CN118291520A - 用于改造植物授粉方式的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于改造植物授粉方式的方法。同时敲除HD7和HD7L基因，或超量表达MTR1、MTR2基因中的一个，可抑制茄科植物形成闭花授粉的筒状花药、引起花柱的外露；超量表达Wo P635R 基因，或使用Wo基因启动子、HD7基因启动子、HD7L基因启动子、MTR1基因启动子、MTR2基因启动子中的一个驱动Wo P635R 基因在花柱中特异表达，可促进茄科植物花柱从花药筒中露出；超量表达wo W106R 基因，或使用Wo基因启动子驱动wo W106R 、HD7 mHD 、HD7L mHD 基因中的一个在花柱中特异表达，或同时敲除HD7和Wo基因，或同时敲除HD7L和Wo基因，可引起茄科植物花柱长度缩短、柱头内缩；超量表达Wo I692RD695Y 基因，或使用MX1基因启动子驱动Wo I692RD695Y 基因在花柱中特异表达，可促进茄科植物花瓣间相互链接、形成几乎完全闭合的花器官。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及用于改造植物授粉方式的方法。
背景技术
闭花授粉(Cleistogamy)是开花授粉(chasmogamous-CH)进化而来，其花器官由开放状转变为闭合状(cleistogamous-CL)。闭花授粉存在多种形式，前人已经将它们分为4类：花前受精闭锁花(Preanthesis cleistogamy)，假闭花受精闭锁花(pseudocleistogamy)，完全闭锁花(Completecleistogamy)，真正的闭锁花("True"cleistogamy)(参考文献：Lord,E.M..The Botanical Review,1981,47(4):421-449.)。其中，"True"cleistogamy来源于单个物种中，不同的发育途径发生改变而产生的花器官形态的转变。番茄是典型的"True"cleistogamy，其授粉方式由开花授粉转变为闭花授粉的园艺作物。在番茄近缘种和近缘种野生番茄中，花的形态都是散开状，授粉方式是开花授粉。而经过驯化后的栽培番茄，花药上形成表皮毛，相邻花药通过这些表皮毛相互铰链在一起，并将花柱完全包裹住，形成闭合的结构，授粉方式由开花授粉转变为闭花授粉。闭花授粉植物不需要媒介就能够完成授粉过程，具有较高的结实率。同时，闭花授粉可以防止柱头受到异源花粉的污染，具有稳定的性状遗传(参考文献：Schoen,D.J.and D.G.Lloyd.BiologicalJournal ofthe Linnean Society1984,23(4):303-322.)。而开花授粉可以更加方便地接收异源花粉，有利于农业生产中杂交种子的创制。番茄授粉方式的转变机制可用于创制改造植物授粉方式的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供改造植物授粉方式的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
用于改造茄科植物授粉方式的方法，所述方法包括改变茄科植物中调控闭合花药形成基因的表达的步骤；所述调控闭合花药形成基因包括HD7基因、HD7L基因、MTR1基因、MTR2基因、WoP635R基因、Wo基因、woW106R基因、HD7mHD基因、HD7LmHD基因、WoI692RD695Y基因；
所述HD7基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示；
所述HD7L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示；
所述MTR1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，其编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示；
所述MTR2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，其编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.8所示；
所述WoP635R基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，其编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.10所示；
所述Wo基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，其编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.12所示；
所述woW106R基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，其编码的氨基酸序列如SEQID NO.14所示；
所述HD7mHD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，其编码的氨基酸序列如SEQID NO.16所示；
所述HD7LmHD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，其编码的氨基酸序列如SEQID NO.18所示；
所述WoI692RD695Y基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示。
优选的，同时敲除HD7基因和HD7L基因，或者超量表达MTR1基因、MTR2基因中的一个，可抑制茄科植物形成闭花授粉的筒状花药、引起花柱的外露，导致其授粉方式由闭花授粉转变为开花授粉。
优选的，超量表达WoP635R基因，或者使用Wo基因启动子、HD7基因启动子、HD7L基因启动子、MTR1基因启动子、MTR2基因启动子中的一个驱动WoP635R基因在花柱中特异表达，可促进茄科植物花柱从花药筒中露出，导致其授粉方式由闭花授粉转变为开花授粉；所述所述Wo基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；
所述HD7基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；
所述HD7L基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；
所述MTR1基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；
所述MTR2基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。
优选的，超量表达woW106R基因，或者使用基因编辑技术将Wo、HD7、HD7L基因分别改造成woW106R基因、HD7mHD基因、HD7LmHD基因相同的突变形式，或者使用Wo基因启动子驱动woW106R、HD7mHD、HD7LmHD基因中的一个在花柱中特异表达，或者同时敲除HD7基因和Wo基因，或者同时敲除HD7L基因和Wo基因，可引起茄科植物花柱长度缩短、柱头内缩；
所述Wo基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。
优选的，超量表达WoI692RD695Y基因，或者使用MX1基因启动子驱动WoI692RD695Y基因在花柱中特异表达，可促进茄科植物花瓣间相互链接、形成几乎完全闭合的花器官；
所述MX1基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示。
优选的，所述茄科植物包括番茄、马铃薯、茄子、香瓜茄、辣椒。
一种表达载体，其特征在于：所述表达载体含有上述调控闭合花药形成基因。
上述方法在促进或抑制植物闭合授粉器官形成中的应用。
本发明的有益之处在于：
本发明提供了多种通过调控植物花器官结构闭合和开放改造茄科植物授粉方式的方法。本发明提供了包括HD7基因、HD7L基因、MTR1基因、MTR2基因、WoP635R基因、Wo基因、woW106R基因、HD7mHD基因、HD7LmHD基因和WoI692RD695Y基因等，共10个基因；启动子序列包括：Wo基因启动子、HD7基因启动子、HD7L基因启动子、MTR1基因启动子、MTR2基因启动子和MX1基因启动子，共6个启动子序列。敲除/沉默HD7和HD7L基因，或者超量表达MTR1或者MTR2基因，都能够抑制茄科植物形成闭花授粉的筒状花药，导致授粉方式转变为开花授粉；超量表达WoP635R基因，或者使用Wo基因启动子、HD7基因启动子、HD7L基因启动子、MTR1基因启动子、MTR2基因启动子在花柱中特异驱动WoP635R基因表达，都能导致成茄科植物花柱从花药筒中露出，由闭花授粉转变为开花授粉。敲除/沉默HD7和Wo基因，或者敲除/沉默HD7L和Wo基因，或者使用基因编辑技术将Wo、HD7、HD7L基因分别改造成woW106R基因、HD7mHD基因、HD7LmHD基因相同的突变形式，或者超量或特异表达woW106R基因、HD7mHD基因、HD7LmHD基因都能够造成茄科植物花柱极显著内缩，促进更加高效的闭花授粉。超量表达WoI692RD695Y基因或者使用MX1基因启动子驱动WoI692RD695Y的特异表达能够造成茄科植物花瓣间相互链接，形成几乎完全闭合的花器官。本发明的方法对于创造闭花授粉或开花授粉的花器官结构，对增加植物的结实率或者杂交育种工具的开发具有重要意义，同时对避免花粉扩散污染、提高转基因植物安全具有重要价值。本发明的方法适用于与番茄具有类似花器官结构的植物，其中包括番茄、马铃薯、茄子、香瓜茄和辣椒等植物。
