CN118284693A - 突变体文库池制作方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供低价、简便地制作多样性高的突变文库池的方法。包括以下的工序(a)～(c)的突变文库池的制作方法：(a)使用模板DNA和多种突变导入用引物对，对每对该突变导入用引物对利用DNA聚合酶进行DNA合成反应，获得具有5’突出末端的DNA片段的工序，其中，该突变导入用引物对与该模板DNA进行退火，具有相互互补的区域，并且在至少一方包含突变导入部位；(b)使DNA连接酶作用于工序(a)中所得到的DNA片段的工序；和(c)用工序(b)中所得到的DNA对宿主细胞进行转化的工序。

Description

突变体文库池制作方法
技术领域
本发明涉及突变体文库池制作方法。
背景技术
为了对蛋白质编码序列、启动子序列等DNA序列所具有的功能进行解析或使其提高，使用了对模板DNA导入了各种突变的DNA的突变文库。作为突变文库，有独立使用各个突变DNA的方法、和使用各种突变DNA的混合物的突变文库池的方法。近年来，由于实验的自动化、通量性高的分析系统开发的进步，使用了多样性高的突变文库池的序列的功能解析、功能提高筛选成为可能。因此，要求可以低价且简便地制作多样性高、广泛含有目标突变的突变文库池。
作为大规模的突变文库池的制作方法，最广泛利用的是易错PCR(Error-PronePCR)(非专利文献1)。高性能的易错PCR的试剂由各公司销售，能够低价且简便地制作突变文库池。但是，易错PCR中，在相邻的碱基同时导入突变是非常稀有的，具有存在非常多的无法获得的突变序列的技术问题(非专利文献2)。为了解决该技术问题，近年来，将大规模并行寡聚核苷酸合成法(非专利文献2)作为有效的手段。大规模并行寡聚核苷酸合成法能够合成广泛含有目标的突变的突变文库池。但是，在大规模的突变文库池的制作中，大规模并行寡聚核苷酸合成法与易错PCR相比依然昂贵，并且，超过106的规模的突变文库池的合成特别昂贵并且困难。另一方面，作为低价地制作广泛含有目标突变的突变文库池的方法，报道了以单链环状DNA为模板的利用PCR的方法(非专利文献3)、使用金门克隆(Golden GateCloning)的方法(例如，非专利文献4)等。但是，以单链环状DNA为模板的利用PCR的方法中，模板的序列受到限制，另外，使用金门克隆(Golden Gate Cloning)的方法中，所使用的寡聚DNA的设计复杂等，简便性依然存在改良的余地。另外，这些方法中能够应用的突变序列的长度的限制仍不明确，担心向大区域导入突变导致效率降低。
另一方面，作为导入单一突变的方法，已知有使用互补的引物对的利用PCR的简便的位点特异性的导入方法(非专利文献5、6、和专利文献1)，但仍不知晓使用互补的引物对的利用PCR的大规模的突变文库池的制作方法。
(专利文献1)日本专利第5390076号公報
(非专利文献1)Cirino,Patrick C.,Kimberly M.Mayer,and DaisukeUmeno.Directed Evolution Library Creation.Humana Press,2003.3-9.
(非专利文献2)Oeling,David,et al.ACS Synthetic Biology 7.9(2018):2317-2321.
(非专利文献3)Wrenbeck,Emily E.,et al.Nature Methods 13.11(2016):928-930.
(非专利文献4)Nedrud,David,Willow Coyote-Maestas,and DanielSchmidt.Proteins:Structure,Function,and Bioinformatics(2021).
(非专利文献5)Braman,Jeffrey,Carol Papworth,and Alan Greener.In VitroMutagenesis Protocols(1996):31-44.
(非专利文献6)Zheng,Lei,Ulrich Baumann,and Jean-Louis Reymond.NucleicAcids Research 32.14(2004):e115-e115.
