S-T263H的大鼠芳基磺基转移酶IV(Var09少突变N195D：“Var09-N195D”)的氨基酸序列。
序列ID NO:33代表包含突变P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-W33R-K62D-A97S-N195D的大鼠芳基磺基转移酶IV(Var09少突变T263H：“Var09-T263H”)的氨基酸序列。
序列ID NO:34代表包含突变P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-W33R-A97S-N195D的大鼠芳基磺基转移酶IV(Var09少突变K62D和T263H：“Var09-K62D-T263H”)的氨基酸序列。
序列ID NO:35代表包含突变P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-W33R-A97S的大鼠芳基磺基转移酶IV(“Var09少突变K62D、N195D和T263H：Var09-K62D-N195D-T263H”)的氨基酸序列。
序列ID NO:36代表包含突变P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、I17F、W33R、K62D、A97S、N195D、和T263H的大鼠芳基磺基转移酶IV(Var09加突变I17F：“Var09+I17F”)的氨基酸序列。
序列ID NO:37代表包含突变P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、I17Y、W33R、K62D、A97S、N195D、和T263H的大鼠芳基磺基转移酶IV(Var09加突变I17Y：“Var09+I17Y”)的氨基酸序列。
序列ID NO:38代表包含突变P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、F20I、W33R、K62D、A97S、N195D、和T263H的大鼠芳基磺基转移酶IV(“Var09加突变F20I：Var09+F20I”)的氨基酸序列。
序列ID NO:39代表包含突变P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、F20L、W33R、K62D、A97S、N195D、和T263H的大鼠芳基磺基转移酶IV(Var09加突变F20L：“Var09+F20L”)的氨基酸序列。
序列ID NO:40代表包含突变P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、F138H、N195D、和T263H的大鼠芳基磺基转移酶IV(Var09加突变F138H：“Var09+F138H”)的氨基酸序列。
序列ID NO:41代表包含突变P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D、Y236F、和T263H的大鼠芳基磺基转移酶IV(Var09加突变Y236F：“Var09+Y236F”)的氨基酸序列。
序列ID NO:42代表包含突变P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D、I239D、和T263H的大鼠芳基磺基转移酶IV(Var09加突变I239D：“Var09+I239D”)的氨基酸序列。
序列ID NO:43代表包含突变P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D、M244N、和T263H的大鼠芳基磺基转移酶IV(“Var09加突变M244N：Var09+M244N”)的氨基酸序列。
序列ID NO:44代表包含突变P6Q、P7D、L8A、V9G、和V11L的大鼠芳基磺基转移酶IV(“Var5A”)的氨基酸序列。
序列ID NO:45代表包含突变W33R、K62D、A97S、N195D、和T263H的大鼠芳基磺基转移酶IV(“Var5B”)的氨基酸序列。
序列ID NO:46代表包含突变P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、和W33R的大鼠芳基磺基转移酶IV(“Var5A+W33R”)的氨基酸序列。
序列ID NO:47代表包含突变P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、和K62D的大鼠芳基磺基转移酶IV(“Var5A+K62D”)的氨基酸序列。
序列ID NO:48代表包含突变P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、和A97S的大鼠芳基磺基转移酶IV(“Var5A+A97S”)的氨基酸序列。
序列ID NO:49代表包含突变P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、和N195D的大鼠芳基磺基转移酶IV(“Var5A+N195D”)的氨基酸序列。
序列ID NO:50代表包含突变P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、和T263H的大鼠芳基磺基转移酶IV(“Var5A+T263H”)的氨基酸序列。
序列ID NO:51代表包含突变P6Q、W33R、K62D、A97S、N195D、和T263H的大鼠芳基磺基转移酶IV(“Var5B+P6Q”)的氨基酸序列。
序列ID NO:52代表包含突变P7D、W33R、K62D、A97S、N195D、和T263H的大鼠芳基磺基转移酶IV(“Var5B+P7D”)的氨基酸序列。
序列ID NO:53代表包含突变L8A、W33R、K62D、A97S、N195D、和T263H的大鼠芳基磺基转移酶IV(“Var5B+L8A”)的氨基酸序列。
序列ID NO:54代表包含突变V9G、W33R、K62D、A97S、N195D、和T263H的大鼠芳基磺基转移酶IV(“Var5B+V9G”)的氨基酸序列。
序列ID NO:55代表包含突变V11L、W33R、K62D、A97S、N195D、和T263H的大鼠芳基磺基转移酶IV(“Var5B+V11L”)的氨基酸序列。
序列ID NO:56代表包含突变P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、T263H和Y236F的大鼠芳基磺基转移酶IV(Var09少N195D并加Y236F：“Var09-N195D+Y236F”)的氨基酸序列。
[具体实施方式]
定义
必须注意的是，如本文和所附权利要求所用，单数形式“一种/一个(a/an)”和“该(the)”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。除非上下文另有明确规定，否则“一种/一个(a/an)”意指“至少一个/种”。
如本文所用，术语“约”或“大约”是指对于本技术领域中的技术人员容易知道的用于相应值的通常的误差范围。本文中提及的“约”值或参数包括(并且描述)涉及该值或参数本身的实施例。在一些实施例中，术语“约”是指给定值的±10％。然而，每当讨论的值是指不可分割的对象(如分子)或其他一旦细分就会失去其身份的对象时，“大约”是指不可分割的对象的±1。
在本披露中，表述“取代”和“氨基酸取代”可互换使用，并且旨在是指一个氨基酸残基取代另一个氨基酸残基。氨基酸取代可以是保守的或非保守的。“保守氨基酸取代”是指一个氨基酸残基取代另一个共享氨基酸侧链的化学和物理特性(例如，电荷、大小、疏水性/亲水性)的氨基酸残基。被另一个氨基酸取代的氨基酸称为被取代的氨基酸。取代另一种氨基酸的氨基酸称为取代氨基酸。
在本披露中，表述“芳基磺基转移酶”旨在是指催化产物的硫酸根缀合的酶。例如，芳基磺基转移酶可以在硫酸根供体(或磺基供体)(如3'-磷酸腺苷酰基硫酸酯或3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS))存在下催化芳基部分上的磺基的转移，以产生芳基硫酸盐和硫酸根供体的代谢物，如3',5'-二磷酸腺苷或(PAP)。在合适的条件下，芳基磺基转移酶还可以催化此反应的逆反应，从而由PAP生成PAPS。
在本披露中，表述“芳基磺基转移酶活性”旨在是指芳基磺基转移酶转移PAP上的硫酸基团以生成PAPS的催化活性。磺基转移酶活性可导致PAPS的产生、PAP的消失、反应中使用的磺基供体基团的消耗、或由于反应而从磺基供体产生的代谢物。
应理解，本文所述的本披露的方面和实施例包括“具有”方面和实施例、“包含”方面和实施例、“由方面和实施例组成”以及“基本上由方面和实施例组成”。词语“具有(have)”和“包含/包括(comprise)”或变体如“具有(has/having)”、“包含/包括(comprises/comprising)”将被理解为暗指包括所述元素(如物质的组成或方法步骤)，但不排除任何其他元素。术语“由...组成”暗指包括所述元素，排除任何另外的元素。术语“基本上由...组成”暗指包括所述元素，以及可能的其他元素，其中其他元素不会实质上影响本披露的基本特征。应理解，使用术语“包含/包括”或等同术语的本披露的不同实施例涵盖此术语被替换为“仅包含/包括”、“由...组成”或“基本上由...组成”的实施例。
关于非天然存在的酶的表达“增强的活性”旨在意指与野生型酶相比，该酶具有增强的催化活性、或热稳定性或结构稳定性。
在本披露中，关于化合物或实体(如酶)的表述“分离的”是指该化合物或实体处于与该化合物或实体可能天然存在的环境不同的环境中。“分离的”意指包括样品中的化合物或实体，在这些样品中，此化合物或实体显著富集和/或此化合物或实体是部分或基本上纯化的。在一些情况下，分离的化合物或实体(例如蛋白质，如突变的芳基磺基转移酶；核酸；重组载体)是纯化的，例如，其是至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或大于99％纯的。
在本披露中，如本文所用，关于核酸、肽、多肽或蛋白质的表述“非天然存在的”是指自然界中未发现的任何核酸、肽、多肽或蛋白质。
在本披露中，如本文所用，关于肽、多肽或蛋白质的表述“突变体”是指包含至少一个氨基酸突变的任何肽、多肽或蛋白质。“氨基酸突变”和“突变”可互换使用，并且旨在是指与野生型或天然存在的对应物相比的氨基酸的取代、缺失或插入。特别地，突变肽、多肽或蛋白质可包含至少一个氨基酸取代。
如本文所用，“重组蛋白”旨在是指用重组DNA产生的蛋白质。“重组DNA”是指通过将不同来源或同一来源另一部分的DNA片段拼接，然后导入受体(宿主)细胞的基因工程化DNA分子。例如，重组蛋白可以通过将相应的编码核酸插入质粒载体中并将载体递送至适用于表达该蛋白的宿主细胞中来产生。
在本披露中，关于变化使用的术语“显著”旨在意指观察到的变化是明显的和/或其具有统计意义。
在本披露中，与本披露的特征结合使用的术语“基本上”旨在定义与此特征相关的一组实施例，这些实施例在很大程度上类似于但不完全类似于此特征。与给定特征相关的一组实施例与给定特征之间的差异在于，在该组实施例中，给定特征的性质和功能没有受到实质性影响。
在本披露中，用于相对于参考酶的催化活性来鉴定给定酶的催化活性表述“基本上相同于或高于”旨在定义(i)当用相同的方案和条件测量时，两种酶的催化活性没有显著差异或(ii)当用相同的方案和条件测量两者时，给定酶的催化活性显著高于参考酶的催化活性。显著高于参考催化活性的催化活性可以例如是参考催化活性的至少1.3倍，例如是参考催化活性的至少2、3或4倍。
如本文所用，术语“硫酸化”是指将磺酸基团或硫酰基基团从一个分子转移到另一个分子。
应理解的是，为清楚起见，在单独的实施例的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施例中组合提供。相反，为简洁起见，在单一实施例的上下文中描述的本发明的多个特征也可单独提供或以任何合适的子组合提供。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与由本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管与本文所述的那些方法和材料相似或等效的任何方法和材料也可以用于本发明的实践或测试中。本文提及的所有出版物通过引用并入本文以披露和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。
列出了如下所述的来源、成分和组分的列表，使得其组合和混合物也被考虑并且在本文的范围内。
应当理解在本说明书通篇中给出的每一最大数值限度包括每一较低数值限度，如同这样的较低数值限度在本文中明确写出一样。在本说明书通篇中给出的每一最小数值限度将包括每一较高数值限度，如同这样的较高数值限度在本文中明确写出一样。在本说明书通篇中给出的每一数值范围将包括落入这样的较宽数值范围内的每一较窄数值范围，如同这样的较窄数值范围在本文中全部明确写出一样。
所有项目列表(如例如成分列表)都旨在并且应被解释为马库什组(Markushgroup)。因此，所有列表都可以被解读和解释为“选自由项目列表组成的组中”的项目“及其组合和混合物”。
本文所引用的可以是包括本披露中使用的各种成分在内的组分的商品名称。本文的发明人无意受任何特定商品名称下的材料的限制。在本文的描述中可以替换和使用与以商品名称提及的材料等效的材料(例如，从不同来源以不同名称或参考编号的获得的材料)。
芳基磺基转移酶突变体
如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶包含与氨基酸序列SEQ IDNO:1(大鼠芳基磺基转移酶IV或大鼠AST IV的序列)具有至少60％同一性的氨基酸序列或由其组成，并且包含选自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263、及其组合的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代，该氨基酸位置是相对于SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以是包含如本文披露的氨基酸取代及其组合的SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含上述突变的另外的突变，条件是这些另外的突变不会负面影响本文披露的突变体的特性，特别是展现的与SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的硫酸化活性相比增强的硫酸化活性。
如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性是SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的所述活性的至少约1.3倍。
芳基磺基转移酶活性可以根据本领域任何已知的方法来检测和测量。在一些实施例中，与SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的活性相比的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的活性至少约1.3倍的增加可以用比色法来测量。在一些实施例中，比色法允许测量通过根据以下方案反应，将硫酰基基团从对硝基苯硫酸盐(pNPS)转移到3’,5’-磷酸腺苷(PAP)以产生3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)而释放(或产生)的对硝基苯基(pNP)的量：PAP+pNPS→PAPS+pNP
该方法可以包括以下步骤：
a)使非天然存在的突变的芳基磺基转移酶(例如在细菌中表达的或以表达所述非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的细菌的裂解物提供的或以纯化形式提供的)与足够量的pNPS和PAP在合适的缓冲液中接触，
b)获取代表步骤a)产生的pNP的测量值，
c)使SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV(例如在细菌中表达的或以表达所述非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的细菌的裂解物提供的或以纯化形式提供的)与足够量的pNPS和PAP在合适的缓冲液中接触，
d)获取代表步骤c)产生的pNP的测量值，以及
e)比较步骤b)和步骤d)获得的测量值。
适用于表达突变或野生型芳基磺基转移酶(如SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV)的细菌可以是大肠杆菌BL21 DE3。适合于反应的酶的量(无论以何种方式提供)可以是约30ng/μL。
当使用30ng/μL的酶时，足够量的pNPS和PAP可以分别为约1mM和约0.23mM。
代表反应期间产生的pNP的测量值可以通过测量404nm处的光密度来获得，例如根据制造商的建议使用来自美谷分子仪器公司(Molecular Devices)的190。获得的测量值可以以任意吸光度单位表示。
用于反应的合适缓冲液可以是包含10％甘油的pH 7.0的磷酸盐缓冲液。
合适的反应温度可以为约37℃。
测量值的获取可以在反应开始后10、30或90分钟进行，例如反应开始后10分钟。
在一些实施例中，可以减去空白以归一化获得的测量值。空白可以是水或不含酶和底物的缓冲液。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:5至23、25-35、41、45-47、和49-56的突变的芳基磺基转移酶中的任一种的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:5的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:6的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:7的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:8的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:9的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:10的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:11的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:12的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:13的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:14的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:15的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:16的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:17的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:18的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:19的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:20的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:21的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:22的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:23的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:25的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:26的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:27的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:28的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:29的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:30的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:31的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:32的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:33的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:34的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:35的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:41的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:45的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:46的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:47的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:49的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:50的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:51的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:52的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:53的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:54的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:55的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:56的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶包含与氨基酸序列SEQ IDNO:1(大鼠芳基磺基转移酶IV或大鼠AST IV的序列)具有至少60％同一性的氨基酸序列或由其组成，并且包含选自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263、及其组合的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代，该氨基酸位置是相对于SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV，并且具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性是SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的所述活性的至少1.3倍。至少约1.3倍的活性增加可以用如本文所述的比色法来测量。
在一些其他实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶不包含上述位置的其他位置的突变。
在说明书中，被取代的氨基酸的位置是相对于氨基酸序列SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的氨基酸位置给出的。
本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶是分离的蛋白质。
本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶是重组蛋白。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的序列可以与SEQ ID NO:1的整个序列具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％同一性。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的序列可以与SEQ ID NO:1的整个序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、或99％同一性。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的序列可以与SEQ ID NO:1的整个序列具有至少85％、90％、95％、或99％同一性。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的序列可以与SEQ ID NO:1的整个序列具有至少90％、95％、或99％同一性。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的序列可以与SEQ ID NO:1的整个序列具有至少90％同一性。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的序列可以与SEQ ID NO:1的整个序列具有至少95％同一性。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的序列可以与SEQ ID NO:1的整个序列具有至少99％同一性。
序列的同源性或同一性可以使用已知的方法测量。例如，UWGCG包提供了BESTFIT程序，该程序可用于计算同源性(例如以其默认设置使用)(Devereux等人(1984)NucleicAcids Research[核酸研究]12,387-395)。PILEUP和BLAST算法可用于计算同源性或排列序列(典型地以其默认设置)，例如如Altschul S.F.(1993)J Mol Evol[分子生物学杂志]36:290-300；Altschul,S,F等人(1990)J Mol Biol[分子生物学杂志]215:403-10中所述。
用于执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Centerfor Biotechnology Information)(www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开地获得。该算法涉及首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字来鉴定高评分序列对(HSP)，当与数据库序列中的相同长度的字比对时，该长度为W的短字匹配或满足一些正值阈值得分T。T被称为邻域词得分阈值(Altschul等人，同上)。这些最初的邻域字命中点作为种子，用于启动搜索以找到包含它们的HSP。字命中点沿着每个序列在两个方向上扩展，远至可以增加累积比对得分。当出现以下情形时，字命中点向各方向的延伸终止：累积比对得分从其最大获得值跌落数量X；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积得分走向零或更低；或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用字长(W)11、BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89:10915-10919)比对(B)50、期望值(E)10、M＝5、N＝4和两条链比较作为默认值。
BLAST算法执行两个序列之间相似性的统计分析；参见例如，Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:5873-5787。由BLAST算法提供的一种相似性量度是最小总和概率(P(N))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果第一序列与第二序列的比较的最小总和概率小于约1，优选地小于约0.1、更优选地小于约0.01、并且最优选地小于约0.001，则认为序列与另一个序列相似。
虽然突变是参考氨基酸序列SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV中的氨基酸位置来定义，但还涵盖与SEQ ID NO:1共享至少60％，或至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％氨基酸同一性的芳基磺基转移酶同源物的多肽链中的同源或相应位置处的等价取代。参考氨基酸序列SEQ ID NO:1确定等效位置。通过基于序列之间的同源性将同源物的序列与SEQ ID NO:1进行排列，可以容易地推断出同源或相应的位置。PILEUP和BLAST算法可用于排列序列。
作为适用于本披露的同源序列的实例，可以引用智人(SEQ ID NO:2)、红原鸡(SEQID NO:3)或家牛(SEQ ID NO:4)的芳基磺基转移酶的序列。
在一些实施例中，当非天然存在的芳基磺基转移酶是大鼠芳基磺基转移酶IV时，取代不是F138A和/或Y236A。例如，当非天然存在的芳基磺基转移酶是大鼠芳基磺基转移酶IV并包含一个或两个突变时，这些突变不是F138A和/或Y236A。
在一些实施例中，酶突变体不包含以下取代中的任一个：I239M、F138A、Y236A，氨基酸位置是相对于SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶不是以下序列中的任一种：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:4。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含选自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263的任何氨基酸位置或选自其的氨基酸位置的任何组合的氨基酸取代。其可以包含仅1个至高达16个取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含选自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263、及其组合的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代，并且具有与序列SEQ ID NO:1的野生型芳基磺基转移酶相比增强的活性。增强的活性可以是增强的催化活性，或热稳定性或结构稳定性。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含选自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263、及其组合的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代，并且具有与序列SEQ ID NO:1的野生型芳基磺基转移酶相比增强的磺基转移酶催化活性。
位置6、7、8、9、11、33、62、97、195、263、及其组合中任一个的氨基酸取代可以有利地影响突变体的磺基转移酶催化活性。具有这样的突变的突变体可以具有与序列SEQ IDNO:1的野生型芳基磺基转移酶相比至少1.3倍增强的磺基转移酶活性。
位置6、7、8、9、11、33、62、97、195、263、及其组合中任一个的氨基酸取代可以具有与序列SEQ ID NO:1的野生型芳基磺基转移酶相比增强的热稳定性和/或结构稳定性。这些位置中任一个的氨基酸取代都可以有利地影响突变体的热稳定性。位置33、62、97、195、263、及其组合中任一个(例如所有位置)的氨基酸取代可以具有增强的热稳定性。突变体的热稳定性可以比野生型芳基磺基转移酶的高至少约1℃、约2℃、约3℃、约4℃、约5℃、约6℃、约10℃、约15℃、约20℃或更多，例如高约1℃-30℃、约2℃-25℃、约3℃-20℃、约4℃-15℃、约5℃-10℃或约6℃。突变体的热稳定性可以比野生型芳基磺基转移酶的高至少约1℃至约6℃，或约1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、或约6℃。如本文所用，“热稳定性”是指当暴露于较高温度时蛋白质的稳定性；热稳定的突变蛋白在比野生型蛋白更高的温度下保持其构象。
在其他实施例中，氨基酸取代可以在位置17、20、138、236、239、244、及其组合中的任一个。取自该组被取代的位置的取代(单独或组合)可以有利地影响突变体的磺基转移酶活性。具有这样的突变的突变体可以具有与序列SEQ ID NO:1的野生型芳基磺基转移酶相比至少1.3倍增强的磺基转移酶活性。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含选自位置6、7、8、9、11、33、62、97、195、和263的位置的至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个、或至少6个、或至少7个、或至少8个、或至少9个、或10个氨基酸取代。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含选自位置6、7、8、9、11、33、62、97、195、和263的位置的不超过2个、或不超过3个、或不超过4个、或不超过5个、或不超过6个、或不超过7个、或不超过8个、或不超过9个氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含选自位置6、7、8、9、11、33、62、97、195、和263的位置的至少5个氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以至少在位置6包含至少一个氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含选自位置33、62、97、195、和263的位置的至少一个氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含选自位置6、33、62、97、195、和263的位置的至少一个氨基酸取代。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸位置6、7、8、9、和11的氨基酸取代。包含所有位置6、7、8、9、和11的氨基酸取代的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶进一步包含选自位置33、62、97、195、和263的至少一个或至少两个氨基酸位置的氨基酸取代。包含所有位置6、7、8、9、和11的氨基酸取代的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶进一步包含选自位置33、62、195、和263的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代，并且不包含位置97的氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸位置6、7、8、9、11、和33的氨基酸取代，以及任选地选自位置62、97、195、和263的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸位置6、7、8、9、11、和62的氨基酸取代，以及任选地选自位置33、97、195、和263的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸位置6、7、8、9、11、和97的氨基酸取代，以及选自位置33、62、195、和263的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸位置6、7、8、9、11、和195的氨基酸取代，以及任选地选自位置33、62、97、和263的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸位置6、7、8、9、11、和263的氨基酸取代，以及任选地选自位置33、62、97、和195的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代。
包含至少所有位置6、7、8、9、和11的氨基酸取代的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以进一步包含选自位置33、62、195、和263的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代。
包含至少所有氨基酸位置6、7、8、9、和11的氨基酸取代的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以进一步包含选自位置33、62、和263的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸位置6、7、8、9、和11的氨基酸取代，以及选自位置33和62的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸位置6、7、8、9、和11的氨基酸取代，并且不包含位置97的氨基酸取代。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶不包含位置97的氨基酸取代。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸位置33、62、97、195、和263的氨基酸取代。包含所有氨基酸位置33、62、97、195、和263的氨基酸取代的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以进一步包含选自位置6、7、8、9、和11的组的氨基酸位置的至少一个氨基酸取代突变。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸位置33、62、97、195、263、和6的氨基酸取代，以及任选地选自位置7、8、9、和11的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸位置33、62、97、195、263、和7的氨基酸取代，以及任选地选自位置6、8、9、和11的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸位置33、62、97、195、263、和8的氨基酸取代，以及任选地至少选自位置6、7、9、和11的一个氨基酸位置的氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸位置33、62、97、195、263、和9的氨基酸取代，以及任选地选自位置6、7、8、和11的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸位置33、62、97、195、263、和11的氨基酸取代，以及任选地选自位置6、7、8、和9的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸位置6、33、62、97、195、和263的氨基酸取代。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸位置6、33、62、97、195、263、和236的氨基酸取代，以及任选地选自位置7、8、9、和11的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸位置6、33、62、195、263、和236的氨基酸取代，以及任选地选自位置7、8、9、和11的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸位置6、33、62、195、263、和236的氨基酸取代，以及任选地选自位置7、8、9、和11的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代，并且不包含位置97的氨基酸取代。