CN118290534A - 鹅膏毒肽半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了鹅膏毒肽半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法，以及将其应用于酶联免疫试剂盒，试剂盒包括：包被有包被原的酶标板、鹅膏毒肽标准品溶液、鹅膏毒肽抗体、酶结合物浓缩液、酶结合物稀释液、底物显色液、终止液、洗涤液，所述包被原为鹅膏毒肽偶联抗原，所述酶结合物为酶标记的鹅膏毒肽抗体，所述鹅膏毒肽抗体是由免疫原免疫动物得到的。本发明还公开了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测鹅膏毒肽的方法，它包括：首先进行样品前处理，然后用试剂盒进行检测，最后分析检测结果。本发明提供的酶联免疫试剂盒可用于检测蘑菇样本中鹅膏毒肽的含量，其操作简便、费用低廉、灵敏度高、能够现场监控且适合大量样本的筛查。

Description

鹅膏毒肽半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种鹅膏毒肽半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用技术，具体涉及一种鹅膏毒肽人工抗原分子结构以及用于检测鹅膏毒肽的酶联免疫试剂盒，可定性、定量检测蘑菇中鹅膏毒肽药物的残留量。

背景技术

鹅膏毒素学名Amatoxin，是从剧毒磨菇中分离出来的一种多肽物质，属于毒伞肽类毒素，是一种对人致命毒素，其毒性要强于毒鼠强，它可在几天之内摧毁人们的肝和肾，人们会清醒的感受到来自于身体的极度疼痛，直至昏迷、死亡。全世界每年有成百上千人由于吃毒蘑菇而身亡，其中90%以上是由于鹅膏毒素引起的，它是一种双环状八肽。20种氨基酸的平均分子量为128。

鹅膏菌属隶属于真菌界、担子菌门、伞菌目、鹅膏科。全世界报道500多种，广布世界各大洲。该属中有些种是美味食用菌，如红黄鹅膏；而另一些种则是剧毒蘑菇。蘑菇中毒事件大多数是由鹅膏（如玫瑰红鹅膏、灰花纹鹅膏、绿盖鹅膏、和鳞柄鹅膏等）引起的。鹅膏肽类毒素根据其氨基酸的组成和结构可分为鹅膏毒肽、鬼笔毒肽、毒伞素三类，目前已分离鉴定的天然毒素有22种。含有鹅膏肽类毒素的蘑菇主要有鹅膏属、盔孢伞属和环柄菇属中的一些种类，但导致人们中毒死亡的绝大多数是鹅膏菌属的种类。在欧洲，导致死亡的95%是由毒鹅膏所致，因此人们对于鹅膏肽类毒素的研究所用材料主要来自毒鹅膏。最近的研究表明毒鹅膏在美国、南非、马来西亚、墨西哥、澳大利亚、印度等国家也有分布和中毒事件发生。我国鹅膏菌种类相当丰富，迄今为止，我国此属已记载约100种，但很多种类沿用了欧洲、北美的鹅膏菌名称，如一些很重要的有毒鹅膏菌沿用了欧洲的毒鹅膏、白毒伞等。在我国及东亚地区，主要的剧毒鹅膏菌有灰花纹鹅膏、致命鹅膏和黄盖鹅膏白色变种。

鹅膏毒素作为一类重要的生化试剂，其在分子生物学、发育生物学、遗传学、生物化学、医学、生物防治等领域具有广泛的应用价值。项目经过100余年的研究 ，已经完全掌握了该毒素的分离纯化与制备技术，用于生产的资源可得到充分保证，项目总体达到国际先进水平。目前，鹅膏毒素在许多生物公司有售，价值昂贵，每克在5~16万美元以上，需求每年以10%的速度上升。另外，该毒素可作为标样用于误食毒菌子实体或中毒病人呕吐物、血液、尿液中毒素成分的快速鉴定，因此在各省、市卫生防疫站和各大医院具有广泛的推广价值。

由于鹅膏毒肽具有致命毒性，因此，检测鹅膏毒肽的含量极有必要。2020年11月19日，国家市场监督管理总局发布了《凉拌菜中1,2-丙二醇和1,3-丙二醇的测定》等6项食品补充检验方法，其中包括《蘑菇中α-鹅膏毒肽等6种蘑菇毒素的测定》，检出限均为10μg/kg，定量限均为30μg/kg。