发明内容
在一个方式中，本发明提供包括以下的工序(a)～(c)的突变文库池的制作方法：
(a)使用模板DNA和多种突变导入用引物对，对每对该突变导入用引物对利用DNA聚合酶进行DNA合成反应，获得具有5’突出末端的DNA片段的工序，其中，该突变导入用引物对与该模板DNA进行退火，具有相互互补的区域，并且在至少一方包含突变导入部位；
(b)使DNA连接酶作用于工序(a)中所得到的DNA片段的工序；和
(c)用工序(b)中所得到的DNA对宿主细胞进行转化的工序。
在另一个方式中，本发明提供包括以下的工序(a’)～(c)的突变文库池的制作方法：
(a’)使用模板DNA和突变导入用引物对，利用DNA聚合酶进行DNA合成反应，获得具有5’突出末端的DNA片段的工序，其中，该模板DNA是碱基序列的一部分不同的多种DNA的混合物，该突变导入用引物对与该模板DNA进行退火，具有相互互补的区域，并且在至少一方包含突变导入部位；
(b)使DNA连接酶作用于工序(a’)中所得到的DNA片段的工序；和
(c)用工序(b)中所得到的DNA对宿主细胞进行转化的工序。
在另一个方式中，本发明提供通过上述的突变文库池的制作方法制得的突变文库池。
在另一个方式中，本发明提供一种具有所期望的性质的DNA的筛选方法，该方法包括从通过上述的突变文库池的制作方法制得的突变文库池，以所期望的性质为指标，筛选具有该所期望的性质的DNA的工序。
附图说明
图1是用于在β-内酰胺酶的第24个残基的组氨酸导入饱和突变的引物对的设计的概略图。
图2是表示YR288dRT(α-淀粉酶突变体)单突变文库池的YR288dRT的各氨基酸残基位置中DNA三联体的出现频率的图。
图3是表示YR288dRT双重突变文库池的YR288dRT的各氨基酸残基位置中DNA三联体的出现频率的图。
图4是在YR288dRT的各氨基酸残基位置通过易错PCR导入1碱基取代而得到的突变的映射图。
具体实施方式
在本说明书中，“突变文库池”是指包含由于不同的突变得到的不同的碱基序列的DNA的混合物、或具有该DNA的菌体的混合物。通过本发明的方法制作的突变文库池优选为包含由于不同的突变得到的不同的碱基序列的质粒DNA的混合物、或具有该质粒DNA的菌体的混合物。例如，关于某种蛋白质的“突变文库池”是指包含编码该蛋白质的DNA且由于不同的突变得到的不同的碱基序列所构成的DNA的质粒DNA的混合物、或具有该质粒DNA的菌体的混合物。关于某种蛋白质的“单突变文库池”是指上述突变文库池之中构成突变文库池的各个成员为在编码该蛋白质的DNA中具有相当于单一氨基酸残基的取代的突变的突变文库池。另外，关于某种蛋白质的“双重突变文库池”是指上述突变文库池之中构成突变文库池的各个成员为编码该蛋白质的DNA中具有相当于任意2处氨基酸残基的取代的突变的突变文库池。
在本说明书中，“饱和突变导入”是指在DNA的特定的位置的碱基序列中导入可以发生的各种突变，在该DNA编码蛋白质的情况下，作为结果，导入在该蛋白质的特定的位置的氨基酸残基可以产生的各种突变。
在本说明书中，碱基和氨基酸残基的缩写根据公认的IUPAC标记。在本说明书中，“脱氧核糖核酸(DNA)”不仅包含双链DNA，也包含构成双链DNA的正义链和反义链这样的单链DNA。
在本说明书中，与某碱基序列“互补”不限于指该某碱基序列的完全互补的序列的情况，只要与该某碱基序列的互补序列具有优选为80％以上、更优选为90％以上、进一步优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上的碱基序列的同一性即可。碱基序列的同一性能够根据BLAST等的算法确定。
这里所能够采用的各种操作、例如以DNA的合成、同切断、删除、添加或结合为目的的酶处理、同分离、纯化、选择等、重组DNA的制作等均能够根据通常方法进行(例如参照《分子遗传学实验法(Method for Molecular Genetic Experiment)》、共立出版株式会社1993年发行；《PCR技术(PCR Technology)》、宝酒造株式会社1990年发行、Science,224,1431(1984)；Biochem.Biophys.Res.Comm.,130,692(1985)；Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,80,5990(1983)；Moplecular Cloning,by T.Maniatis et al.,Cold Spring HarborLaboratory(1982)等)。