附图说明
图1：茄科植物(番茄、茄子、马铃薯、香瓜茄和辣椒)的花药及花瓣结构。注：在这些茄科植物的花瓣开放前4天(-4d)，花药被花瓣完全包裹。在花瓣开放当天，花瓣呈开散状，露出聚合的花药。但是，在这些茄科植物中，只有番茄的花药具有完全闭合的结构。扫描电镜观察结果显示，番茄花药被花药上的锁链表皮毛(interlocking trichome)聚合成闭合的筒状结构。而茄子、马铃薯、香瓜茄和辣椒花药上都没有锁链表皮毛，花药间是相互独立的。
图2：cr-hd7/hd7l、OE-MTR1和OE-MTR2的花药表型。注：(A)HD7和HD7L双靶点CRISPR/CAS9敲除载体示意图；(B)超量表达MTR1和MTR2基因载体示意图；(C)同时敲除HD7和HD7L，或者超量表达MTR1或MTR2都会造成番茄花药上锁链表皮毛消失，花药呈开散状，引起花柱的外露。
图3：Wo、HD7、HD7L、MTR1和MTR2等基因的启动子在花柱中的表达模式和超量表达WoP635R基因的表型。注：(A)Wo、HD7、HD7L、MTR1和MTR2等基因的启动子GUS表达载体示意图和超量表达WoP635R基因载体示意图；(B)GUS染色结果显示Wo、HD7、HD7L、MTR1和MTR2等基因的启动子都在花柱顶部区域特异表达。(C)使用Wo基因启动子或者CaMV35S启动子驱动WoP635R基因表达都能够造成花柱外露表型。
图4：woW106R,pWo:woW106R,pWo:HD7mHD,pWo:HD7LmHD突变体及转基因植的短花柱表型。注：(A)woW106、HD7mHD和HD7LmHD等蛋白的突变位置示意图；(B)HD7/Wo和Wo/HD7L双靶点CRISPR/CAS9敲除载体示意图，以及特异表达woW106、HD7mHD、HD7LmHD、WoI692RD695Y等基因的载体示意图；(C)woW106突变体、cr-hd7/wo、cr-wo/hd7l突变体，以及使用Wo基因启动子驱动这些突变等位基因表达后所造成的短花柱表型。
图5：pMX1:WoI692RD695Y和OE-WoI692RD695Y的闭合花瓣表型。注：无论是使用MX1基因启动子还是CaMV35S组成型启动子驱动WoI692RD695Y基因表达都能够使得番茄花瓣之间相互交联在一起，形成的结构。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。
在一些近缘种植物中，它们的花器官的调控机制往往具有很高的相似性，比如番茄、茄子、马铃薯、香瓜茄、辣椒等植物(图1)。本发明实施例中仅展示在番茄中的遗传转化结果，这只是为了展示本发明方法的可行性，而不是限制本发明的实施，也不应被解释为限制由所附权利要求书限定的本技术的范围。
本发明所描述的“锁链表皮毛(interlocking trichome)”指代将相邻花药或者相邻花瓣聚合成闭合状态的表皮毛细胞。在不同茄科和桑科等植物中，其多细胞表皮毛亚型和形态可能与文中所列表皮毛细胞存在部分差异，但是这不应被解释为限制由所附权利要求书限定的本技术的范围。
敲除或者沉默一个基因的方法有很多，其目的是为了让目的基因的无法表达或者表达量降低，只要能够达到抑制目的基因表达的方法都可以视为具有敲除或者沉默目的基因表达作用，包括RNAi技术、CASPR/CAS9技术、诱变或者表观遗传修饰等。本发明中只展示CRISPR/CAS9敲除用于敲除目的基因，是为了证明本发明方法的可靠性，而不是限制本发明的实施，也不应被解释为限制由所附权利要求书限定的本技术的范围。
敲除或者沉默载体的构建已经是公开多年的成熟技术。一个基因往往具有多个CRISPR/CAS9敲除靶位点，本发明只选择其中的一个位点进行敲除实验展示。这些是为了展示说明本发明方法的结果，而不是限制本发明的实施，也不应被解释为限制由所附权利要求书限定的本技术的范围。
组成型表达或者诱导表达或者在植物表皮上特异表达载体有很多，其构建技术也是已经公开的技术，本发明实施例中仅使用烟草花叶病毒CaMV35S启动子，以及Wo基因启动子载体是用于展示本发明方法的结果，而不是限制本发明的实施，也不应被解释为限制由所附权利要求书限定的本技术的范围。
目前已公开的植物遗传转化方法有很多种。本发明实施例中仅使用农杆菌介导的遗传转化方法，这只是为了展示本发明方法的可行性，而不是限制本发明的实施，也不应被解释为限制由所附权利要求书限定的本技术的范围。
授粉方式分开花授粉和闭花授粉。在农业生产中，开花授粉有利于进行杂交育种，而闭花授粉则具有较高的结实率和稳定的遗传性状，同时可以避免转基因材料花粉的扩散传播。因此，改造植物的授粉方式具有重要运用价值。