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸位置6、33、62、97、263、和236的氨基酸取代，以及任选地选自位置7、8、9、和11的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代，并且不包含位置195的氨基酸取代。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含氨基酸位置6、7、8、9、11、33、62、97、和263的氨基酸取代。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸位置6、7、8、9、11、33、62、97、195、和263的氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含所有氨基酸位置6、8、9、11、33、62、97、195、和263的氨基酸取代，并且任选地不包含位置7的氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含所有氨基酸位置6、7、9、11、33、62、97、195、和263的氨基酸取代，并且任选地不包含位置8的氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含所有氨基酸位置6、7、8、11、33、62、97、195、和263的氨基酸取代，并且任选地不包含位置9的氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含所有氨基酸位置6、7、8、9、33、62、97、195、和263的氨基酸取代，并且任选地不包含位置11的氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含所有氨基酸位置6、7、8、9、11、62、97、195、和263的氨基酸取代，并且任选地不包含位置33的氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含所有氨基酸位置6、7、8、9、11、33、97、195、和263的氨基酸取代，并且任选地不包含位置62的氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含所有氨基酸位置6、7、8、9、11、33、62、195、和263的氨基酸取代，并且任选地不包含位置97的氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含所有氨基酸位置6、7、8、9、11、33、62、97、和263的氨基酸取代，并且任选地不包含位置195的氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含所有氨基酸位置6、7、8、9、11、33、62、97、和195的氨基酸取代，并且任选地不包含位置263的氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含所有氨基酸位置6、7、8、9、11、33、97、和195的氨基酸取代，并且任选地不包含位置62和/或263的氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含所有氨基酸位置6、7、8、9、11、33、和97的氨基酸取代，并且任选地不包含位置62、195和/或263的氨基酸取代。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶不包含位置195的氨基酸取代。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶不包含位置97的氨基酸取代。
在另外的实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以进一步包含选自位置17、20、138、236、239、和244的至少1个、或至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个、或至少6个氨基酸位置的氨基酸取代。可替代地，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以进一步包含选自位置17、20、138、236、239、和244的不超过1个、或不超过2个、或不超过3个、或不超过4个、或不超过5个氨基酸位置的氨基酸取代。在另外的实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含选自位置17、20、138、236、239、和244的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代，独立于(或不具有)氨基酸位置6、7、8、9、11、33、62、97、195、和263的氨基酸取代。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸位置6、7、8、9、11、33、62、97、195、和263的氨基酸取代，并且可能包含选自位置17、20、138、236、239、和244的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少位置6和236的氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少位置6和236的氨基酸取代并且不包含位置97和/或195的氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸位置6、7、8、9、11、33、62、97、195、263、和17的氨基酸取代，以及至少选自位置20、138、236、239、和244的一个氨基酸位置的氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸位置6、7、8、9、11、33、62、97、195、263、和20的氨基酸取代，以及选自位置17、138、236、239、和244的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸位置6、7、8、9、11、33、62、97、195、263、和138的氨基酸取代，以及选自位置17、20、236、239、和244的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸位置6、7、8、9、11、33、62、97、195、263、和236的氨基酸取代，以及任选地选自位置17、20、138、239、和244的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代。
天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸位置6、7、8、9、11、33、62、97、263和236的氨基酸取代，以及任选地选自位置17、20、138、239、和244的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代。
天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸位置6、7、8、9、11、33、62、97、263和236的氨基酸取代，以及任选地选自位置17、20、138、239、和244的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代，并且不包含位置195的氨基酸取代。
天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸位置6、7、8、9、11、33、62、97、263和236的氨基酸取代，并且不包含位置195的氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸位置6、7、8、9、11、33、62、97、195、263、和239的氨基酸取代，以及选自位置17、20、138、236、和244的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸位置6、7、8、9、11、33、62、97、195、263、和244的氨基酸取代，以及至少选自位置17、20、138、236、和239的一个氨基酸位置的氨基酸取代。
在一些实施例中，取代可以是保守的，即其用具有相似化学结构、相似化学特性或相似侧链体积的另一种氨基酸取代氨基酸。引入的氨基酸可以与它们取代的氨基酸具有相似的极性、亲水性或疏水性。保守氨基酸变化是本领域熟知的。还可以通过参考用于氨基酸序列保守性的评分矩阵的可接受点突变(Point Accepted Mutation，PAM)或模块替换矩阵(BLOcks SUbstitution Matrix，BLOSUM)族来确定保守氨基酸变化。因此，保守氨基酸改变可以是等价组的成员，其是在选择用于在参考和突变多肽链的比对中使用的评分矩阵的相似性表示中具有相互正得分的一组氨基酸。
例如，保守取代可以是一类氨基酸被同一类氨基酸取代：
表1：氨基酸的种类
可替代地，保守取代可以是一类氨基酸被另一类氨基酸取代，但具有相似的化学结构、相似的化学特性和/或相似的侧链体积。
可替代地，在一些实施例中，取代突变可以是非保守突变，其用具有不相似的化学结构、不相似的化学特性和/或不相似的侧链体积的氨基酸取代一类氨基酸。
例如，给出了可能的保守突变表：
表2：保守氨基酸取代
在一些实施例中，本文披露的突变的芳基磺基转移酶可以包含保守取代和非保守取代。
位置6的取代氨基酸可以是谷氨酰胺(Q)或天冬酰胺(N)。在一些实施例中，位置6的取代氨基酸可以是谷氨酰胺(Q)。
位置7的取代氨基酸可以是天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)。在一些实施例中，位置7的取代氨基酸可以是天冬氨酸(D)。
位置8的取代氨基酸可以是丙氨酸(A)、甘氨酸(G)或缬氨酸(V)。在一些实施例中，位置8的取代氨基酸可以是丙氨酸(A)。
位置9的取代氨基酸可以是甘氨酸(G)、丙氨酸(A)或缬氨酸(V)。在一些实施例中，位置9的取代氨基酸可以是甘氨酸(G)。
位置11的取代氨基酸可以是亮氨酸(L)、缬氨酸(V)或异亮氨酸(I)。在一些实施例中，位置11的取代氨基酸可以是亮氨酸(L)。
位置17的取代氨基酸可以是苯丙氨酸(F)或酪氨酸(Y)。
位置20的取代氨基酸可以是异亮氨酸(I)或亮氨酸(L)。
位置33的取代氨基酸可以是精氨酸(R)、组氨酸(H)或赖氨酸(K)。在一些实施例中，位置33的取代氨基酸可以是精氨酸(R)。
位置62的取代氨基酸可以是天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)。在一些实施例中，位置62的取代氨基酸可以是天冬氨酸(D)。
位置97的取代氨基酸可以是丝氨酸(S)或苏氨酸(T)。在一些实施例中，位置97的取代氨基酸可以是丝氨酸(S)。
位置138的取代氨基酸可以是组氨酸(H)、赖氨酸(K)或精氨酸(R)。在一些实施例中，位置138的取代氨基酸可以是组氨酸(H)。
位置195的取代氨基酸可以是天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)。在一些实施例中，位置195的取代氨基酸可以是天冬氨酸(D)。
位置236的取代氨基酸可以是苯丙氨酸(F)或色氨酸(W)。在一些实施例中，位置236的取代氨基酸可以是苯丙氨酸(F)。
位置239的取代氨基酸可以是天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)。在一些实施例中，位置239的取代氨基酸可以是天冬氨酸(D)。
位置244的取代氨基酸可以是天冬酰胺(N)或谷氨酰胺(Q)。在一些实施例中，位置244的取代氨基酸可以是天冬酰胺(N)。
位置263的取代氨基酸可以是组氨酸(H)、赖氨酸(K)或精氨酸(R)。在一些实施例中，位置263的取代氨基酸可以是组氨酸(H)。
在一些实施例中，氨基酸取代不是F138A和/或Y236A。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含选自包含以下的组的至少一个氨基酸取代：P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、I17F、I17Y、F20L、F20I、W33R、K62D、A97S、F138H、N195D、Y236F、I239D、M244N、和T263H及其组合。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含选自包含P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D、T263H、及其组合的组的至少一个氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以至少包含氨基酸取代P6Q。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含所有氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、和V11L。包含所有氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、和V11L的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以进一步包含选自W33R、K62D、A97S、N195D、和T263H的至少一个或至少两个氨基酸取代。包含所有氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、和V11L的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以进一步包含选自W33R、K62D、N195D、和T263H的至少一个氨基酸取代，并且不包含氨基酸取代A97S。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含所有氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、和W33R，以及任选地选自K62D、A97S、N195D、和T263H的至少一个氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含所有氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、和K62D，以及任选地选自W33R、A97S、N195D、和T263H的至少一个氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含所有氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、和A97S，以及选自W33R、K62D、N195D、和T263H的至少一个氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含所有氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、和N195D，以及任选地选自W33R、K62D、A97S、和T263H的至少一个氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含所有氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、和T263H，以及任选地选自W33R、K62D、A97S、和N195D的至少一个氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含所有氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L，以及任选地选自W33R、K62D、N195D、和T263H的至少一个氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含所有氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、和V11L，可以进一步包含选自W33R、K62D、和T263H的至少一个氨基酸取代。
包含所有氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、和V11L的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以进一步包含选自W33R和K62D的至少一个氨基酸取代。
在一些实施例中，包含所有氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、和V11L的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶不包含氨基酸取代A97S。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含所有氨基酸取代W33R、K62D、A97S、N195D、和T263H。包含所有氨基酸取代W33R、K62D、A97S、N195D、和T263H的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以进一步包含选自P6Q、P7D、L8A、V9G、和V11L的至少一个氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸取代W33R、K62D、A97S、N195D、T263H、和P6Q，以及任选地选自P7D、L8A、V9G、和V11L的至少一个氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸取代W33R、K62D、A97S、N195D、T263H、和P7D，以及任选地选自P6Q、L8A、V9G、和V11L的至少一个氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸取代W33R、K62D、A97S、N195D、T263H、和L8A，以及任选地选自P6Q、P7D、V9G、和V11L的至少一个氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸取代W33R、K62D、A97S、N195D、T263H、和V9G，以及任选地选自P6Q、P7D、L8A、和V11L的至少一个氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸取代W33R、K62D、A97S、N195D、T263H、和V11L，以及任选地选自P6Q、P7D、L8A、和V9G的至少一个氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含所有位置W33R、K62D、A97S、N195D、和T263H的氨基酸取代，以及任选地选自P6Q和/或Y236F的氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含所有位置P6Q、W33R、K62D、A97S、N195D、和T263H的氨基酸取代，以及任选地选自P7D、L8A、V9G、和V11L的至少一个氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含所有位置P6Q、W33R、K62D、A97S、N195D、T263H、和Y236F的氨基酸取代，以及任选地选自P7D、L8A、V9G、和V11L的至少一个氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含所有位置P6Q、W33R、K62D、N195D、T263H、和Y236F的氨基酸取代，以及任选地选自P7D、L8A、V9G、和V11L的至少一个氨基酸取代。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶不包含氨基酸取代A97S。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含所有位置P6Q、W33R、K62D、N195D、T263H、和Y236F的氨基酸取代，以及任选地选自P7D、L8A、V9G、和V11L的至少一个氨基酸取代，并且不包含氨基酸取代A97S。