本说明书中所引用的全部专利文献、非专利文献、及其它的出版物在本说明书中作为参考而整体引用。
本发明提供能够低价且简便地制作多样性高且广泛含有目标突变的突变文库池的方法。
本发明的发明人对突变文库池的制作方法进行了各种研究，结果发现，通过使用模板DNA和用于导入不同的突变的多种互补的引物对，对每对该互补的引物对进行PCR，将所得到的DNA片段混合，对宿主细胞进行转化，能够制作突变文库池。另一方面，发现了使用了互补的引物对通过PCR扩增得到的DNA片段的转化效率对于需要多样性的突变文库池的构建是不充分的这样的技术问题。本发明的发明人为了解决该技术问题，进一步重复进行了研究，结果发现，将通过使用了互补的引物对的PCR而扩增得到的DNA片段提供给连接反应，由此，能够大幅提高转化效率。还发现了作为模板DNA使用预先制作的突变文库池，能够制作飞跃性地提高了多样性的突变文库池。
根据本发明的方法，能够制作多样性高且广泛含有目标突变的网罗性、半网罗性的突变文库池。本发明的方法基本上包括使用了互补的引物对的DNA合成反应、连接反应和转化这样的简便方法，能够低价地制作突变文库池。
本发明提供突变文库池的制作方法。该方法包括以下的工序(a)～(c)。
(a)使用模板DNA和多种突变导入用引物对，对每对该突变导入用引物对利用DNA聚合酶进行DNA合成反应，获得具有5’突出末端的DNA片段的工序，其中，该突变导入用引物对与该模板DNA进行退火，具有相互互补的区域，并且在至少一方包含突变导入部位；
(b)使DNA连接酶作用于工序(a)中所得到的DNA片段的工序；和
(c)用工序(b)中所得到的DNA对宿主细胞进行转化的工序。
本发明的方法的工序(a)是使用模板DNA和多种突变导入用引物对，对每对该突变导入用引物对利用DNA聚合酶进行DNA合成反应，获得具有5’突出末端的DNA片段的工序。通过这样的工序，获得在特定的部位导入了突变的DNA片段。
本发明的方法中所使用的“模板DNA”只要包含要导入突变的目标DNA即可。目标DNA的种类和来源没有特别限定。作为目标DNA，可以列举编码启动子的DNA、编码蛋白质的DNA等，优选列举编码蛋白质的DNA。目标DNA可以为任意的长度，其长度例如优选为15个碱基以上、更优选为60个碱基以上、进一步优选为150个碱基以上、进一步优选为300个碱基以上、更进一步优选为450个碱基以上、更进一步优选为600个碱基以上、更进一步优选为900个碱基以上，并且优选为目标DNA的全长以下。其换算为氨基酸序列长时，优选为5个氨基酸残基以上、更优选为20个氨基酸残基以上、进一步优选为50个氨基酸残基以上、进一步优选为100个氨基酸残基以上、更进一步优选为150个氨基酸残基以上、更进一步优选为200个氨基酸残基以上、更进一步优选为300个氨基酸残基以上，并且优选为目标DNA所编码的氨基酸序列的全长以下。目标DNA能够从包含该目标DNA的基因组DNA、线粒体基因组DNA、叶绿体基因组DNA、质粒DNA、病毒基因组DNA、合成DNA等通过通常的基因工程的方法来获得。
模板DNA只要是环状DNA即可，优选为双链环状DNA。双链环状DNA只要能够形成环状结构即可，也包括在一个链或两个链具有切口(nick)或裂口(gap)的DNA、以及链的一部分为单链的DNA。作为环状DNA的具体例，可以列举质粒DNA、粘粒DNA等，在本发明的方法中适合使用质粒DNA。作为优选的质粒DNA的例子，不限定于以下例子，可以列举pET22b(+)、pBR322、pBR325、pUC57、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、pBluescript、pHA3040SP64、pHSP64R或pASP64(日本专利第3492935号)、pHY300PLK(Jpn J Genet，1985，60：235-243)、pAC3(Nucleic Acids Res，1988，16：8732)、pUB110(J Bacteriol，1978，134：318-329)、pTA10607(Plasmid，1987，18：8-15)等。该质粒中，可以插入有用于在后述的工序(c)中选择转化体的标记基因(例如，氨苄西林、新霉素、卡那霉素、氯霉素等药剂的抗性基因)。或者，在对宿主使用营养需求性株时，编码所需求的营养的合成酶的基因可以作为标记基因插入。更或者，在使用为了生长而需要特定的代谢的选择培养基时，可以插入该代谢的相关基因作为标记基因。