在本发明中公开的方法中，同时敲除/沉默HD7和HD7L基因，或者使用CaMV35S组成型启动子超量表达MTR1、MTR2基因中的一个，均能够抑制茄科植物形成闭花授粉的桶状花药，引起茄科植物花柱的外露，导致其授粉方式转变为开花授粉；使用CaMV35S组成型启动子超量表达WoP635R基因，或者使用Wo基因启动子、HD7基因启动子、HD7L基因启动子、MTR1基因启动子、MTR2基因启动子中的一个驱动WoP635R基因在花柱中特异表达，均能够引起茄科植物花柱的外露，导致其授粉方式由闭花授粉转变为开花授粉。这些方法对于茄科植物花药聚合和茄科植物花柱伸长的研究和运用都将会有很大帮助。
在本发明中公开的方法中，使用CaMV35S组成型启动子超量表达woW106R基因，或者使用基因编辑技术将Wo、HD7、HD7L基因分别改造成woW106R基因、HD7mHD基因、HD7LmHD基因相同的突变形式，或者使用Wo基因启动子驱动woW106R、HD7mHD、HD7LmHD基因中的一个在花柱中特异表达，或者同时敲除/沉默HD7和Wo基因，或者同时敲除/沉默HD7L和Wo基因，均能够引起茄科植物花柱长度缩短，柱头内缩，形成更加高效的闭花授粉；使用CaMV35S组成型启动子超量表达WoI692RD695Y基因，或者使用MX1基因启动子驱动WoI692RD695Y基因在花柱中特异表达，均能够造成茄科植物花瓣间相互链接，形成几乎完全闭合的花器官。这些方法对于茄科植物花柱缩短和茄科植物花瓣聚合的研究和运用都将会有很大帮助。
实施例1：用于调控茄科植物开花授粉的方法
(1)载体构建：
同时敲除HD7和HD7L基因载体的构建。以番茄基因组中的HD7基因(SEQ ID NO.1-2)和HD7L基因(SEQ ID NO.3-4)为例，从CRISPR/CAS9靶点设计在线网站(如CRISPR-Pv2.0)上设计HD7和HD7L基因的敲除靶位点扩增引物CR-HD7-F和CR-HD7L-R，以pU6-M载体中的sgRNA骨架为模板(sgRNA骨架的启动子为番茄U6启动子)，通过PCR扩增将引导RNA序列融合进入sgRNA序列中，再通过凝胶电泳分离目的DNA片段，通过DNA回收试剂盒回收带有靶向HD7和HD7L基因的串联sgRNA片段。再通过infusion连接(BsaI酶切位点)将靶序列插入到由烟草花叶病毒CaMV35S启动子驱动的CRISPR/CAS9终载pTX载体中。用热激法将连接产物转入DH5α感受态细胞中，并用含有100mg/L卡那霉素的LB培养基进行筛选，经过PCR鉴定后，将阳性克隆在含有相应抗性的LB液体培养基中大摇16小时，提质粒送测序公司进行测序分析，完成基因敲除载体构建(图2A)。
CR-HD7-F：5’-AATCTAACAGTGTAGTTTGGATTTTGGTCCGATCCCACGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’
CR-HD7L-R：5’-CTATTTCTAGCTCTAAAACACACCGATATCGAGTGAACGCAAACTACACTGTTAGATTC-3’
超量表达MTR1、MTR2或WoP635R基因载体的构建。以番茄基因组中的MTR1(SEQ IDNO.5-6)、MTR2(SEQ ID NO.7-8)、WoP635R基因(SEQ ID NO.9-10)为例。使用高保真酶，分别PCR扩增MTR1、MTR2和WoP635R基因。其扩增引物分别为MTR1-EcoRI-F/MTR1-EcoRI-R、MTR2-EcoRI-F/MTR2-EcoRI-R、WoP635R-EcoRI-F/WoP635R-EcoRI-R。切胶回收PCR产物，再通过infusion连接方法，将回收到的MTR1、MTR2、WoP635R DNA片段分别插入到由烟草花叶病毒CaMV35S启动子驱动的表达载体中。用热激法将连接产物转入DH5α感受态细胞中，并用含有50mg/L壮观霉素的LB培养基进行筛选，经过PCR鉴定后，将阳性克隆在含有相应抗性的LB液体培养基中大摇16小时，提质粒送测序公司进行测序分析，完成基因超量表达载体构建(图2B)。
MTR1-EcoRI-F：5’-ACCGGTACCAAGCTTGAATTCATGAGCAGGAGAAATGGAAATGGTT-3’
MTR1-EcoRI-R：5’-CCCTTGCTCACCATGAATTCTTTTTTCTCATAGATAACTTCAAGC-3’
MTR2-EcoRI-F：5’-ACCGGTACCAAGCTTGAATTCATGAACTACAGGAGGGAGAGTATTC-3’
MTR2-EcoRI-R：5’-CCCTTGCTCACCATGAATTCATTCTTTGGATTATTGATTCGATCC-3’