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶不包含氨基酸取代N195D。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含所有位置P6Q、W33R、K62D、T263H、和Y236F的氨基酸取代，以及任选地选自P7D、L8A、V9G、和V11L的至少一个氨基酸取代，并且不包含氨基酸取代N195D。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含选自P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D、和T263H的氨基酸取代。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D、和T263H。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸取代P6Q、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D、和T263H，并且任选地不包含氨基酸取代P7D。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸取代P6Q、P7D、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D、和T263H，并且任选地不包含氨基酸取代L8A。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D、和T263H，并且任选地不包含氨基酸取代V9G。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、W33R、K62D、A97S、N195D、和T263H，并且任选地不包含氨基酸取代V11L。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、K62D、A97S、N195D、和T263H，并且任选地不包含氨基酸取代W33R。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、A97S、N195D、和T263H，并且任选地不包含氨基酸取代K62D。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、N195D、和T263H，并且任选地不包含氨基酸取代A97S。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、和T263H，并且任选地不包含氨基酸取代N195D。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、和N195D，并且任选地不包含氨基酸取代T263H。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、A97S、和N195D，并且任选地不包含氨基酸取代K62D和/或T263H。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、和A97S，并且任选地不包含氨基酸取代K62D、N195D、和/或T263H。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶不包含氨基酸取代N195D。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶不包含氨基酸取代A97S。
在另外的实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以进一步包含选自包含I17、F20、F138、Y236、I239、M244、及其组合的组的至少一个、或至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个、或至少6个氨基酸取代。可替代地，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以进一步包含选自I17、F20、F138、Y236、239和IM244的不超过1个、或不超过2个、或不超过3个、或不超过4个、或不超过5氨基酸位置的氨基酸取代。在另外的实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含选自I17、F20、F138、Y236、239和IM244的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代，独立于(或不具有)选自P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D、和T263H的氨基酸取代。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、和T263H，以及可能地选自包含I17F、I17Y、F20L、F20I、F138H、Y236F、I239D、M244N、及其组合的组的至少一个氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以至少包含氨基酸取代P6Q和Y236F。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以至少包含氨基酸取代P6Q和Y236F，并且不包含位置97和/或195的氨基酸取代。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以至少包含氨基酸取代P6Q和Y236F，并且不包含氨基酸取代A97S和/或N195D。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含所有氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D和T263H，以及任选地Y236F。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含所有氨基酸取代P6Q、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D和T263H，以及任选地Y236F，并且任选地不包含氨基酸P7D。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含所有氨基酸取代P6Q、P7D、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D和T263H，以及任选地Y236F，并且任选地不包含氨基酸取代L8A。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含所有氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D和T263H，以及任选地Y236F，并且任选地不包含氨基酸取代V9G。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含所有氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、W33R、K62D、A97S、N195D和T263H，以及任选地Y236F，并且任选地不包含氨基酸取代V11L。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含所有氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、K62D、A97S、N195D和T263H，以及任选地Y236F，并且任选地不包含氨基酸取代W33R。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含所有氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、A97S、N195D和T263H，以及任选地Y236F，并且任选地不包含氨基酸取代K62D。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含所有氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、N195D和T263H，以及任选地Y236F，并且任选地不包含氨基酸取代A97S。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含所有氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S和T263H，以及任选地Y236F，并且任选地不包含氨基酸取代N195D。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含所有氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S和N195D，以及任选地Y236F，并且任选地不包含氨基酸取代T263H。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、T263H、和Y236F，并且任选地不包含氨基酸取代N195D。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D、T263H、和I17F，以及选自包含F20L、F20I、F138H、Y236F、I239D、M244N、及其组合的组的至少一个氨基酸取代。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D、T263H、和I17Y，以及选自包含F20L、F20I、F138H、Y236F、I239D、M244N、及其组合的组的至少一个氨基酸取代。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D、T263H、和F20L，以及选自包含I17F、I17Y、F138H、Y236F、I239D、M244N、及其组合的组的至少一个氨基酸取代。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D、T263H、和F20I，以及选自包含I17F、I17Y、F138H、Y236F、I239D、M244N、及其组合的组的至少一个氨基酸取代。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D、T263H、和F138H，以及选自包含I17F、I17Y、F20I、F20L、Y236F、I239D、M244N、及其组合的组的至少一个氨基酸取代。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D、T263H、和Y236F，以及任选地选自包含I17F、I17Y、F20I、F20L、F138H、I239D、M244N、及其组合的组的至少一个氨基酸取代。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、T263H、和Y236F，以及任选地选自包含I17F、I17Y、F20I、F20L、F138H、I239D、M244N、及其组合的组的至少一个氨基酸取代，并且任选地不包含氨基酸取代N195D。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、N195D、T263H、和Y236F，以及任选地选自包含I17F、I17Y、F20I、F20L、F138H、I239D、M244N、及其组合的组的至少一个氨基酸取代，并且任选地不包含氨基酸取代A97S。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、T263H、和Y236F，并且不包含氨基酸取代N195D。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D、T263H、和I239D，以及选自包含I17F、I17Y、F20I、F20L、F138H、Y236F、M244N、及其组合的组的至少一个氨基酸取代。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以包含至少所有氨基酸取代P6Q、P7D、L8A、V9G、V11L、W33R、K62D、A97S、N195D、T263H、和M244N，以及选自包含I17F、I17Y、F20I、F20L、F138H、Y236F、I239D、及其组合的组的至少一个氨基酸取代。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以是包含如本文披露的氨基酸取代及其组合的SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV。
非天然存在的芳基磺基转移酶可以包含或可以是如下表3中所示的氨基酸序列：
表3：芳基磺基转移酶突变体的序列
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有选自SEQ ID NO:5至23、25-35、41、45-47、和49-56的氨基酸序列。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有与选自SEQ ID NO:5至23、25-35、41、45-47、和49-56的序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％同一性的氨基酸序列，并且具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性是SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的所述活性的至少约1.3倍、或至少约两倍、或至少约三倍。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有氨基酸序列SEQ ID NO:13。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有与序列SEQ ID NO:13(Var09)具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％同一性的氨基酸序列，并且具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性是SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的所述活性的至少约1.3倍、或至少约两倍、或至少约三倍。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有氨基酸序列SEQ ID NO:32。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有与序列SEQ ID NO:32(“Var09-N195D”)具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％同一性的氨基酸序列，并且具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性是SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的所述活性的至少约1.3倍、或至少约两倍、或至少约三倍。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有氨基酸序列SEQ ID NO:41。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有与序列SEQ ID NO:41(“Var09+Y236F”)具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％同一性的氨基酸序列，并且具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性是SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的所述活性的至少约1.3倍、或至少约两倍、或至少约三倍。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有氨基酸序列SEQ ID NO:45。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有与序列SEQ ID NO:45(“Var05B”)具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％同一性的氨基酸序列，并且具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性是SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的所述活性的至少约1.3倍、或至少约两倍、或至少约三倍。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有与序列SEQ ID NO:45(“Var05B”)具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％同一性的氨基酸序列，并且具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性基本上类似于SEQ ID NO:45的大鼠芳基磺基转移酶IV的活性。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有氨基酸序列SEQ ID NO:56。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有与序列SEQ IDNO:56(“Var09-N195D+Y236F”)具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％同一性的氨基酸序列，并且具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性是SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的所述活性的至少约1.3倍、或至少约两倍、或至少约三倍。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶不是选自SEQ ID NO:24、36-40、42-44和48的氨基酸序列。
本文披露的突变可通过使用本领域已知的任何方法引入酶中，如酶的定向诱变、PCR和基因混编方法或通过在定向诱变循环中使用多种诱变寡核苷酸。可以以定向或随机方式引入突变。因此，诱变方法产生编码一种或多种不同突变体的一种或多种多核苷酸。典型地，产生突变基因文库，该突变基因文库可用于产生突变酶文库。
重组表达
本披露的芳基磺基转移酶突变体可以通过任何合适的方法产生，包括重组和非重组方法(例如，化学合成)。
当使用重组技术产生非天然存在的突变的芳基磺基转移酶时，这些方法可以涉及任何合适的构建体和任何合适的宿主细胞，其可以是原核或真核细胞，通常是细菌或酵母宿主细胞，更通常是细菌细胞。用于将遗传物质引入宿主细胞的方法包括例如转化、电穿孔、缀合、磷酸钙方法等。可选择转移方法以提供所引入的非天然存在的芳基磺基转移酶编码核酸的稳定表达。突变的芳基磺基转移酶编码核酸可以作为可遗传的附加型元件(例如，质粒)提供或可以被基因组整合。
本披露提供了核酸，包括分离的或重组的核酸，这些核酸包含编码如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的核苷酸序列。在一些实施例中，本披露提供了一种编码如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的核酸(或核苷酸序列)。在一些实施例中，核苷酸序列可操作地连接至转录控制元件，例如启动子。启动子在一些情况下是组成型的。启动子在一些情况下是诱导型的。在一些情况下，启动子适合在原核宿主细胞中使用(例如，在其中有活性)。在一些情况下，启动子适合在真核宿主细胞中使用(例如，在其中有活性)。