模板DNA可以使用1种模板DNA，也可以使用碱基序列的一部分、具体而言为目标DNA的碱基序列的一部分不同的多种DNA的混合物。其中，多种是指至少2种，优选为50种以上、更优选为100种以上、进一步优选为300种以上、进一步优选为500种以上、更进一步优选为1000种以上、更进一步优选为2000种以上、更进一步优选为3000种以上、更进一步优选为5000种以上、更进一步优选为10000种以上，并且优选为目标DNA的碱基序列理论上所能够产生的全部突变体的种类数以下。与模板DNA的种类数增加相对应，所得到的突变文库池的多样性提高。另外，碱基序列的一部分不同是指碱基序列中的至少1个碱基不同。
或者，作为模板DNA，也能够使用通过本发明的方法制作的突变文库池或通过公知的方法(例如，易错PCR)制作的突变文库池，由此，能够制作多样性更高的突变文库池。
本发明的方法中所使用的“突变导入用引物对”与模板DNA进行退火，具有相互互补的区域，并且在至少一方包含突变导入部位。其中，“具有相互互补的区域”是指构成引物对的第一引物和第二引物的序列的一部分或全部相互形成互补序列。本说明书中，有时将具有相互互补的区域的引物对称为互补的引物对。另外，引物对的相互互补的区域优选与模板DNA也互补。从降低引物二聚体的方面考虑，第一引物和第二引物的序列优选为各引物仅一部分相互形成互补序列，更优选各引物的5’末端侧的至少一部分相互形成互补序列，进一步优选各引物的5’末端侧的包含5’末端的区域相互形成互补序列。互补序列的长度没有特别限定，优选为9～30个碱基、更优选为12～24个碱基、进一步优选为15～18个碱基。
“突变导入部位”是用于对模板DNA、具体而言为模板DNA中的目标DNA导入突变的部位，包含相当于导入的突变的碱基序列。作为突变，可以为取代、插入、缺失的任意种，可以为任意1种，也可以为任意2种以上的组合。导入的突变为取代时，相当于突变的碱基序列设为目标DNA中导入的碱基序列或与其互补的碱基序列即可。或者，导入的突变为插入时，相当于突变的碱基序列为目标DNA中插入的碱基序列或与其互补的碱基序列即可。为了导入取代或插入，作为构成相当于突变的碱基序列的碱基，也能够使用选自R、M、W、S、Y、K、H、B、D、V和N的至少1种的混合碱基，一次性导入多种突变。或者，导入的突变为缺失时，将从目标DNA缺失的碱基序列的5’侧相邻的碱基序列和3’侧相邻的碱基序列连结而成的碱基序列或与其互补的碱基序列作为相当于突变的碱基序列即可。突变导入部位的长度没有特别限定，导入的突变为取代或插入时，优选为1～21个碱基、更优选为1～18个碱基、进一步优选为3～9个碱基。导入的突变为缺失时，突变导入部位的长度没有特别限定。
突变导入部位包含于构成突变导入用引物对的第一引物和第二引物中的至少一方即可，也可以包含于双方。仅在一个引物包含突变导入部位时，突变导入部位包含于一方引物与另一方引物不互补的区域，优选包含于一方引物与另一方引物不互补的区域靠3’侧的区域。而在引物双方包含突变导入部位时，突变导入部位包含于双方的引物的相互互补的区域，由相互互补的序列构成。从费用的方面考虑，突变导入部位优选包含于突变导入用引物对的任意一方的引物。在包含突变导入部位的引物中，优选在突变导入部位的3’末端侧包含用于与模板DNA退火的碱基序列，其长度没有特别限定，优选为5～30个碱基、更优选为10～25个碱基、进一步优选为15～20个碱基。
作为优选的突变导入用引物对的例子，虽然不限定于下述例子，优选如下的引物对：与模板DNA进行退火，具有与5’末端相互互补的15个碱基左右的碱基序列，一方的引物在包含与另一方的引物互补的区域的3’末端侧包含突变导入部位，还在其3’末端侧包含17个碱基左右的碱基序列，在该另一方的引物与该一方的引物互补的区域的3’末端侧包含9个碱基左右的碱基序列。