WoP635R-EcoRI-F：5’-ACCGGTACCAAGCTTGAATTCATGTTTAATAACCACCAGCACTTGC-3’
WoP635R-EcoRI-R：5’-CCCTTGCTCACCATGAATTCTGCATTTGCGGAAGTTACAGCACCT-3’
在花柱中特异表达的启动子的GUS表达载体的构建。以番茄基因组为例，使用高保真酶，分别PCR扩增番茄Wo基因启动子(SEQ ID NO.21)、HD7基因启动子(SEQ ID NO.22)、HD7L基因启动子(SEQ ID NO.23)、MTR1基因启动子(SEQ ID NO.24)、MTR2基因启动子(SEQID NO.25)，并对扩增后的DNA片段进行回收。扩增引物分别为pWo-SacI-F/pWo-XbaI-R、pHD7-SacI-F/pHD7-XbaI-R、pHD7L-SacI-F/pHD7L-XbaI-R、pMTR1-SacI-F/pMTR1-XbaI-R、pMTR2-SacI-F/pMTR2-XbaI-R。通过酶切连接(SacI/XbaI双酶切)，将扩增后的Wo基因启动子、HD7基因启动子、HD7L基因启动子、MTR1基因启动子、MTR2基因启动子DNA片段分别插入到GUS表达载体。用热激法将连接产物转入DH5α感受态细胞中，并用含有50mg/L壮观霉素的LB培养基进行筛选，经过PCR鉴定后，将阳性克隆在含有相应抗性的LB液体培养基中大摇16小时，提质粒送测序公司进行测序分析，完成Wo基因启动子、HD7基因启动子、HD7L基因启动子、MTR1基因启动子、MTR2基因启动子驱动GUS表达载体的构建(图3A)。
pWo-SacI-F：5’-ATCCAACGCGTTGGGAGCTCACATACAGAACTTATGAGGGAA-3’
pWo-XbaI-R：5’-TCTCCTTTACTCATTCTAGACTTGAATACCTTCTCGATCTTCTTC-3’
pHD7-SacI-F：5’-ATCCAACGCGTTGGGAGCTCATCGTTTCACCATATAGTCCATACC-3’pHD7-XbaI-R：5’-TCTCCTTTACTCATTCTAGACTTGAATATTTTTTTGCACCTTCTTGCAAAGC-3’
pHD7L-SacI-F：5’-ATCCAACGCGTTGGGAGCTCACGAGATACACATAGGGCGGATACA-3’
pHD7L-XbaI-R：5’-TCTCCTTTACTCATTCTAGATTTGACTTAAATCTATATATATATCCGT-3’
pMTR1-SacI-F：5’-ATCCAACGCGTTGGGAGCTCCCACCAACCTTAGCAGCCATATATT-3’
pMTR1-XbaI-R：5’-TCTCCTTTACTCATTCTAGATCTAAAATCAAACAAAATAAAAAAT-3’
pMTR2-SacI-F：5’-ATCCAACGCGTTGGGAGCTCTCATGTCATCCCTAATGGGTGTTTA-3’
pMTR2-XbaI-R：5’-TCTCCTTTACTCATTCTAGATTTGAACAGCTTTATCAACAAGACA-3’
特异表达WoP635R基因载体的构建。以番茄基因组中的Wo基因启动子为例。使用高保真酶，PCR扩增Wo基因启动子(SEQ ID NO.21)，并对扩增后的DNA片段进行回收，扩增引物为pWo-SacI-F/pWo-XhoI-R。通过酶切连接(SacI/XhoI双酶切)，用扩增后的Wo基因启动子DNA片段替换超量表达载体中的烟草花叶病毒CaMV35S启动子。用热激法将连接产物转入DH5α感受态细胞中，并用含有50mg/L壮观霉素的LB培养基进行筛选，经过PCR鉴定后，将阳性克隆在含有相应抗性的LB液体培养基中大摇16小时，提质粒送测序公司进行测序分析，完成Wo基因启动子特异表达骨架载体的构建(pWo:GFP，图3A)。再通过酶切连接(EcoRI酶切)，将Wo基因启动子特异表达骨架载体线性化，并将WoP635R DNA片段插入到Wo基因启动子后面，并进行测序验证，完成Wo基因启动子特异驱动WoP635R基因的载体构建(图3A)。
pWo-SacI-F：5’-ATCCAACGCGTTGGGAGCTCACATACAGAACTTATGAGGGAA-3’
pWo-XhoI-R：5’-TTGGTACCGGTACCCTCGAGCTTGAATACCTTCTCGATCTTCTTC-3’