检测鹅膏毒肽的方法有超高效液相色谱-串联质谱法、超声波-固相萃取-高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱、高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法等。与上述方法相比，免疫化学检测法对药物检测具有快速、特异、灵敏、准确、可以批量监测、样品处理简单、能实现自动化操作等优点。而免疫化学法检测鹅膏毒肽的前提是需要具备针对鹅膏毒肽的抗体，本申请发明了鹅膏毒肽人工抗原制备方法，并将其应用于酶联免疫试剂盒中，用时短，操作简单，成本较低，适用于基层单位大批量地检测样品。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够检测蘑菇中鹅膏毒肽药物残留量的酶联免疫试剂盒，并提供一种高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定量检测方法。

本发明试剂盒，它包括：包被有包被原的酶标板、鹅膏毒肽标准品溶液、鹅膏毒肽抗体、酶结合物浓缩液、酶结合物稀释液、底物显色液、终止液、洗涤液，所述包被原为鹅膏毒肽偶联抗原，所述酶结合物为酶标记的鹅膏毒肽抗体。

所述鹅膏毒肽特异性抗体是以一种鹅膏毒肽人工抗原作为免疫原制备获得，所述鹅膏毒肽特异性抗体为鹅膏毒肽单克隆抗体或鹅膏毒肽多克隆抗体。

所述酶结合物的标记酶为辣根过氧化物酶或细菌提取碱性磷酸酯酶，其中优选辣根过氧化物酶；酶结合物是由酶和鹅膏毒肽抗体偶联得到的。

为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括鹅膏毒肽标准品溶液、底物显色液、终止液、洗涤液。

所述鹅膏毒肽标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L，0.05μg/L，0.15μg/L，0.45μg/L，1.35μg/L，4.05μg/L。

当标记酶为辣根过氧化物酶时，所述底物显色液由底物液A液和底物液B液组成，A为过氧化氢或过氧化脲，B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，所述终止液为1~2mol/L的硫酸溶液或盐酸缓冲液；当标记酶为细菌提取碱性磷酸酯酶时，所述底物显色液为对硝基磷酸盐缓冲液，所述终止液为1~2mol/L氢氧化钠溶液。

所述洗涤液优选为pH值为7.4，含有0.5%~1.0%吐温-20、0.01‰~0.03‰叠氮化钠防腐剂、0.1~0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

其中在酶标板制备过程中所用到的包被缓冲液为pH值为9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，封闭液为pH值为7.1~7.5，含有1%~3%酪蛋白、0.1~0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

本发明中酶标板的制备过程为：用包被缓冲液将包被原稀释成30μg/mL，每孔加入100μl，25℃避光孵育2h或4℃过夜，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150~200μl封闭液，25℃避光孵育1~2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。

本发明的检测原理为：本试剂盒采用ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的鹅膏毒肽和酶标板微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗鹅膏毒肽的酶结合物，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含残留物鹅膏毒肽的含量成负相关，与标准曲线比较，再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样本中鹅膏毒肽的残留量。

本发明还提供了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测鹅膏毒肽的方法，它包括步骤：（1）用试剂盒进行检测；（2）分析检测结果。

本发明检测鹅膏毒肽的酶联免疫试剂盒主要采用ELISA方法定性或定量检测样品中鹅膏毒肽的含量；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批量样品；主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。本发明的酶联免疫试剂盒，结构简单、使用方便、价格便宜、携带便利、检测方法高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定量。

附图说明

图1：鹅膏毒肽半抗原的分子结构式

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。

实施例1 试剂盒组分的制备

1、鹅膏毒肽半抗原的制备

取α-鹅膏毒肽100mg，加水5ml溶解，加1mol/L盐酸0.1mL，搅拌，加氨基丁酸206mg，搅拌混匀，加37%甲醛0.12ml，55℃搅拌反应12h，停止反应，加1mol/L氢氧化钠调节pH值到7，旋蒸，除去水，加无水乙醇4mL重结晶，得到丁酸-鹅膏毒肽43mg，收率38.3%，即为半抗原产物。