本发明的方法中，使用多种突变导入用引物对。其中，多种是指至少2种，优选为10种以上、更优选为20种以上、进一步优选为30种以上、进一步优选为50种以上、更进一步优选为70种以上、更进一步优选为100种以上、更进一步优选为150种以上、更进一步优选为200种以上、更进一步优选为300种以上，并且优选为目标DNA的碱基序列中理论上能够导入的突变的种类数以下。多种突变导入用引物对分别用于对目标DNA导入不同的突变，优选用于对目标DNA的不同位置导入突变。因此，多种突变导入用引物对优选对目标DNA导入至少2种类、优选为10种以上、更优选为20种以上、进一步优选为30种以上、进一步优选为50种以上、更进一步优选为70种以上、更进一步优选为100种以上、更进一步优选为150种以上、更进一步优选为200种以上、更进一步优选为300种以上、且优选为目标DNA的碱基序列中理论上能够导入的突变的种类数以下的突变。另外，多种突变导入用引物对优选对目标DNA导入至少2处、优选为10处以上、更优选为20处以上、进一步优选为30处以上、进一步优选为50处以上、更进一步优选为70处以上、更进一步优选为100处以上、更进一步优选为150处以上、更进一步优选为200处以上、更进一步优选为300处以上、且优选为目标DNA的碱基序列中理论上能够导入的个数以下的突变。
突变导入用引物对能够基于目标DNA的碱基序列和相当于导入的突变的碱基序列来适当设计。引物的长度只要是能够进行特异性退火和链延伸的长度即可，优选列举具有10～100个碱基、更优选15～50个碱基、进一步优选20～40个碱基的链长。引物只要能够进行特异性退火和链延伸即可，可以包含与模板DNA的错配。另外，引物能够为DNA或者RNA，可以为合成的也可以为天然的。
在本发明的方法中，“利用DNA聚合酶进行的DNA合成反应”是指利用各种DNA聚合酶进行的PCR扩增反应或利用各种DNA聚合酶进行的DNA的复制反应。该反应能够使用本领域技术人员所公知的任意的方法来进行。本发明的方法中能够使用的DNA聚合酶只要能够以DNA为模板合成具有与其互补的碱基序列的DNA链即可，可以是任意的，从降低目标外的突变导入的方面考虑，优选具有校正活性、准确性高的DNA聚合酶。这样的DNA聚合酶市面有售，例如，能够使用KOD DNA聚合酶(TOYOBO)、PrimeSTAR(注册商标)DNA聚合酶(TAKARABIO)、PfuUltra(注册商标)DNA聚合酶(AGILENT)、Platinum(注册商标)SuperFi IIDNA聚合酶(Thermo Fisher Scientific)等。
利用DNA聚合酶进行的DNA合成反应优选通过PCR进行。PCR能够使用市售的PCR用试剂、机器，根据常规方法来进行。PCR的条件没有特别限定，根据每个PCR确定最佳条件即可，例如，可以列举以下的条件。
1)双链DNA向单链DNA的热变性：通常以93～95℃左右、通常加热3秒～1分钟左右。
2)退火：通常以50～60℃左右、通常加热10秒～1分钟左右。
3)DNA延伸反应：通常以60～74℃左右、通常加热10秒～5分钟左右。
将上述1)～3)的反应设为1个循环，通常将其进行30个循环以上、优选35个循环以上、且通常50个循环以下、优选45个循环以下即可。
利用DNA聚合酶进行的DNA合成反应中，使用多种突变导入用引物对，对每对突变导入用引物对进行。其结果，在每个DNA合成反应中，得到导入了不同的突变的DNA片段。这些DNA片段可以分别提供给工序(b)，也可以混合提供给工序(b)，从操作效率的方面考虑，优选将DNA片段混合提供给工序(b)。因此，本发明的方法包括在工序(a)之后接着将所得到的DNA片段混合的工序。
在DNA合成反应后，根据需要，可以用DpnI等仅消化甲基化DNA的限制酶进行处理，除去模板DNA。或者，通过使提供给DNA合成反应的模板DNA的浓度充分低，也能够不进行DpnI处理而进入下一工序。另外，DNA合成反应后，根据需要，可以使用乙醇沉淀、电泳、柱纯化、磁珠纯化、亲和纯化等的通常的手段对DNA片段进行纯化。
这样操作而得到的DNA片段典型而言是形成由来自构成突变导入用引物对的第一引物的延伸链和来自第二引物的延伸链构成的双链的环状DNA、且具有5’突出末端的DNA片段，包含来自该突变导入用引物对所包含的突变导入部位的突变。
或者，作为工序(a)，也可以进行以下的工序(a’)。