在某些情况下，包含编码非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的核苷酸序列的核酸可以存在于表达载体中。在一些实施例中，本披露提供了一种重组表达载体，该重组表达载体包含编码如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的核酸。本披露提供了重组表达载体(例如，分离的重组表达载体)，该重组表达载体包含编码本披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的核苷酸序列。
在一些实施例中，编码突变的芳基磺基转移酶的核苷酸序列可操作地连接至转录控制元件，例如启动子。启动子在一些情况下是组成型的。启动子在一些情况下是诱导型的。在一些情况下，启动子适合在原核宿主细胞中使用(例如，在其中有活性)。在一些情况下，启动子适合在真核宿主细胞中使用(例如，在其中有活性)。
用于转移非天然存在的突变的芳基磺基转移酶编码核酸的合适载体的组成可以不同。
整合载体可以是条件复制或自杀质粒、噬菌体等。构建体可以包括各种元件，包括例如启动子、选择性遗传标志(例如赋予针对抗生素(例如卡那霉素、红霉素、氯霉素或庆大霉素)的抗性的基因)、复制起点(促进宿主细胞(例如，细菌宿主细胞)中的复制)等。载体的选择将取决于多种因素，如需要增殖的细胞类型和增殖目的。某些载体可用于扩增和产生大量所需DNA序列。其他载体适用于培养物的细胞中的表达。还有其他载体适用于完整动物的细胞中的转移和表达。适当载体的选择是本领域技术人员熟知的。许多这样的载体是可商购的。
在一个实例中，载体是基于附加型质粒的表达载体，其含有可选择的药物抗性标志和元件，这些元件提供在不同宿主细胞(例如，大肠杆菌和脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)两者)中的自主复制。这样的“穿梭载体”的一个实例是质粒pFPIO(Pagotto等人(2000)Gene[基因]244:13-19)。
构建体(重组载体)可以通过例如将目的多核苷酸插入构建体主链中(典型地通过DNA连接酶附接至载体中切割的限制性酶位点)来制备。可替代地，可以通过同源重组或位点特异性重组插入所需核苷酸序列。典型地，同源重组通过将与载体同源的区域附接至所需核苷酸序列的侧翼来完成，而位点特异性重组可以通过使用促进位点特异性重组的序列(例如，cre-lox、att位点等)来完成。含有这样的序列的核酸可以通过例如寡核苷酸的连接或通过使用包含同源区域和所需核苷酸序列的一部分的引物的聚合酶链式反应来添加。
载体可以提供宿主细胞中的染色体外维持或可以提供整合到宿主细胞基因组中。本领域人员熟知的许多出版物中都详细描述了载体，包括例如Short Protocols inMolecular Biology[精编分子生物学实验指南],(1999)F.Ausubel,等人,编辑,Wiley&Sons[威利父子公司]。载体可以提供编码目的蛋白的核酸的表达，可以提供主题核酸的增殖，或两者。
可以使用的载体的实例包括但不限于衍生自重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA的那些。例如，可以使用质粒载体，如pBR322，pUC 19/18，pUC 118、119和M13 mp系列载体。pET21也是可以使用的表达载体。噬菌体载体可包括λgtl0、λgtl l、λgtl8-23、λZΑΡ/R和EMBL系列噬菌体载体。可以利用的另外的载体包括但不限于pJB8、pCV 103、pCV 107、pCV108、pTM、pMCS、pNNL、pHSG274、COS202、COS203、pWE15、pWE16和卡隆粒9系列载体。
为了表达目的蛋白，可以使用表达盒。因此，本披露提供了一种包含主题核酸的重组表达载体。表达载体提供转录和翻译调节序列，并且可以提供诱导型或组成型表达，其中编码区在转录起始区以及转录和翻译终止区的转录控制下可操作地连接。这些控制区对于衍生非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的芳基磺基转移酶可能是天然的，或可以衍生自外源。通常，转录和翻译调节序列可以包括但不限于启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或激活子序列。启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子，并且可以是强组成型启动子(例如，T7等)。
表达载体通常具有位于启动子序列附近的方便的限制性位点，以提供编码目的蛋白的核酸序列的插入。可存在在表达宿主中有效的选择性标志以促进含有载体的细胞的选择。此外，表达构建体可以包括另外的元件。例如，表达载体可以具有一种或两种复制系统，从而使其在生物中，例如在哺乳动物或昆虫细胞中维持表达，并在原核宿主中维持克隆和扩增。此外，表达构建体可以含有选择性标志基因以允许选择转化的宿主细胞。选择基因是本领域熟知的并且将随所使用的宿主细胞而变化。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的分离和纯化可以根据本领域已知的方法来完成。例如，可以通过免疫亲和纯化从细胞(其经基因修饰以表达非天然存在的突变的芳基磺基转移酶)的裂解物或合成反应混合物中分离非天然存在的突变的芳基磺基转移酶，这通常涉及将样品与抗芳基磺基转移酶抗体接触，洗涤以除去非特异性结合的物质，以及洗脱特异性结合的芳基磺基转移酶。分离的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以通过透析和蛋白质纯化方法中常用的其他方法进一步纯化。在一个实例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以使用金属螯合色谱法分离。
许多合适的宿主细胞中的任一种都可以用于生产非天然存在的突变的芳基磺基转移酶。通常，本文所述的目的蛋白可以根据常规技术在原核生物或真核生物(例如细菌，如大肠杆菌)中表达。因此，本披露进一步提供了一种体外宿主细胞，其包含编码如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的核酸。用于生产(包括大规模生产)目的蛋白的宿主细胞可以选自多种可用的宿主细胞中的任一种。
用于表达的宿主细胞的实例包括原核或真核单细胞生物的那些，如细菌(例如，大肠杆菌菌株)、酵母(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤醇母属物种等)，并且可以包括最初源自高等生物(如昆虫，脊椎动物例如哺乳动物)的宿主细胞。合适的细菌包括但不限于BL21感受态大肠杆菌、BL21(DE3)感受态大肠杆菌、NEB表达感受态大肠杆菌、NEB表达Iq感受态大肠杆菌、T7表达感受态大肠杆菌、T7表达Iq感受态大肠杆菌、T7表达lysY感受态大肠杆菌、T7表达lysY/Iq感受态大肠杆菌、T7表达晶体(Crystal)感受态大肠杆菌、SHuffle表达感受态大肠杆菌、SHuffle T7表达感受态大肠杆菌、SHuffle T7表达lysY感受态大肠杆菌、SHuffle T7感受态大肠杆菌、NiCo21(DE3)感受态大肠杆菌、Lemo21(DE3)感受态大肠杆菌。合适的哺乳动物细胞系包括但不限于HeLa细胞(例如，美国典型培养物保藏中心(ATCC)编号CCL-2)、CHO细胞(例如，ATCC编号CRL9618、CCL61、CRL9096)、293细胞(例如，ATCC编号CRL-1573)、Vero细胞、NIH 3T3细胞(例如，ATCC编号CRL-1658)、Huh-7细胞、BHK细胞(例如，ATCC编号CCL10)、PC12细胞(ATCC编号CRL1721)、COS细胞、COS-7细胞(ATCC编号CRL1651)、RATI细胞、小鼠L细胞(ATCC编号CCLI.3)、人胚肾(HEK)细胞(ATCC编号CRL1573)、HLHepG2细胞等。在一些情况下，细菌宿主细胞和酵母宿主细胞在用于生产目的蛋白方面特别令人感兴趣。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以以基本上纯的或基本上分离的形式制备。可以提供纯化的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶，使得多肽存在于基本上不含其他表达的多肽的组合物中，例如，小于90％、通常小于60％、并且更通常小于50％的组合物由其他表达的多肽组成。
试剂盒
在一些实施例中，本披露涉及一种用于硫酸化底物的试剂盒。
用于硫酸化底物的试剂盒可以至少包含：
第一容器中的一种如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶；以及
第二容器中的磺基供体。
如本文披露的试剂盒可用于硫酸化多糖。如本文披露的试剂盒可以用于将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)。如本文披露的试剂盒可以用于合成硫酸化底物。如本文披露的试剂盒可以用于合成硫酸乙酰肝素。如本文披露的试剂盒可以用于合成硫酸化肝素。
磺基供体基团可以是芳基硫酸盐化合物。
芳基硫酸盐化合物可以是pNPS。
试剂盒可以进一步包含用于硫酸化底物(例如多糖)的说明书。说明书可能涉及肝素的合成。
试剂盒可以进一步含有适用于酶的催化活性的缓冲液。缓冲液可以与如本文披露的芳基磺基转移酶一起包装，或者可以包装在单独的容器中。合适的缓冲液可以是，例如，TRIS缓冲液、磷酸钠缓冲液和磷酸钾缓冲液。合适的pH为约6.0至约7.5，以及约7.0。
在一些实施例中，试剂盒可以包含至少一种另外的酶。另外的酶可以是糖基转移酶、N-脱乙酰酶/N-磺基转移酶、C5-差向异构酶、或O-磺基转移酶(OST)，如例如2-OST、3-OST、3-OST-1、3-OST-3、6-OST、6-OST-1、6-OST3。当试剂盒含有两种或更多种酶时，每种酶可以包装在单独的容器中。
芳基磺基转移酶突变体催化活性及筛选方法
如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性是SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的所述活性的至少约1.3倍。
芳基磺基转移酶活性可以根据本领域任何已知的方法来检测和测量。
在一些实施例中，与SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的活性相比的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的活性至少约1.3倍的增加可以用比色法来测量，该比色法允许测量通过根据以下方案反应，将硫酰基基团从对硝基苯硫酸盐(pNPS)转移到3’,5’-磷酸腺苷(PAP)以产生3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)而释放(或产生)的对硝基苯基(pNP)的量：
PAP+pNPS→PAPS+pNP
该方法可以包括以下步骤：
a)使非天然存在的突变的芳基磺基转移酶(例如在细菌中表达的或以表达所述非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的细菌的裂解物提供的或以纯化形式提供的)与足够量的pNPS和PAP在合适的缓冲液中接触，
b)获取代表步骤a)产生的pNP的测量值，
c)使SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV(例如在细菌中表达的或以表达所述非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的细菌的裂解物提供的或以纯化形式提供的)与足够量的pNPS和PAP在合适的缓冲液中接触，
d)获取代表步骤c)产生的pNP的测量值，以及
e)比较步骤b)和步骤d)获得的测量值。
适用于表达突变或野生型芳基磺基转移酶(如SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV)的细菌可以是大肠杆菌BL21 DE3。适合于反应的酶的量(无论以何种方式提供)可以是约30ng/μL。
当使用30ng/μL的酶时，足够量的pNPS和PAP可以分别为约1mM和约0.23mM。
代表反应期间产生的pNP的测量值可以通过测量404nm处的光密度来获得，例如根据制造商的建议使用来自美谷分子仪器公司(Molecular Devices)的190。获得的测量值可以以任意吸光度单位表示。
用于反应的合适缓冲液可以是包含10％甘油的pH 7.0的磷酸盐缓冲液。
合适的反应温度可以为约37℃。
测量值的获取可以在反应开始后10、30或90分钟进行，例如反应开始后10分钟。
在一些实施例中，可以减去空白以归一化获得的测量值。空白可以是水或不含酶和底物的缓冲液。
可替代地，在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:5至23、25-35、41、45-47、和49-56的突变的芳基磺基转移酶中的至少一种的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:5至23、25-35、41、45-47、和49-56的突变的芳基磺基转移酶中的任一种的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:5的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:6的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:7的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:8的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:9的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:10的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:11的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:12的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:13的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:14的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:15的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:16的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:17的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:18的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:19的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:20的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:21的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:22的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:23的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:25的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:26的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:27的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:28的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:29的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:30的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:31的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:32的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:33的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:34的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:35的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:41的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:45的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:46的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:47的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:49的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:50的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:51的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:52的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:53的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:54的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:55的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
在一些实施例中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:56的突变的芳基磺基转移酶的催化活性。
本披露的芳基磺基转移酶突变体相对于相应的野生型大鼠AST IV酶显示增强的硫酸化活性。增强的硫酸化活性可以以提高的催化效率或提高的用一种或多种硫酸化底物的产物形成速率来表征。提高的偶联效率或提高的产物形成速率可能会或可能不会在本披露的芳基磺基转移酶突变体所使用的所有底物之间共享。在一些实施例中，与野生型大鼠AST IV酶相比，本文披露的突变的芳基磺基转移酶的增强的催化活性是由PAP与磺基供体基团(如pNPS)产生PAPS的逆反应。
如本文披露的芳基磺基转移酶的酶活性可以使用适用于给出硫酸化速率、代谢物形成速率或底物消失速率的任何底物或条件在体外测量。例如，可以用比色法检测和测量芳基磺基转移酶活性。在这样的方法中，可以使用比色酶底物或比色代谢物。可以检测和测量比色底物的消失，和/或可以检测和测量比色代谢物的出现。
可以测量转化速率。
用于硫酸化过程的底物可以是能够被芳基磺基转移酶硫酸化的任何有机化合物。任何有机化合物对于被芳基磺基转移酶硫酸化的适用性可以通过本文所述的方法常规地确定。
底物可以是天然底物野生型芳基磺基转移酶，或通常不是野生型酶的底物但能够在突变酶中这样利用的底物。芳基磺基转移酶的天然底物的实例是3’,5’-磷酸腺苷(PAP)或对硝基苯硫酸盐(pNPS)。
为了检测和测量芳基磺基转移酶对3’,5’-磷酸腺苷(PAP)转化为3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸(PAPS)的活性，可以使用对硝基苯硫酸盐(pNPS)作为磺基供体基团，该对硝基苯硫酸盐根据以下方案转化为比色代谢物对硝基苯基(pNP)：
PAP+pNPS→PAPS+pNP
pNP的存在可以通过在404nm处测量的吸光度检测来检测和测量。