按现有核磁共振测试方法对所得鹅膏毒肽半抗原进行检测，所得结果如下，见下核磁共振测试方法检测鹅膏毒肽半抗原：1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 9.48 (s,1H), 9.05 (s, 1H), 8.08 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.91 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.52 –7.47 (m, 2H), 7.17 – 7.02 (m, 5H), 6.44 (t, J = 6.2 Hz, 1H), 6.15 (t, J = 5.9Hz, 1H), 4.83 – 4.72 (m, 2H), 4.68 (dt, J = 9.1, 6.0 Hz, 1H), 4.42 – 4.34 (m,1H), 4.34 (ddd, J = 4.6, 1.8, 0.9 Hz, 1H), 4.34 – 4.29 (m, 1H), 4.24 (ddq, J= 8.7, 7.3, 1.5 Hz, 1H), 3.92 (td, J = 8.6, 6.3 Hz, 4H), 3.85 – 3.81 (m, 1H),3.84 – 3.78 (m, 1H), 3.81 – 3.76 (m, 2H), 3.74 (t, J = 3.4 Hz, 2H), 3.65 –3.58 (m, 2H), 3.48 (d, J = 5.7 Hz, 1H), 3.21 – 3.12 (m, 4H), 3.11 – 2.97 (m,2H), 2.90 (dd, J = 17.6, 7.1 Hz, 1H), 2.88 – 2.76 (m, 2H), 2.40 – 2.29 (m,3H), 2.11 (tt, J = 5.8, 5.0 Hz, 1H), 2.06 – 1.95 (m, 2H), 1.87 – 1.74 (m,2H), 1.73 (ddd, J = 12.1, 7.0, 4.3 Hz, 1H), 1.40 – 1.18 (m, 2H), 1.01 (dd, J= 6.8, 1.5 Hz, 3H), 0.94 (dd, J = 6.9, 1.5 Hz, 3H), 0.86 (t, J = 7.6 Hz, 3H)。

化学位移δ=2.88 – 2.76 (m, 2H)，1.87 – 1.74 (m, 2H)，2.06 – 1.95 (m, 2H)的氢吸收峰的存在，证明氨基丁酸与鹅膏毒肽偶联成功。

2、抗原的制备

免疫原制备——鹅膏毒肽半抗原与牛血清白蛋白（BSA）偶联得到免疫原

取丁酸-鹅膏毒肽 15.43mg，加1mlDMF溶解澄清，加NHS4.28mg，EDC5.91mg，充分溶解混匀，室温反应2h，得到半抗原活化液A液；取牛血清白蛋白 BSA 20mg，加0.1M CB9.5缓冲液 4ml溶解，得到B液，将A液逐滴滴加到B液中，室温反应6h，停止反应，0.02M PBS透析纯化3天，每天换液3次，离心分装，得到鹅膏毒肽-BSA偶联物，即为免疫原。

包被原制备——鹅膏毒肽半抗原与卵清蛋白OVA偶联得到包被原

同法，13.18mg 化合物Ⅲ与20mg卵清蛋白OVA，在CB9.5缓冲液中偶联，透析纯化后得到鹅膏毒肽-OVA偶联物，用作包被原。

3、鹅膏毒肽单克隆抗体的制备

α-鹅膏毒肽与氨基丁酸，在甲醛存在的条件下，经酸性催化，进行曼尼希反应，得到氨基丁酸-鹅膏毒肽半抗原产物，与载体蛋白偶联，免疫动物制备单克隆抗体。

动物免疫：将上述步骤得到的免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。

细胞融合和克隆化：小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按8:1（数量配比）比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌鹅膏毒肽单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

细胞冻存和复苏：将单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成1×10⁶个/mL的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

单克隆抗体的生产与纯化：将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5mL/只，7天后腹腔注射稳定的单克隆杂交瘤细胞株5×10⁵个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，-20℃保存。

4、酶结合物的制备

以山羊作为免疫动物，以鹅膏毒肽单克隆抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫，得到鹅膏毒肽抗体。将鹅膏毒肽抗体与辣根过氧化物酶（HRP）进行偶联得到酶结合物。

5、酶标板的制备

用包被缓冲液将包被原稀释成30μg/mL，每孔加入100μl，25℃避光孵育2h，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入200μl封闭液，25℃避光孵育2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。

实施例2 检测鹅膏毒肽的酶联免疫试剂盒的组建

组建检测鹅膏毒肽的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分。

（1）包被鹅膏毒肽偶联抗原的酶标板。

（2）鹅膏毒肽标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L，0.05μg/L，0.15μg/L，0.45μg/L，1.35μg/L，4.05μg/L。

（3）用辣根过氧化物酶标记的鹅膏毒肽抗体。

（4）底物显色液由A液和B液组成，A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺。

（5）终止液为2mol/L硫酸。

（6）洗涤液为pH值为7.4，含有0.5%~1.0%吐温-20、0.01‰~0.03‰叠氮化钠防腐剂、0.1~0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