(a’)使用模板DNA和突变导入用引物对，利用DNA聚合酶进行DNA合成反应，获得具有5’突出末端的DNA片段的工序，其中，该模板DNA是碱基序列的一部分不同的多种DNA的混合物，该突变导入用引物对与该模板DNA进行退火，具有相互互补的区域，并且在至少一方包含突变导入部位。
工序(a’)是使用模板DNA和突变导入用引物对，利用DNA聚合酶进行DNA合成反应，获得具有5’突出末端的DNA片段的工序。通过这样的工序，获得在特定的部位导入了突变的DNA片段。
“模板DNA”是碱基序列的一部分、具体而言为目标DNA的碱基序列的一部分不同的多种DNA的混合物，关于各模板DNA的具体的内容，如前所述。其中，多种是指至少2种，优选为50种以上、更优选为100种以上、进一步优选为300种以上、进一步优选为500种以上、更进一步优选为1000种以上、更进一步优选为2000种以上、更进一步优选为3000种以上、更进一步优选为5000种以上、更进一步优选为10000种以上，并且优选为目标DNA的碱基序列理论上所能够产生的全部突变体的种类数以下。与模板DNA的种类数增加相对应，所得到的突变文库池的多样性提高。
或者，作为模板DNA，也能够使用通过本发明的方法制作的突变文库池或通过公知的方法(例如，易错PCR)制作的突变文库池，由此，能够制作多样性更高的突变文库池。
“突变导入用引物对”与模板DNA进行退火，具有相互互补的区域，并且在至少一方包含突变导入部位。关于突变导入用引物对的具体的内容，如前所述。突变导入用引物对可以仅使用1种，也可以使用多种。其中，多种是指至少2种，优选为10种以上、更优选为20种以上、进一步优选为30种以上、进一步优选为50种以上、更进一步优选为70种以上、更进一步优选为100种以上、更进一步优选为150种以上、更进一步优选为200种以上、更进一步优选为300种以上，并且优选为目标DNA的碱基序列中理论上能够导入的突变的种类数以下。使用多种突变导入引物对时，优选对每对突变导入用引物对利用DNA聚合酶进行DNA合成反应。关于利用DNA聚合酶进行的DNA合成反应的具体的内容，如前所述。
在本发明的方法中，工序(b)是对工序(a)中所得到的DNA片段作用DNA连接酶的工序。如上所述，工序(a)中所得到的DNA片段是具有5’突出末端的DNA片段，各链的5’末端与3’末端不连结。工序(b)是使DNA片段的各链的5’末端和3’末端分别连结的工序，通过这样的工序，能够大幅提高此后的转化效率。
对DNA片段作用DNA连接酶的工序能够根据公知的方法实施。作为本发明的方法中能够使用的DNA连接酶，没有特别限定，可以列举T4 DNA连接酶、E.coli DNA连接酶、TaqDNA连接酶等。这些DNA连接酶市面有售，能够从TOYOBO、TAKARA BIO等购入。利用DNA连接酶的连接反应能够以通常的步骤、例如根据酶附带的操作手册来实施。反应条件能够根据酶的最佳条件、作为底物的DNA片段的量来适当确定。例如，连接反应能够将温度设定为4～25℃、优选为16℃、将反应时间设定为5～60分钟、优选为5～30分钟来实施。或者，连接反应能够利用Ligation high Ver.2(TOYOBO)、DNA Ligation Kit Ver.2.1(TAKARA BIO)等的市售的试剂盒，根据试剂盒附带的操作手册来实施。
作为对DNA片段高效作用DNA连接酶的方法，例如，可以列举使用5’末端被预先磷酸化的突变导入用引物对进行工序(a)，对所得到的DNA片段作用DNA连接酶的方法。此时，在工序(a)中所得到的DNA片段的各链的5’末端由于存在磷酸基，因此，通过对该DNA片段作用DNA连接酶，该DNA片段的各链的5’末端和3’末端被高效连结。另外，可以列举使用5’末端没有被磷酸化的突变导入用引物对进行工序(a)，对所得到的DNA片段作用多聚核苷酸激酶，接着作用DNA连接酶的方法。此时，工序(a)中所得到的DNA片段的各链的5’末端不存在磷酸基，通过作用多聚核苷酸激酶将该DNA片段的5’末端磷酸化之后作用DNA连接酶，该DNA片段的各链的5’末端和3’末端被高效连结。这些方法作为将DNA片段与载体连接时高效作用DNA连接酶的方法是已知的，但是，如本发明这样以使用互补的引物对得到的DNA片段对宿主细胞进行转化时的转化效率飞跃性提高这一点是未知的，完全是预料外的。