(2)遗传转化：通过农杆菌介导的遗传转化方法进行番茄遗传转化，操作步骤参考前人已报道的方法(Hyeon-Jin Sun,Sayaka Uchii,Shin Watanabe,Hiroshi Ezura.Plantand Cell Physiology,March 2006,Volume 47,Issue 3,Pages 426–431.)。以PTX质粒的遗传转化为例，具体步骤如下：1)将阳性克隆质粒通过热激法转入C58感受态细胞中，通过含有庆大霉素(50mg/L)，卡那霉素(100mg/L)和利福平(50mg/L)的固体LB筛选培养基进行筛选，在28℃培养箱中培养48小时后。将经过PCR鉴定的阳性克隆，使用含有庆大霉素(50mg/L)，卡那霉素(100mg/L)和利福平(50mg/L)的LB液体培养基进行扩繁。2)待菌浓度OD值达到0.6时，将菌体离心后收集后用KC液体培养基(含1.5mg/L zeatin的MS培养基)重悬，继而进行农杆菌侵染番茄子叶(时间5分钟)。3)侵染结束后，将子叶转移到KC固体培养基中，黑暗室温条件下共培养48小时，再将子叶转移至筛选培养基(含1.5mg/L zeatin和300mg/L的特美汀。进行筛选，温度26℃，光照16小时，黑暗8小时。生长2-3周后，转入含1mg/L zeatin的筛选培养基(其它成分不变)继续筛选。4)待转基因植株幼芽长出来后，将幼芽用手术刀切下来，并转移到生根培养基中进行生根培养(1/2MS，300mg/L的特美汀以及100mg/L的卡那霉素)。在遗传转化过程中，植物筛选抗生素根据使用载体的植物抗性决定，如果使用载体的植物抗性基因为潮霉素基因，则加入10mg/L的潮霉素，如果是卡那霉素抗性，则再加入100mg/L的卡那霉素。生根培育大概2-3周后，将生根的转基因苗移植到温室培育，并对T1代纯合突变植株或者超量表达植株进行表型观察。最终获得了cr-hd7/hd7l、OE-MTR1、OE-MTR2、pWo:GFP-GUS、pHD7:GFP-GUS、pHD7L:GFP-GUS、pMTR1:GFP-GUS、pMTR2:GFP-GUS、OE-WoP635R、pWo:WoP635R等突变体和超量表达材料。
(3)表型观察结果显示，与WT相比，cr-hd7/hd7l、OE-MTR1、OE-MTR2的花药上锁链表皮毛消失，花药由聚合转变为开散状，花柱外露(图2C)；说明同时敲除/沉默HD7和HD7L基因，或者使用CaMV35S组成型启动子超量表达MTR1、MTR2基因中的一个，均能够抑制番茄形成闭花授粉的筒状花药，引起番茄花柱的外露，导致其授粉方式转变为开花授粉。GUS染色结果显示，Wo基因启动子、HD7基因启动子、HD7L基因启动子、MTR1基因启动子、MTR2基因启动子都在番茄花柱的最顶端区域表达(图3B)。与WT相比，pWo:WoP635R、p35S:WoP635R的花柱大幅外露(图3C)，说明无论是使用CaMV35S组成型启动子超量表达WoP635R基因，还是使用Wo基因启动子驱动WoP635R基因在花柱中特异表达，均能够引起番茄花柱的外露，导致其授粉方式转变为开花授粉。
实施例2用于调控闭花授粉的方法
(1)载体构建：
特异表达woW106R、HD7mHD或HD7LmHD基因载体的构建。使用高保真酶，通过融合PCR扩增将番茄Wo(SEQ ID NO.11-12)、HD7(SEQ ID NO.1-2)、HD7L基因(SEQ ID NO.3-4)，分别改造成woW106R(SEQ ID NO.13-14)、HD7mHD(SEQ ID NO.15-16)、HD7LmHD基因(SEQ ID NO.17-18)。woW106R基因的扩增引物为Wo-EcoRI-F/Wo-EcoRI-R，模板为woW106R突变体番茄幼叶cDNA。创建HD7mHD基因片段的第一轮融合引物分别为HD7-EcoRI-F/HD7mHD-R和HD7mHD-F/HD7-EcoRI-R，番茄HD7基因DNA片段为模板；第二轮引物为HD7-EcoRI-F/HD7-EcoRI-R，模板为第一轮PCR产物混合样品(图4A)。创建HD7LmHD基因片段的第一轮融合引物分别为HD7L-EcoRI-F/HD7LmHD-R和HD7LmHD-F/HD7L-EcoRI-R，番茄HD7基因DNA片段为模板；第二轮引物为HD7L-EcoRI-F/HD7L-EcoRI-R，模板为第一轮PCR产物混合样品(图4A)。最终通过infusion连接方式将这些突变等位基因插入实施例1中的pWo:GFP载体中(EcoRI酶切)，经过大肠杆菌转化和筛选，最终获得pWo:woW106R-GFP、pWo:HD7mHD-GFP、pWo:HD7LmHD-GFP载体(图4B)。
HD7-EcoRI-F：5’-ACCGGTACCAAGCTTGAATTCATGTTTCAGCATAACATGTTCGATA-3’
HD7-EcoRI-R：5’-CCCTTGCTCACCATGAATTCCTAGGCGTTTTCGCACGTTATGGAA-3’
HD7mHD-F：5’-AACGTCCCAAGCAAATGAAGTCTCAACATGAACG-3’
HD7mHD-R：5’-GAGACTTCATTTGCTTGGGACGTTTATTAGGATCTTG-3’