实施例3 蘑菇中鹅膏毒肽的检测

1、用试剂盒检测

将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。加入标准品/样本50ml到对应的微孔中，然后加入酶结合物工作液50ml/孔， 25℃避光环境中反应30min。将孔内液体甩干，洗涤4-5次，拍干。加入底物液A液50ml /孔，再加入底物液B液50ml/孔，混匀，25℃避光环境中反应15min。加入终止液50ml/孔，混匀，设定酶标仪于450nm处，测定每孔OD值。

2、检测结果分析

标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准品（0标准）的吸光度值的平均值，再乘以100%，得到标准品或样本的百分吸光度值。以标准品百分吸光率为纵坐标，以鹅膏毒肽标准品浓度（µg/L）的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中鹅膏毒肽的实际浓度。

实施例4 鹅膏毒肽技术参数的确定试验

1、试剂盒灵敏度和检测限

按照常规方法测定试剂盒灵敏度，标准曲线的范围为0.05~4.05 μg/L，IC₅₀（50%抑制浓度）浮动范围为0.18~0.42 μg/L；对20份样品进行检测，从标准曲线上查出对应于各百分吸光度值的浓度，以20份样本浓度的平均值加上3倍标准差表示检测限，结果显示，该方法对蘑菇中鹅膏毒肽的检测限为0.5μg/kg。

2、样本精密度和准确度试验

以回收率作为准确度评价指标，重复测定某一浓度样品的检测结果相对标准偏差（RSD%）作为精密度评价指标。计算公式为：回收率（%）＝实际测定值/理论值×100%，其中理论值为样品的添加浓度；相对标准偏差RSD%＝SD/X×100%，其中SD为标准偏差，X为测定数据的平均值。

按0.25μg/kg、0.5μg/kg两个浓度的鹅膏毒肽对蘑菇样品进行添加回收测定，每个样品做4个平行，用三批不同试剂进行测定，计算样品的平均回收率及精密度结果见下表。

表1 蘑菇样本精密度及准确度试验

按0.25μg/kg、0.5μg/kg两个浓度的鹅膏毒肽对蘑菇样品进行添加回收测定，回收率范围为82.4%~106.3%；批内、批间相对标准偏差均小于10%。

3、试剂盒稳定性试验

试剂盒保存条件为2~8℃，经过12个月的测定，试剂盒的最大吸光度值（零标准）、50%抑制浓度、鹅膏毒肽添加实际测定值均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存条件下放置7天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻7天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2~8℃至少保存12个月以上。

4、试剂盒特异性试验

用鹅膏毒肽试剂盒测定与α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、ε-鹅膏毒肽等物质的交叉反应率，结果见表2。试验结果显示试剂盒能够同时检测多种鹅膏毒肽，可对蘑菇中毒患者及时检测。

表2 特异性试验

Claims (6)

1.一种蘑菇中鹅膏毒肽检测用半抗原，其特征在于，结构式如下：

。

2.一种含如权利要求1中所述蘑菇中鹅膏毒肽检测用半抗原的酶联免疫试剂盒。

3.根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，包括：包被有包被原的酶标板、鹅膏毒肽标准品溶液、鹅膏毒肽抗体、酶结合物浓缩液、酶结合物稀释液、底物显色液、终止液、洗涤液。

4.根据权利要求3所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述包被原为鹅膏毒肽偶联抗原，所述酶结合物为酶标记的鹅膏毒肽抗体，所述鹅膏毒肽抗体是由免疫原免疫动物得到的，所述鹅膏毒肽偶联抗原是由鹅膏毒肽半抗原与载体蛋白偶联得到，所述鹅膏毒肽半抗原是由α-鹅膏毒肽与氨基丁酸经过一系列化学反应得到的。

5.根据权利要求3所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述免疫原的制备方法如下：

取丁酸-鹅膏毒肽 15.43mg，加1ml DMF溶解澄清，加NHS 4.28mg，EDC 5.91mg，充分溶解混匀，室温反应2h，得到半抗原活化液A液；取牛血清白蛋白 BSA 20mg，加0.1 mol/LCB9.5缓冲液 4ml溶解，得到B液，将A液逐滴滴加到B液中，室温反应6h，停止反应，0.02mol/L PBS透析纯化3天，每天换液3次，离心分装，得到鹅膏毒肽-BSA偶联物，即为免疫原。

6.一种检测样品中鹅膏毒肽含量的方法，包括步骤：

（1）用权利要求2~5任一项所述的试剂盒进行检测；

（2）分析检测结果。