另外，作为对DNA片段高效地作用DNA连接酶的方法，也可以列举对工序(a)中所得到的DNA片段组合作用DNA连接酶以及5’核酸外切酶和DNA聚合酶的方法，在使用5’末端没有被磷酸化的突变导入用引物对进行工序(a)时，也能够使所得到的DNA片段的各链的5’末端和3’末端高效地连结。包含上述3种的酶的试剂NEBuilder(注册商标)HiFi DNAAssembly Master Mix(New England Biolabs)市面有售。已知该试剂能够为各种DNA片段的集合，但是，如本发明这样以使用互补的引物对得到的DNA片段对宿主细胞进行转化时的转化效率飞跃性提高这一点是未知的，完全是预料外的。
在对每个工序(a)中所得到的DNA片段分别实施工序(b)时，所得到的DNA可以直接分别提供给工序(c)，也可以混合提供给工序(c)，从操作效率的方面考虑，优选将DNA混合提供给工序(c)。因此，本发明的方法包括在工序(b)之后接着将所得到的DNA混合的工序。
工序(b)中所得到的DNA可以根据需要使用乙醇沉淀、电泳、柱纯化、磁珠纯化、亲和纯化等的通常的手段进行纯化。
在本发明的方法中，工序(c)是用工序(b)中所得到的DNA对宿主细胞进行转化的工序。通过该工序，能够得到包含导入了突变的目标DNA的转化体。
作为宿主细胞，可以列举细菌、丝状菌等的微生物。作为细菌的例子，可以列举属于大肠杆菌(Escherichia coli)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、李斯特菌属(Listeria)、杆菌属(Bacillus)的细菌等，其中，优选大肠杆菌和杆菌属细菌，更优选大肠杆菌。作为丝状菌的例子，可以列举木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、根霉属(Rizhopus)等。
作为转化方法，能够使用电穿孔法、转化法、转染法、接合法、原生质体法、粒子枪法、农杆菌法等本领域通常使用的方法。适当进行了转化的转化体(转化细胞)能够以标记基因的表达、营养需求性等为指标进行筛选。
对每个工序(a)中所得到的DNA片段分别实施工序(b)和(c)时，将筛选得到的转化体混合即可。因此，本发明的方法包括在工序(c)之后接着将所得到的转化体混合的工序。
筛选得到的各转化体是含有包含分别由不同的突变引起的不同的碱基序列的目标DNA的菌体。因此，筛选得到的转化体的混合物构成突变文库池。另外，从筛选得到的转化体的混合物提取的DNA、或者从筛选得到的转化体提取的DNA的混合物也构成突变文库池。该DNA能够从转化体或转化体的混合物使用本领域中通常的方法提取或分离DNA来获得。该提取或分离时例如能够使用市售的DNA提取试剂盒等。
通过将本发明的方法中制作的突变文库池作为模板，进行本发明的突变文库池的制作方法或公知的突变文库池制作方法(例如，易错PCR)，能够制作进一步提高了多样性的突变文库池。
在本发明的方法的优选的一个实施方式中，模板DNA包含编码导入了突变的蛋白质的DNA。突变导入用引物对的至少一方中所包含的突变导入部位优选构成为由使该蛋白质的特定的位置的氨基酸残基被取代突变的碱基序列构成，作为该碱基序列，更优选使用NNK、NNS、NNB、NNN、NDT、DBK等。通过将突变导入部位的碱基序列设为NNK、NNS、NNB、NNN、NDT或DBK，能够导入指定多种类的氨基酸残基的密码子，特别是，通过将突变导入部位的碱基序列设为NNK、NNS或NNB，能够网罗性导入指定20种类的氨基酸残基的密码子和终止密码子，并且降低终止密码子的发生概率。使用模板DNA和将上述的突变导入部位的碱基序列设为NNK、NNS或NNB的突变导入用引物对并利用DNA聚合酶进行DNA合成反应而得到的DNA片段是编码该蛋白质的特定的位置的氨基酸残基的密码子为编码本来的氨基酸残基的密码子、编码本来的氨基酸残基以外的任意氨基酸残基的密码子、或终止密码子的DNA片段的混合物，关于该蛋白质的特定的位置的氨基酸残基导入了饱和突变。因此，上述的将突变导入部位的碱基序列设为NNK、NNS或NNB的突变导入用引物对的种类数增加时，在该蛋白质的氨基酸序列导入了饱和突变的氨基酸残基也随之增加。其中，作为上述的突变导入用引物对的种类数，优选为至少2种类、更优选为10种以上、进一步优选为20种以上、进一步优选为30种以上、更进一步优选为50种以上、更进一步优选为70种以上、更进一步优选为100种以上、更进一步优选为150种以上、更进一步优选为200种以上、更进一步优选为300种以上，并且优选为该蛋白质的氨基酸残基数相当的种类以下。使用分别对该蛋白质的各位置的氨基酸残基将上述的突变导入部位的碱基序列设为NNK、NNS或NNB的突变导入用引物对(即，该蛋白质的氨基酸残基数相当的突变导入用引物对)，能够制作该蛋白质的单突变文库池。另外，通过将该单突变文库池作为模板DNA，也能够制作该蛋白质的双重突变文库池。