这样的方法中适合检测和测量芳基磺基转移酶活性的参数可以使用约30ng/μL酶，1mM pNPS，0.23mM PAP，在pH 7.0的具有10％甘油的磷酸缓冲液中。可以将反应混合物在约37℃孵育10、30或90分钟。通过将PAP添加到酶和pNPS的混合物中来启动反应。
在一些实施例中，芳基磺基转移酶活性可以根据反应PAP+pNPS→PAPS+pNP，通过测量形成的代谢物pNP的量来检测和测量。
在一些实施例中，将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性可以是SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的所述活性的至少约1.5倍，或至少约1.8、或至少约1.9、或至少约2.0、或至少约2.2、或至少约2.5、或至少约3.0、或至少约3.2、或至少约3.5、或至少约4.0、或至少约4.5、或至少约5.0、或至少约5.5、或至少约6.0、或至少约6.5、或至少约7.0倍。与SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的活性相比的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的活性增加可以用如本文所述的比色法来测量。
将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性可以通过检测由磺基供体基团的转化产生的代谢物来测量，例如，检测pNPS转化产生的pNP。在这样的情况下，反应PAP+pNPS→PAPS+pNP中pNPS至pNP的转化速率提高相当于PAP至PAPS的转化速率提高。
如上所述，非天然存在的芳基磺基转移酶可以分离和纯化使用，或在重组宿主细胞(如重组大肠杆菌)内使用。适用于表达突变或野生型芳基磺基转移酶(如SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV)的细菌可以是大肠杆菌BL21 DE3。适合于反应的酶的量(无论以何种方式提供)可以是约30ng/μL。
当使用30ng/μL的酶时，足够量的pNPS和PAP可以分别为约1mM和约0.23mM。
为了发生催化酶反应，可以将反应介质置于范围为约20℃至约40℃、或约25℃至约37℃、或约30℃至约35℃的温度。例如，反应温度可以为约37℃。作为其他实例，反应温度可以为约40℃。
可以在催化反应开始后的不同时间段(例如0、10、30或90分钟)读取光密度(OD)或吸光度，以测量催化活性的速率。可以减去空白以归一化获得的测量值。空白可以是水或不含酶和底物的缓冲液。
本文披露的突变可通过使用本领域已知的任何方法引入酶中，如酶的定向诱变、PCR和基因混编方法或通过在定向诱变循环中使用多种诱变寡核苷酸。可以以定向或随机方式引入突变。因此，诱变方法产生编码一种或多种不同突变体的一种或多种多核苷酸。典型地，产生突变基因文库，该突变基因文库可用于产生突变酶文库，此后可根据下文披露的方法筛选该突变酶文库。可替代地，编码本文披露的突变酶的核酸可以使用本领域已知的任何基因合成方法获得。
芳基磺基转移酶突变体可以在从重组细胞中提取和纯化后或在用于产生其的重组细胞内进行筛选。
筛选方法可以使用在作为磺基供体基团的对硝基苯硫酸盐(pNPS)存在下3’,5’-磷酸腺苷(PAP)至3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸(PAPS)的转化。对硝基苯基(pNP)代谢物形成的测量可用于寻找增强的催化活性。
与野生型酶的催化活性相比至少1.3倍的催化活性增强可以用作参考阈值，以鉴定具有增强的目的催化活性的突变的芳基磺基转移酶。
可替代地，对应于本文披露的以及例如具有选自包含SEQ ID NO:5至23、25-35、41、45-47、和49-56的组的氨基酸序列的芳基磺基转移酶中的任一种的催化活性可用作参考阈值，以鉴定具有增强的目的催化活性的突变的芳基磺基转移酶。
在一些实施例中，筛选和/或选择非天然存在的突变的芳基磺基转移酶(该芳基磺基转移酶至少包含一个氨基酸取代突变并且具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性是SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的所述活性的至少1.3倍或至少基本上相同于或高于具有选自包含SEQ ID NO:5至23、25-35、41、45-47、和49-56的组的氨基酸序列的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的所述活性)的方法可以至少包括以下步骤：
a)使包含至少一个氨基酸取代突变的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶候选物与磺基供体在适用于将磺基从该磺基供体转移到PAP以获得PAPS的条件下接触，
b)检测PAPS的形成速率或量，
c)将步骤b)获得的PAPS的形成速率或量与用SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV获得的或用具有选自包含SEQ ID NO:5至23、25-35、41、45-47、和49-56的组的氨基酸序列的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶获得的参考速率或量进行比较，以及
d)选择任何非天然存在的突变的芳基磺基转移酶候选物，该候选物至少包含一个氨基酸取代突变并且具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性是SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的所述活性的至少1.3倍或至少基本上相同于或高于具有选自包含SEQ ID NO:5至23、25-35、41、45-47、和49-56的组的氨基酸序列的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的所述活性。
与SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的活性相比的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的活性增加可以用如本文所述的比色法来测量。
步骤b)中PAPS的形成速率或量的检测可以通过测量代谢物PAPS的量直接进行，通过测量待转化产物PAP的量间接进行。
可替代地，步骤b)中PAPS的形成速率或量的检测可以通过测量磺基供体基团(例如pNPS)的量，或通过测量磺基供体基团的代谢物(例如，pNP)的量来进行。
在一个实施例中，本文披露的方法可以使用磺基供体，如对硝基苯硫酸盐。
在一个实施例中，本文披露的方法将pNPS用作磺基供体基团，并且检测PAPS的形成速率或量的步骤b)通过检测从pNPS形成pNP的速率或量来间接进行。
在一些实施例中，本披露还涉及一种非天然存在的突变的芳基磺基转移酶，该芳基磺基转移酶至少包含一个氨基酸取代突变并且具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性是SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的所述活性的至少1.3倍或至少相同于具有选自包含SEQ ID NO:5至23、25-35、41、45-47、和49-56的组的氨基酸序列的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的所述活性，该活性通过如本文披露的方法鉴定。
用于硫酸化底物的用途和方法
硫酸化
在一些实施例中，本披露涉及如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶用于硫酸化底物的用途。
在一些实施例中，本披露涉及一种硫酸化底物的方法，该方法至少包括使待硫酸化的底物与a)如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶和b)磺基供体在适用于将磺基从该磺基供体转移到所述底物的条件下接触的步骤。
本披露的用途或方法可以将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)。
本披露的用途或方法可以是合成肝素。
如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶包含选自6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263、及其组合的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代，其中该氨基酸位置是相对于大鼠芳基磺基转移酶IV的氨基酸序列SEQ ID NO:1，并且包含与氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，条件是当所述芳基磺基转移酶是该大鼠芳基磺基转移酶IV时，突变不是F138A和/或Y236A。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性是SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的所述活性的至少约1.3倍。
非天然存在的突变的芳基磺基转移酶包含选自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263、及其组合的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代，其中该氨基酸位置是相对于大鼠芳基磺基转移酶IV的氨基酸序列SEQ ID NO:1，并且包含与氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述非天然存在的突变的芳基磺基转移酶具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性是SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的所述活性的至少约1.3倍。
可替代地，在一些实施例中，在本文披露的用途和方法中，如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶可以具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性至少基本上类似于或高于SEQ ID NO:5至23、25-35、41、45-47、和49-56的突变的芳基磺基转移酶中的至少一种的催化活性。
如本文披露的用于硫酸化底物的方法可以至少包括使所述待硫酸化的底物与：
a)如本文披露的非天然存在的突变的芳基磺基转移酶，和
b)磺基供体在适用于将磺基从该磺基供体转移到所述底物的条件下接触的步骤。
该方法可以进一步包括回收(retrieving)硫酸化底物的步骤。
待硫酸化的底物可以选自包含以下的组：3',5'-二磷酸腺苷(PAP)、多糖、乙酰肝素、硫酸肝素前体、或硫酸化肝素。
本披露涉及一种通过用至少一种磺基转移酶和PAPS硫酸化底物来获得硫酸化底物的方法，所述方法至少包括一个通过使PAP与非天然存在的突变的芳基磺基转移酶接触来将所述PAP转化为PAPS的步骤，该芳基磺基转移酶包含(1)选自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263、及其组合的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代，其中该氨基酸位置是相对于大鼠芳基磺基转移酶IV的氨基酸序列SEQ ID NO:1，和(2)与SEQID NO:1具有至少60％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
根据特定实施例，将PAP转化为PAPS的步骤与硫酸化步骤同时进行。
根据另一实施例，将PAP转化成PAPS的步骤和硫酸化步骤是连续的。
本披露涉及一种用磺基转移酶和PAPS硫酸化底物的方法，该方法在适合将磺基从PAPS转移到待硫酸化的底物并获得硫酸化底物和PAP的条件下进行，该方法至少包括通过以下来将如此获得的PAP转化为PAPS的步骤：使该PAP与
(i)非天然存在的突变的芳基磺基转移酶，该芳基磺基转移酶包含(1)选自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263、及其组合的组的氨基酸位置的至少一个氨基酸取代突变，其中该氨基酸位置是相对于SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV，和(2)与SEQ ID NO:1具有至少60％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，以及
(ii)磺基供体
在适用于将该磺基从该磺基供体转移到PAP以获得PAPS的条件下接触。
本披露涉及一种用于硫酸化底物的方法，该方法至少包括以下步骤：
a)在适合将磺基从PAPS转移到待硫酸化的底物并获得硫酸化底物和PAP的条件下用磺基转移酶和PAPS硫酸化底物，以及
b)通过以下来将步骤a)获得的PAP转化为PAPS：使该PAP与
(i)非天然存在的突变的芳基磺基转移酶，该芳基磺基转移酶包含(1)选自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263、及其组合的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代，其中该氨基酸位置是相对于大鼠芳基磺基转移酶IV的氨基酸序列SEQ IDNO:1，和(2)与氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，和
(ii)磺基供体
在适用于将该磺基从该磺基供体转移到PAP以获得PAPS的条件下接触。
这些方法可以进一步包括回收如此形成的硫酸化底物的步骤。
本文披露的方法可以用于将PAP回收为PAPS，并且可以至少包括使所述PAP与：
a)非天然存在的突变芳基磺基转移酶，该非天然存在的突变芳基磺基转移酶包含(i)选自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263、及其组合的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代，其中该位置是相对于大鼠芳基磺基转移酶IV的氨基酸序列SEQ ID NO:1，和(ii)与氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，以及
b)磺基供体在适用于将磺基从该磺基供体转移到PAP以获得PAPS的条件下接触的步骤。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的序列可以与SEQ ID NO:1的整个序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、或99％同一性。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的序列可以与SEQ ID NO:1的整个序列具有至少85％、90％、95％、或99％同一性。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的序列可以与SEQ ID NO:1的整个序列具有至少90％、95％、或99％同一性。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的序列可以与SEQ ID NO:1的整个序列具有至少90％同一性。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的序列可以与SEQ ID NO:1的整个序列具有至少95％同一性。
在一些实施例中，非天然存在的突变的芳基磺基转移酶的序列可以与SEQ ID NO:1的整个序列具有至少99％同一性。
如本文披露的方法可以用于合成肝素。
当用于硫酸化底物的方法包括用如本文披露的突变的芳基磺基转移酶将PAP转化为PAPS时，用于硫酸化底物的磺基转移酶可以不同于突变的芳基磺基转移酶。底物的硫酸化可以用O-磺基转移酶(OST)(如例如2-OST、3-OST、3-OST-1、3-OST-3、6-OST、6-OST-1、6-OST3)或N-磺基转移酶(如NDST1、NDST2)进行。
底物硫酸化步骤和将PAP转化为PAPS的步骤可以在一锅反应中依次或同时进行。
将PAP转化为PAPS的步骤可以包括提供包含PAP、如本文披露的芳基磺基转移酶和磺基供体的反应混合物。
在一些实施例中，本文披露的方法的底物硫酸化步骤可以包括多个子步骤：a1)、a2)、a3)、…，在此期间，底物可能经历连续的酶催化反应。这些反应可以是底物内不同位置的硫酸化，由不同的磺基转移酶使用PAPS作为磺基供体基团进行。不同的磺基转移酶可能是例如不同的OST。其中发生硫酸化的每个子步骤a1)、a2)、a3)、…可能与将PAP转化为PAPS的单个步骤或多个相关的子步骤b1)、b2)、b3)、…相关，在此期间，由不同硫酸化步骤产生的PAP通过如本文披露的突变的芳基磺基转移酶转化为PAPS。
在一些实施例中，底物硫酸化步骤可以包括多个同时或连续的子步骤a1)、a2)、a3)、…、an)，并且其中至少两个子步骤各自包括使用PAPS作为磺基供体、由磺基转移酶催化的硫酸化，以获得PAP和硫酸化底物。
在一些实施例中，将PAP转化成PAPS的步骤可以包括单个步骤或多个同时或顺序的子步骤b1)、b2)、b3)、…、bn)，并且其中每个子步骤a1)、a2)、a3)(在此期间发生使用PAPS的、磺基转移酶催化的硫酸化)获得的PAP被转化为PAPS。
本披露的一方面涉及一种可用于多糖底物硫酸化方法中的PAPS再生系统。PAPS再生系统可以在将PAP转化为PAPS的步骤中使用。该方法可以是其中多糖底物的硫酸化由磺基转移酶(如一种或多种OST)催化的类型，其中3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸(PAPS)转化为3′,5′-二磷酸腺苷(PAP)。硫酸化过程可以与PAPS再生系统偶联使用，允许从3′,5′-二磷酸腺苷酶促再生3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸。酶促再生系统采用如本文披露的突变的非天然存在的芳基磺基转移酶和芳基硫酸盐(作为底物)。
在如本文披露的PAPS再生系统中，可以将突变的非天然存在的芳基磺基转移酶接枝至支持物上。合适的支持物可以是珠、板、纤维素片。因此，反应器皿可以含有反应混合物，该反应混合物包含待硫酸化的底物、不同于如本文披露的突变的芳基磺基转移酶的一种或多种磺基转移酶、以及作为磺基供体基团的PAPS，并且将突变的芳基磺基转移酶接枝至支持物，以允许连续将PAP转化为PAPS。
如本文披露的突变的芳基磺基转移酶可以根据本领域任何已知的方法共价或非共价地接枝至合适的支持物。
将磺基转移酶催化的硫酸化反应与如本文披露的PAPS再生系统偶联可以提供直接从PAP产生在反应中使用的PAPS的另一个优势。即，可以配制反应混合物以在向反应混合物中添加磺基转移酶之前或同时将PAP与PAPS再生系统组合。然后突变的芳基磺基转移酶可以从PAP产生PAPS以供磺基转移酶使用，从而减轻向反应混合物提供任何更昂贵和不稳定的PAPS的需要。
时间和温度
如本文披露的突变的芳基磺基转移酶可以与PAP和磺基供体基团接触足以催化通过如本文披露的芳基磺基转移酶利用磺基供体作为底物从PAP产生PAPS的时间段，如例如约1分钟至约90分钟、约10分钟至约30分钟的时间段。
在一些实施例中，如本文披露的突变的芳基磺基转移酶可以与PAP和磺基供体基团接触与在工业放大过程中通过芳基磺基转移酶从PAP产生PAPS兼容的时间段，如约2小时、或约3小时、或约6小时、或约12小时、或约24小时、或约48小时、或约72小时。
反应温度可以为约20℃至约40℃、或约25℃至约37℃、或约30℃至约35℃。例如，反应温度可以为约37℃。作为其他实例，反应温度可以为约40℃。
磺基供体
磺基供体可以是芳基硫酸盐化合物。芳基硫酸盐化合物可以是对硝基苯硫酸盐(pNPS)。
底物
在用于硫酸化底物的方法(其中如本文披露的突变的芳基磺基转移酶用于将PAP转化为PAPS)中，待硫酸化的底物可以选自包含以下的组：多糖、乙酰肝素、硫酸肝素前体、化学脱硫的N-硫酸化(CDSNS)肝素、糖胺聚糖(GAG)、硫酸乙酰肝素或硫酸化肝素。