HD7L-EcoRI-F：5’-ACCGGTACCAAGCTTGAATTCATGTTTCAGCCAAATATGTTTGAGA-3’
HD7L-EcoRI-R：5’-CCCTTGCTCACCATGAATTCTCATAAAGCACTGTCACAAGCTACA-3’
HD7LmHD-F：5’-GATCCTAATCAACGTCCAAACAACAAGCGTACTCAAATGAAGGCG-3’
HD7LmHD-R：5’-GAGTACGCTTGTTGTTTGGACGTTGATTAGGATCAACT-3’
同时敲除HD7和Wo基因、HD7L和Wo基因载体的构建。以番茄基因组中的Wo(SEQ IDNO.11-12)、HD7(SEQ ID NO.1-2)、HD7L基因(SEQ ID NO.3-4)为例，从CRISPR/CAS9靶点设计在线网站上(CRISPR-P v2.0)设计Wo基因的敲除靶位点扩增引物CR-Wo-F/CR-Wo-R，HD7、HD7L基因的敲除靶位点扩增引物参照实施例1中的引物。构建同时敲除HD7和Wo基因载体时，正向引物为CR-HD7-F，反向为CR-Wo-R；构建同时敲除HD7L和Wo基因载体时，正向引物为CR-Wo-F，CR-HD7L-R；参照实施例1中构建敲除载体的方法，构建cr-hd7/wo和cr-wo/hd7l载体，并进行测序验证(图4B)。
CR-Wo-F：5’-GAATCTAACAGTGTAGTTTGCAGCATGCCCAAATTGTGGAGTTTTAGAGCTAGAAATAG-3’
CR-Wo-R：5’-GCTATTTCTAGCTCTAAAACTTGGATATTCTCATCAACTTCAAACTACACTGTTAGATT-3’超量表达和特异表达WoI692RD695Y基因载体的构建。因为WoI692RD695Y基因(SEQ ID NO.19-20)是Wo基因(SEQ ID NO.11-12)的功能获得型突变体,其扩增引物和Wo基因一样，模板为WoI692RD695Y突变体番茄幼叶cDNA。通过胶回收获得WoI692RD695Y基因DNA片段后，再通过infusion方法，将WoI692RD695Y基因DNA片段插入p35S:GFP载体中(EcoRI酶切)。通过如实施案例1中的大肠杆菌筛选、PCR阳性克隆筛选和测序分析，最终获得p35S:WoI692RD695Y-GFP载体(图4B)。构建pMX1:WoI692RD695Y-GFP载体时，使用SacI和EcoRI对p35S:WoI692RD695Y-GFP载体进行双酶切，剔除CaMV35S启动子序列，并用高保真酶扩增MX1基因启动子序列(SEQ IDNO.26)，扩增引物为pMIX1-SacI-F/pMIX1-WoI692RD695Y-EcoRI-R。最终将纯化好的MX1基因启动子DNA片段插入到WoI692RD695Y-GFP载体中，最终构建完成pMX1:WoI692RD695Y-GFP载体(图4B)。
pMIX1-SacI-F ： 5 ’ -CATCCAACGCGTTGGGAGCTCGCAGGAATAGTCCAAAACGTCCCTT-3’pMIX1-WoI692RD695Y-EcoRI-R ： 5 ’ -GTGGTTATTAAACATGAATTCTTTCTTTGGACTTACAAAGAGAAACC-3’
(2)遗传转化：通过农杆菌介导的遗传转化方法进行番茄遗传转化(转化步骤参考具体实施案例1)。经过筛选，最终获得了cr-hd7/wo和cr-wo/hd7l突变材料，以及pWo:woW106R-GFP、pWo:HD7mHD-GFP、pWo:HD7LmHD-GFP、p35S:WoI692RD695Y-GFP和pMX1:WoI692RD695Y-GFP等转基因苗。
(3)通过与WT背景材料相比较，可以看到woW106R、cr-hd7/wo、cr-wo/hd7l突变材料，以及pWo:woW106R-GFP、pWo:HD7mHD-GFP、pWo:HD7LmHD-GFP等转基因苗的花柱明显变短，柱头内缩至花药内部(图4C)，而p35S:WoI692RD695Y-GFP和pMX1:WoI692RD695Y-GFP等转基因苗则出现花瓣闭合的表型(图5)。以上方式分别通过缩短花柱和闭合花瓣以达到增强番茄闭花授粉的功能，这些方法同样适合用于改造其它茄科植物的授粉方式。
Claims (8)
1.用于改造茄科植物授粉方式的方法，其特征在于：所述方法包括改变茄科植物中调控花器官结构相关基因的表达的步骤；所述调控闭合花药形成基因包括HD7基因、HD7L基因、MTR1基因、MTR2基因、Wo P635R 基因、Wo基因、wo W106R 基因、HD7 mHD 基因、HD7L mHD 基因、Wo I692RD695Y 基因；