在反应混合物孵育之前，可以将多糖底物部分硫酸化。在一些实施例中，硫酸化多糖是糖胺聚糖(GAG)，如例如硫酸乙酰肝素(HS)。在一些实施例中，硫酸化多糖是HS，其为抗凝活性HS、抗凝血酶结合HS、成纤维细胞生长因子(FGF)结合HS、单纯疱疹病毒包膜糖蛋白D结合HS或具有这些特性的组合。
在一些实施例中，待硫酸化的底物可进一步经历至少一种另外的酶催化反应的硫酸化。这一或这些另外的反应可以在硫酸化之前或之后进行。
待硫酸化的底物可以是先前N,O-脱硫和再-N-硫酸化多糖的多糖底物，如例如化学脱硫的N-硫酸化(CDSNS)肝素。例如，多糖(如CDSNS)可以在PAPS存在下与特定OST反应以产生硫酸化多糖中间产物，然后该中间产物可以随后在PAPS存在下与不同OST反应以在不同位置进一步硫酸化多糖。此多糖底物与不同OST反应的连续过程可以持续进行，直到产生表现所需生物活性的最终多糖。然后，由每个连续硫酸化步骤产生的PAP可以在单个步骤中或在连续步骤期间(例如在每个硫酸化步骤之后)转化为PAPS
本文披露的硫酸化方法允许通过选择合适的磺基转移酶并通过顺序控制那些磺基转移酶向反应系统的添加以促进多糖硫酸化的适当时机来产生多种具有不同生物活性的硫酸化多糖，如硫酸乙酰肝素分子。例如，可以合成的具有特定生物活性的硫酸乙酰肝素包括抗凝硫酸乙酰肝素、肝素、成纤维细胞生长因子2结合活性、单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)结合HS和成纤维细胞生长因子2(FGF2)受体结合HS。这些具有生物活性的硫酸乙酰肝素分子中每一个的合成均只需两个或三个酶促步骤。因此，由于高产率的PAPS再生系统，本文披露的方法为大规模合成多种具有特定活性的硫酸乙酰肝素提供了高效且有效的方法。
在一些实施例中，硫酸化多糖底物可以是糖胺聚糖(GAG)。GAG是体内最丰富的杂多糖。这些分子是含有重复二糖单元的长无支链多糖。二糖单元可以含有以下两种经修饰的糖中的任一种：N-乙酰半糖胺(GalNAc)或N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和糖醛酸如葡糖醛酸盐或艾杜糖醛酸盐。GAG是带高负电荷的分子，具有赋予溶液高粘度的延展构象。GAG的高粘度带来了低压缩性，这使得这些分子成为关节润滑液的理想选择。同时，其刚性为细胞提供了结构完整性，并提供了细胞之间的通道，允许细胞迁移。具有生理意义的特定GAG是透明质酸、硫酸皮肤素、硫酸软骨素、肝素、硫酸乙酰肝素(肝素)、和硫酸角质素。因此，在一些实施例中，硫酸化多糖产物是HS。在一些实施例中，硫酸化多糖产物是抗凝活性HS、抗凝血酶结合HS、FGF结合HS和HSV gD结合HS。
肝素合成
在一些实施例中，本文披露的主题提供了一种合成肝素化合物的方法。
肝素被称为硫酸乙酰肝素，是一种高度酸性的线性多糖，其具有非常可变的结构，具有抗凝活性。因此，本文披露的主题提供了一种合成具有抗凝活性的肝素、低分子量肝素(如重均分子量为4000至6000的低分子量肝素，由于其副作用(如出血)较少而被越来越多地使用)、或硫酸乙酰肝素的方法；肝素、低分子量肝素、硫酸乙酰肝素和硫酸乙酰肝素前体通常称为肝素化合物或肝素。
用于合成肝素的方法可以包括通过用至少一种磺基转移酶和PAPS硫酸化肝素前体来获得硫酸化肝素前体，所述方法至少包括一个通过使PAP与非天然存在的突变的芳基磺基转移酶接触来将所述PAP转化为PAPS的步骤，该芳基磺基转移酶包含(1)选自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263、及其组合的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代，其中该位置是相对于大鼠芳基磺基转移酶IV的氨基酸序列SEQ ID NO:1，和(2)与氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少60％序列同一性的氨基酸序列。
用于合成肝素的方法可以包括在适合将磺基从PAPS转移到待硫酸化的肝素前体并获得肝素前体和PAP的条件下用磺基转移酶和PAPS硫酸化肝素前体，通过以下来将如此获得的PAP转化为PAPS：使该PAP与
(i)非天然存在的突变的芳基磺基转移酶，该芳基磺基转移酶包含(1)选自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263、及其组合的组的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代，其中该位置是相对于大鼠芳基磺基转移酶IV的氨基酸序列SEQ ID NO:1，和(2)与氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，以及
(ii)磺基供体
在适用于将该磺基从该磺基供体转移到PAP以获得PAPS的条件下接触。
肝素前体可以用作本发明的用于合成肝素的方法的多糖原料。肝素前体是一种由葡糖醛酸(GlcA)残基和N-乙酰基-D-葡糖胺(GlcNAc)残基组成的二糖重复结构组成的多糖[→4)-β-D-GlcA-(1→4)-α-D-GlcNAc-(1→]。肝素前体可以例如通过利用具有产生肝素前体的能力的细菌的发酵法来产生。
在一些实施例中，本文披露的用于合成肝素的方法可以使用肝素前体(heparosan)作为肝素前体(heparin precursor)。肝素可以通过使肝素前体作为起始材料经历包括N-脱乙酰化、N-硫酸化、C5-差向异构化、2-O-硫酸化、6-O-硫酸化、3-O-硫酸化的不同步骤来产生。肝素可以通过使肝素前体经历这些步骤中的一个、几个或全部，或者这些步骤中的一些或所有这些步骤的组合来产生。用于产生肝素的方法可以进一步包括解聚步骤。肝素产生过程中的步骤的实施顺序没有特别限制，只要能够获得具有所需特性的肝素即可。
在本文披露的用于合成肝素的方法中，这些步骤可以化学地或酶促地进行，或者可以是化学和酶促进行的步骤之间的组合。酶促步骤可以是例如N-硫酸化、2-O-硫酸化酶促步骤、3-O-硫酸化酶促步骤、6-O-硫酸化酶促步骤或这些步骤的连续或组合。这样的酶促步骤可以通过使用例如N-磺基转移酶(如NDST1或NDST2)、O-磺基转移酶(OST)(如例如，2-OST、3-OST、3-OST-1、3-OST-3、6-OST、6-OST-1、6-OST-3)来进行。根据本文披露的方法合成肝素的酶促步骤可以通过多于一种磺基转移酶或通过一种或多种磺基转移酶与另一种酶之间的组合(例如2-OST和C5差向异构酶)来进行。如本文披露的方法包括用一种磺基转移酶和PAPS的至少一个步骤，包括通过使PAP与根据本发明的非天然存在的芳基磺基转移酶接触来将所述PAP转化为PAPS的至少一个步骤。
用于合成肝素的方法可以进一步包括另外的酶催化反应。
用于合成肝素的方法可以包括：
-提供糖底物；将糖底物延长为所需或预定长度的糖；进行差向异构化反应；和用磺基转移酶和作为磺基供体基团的PAPS进行一次或多次硫酸化反应，从而合成肝素化合物，以及
-通过使PAP与如本文披露的突变的非天然存在的芳基磺基转移酶和磺基供体在适用于将磺基从磺基供体转移到PAP以获得PAPS的条件下接触来将步骤a)获得的PAP转化为PAPS。
在一些实施例中，本文披露的主题提供了一种合成肝素化合物的方法，该方法至少包括由以下组成的步骤：
-提供二糖底物；将二糖底物延长为四糖；将四糖延长为六糖或七糖，其中该六糖或七糖包含N-磺基转移酶底物残基；将六糖或七糖上的N-磺基转移酶底物残基转化为N-磺基葡糖胺(GlcNS)残基；进行差向异构化反应；和进行一种或多种硫酸化反应(选自由N-硫酸化反应、2-O-硫酸化反应、6-O-硫酸化反应、3-O-硫酸化反应(至少与作为磺基供体基团的3'-磷酸腺苷5'-磷酰硫酸(PAPS)接触)及其组合组成的组)，由此合成肝素化合物和PAP，以及
-通过使PAP与如本文披露的突变的非天然存在的芳基磺基转移酶和磺基供体在适用于将磺基从磺基供体转移到PAP以获得PAPS的条件下接触来将步骤a)获得的PAP转化为PAPS。
可以使用酶N-乙酰葡糖胺基转移酶和肝素前体合酶-2，以及底物葡糖醛酸(GlcUA)和N-三氟乙酰葡糖胺(GlcNTFA)将二糖底物延长为四糖。
可以使用酶N-乙酰葡糖胺基转移酶和肝素前体合酶-2，以及底物葡糖醛酸(GlcUA)、N-三氟乙酰葡糖胺(GlcNTFA)、和N-乙酰化葡糖胺(GlcNAc)将四糖延长为七糖。
可以使用糖基转移酶将六糖延长为七糖。糖基转移酶可以是N-乙酰葡糖胺基转移酶。在另一方面，N-磺基转移酶底物残基是N-三氟乙酰葡糖胺(GlcNTFA)残基。
可以使用N-磺基转移酶(NST)、3'-磷酸腺苷5'-磷酰硫酸(PAPS)、三乙胺、CH3OH、和H2O将七糖上的N-三氟乙酰葡糖胺(GlcNTFA)残基转化为N-磺基葡糖胺(GlcNS)残基。
可以使用C5-差向异构酶(C5-epi)将七糖差向异构化。
可以使用2-O-磺基转移酶(2-OST)和3'-磷酸腺苷5'-磷酰硫酸(PAPS)将七糖硫酸化。
可以使用6-O-磺基转移酶(6-OST)和3'-磷酸腺苷5'-磷酰硫酸(PAPS)将七糖硫酸化。
并且可以使用3-O-磺基转移酶(3-OST)和3'-磷酸腺苷5'-磷酰硫酸(PAPS)将七糖硫酸化。
由以下非限制性实例来进一步理解本发明。提供以下实例来详细描述本发明的一些代表性的、目前优选的方法和材料。提供这些实例是为了说明本发明构思的目的，并且不旨在限制由所附权利要求限定的本发明的范围。
[实例]
实例1：芳基磺基转移酶突变体的制备
大鼠芳基磺基转移酶IV(AST-IV-EC 2.8.2.9)的突变体通过基因合成获得并根据制造商的建议使用CODEX DNA公司的自动化系统BioXpTM3200克隆至pET-Duet载体。
制备以下AST IV突变体：
单突变体：
Var01(I17F)-SEQ ID NO:5，
Var04(F20L)-SEQ ID NO:6，
Var03(F20I)-SEQ ID NO:7，
Var05(F138H)-SEQ ID NO:8，
Var06(Y236F)-SEQ ID NO:9，
Var07(M244N)-SEQ ID NO:10，
Var02(I17Y)-SEQ ID NO:11，
Var08(I239D)-SEQ ID NO:12，
Var09-01(P6Q)-SEQ ID NO:14，
Var09-02(P7D)-SEQ ID NO:15，
Var09-03(L8A)-SEQ ID NO:16，
Var09-04(V9G)-SEQ ID NO:17，
Var09-05(V11L)-SEQ ID NO:18，
Var09-06(W33R)-SEQ ID NO:19，
Var09-07(K62D)-SEQ ID NO:20，
Var09-08(A97S)-SEQ ID NO:21，
Var09-09(N195D)-SEQ ID NO:22，和
Var09-10(T263H)-SEQ ID NO:23。
多重突变体：
Var09，包含10个组合的突变：P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-W33R-K62D-A97S-N195D-T263H-SEQ ID NO:13。
“Var09-P6Q”，包含9个组合的突变：P7D-L8A-V9G-V11L-W33R-K62D-A97S-N195D-T263H-SEQ ID NO:24。去除突变P6Q。
“Var09-P7D”，包含9个组合的突变：P6Q-L8A-V9G-V11L-W33R-K62D-A97S-N195D-T263H-SEQ ID NO:24。去除突变P7D。
“Var09-L8A”，包含9个组合的突变：P6Q-P7D-V9G-V11L-W33R-K62D-A97S-N195D-T263H-SEQ ID NO:26。去除突变L8A。
“Var09-V9G”，包含9个组合的突变：P6Q-P7D-L8A-V11L-W33R-K62D-A97S-N195D-T263H-SEQ ID NO:27。去除突变V9G。
“Var09-V11L”，包含9个组合的突变：P6Q-P7D-L8A-V9G-W33R-K62D-A97S-N195D-T263H-SEQ ID NO:28。去除突变V11L。
“Var09-W33R”，包含9个组合的突变：P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-A97S-N195D-T263H-SEQ ID NO:29。去除突变W33R。
“Var09-K62D”，包含9个组合的突变：P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-W33R-K62D-A97S-N195D-T263H-SEQ ID NO:30。去除突变K62D。
“Var09-A97S”，包含9个组合的突变：P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-W33R-K62D-N195D-T263H-SEQ ID NO:31。去除突变A97S。
“Var09-N195D”，包含9个组合的突变：P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-W33R-K62D-A97S-T263H-SEQ ID NO:32。去除突变N195D。
“Var09-T263H”，包含9个组合的突变：P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-W33R-K62D-A97S-N195D-SEQ ID NO:33。去除突变T263H。
“Var09-K62D-T263H”，包含8个组合的突变：P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-W33R-A97S-N195D-SEQ ID NO:34。去除突变K62D和T263H。
“Var09-K62D-N195D-T263H”，包含7个组合的突变：P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-W33R-A97S-SEQ ID NO:35。去除突变K62D、N195D和T263H。
“Var09+I17F”，包含11个组合的突变：P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-I17F-W33R-K62D-A97S-N195D-T263H-SEQ ID NO:36。
“Var09+I17Y”，包含11个组合的突变：P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-I17Y-W33R-K62D-A97S-N195D-T263H-SEQ ID NO:37。
“Var09+F20I”，包含11个组合的突变：P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-F20I-W33R-K62D-A97S-N195D-T263H-SEQ ID NO:38。
“Var09+F20L”，包含11个组合的突变：P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-F20L-W33R-K62D-A97S-N195D-T263H-SEQ ID NO:39。
“Var09+F138H”，包含11个组合的突变：P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-W33R-K62D-A97S-F138H-N195D-T263H-SEQ ID NO:40。
“Var09+Y236F”，包含11个组合的突变：P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-W33R-K62D-A97S-Y236F-N195D-T263H-SEQ ID NO:41。
“Var09+I239D”，包含11个组合的突变：P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-W33R-K62D-A97S-I239D-N195D-T263H-SEQ ID NO:42。
“Var09+M244N”，包含11个组合的突变：P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-W33R-K62D-A97S-N195D-M244N-T263H-SEQ ID NO:43。
Var5A，包含5个组合的突变：P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-SEQ ID NO:44。
Var5B，包含5个组合的突变：W33R-K62D-A97S-N195D-T263H-SEQ ID NO:45。
“Var5A+W33R”，包含6个组合的突变：P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-W33R-SEQ ID NO:46。
“Var5A+K62D”，包含6个组合的突变：P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-K62D-SEQ ID NO:47。
“Var5A+A97S”，包含6个组合的突变：P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-A97S-SEQ ID NO:48。
“Var5A+N195D”，包含6个组合的突变：P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-N195D-SEQ ID NO:49。
“Var5A+T263H”，包含6个组合的突变：P6Q-P7D-L8A-V9G-V11L-T263H-SEQ ID NO:50。
“Var5B+P6Q”，包含6个组合的突变：P6Q-W33R-K62D-A97S-N195D-T263H-SEQ IDNO:51。
“Var5B+P7D”，包含6个组合的突变：P7D-W33R-K62D-A97S-N195D-T263H-SEQ IDNO:52。
“Var5B+L8A”，包含6个组合的突变：L8A-W33R-K62D-A97S-N195D-T263H-SEQ IDNO:53。
“Var5B+V9G”，包含6个组合的突变：V9G-W33R-K62D-A97S-N195D-T263H-SEQ IDNO:54。
“Var5B+V11L”，包含6个组合的突变：V11L-W33R-K62D-A97S-N195D-T263H-SEQ IDNO:55。
将大肠杆菌BL21 DE3细胞用获得的编码不同突变体和野生型AST IV(SEQ ID NO:1)的质粒转化。将2μL克隆质粒(1/10稀释)与40体积的BL21电感受态细胞混合，然后进行电穿孔。简而言之，将40μl细胞与2μl DNA混合，并转移到电穿孔比色皿中。电穿孔装置是根据制造商建议使用的伯乐公司(BioRad)的Gene pulser XCell电穿孔系统。
将转化的细胞用950μL SOC培养基(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisherScientific))重悬。将200μL重悬液铺板在适当的抗生素(氨苄青霉素，100mg/L LB板)琼脂板上。
为了产生野生型酶和AST-IV的不同突变体，将转化的大肠杆菌BL21 DE3细胞在TB培养基(很好的肉汤培养基(Terrific Broth medium)-赛默飞世尔科技公司(0002123806))中在37℃生长直至OD600 nm达到0.5(使用赛默科技公司(ThermoScientific)的Genesys 10Bio测量)，然后通过向生长培养基中添加1mM ITPG并将细菌培养物在25℃维持24小时来诱导突变体的产生。
然后收获表达野生型酶和突变酶的细胞，用磷酸盐缓冲液洗涤并冷冻在-80℃直至酶活性分析。
实例2：芳基磺基转移酶突变体催化活性的分析
材料和方法
为了测试芳基磺基转移酶活性，已开发了比色法来测量通过根据以下方案反应，将硫酰基基团从对硝基苯硫酸盐(pNPS)转移到3’,5’-磷酸腺苷(PAP)以产生3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)而释放的对硝基苯基(pNP)的量：
PAP+pNPS→PAPS+pNP
对于测试，将10μL的OD600 nm＝100(相当于30ng/μL酶)的、表达一种突变体的大肠杆菌BL21 DE3细胞(如实例1中制备的)与以下(最终浓度)一起孵育：
pNPS1mM；
PAP 0.23mM；