所述HD7基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述HD7L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述MTR1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述MTR2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；
所述Wo P635R 基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，其编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.10所示；
所述Wo基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；
所述wo W106R 基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，其编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.14所示；
所述HD7 mHD 基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，其编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.16所示;
所述HD7L mHD 基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，其编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.18所示;
所述Wo I692RD695Y 基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，其编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.20所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：同时敲除HD7基因和HD7L基因，或者超量表达MTR1基因、MTR2基因中的一个，可抑制茄科植物形成闭花授粉的筒状花药、引起花柱的外露，导致其授粉方式由闭花授粉转变为开花授粉。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：超量表达Wo P635R 基因，或者使用Wo基因启动子、HD7基因启动子、HD7L基因启动子、MTR1基因启动子、MTR2基因启动子中的一个驱动Wo P635R 基因在花柱中特异表达，可促进茄科植物花柱从花药筒中露出，导致其授粉方式由闭花授粉转变为开花授粉；
所述所述Wo基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；
所述HD7基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；
所述HD7L基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；
所述MTR1基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；
所述MTR2基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：超量表达wo W106R 基因，或者将Wo、HD7、HD7L基因分别改造成wo W106R 基因、HD7 mHD 基因、HD7L mHD 基因相同的突变形式，或者使用Wo基因启动子驱动wo W106R 、HD7 mHD 、HD7L mHD 基因中的一个在花柱中特异表达，或者同时敲除HD7基因和Wo基因，或者同时敲除HD7L基因和Wo基因，可引起茄科植物花柱长度缩短、柱头内缩；
所述Wo基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：超量表达Wo I692RD695Y 基因，或者使用MX1基因启动子驱动Wo I692RD695Y 基因在花柱中特异表达，可促进茄科植物花瓣间相互链接、花器官闭合；
所述MX1基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述茄科植物包括番茄、马铃薯、茄子、香瓜茄、辣椒。
7.一种表达载体，其特征在于：所述表达载体含有权利要求1中所述调控闭合花药形成基因。
8.权利要求1所述方法在促进或抑制植物闭合授粉器官形成中的应用。
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