pH 7.0的磷酸盐缓冲液；以及
10％的甘油。
表达野生型AST IV(EC 2.8.2.9)的大肠杆菌BL21 DE3细胞用作对照。
将反应混合物进一步在37℃孵育，并根据制造商的建议用来自美谷分子仪器公司的190在10、30或90分钟在404nm处测量光密度(OD)。
作为阴性对照，为每种酶制剂添加无PAP添加的反应混合物样品。
突变体的酶活性以404nm处任意吸光度单位的pNP产量表示。减去空白以归一化结果。
结果
在第一系列实验中，非突变(野生型)芳基磺基转移酶IV(AST IV)和不同突变体Var01至Var09在10分钟和30分钟的酶活性。结果呈现于图1A和1B上。
非突变的芳基磺基转移酶IV(AST IV)和不同突变体Var09-01至Var09-10和Var09在90分钟的酶活性呈现于图2上。
如图所示，与野生型AST IV酶相比，突变体具有与野生型酶活性相比至少约1.3倍的酶活性增加。
图1A显示，反应开始后10分钟，单突变体Var01至Var08的酶活性是野生型酶活性的至少2倍。此外，与野生型酶的活性相比，突变体Var05的酶活性增加到4倍，突变体Var01、Var02、Var06、Var07和Var08的酶活性增加到5倍。
与野生型酶相比，多重突变体Var09的酶活性增加到至少8倍。
这些结果表明，与野生型酶相比，所鉴定的突变体具有增加的催化效率。
图1A显示，反应开始后30分钟，单突变体Var01至Var08的酶活性增加到野生型酶活性的约1.4倍至约1.9倍。多重突变体Var09的酶活性增加到野生型酶活性的至少约3倍。
这些结果表明，与野生型酶相比，所鉴定的突变体具有增加的催化速率。
图2显示，反应开始后90分钟，多重突变体Var09的酶活性增加到野生型酶活性的至少约7倍。单突变体Var09-01至Var09-10的酶活性增加到野生型酶活性的约1.3倍至约2.0-2.2倍。值得注意的是，与野生型相比，Var09-01和Var09-07的酶活性增加到约1.4，并且与野生型酶的活性相比，Var09-02、Var09-03、Var09-04、Var09-06、Var09-08、Var09-09和Var09-10的酶活性增加到约1.8至约2.2倍。
这些结果表明，与野生型酶相比，Var09的突变(单独或组合)诱导催化速率增加。
在第二系列实验中，使用不同构建体(其中去除了Var09的一个、两个或三个取代)探索了Var09的组合突变的重要性。
在反应开始后10分钟，如上先前详述地测量突变体的催化活性。结果呈现于图3上。如图3所示，除了Var09-P6Q(去除取代P6Q的突变体Var09)和Var09-N195D之外，所有突变体都保持了高于野生型酶但低于Var09的活性。不同的取代似乎都在一定程度上有助于增加Var09的催化活性。此外，其似乎共同合作以增强催化活性。
取代P6Q的去除降低了含有Var09的其他取代的突变体的催化活性，该催化活性低于野生型酶的活性(图3)。单独实施P6Q取代(Var09-01；图2)导致催化活性增加，但是以适度的方式。因此，看来P6Q与其他突变积极合作，并且可以比其他突变做出更多贡献，以强烈增加Var09AST IV的催化活性。
取代N195D的去除增强了含有Var09的其他取代的突变体的催化活性，该催化活性高于突变体Var09的活性(图3)。单独实施N195D取代(Var09-09；图2)导致与野生型酶相比催化活性显著增加。因此，看来当与Var09的其他取代组合时，N195D与其他突变负向合作，导致突变的AST IV的催化活性降低。
去除2个(K62D和T263H)或3个(K62D、N195D和T263H)取代导致突变体与野生型ASTIV酶相比具有增强的催化活性，但低于Var09。有趣的是，在已去掉K62D和T263H的突变体中去除N195D不会导致酶活性的显著增加，这表明N195D与如上所述的其他突变的负合作不适用于K62D和T263H组合。值得注意的是，当单独实施时，与野生型酶相比，每个取代K62D、N195D和T263H均导致酶活性显著增加(参见图2的Var09-07、Var09-09和Var09-10)。
这些结果综合起来表明，Var09中的每个取代在单独使用时能增加酶活性，但倾向于彼此合作以进一步增强酶活性。除Var09和Var09-N195D之外，图3结果还显示AST的几个多重突变体表现出高于野生型酶活性的酶活性(Var09-L8A、Var09-A97S、Var09-K62D、Var09-K62D-T263H、Var09-W33R、Var09-V11L、Var09-V9G、Var09-K62D-N195D-T263H、Var09-T263H)。
在另一组实验中，单一取代Var01至Var08中的每个与Var09组合，以给出“Var09+I17F”、“Var09+I17Y”、“Var09+F20I”、“Var09+F20L”、“Var09+F138H”、“Var09+Y236F”、“Var09+I239D”和“Var09+M244N”。
酶催化活性的结果呈现于图4上。在测试的突变体中，Var09与Y236F的10个取代的组合导致远高于Var09酶的强活性增加，表明该位置的突变与其他突变正合作以增加酶活性。
对于酶的构象，位置6、7、8、9和11的突变随机分布在3-D构象上，并且可以在蛋白质结构上产生小的重排，以促进更好的活性，而位置33、62、97、195和263的突变位于3-D构象的表面，可以影响蛋白质的热稳定性。因此，通过构建以下两个突变体探讨了这两类突变的影响(针对其对酶的影响)：包含表面突变(W33R、K62D、A97S、N195D、和T263H)的Var5B和包含其他突变(P6Q、P7D、L8A、V9G、和V11L)的Var5A。此后，每个新的突变体都用于构建一系列突变体(其中添加了每个其他突变之一)：一方面是Var5A+W33R、Var5A+K62D、Var5A+A97S、Var5A+N195D和Var5A+T263H，另一方面是Var5B+P6Q、Var5B+P7D、Var5B+L8A、Var5B+V9G、和Var5B+V11L。如先前所述测量了这组新突变体的催化活性，并将其与野生型酶和Var09突变体进行比较。结果呈现于图5上。
结果表明，表面突变的组合增加了催化活性，并且添加其他突变具有轻微的正作用或相当中性的作用。5A突变的组合具有轻微的负作用，其可以通过添加位置33或62、195、263的其他突变来挽救，其中突变K62d和W33R具有最强的正作用。
与野生型酶相比，本文披露的芳基磺基转移酶突变体具有增加的酶速率和酶效率。因此，这样的突变体可用于将PAP转化或回收为PAPS。这些突变体可以有利地用于需要PAPS作为底物的酶促过程，例如硫酸化多糖(例如肝素)的酶促生产，以有效地转化或回收PAPS中的PAP并确保维持这样的酶促过程的高速率和效率。
实例3：芳基磺基转移酶突变体热稳定性的分析
材料和方法
为了测试芳基磺基转移酶热稳定性，使用带有CFX96光反应模块的伯乐公司(Bio-Rad)的C1000 Touch热循环仪实施热位移测定(Thermo Shift Assay)。用伯乐公司的软件CFX Maestro获得每个变体的熔点，以分析计算d(荧光)/dT的结果。
对不同的芳基磺基转移酶突变体和野生型酶应用从15℃(15秒期间)至100℃的温度梯度，每5秒增加+0.5℃。
使用的反应混合物如下：
酶20μg
磷酸钠缓冲液pH 7.0 50mM
甘油 10％
Sypro橙 1x
结果
在另一组实验中，通过热位移测定测量了简单变体W33R、K62D、A97S、N195D、和T263H(变体5B的组成部分)的熔点，以确定其各自的热稳定性作用。结果呈现于下表4。大多数变体各自的熔点均显示1℃至3℃的低但显著的提高。与野生型酶相比，变体Var5B显示熔点提高6℃，这显然受益于这些突变对热稳定性的个体正作用。
结果呈现于下表4中。
表4：氨基酸取代对大鼠芳基磺基转移酶热稳定性的影响
如表4中所示，与野生型酶相比，单独或组合的氨基酸取代使突变酶的热稳定性提高至少1℃至高达6℃。
可以在更高的孵育温度下使用更热稳定的酶来进行酶反应，例如用于将PAP转化为PAPS，这可以加速反应速率。这可以有利地用于生物过程系统中，例如用于硫酸肝素前体的硫酸化，例如用于肝素生产，以提高将PAP回收为PAPS的速率。这可以进一步提高反应产率并进一步降低生产成本。
实例4：芳基磺基转移酶突变体在偶联反应中的活性
材料与方法
实施了间接测量N-硫酸化肝素前体(NS肝素前体)的用2O-磺基转移酶和C5-差向异构酶的硫酸化偶联反应中芳基磺基转移酶PAPS回收活性的测试。首先纯化几种芳基磺基转移酶突变体，然后将其添加到如下反应介质中。
酶纯化方法
如实例1中详述的，AST-IV酶(野生型和突变体)、C5差向异构酶(D-葡萄糖醛酸基C5-差向异构酶；来自斑马鱼(Danio rerio)的EC:5.1.3.17，如Yi Qin等人,J Biol Chem.[生物化学杂志]2015年2月20日；290(8):4620-4630.doi:10.1074/jbc.M114.602201.2015年1月7日电子出版中引用的)和2-OST(硫酸乙酰肝素2-O-磺基转移酶1；EC:2.8.2.-来自长尾仓鼠(Cricetulus longicaudatus)，如M.Kobayashi等人J Biol Chem.[生物化学杂志]1996年3月29日；271(13):7645-53.doi:10.1074/jbc.271.13.7645中引用的)通过基因合成获得，克隆至pET-Duet载体中并在大肠杆菌BL21DE3细胞中产生。
将酶在Ni-NTA树脂上纯化。首先用50mM磷酸钠pH7、20mM咪唑平衡缓冲液平衡Ni-NTA。将细菌的酶裂解物施加到树脂上，并在4℃在转轮上孵育过夜。将Ni-NTA树脂用50mM磷酸钠pH7、20mM咪唑洗涤缓冲液洗涤3次。在4℃在转轮上添加50mM磷酸钠pH7、250mM咪唑洗脱缓冲液2小时。将洗脱液用Amicon Ultra(截留分子量10kDa)在50mM磷酸钠pH7、10％甘油缓冲液中透析，并保存在-80℃。
测试的芳基磺基转移酶突变体是：“Var09”(SEQ ID NO:13)、“Var09-N195D”(SEQID NO:32)和“Var09+Y236F”(SEQ ID NO:41)。
酶促反应
酶促反应介质的组成如下表5所示：
表5：酶促反应介质的组成
| MES-KOH缓冲液pH7 | 50mM |
| NaCl | 100mM |
| CaCl2.2H2O | 1.32mM |
| PNPS(4-硝基苯硫酸钾盐) | 1-10mM |
| 还原剂 | 1mM |
| PAPS | 0.1-0.5mM |
| NS肝素前体 | 1.2g/L |
| C5差向异构酶 | 22mU/mL |
| 2O磺基转移酶 | 60mU/mL |
| 大鼠AST IV野生型和突变体 | 根据实验的量(0.1或0.03g/L) |
首先将所有原料添加并溶解在介质中，然后添加酶。然后将混合物在37℃在搅拌下孵育24小时。用95℃ 45min内的热冲击终止酶促反应。然后，将样品在4℃以9100g离心10min。回收上清液以进行分析。
用于LC-MS分析的样品制备
将酶促反应产生的40μL样品(1g/L)与20μL柠檬酸(2M)和10μL NaNO2(1.05M)混合，并在Thermomixer中在65℃在1000rpm搅拌下孵育2小时。添加30μL DNPH二硝基苯肼(51.5mM)，并在Thermomixer中在65℃在1000rpm搅拌下孵育2小时。离心样品并将上清液转移到HPLC小瓶中。
LC-MS分析
表6：超高效液相色谱(UPLC)分析采用以下参数：
峰分离后，用沃特世公司(Waters)的Xevo G2-XS QT的质谱法(MS)用于进行峰识别。MS用于鉴定每个峰对应的单糖。硫酸化速率计算为显示2-O硫酸化的单糖占分析的所有单糖总数的百分比。
结果
在C5-差向异构酶和几种AST-IV突变体[Var-09(SEQ ID NO:13)、Var-09-N195D(SEQ ID NO:32)和Var-09+Y236F(SEQ ID NO:41)]存在下测量了对N-硫酸化肝素前体(NS肝素前体)的2-O磺基转移酶活性。将获得的硫酸化速率与野生型AST-IV进行比较。
在使用两种不同AST-IV酶量的两个实验(分别为0.1g/L(图7A)和0.03g/L(图7B))中，在三种突变体Var-09、Var-09-N195D和Var-09+Y236F存在下，获得的硫酸化速率与野生型AST-IV相比明显更高。
换句话说，三种突变体Var-09、Var-09-N195D和Var-09+Y236F允许与AST-IV WT相比增加2-O硫酸化水平，表明PAPS回收活性的改善与其在生物过程系统中的有利用途兼容，该用途例如为用于N-硫酸化肝素前体或硫酸乙酰肝素的硫酸化，例如用于肝素生产(其中需要增强将PAP回收为PAPS)。
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Claims (19)
1.非天然存在的突变的芳基磺基转移酶用于硫酸化底物的用途，该芳基磺基转移酶包含(i)选自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263、及其组合的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代，其中该位置是相对于大鼠芳基磺基转移酶IV的氨基酸序列SEQ ID NO:1，和(ii)与氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，条件是当所述芳基磺基转移酶是该大鼠芳基磺基转移酶IV时，突变不是F138A和/或Y236A。
2.非天然存在的突变的芳基磺基转移酶用于硫酸化底物的用途，该芳基磺基转移酶包含(i)选自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263、及其组合的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代，其中该位置是相对于大鼠芳基磺基转移酶IV的氨基酸序列SEQ ID NO:1，(ii)与氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，并且(iii)具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性是SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的所述活性的至少1.3倍。
3.一种用于硫酸化底物的方法，该方法至少包括使所述待硫酸化的底物与：
a)非天然存在的突变的芳基磺基转移酶，该芳基磺基转移酶包含(i)选自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263、及其组合的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代，其中该位置是相对于大鼠芳基磺基转移酶IV的氨基酸序列SEQ ID NO:1，和(ii)与氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，条件是当所述芳基磺基转移酶是该大鼠芳基磺基转移酶IV时，突变不是F138A和/或Y236A，以及
b)磺基供体在适用于将磺基从该磺基供体转移到所述底物的条件下接触的步骤。
4.一种用于硫酸化底物的方法，该方法至少包括使所述待硫酸化的底物与：
a)非天然存在的突变的芳基磺基转移酶，该芳基磺基转移酶包含(i)选自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263、及其组合的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代，其中该位置是相对于大鼠芳基磺基转移酶IV的氨基酸序列SEQ ID NO:1，(ii)与氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，并且(iii)具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性是SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的所述活性的至少1.3倍，以及
b)磺基供体在适用于将磺基从该磺基供体转移到所述底物的条件下接触的步骤。
5.一种用磺基转移酶和PAPS硫酸化底物的方法，该方法在适合将磺基从PAPS转移到待硫酸化的底物并获得硫酸化底物和PAP的条件下进行，该方法至少包括通过以下来将如此获得的PAP转化为PAPS的步骤：使该PAP与
(i)非天然存在的突变的芳基磺基转移酶，该芳基磺基转移酶包含(1)选自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263、及其组合的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代，其中该位置是相对于大鼠芳基磺基转移酶IV的氨基酸序列SEQ ID NO:1，和(2)与氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，以及
(ii)磺基供体
在适用于将该磺基从该磺基供体转移到PAP以获得PAPS的条件下接触。
6.根据权利要求1所述的用途或根据权利要求4或6所述的方法，其中该非天然存在的突变的芳基磺基转移酶具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性是SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的所述活性的至少1.3倍。
7.根据权利要求3至5中任一项所述的方法，其中将该底物用一种或多种磺基转移酶硫酸化，以进行多次硫酸化。
8.根据权利要求7所述的方法，其中该多次硫酸化同时或依次进行。
9.根据权利要求5至8中任一项所述的方法，其中将PAP转化为PAPS的步骤与该硫酸化同时进行或单独进行。
10.根据权利要求9所述的方法，其中硫酸化的步骤和该将PAP转化为PAPS的步骤在同一反应混合物中同时进行。
11.根据权利要求3至10中任一项所述的方法，该方法进一步包括回收如此硫酸化的底物的步骤。
12.根据权利要求1或2所述的用途或根据权利要求3至11中任一项所述的方法，其中该底物选自包含以下的组：3',5'-二磷酸腺苷(PAP)、多糖、乙酰肝素、硫酸肝素前体、化学脱硫的N-硫酸化(CDSNS)肝素、糖胺聚糖(GAG)、硫酸乙酰肝素或硫酸化肝素。
13.根据权利要求1或2所述的用途或根据权利要求3、4和6至12中任一项所述的方法，用于将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)。
14.根据权利要求1或2所述的用途或根据权利要求3至13中任一项所述的方法，用于制备肝素。
15.一种用于将PAP回收为PAPS的方法，该方法至少包括使所述PAP与：
a)非天然存在的突变芳基磺基转移酶，该非天然存在的突变芳基磺基转移酶包含(i)选自位置6、7、8、9、11、17、20、33、62、97、138、195、236、239、244、263、及其组合的至少一个氨基酸位置的氨基酸取代，其中该位置是相对于大鼠芳基磺基转移酶IV的氨基酸序列SEQID NO:1，和(ii)与氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，以及
b)磺基供体在适用于将磺基从该磺基供体转移到PAP以获得PAPS的条件下接触的步骤。
16.根据权利要求3至15中任一项所述的方法，其中该磺基供体是芳基硫酸盐化合物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中该芳基硫酸盐化合物是对硝基苯硫酸盐(pNPS)。
18.根据权利要求1或2所述的用途或根据权利要求3至17中任一项所述的方法，其中将该突变的非天然存在的芳基磺基转移酶接枝至支持物上。
19.根据权利要求1或2所述的用途或根据权利要求3至18中任一项所述的方法，其中该非天然存在的突变的芳基磺基转移酶具有选自SEQ ID NO:5至23、25-35、41、45-47、和49-56的氨基酸序列或具有与选自SEQ ID NO:5至23、25-35、41、45-47、和49-56的序列具有至少60％同一性的氨基酸序列，并且具有将3',5'-二磷酸腺苷(PAP)转化为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)的磺基转移酶活性，该活性是SEQ ID NO:1的大鼠芳基磺基转移酶IV的所述活性的至少约1.3倍。
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