通过本发明的方法制作的突变文库池优选具有104以上、更优选105以上、进一步优选106以上、进一步优选107以上的DNA序列多样性。另外，DNA序列多样性例如能够通过对构成突变文库池的各成员的碱基序列进行测序，基于所得到的测序数据进行确认。另外，DNA序列多样性可以表示为基于模板DNA的种类数、突变导入用引物对的种类数、用该突变导入用引物对导入的突变的种类数等测算的理论上的DNA序列多样性。在一例中，对于编码全长500个氨基酸的蛋白质的DNA，对单一的全部氨基酸残基使用分别将突变导入部位的碱基序列设为NNK的突变导入用引物对进行饱和突变导入时，以NNK表示的序列包含4×4×2＝32的序列，因此，所得到的单突变文库池的理论上的DNA序列多样性大概测算为500×32＝1.6×104。在另外的一例中，对编码全长500个氨基酸的DNA使用分别在全部组合的2个氨基酸残基将突变导入部位的碱基序列设为NNK的突变导入用引物对进行饱和突变导入时，所得到的双重突变文库池的理论上的DNA序列多样性大概测算为500C2×322＝约1.3×108。
如后述实施例所示，关于本发明的方法中得到的全长483个氨基酸的蛋白质的单突变文库池其理论上的DNA序列多样性为约1.5×104、氨基酸序列多样性为约9.2×103，而从转化效率求得的文库大小为2.7×108，具有能够充分网罗由全部单突变构成的多样性的高的多样性。该多样性与突变文库池制作中通过以往利用的易错PCR所能够制作的单突变文库池的多样性的理论值相比，高至3倍以上。另外，该单突变文库池的平均突变导入数为0.91，为接近理论值的1的良好的值。另外，该单突变文库池具有理论上的DNA序列多样性的80％这样高的覆盖范围。另一方面，关于该蛋白质的双重突变文库池其理论上的DNA序列多样性为约1.1×108、氨基酸序列多样性为约4.2×107，而从转化效率求得的文库大小为9.5×107，具有能够网罗由全部双重突变构成的多样性的大部分的高的多样性。另外，该双重突变文库池的平均突变导入数为1.73，为接近理论值的2的良好的值。另外，该双重突变文库池具有理论上的DNA序列多样性的80％这样高的覆盖范围。这样，通过本发明的方法得到的突变文库池的多样性高且广泛包含目标突变。
通过使用这样的突变文库池，能够筛选用于DNA序列所具有的功能解析、功能提高。例如，从通过本发明的方法制作的突变文库池，以所期望的性质为指标，能够筛选具有该所期望的性质的DNA。其中，DNA的“性质”可以以编码的多肽(例如，酶)的活性、编码的多肽的稳定性、编码的多肽的表达量、编码的启动子的活性、含有该DNA的质粒的拷贝数、含有该DNA的质粒上的与该DNA不同的区域的DNA所编码的多肽的表达量等表示。因此，例如，能够筛选编码的多肽的活性高或者低、编码的多肽的稳定性高或者低、编码的多肽的表达量多或者少、编码的启动子的活性高或者低、含有该DNA的质粒的拷贝数多或者少、或含有该DNA的质粒上的与该DNA不同的区域的DNA所编码的多肽的表达量多或者少的DNA。从突变文库池筛选具有所期望的性质的DNA能够根据该所期望的性质根据适当的方法来实施。
作为本发明的例示的实施方式，在本说明书中进一步公开了以下的物质、制造方法、用途、方法等。但是，本发明不限于这些实施方式。
〔1〕一种突变文库池的制作方法，其中，包括以下的工序(a)～(c)：
(a)使用模板DNA和多种突变导入用引物对，对每对该突变导入用引物对利用DNA聚合酶进行DNA合成反应，获得具有5’突出末端的DNA片段的工序，其中，该突变导入用引物对与该模板DNA进行退火，具有相互互补的区域，并且在至少一方包含突变导入部位；
(b)使DNA连接酶作用于工序(a)中所得到的DNA片段的工序；和
(c)用工序(b)中所得到的DNA对宿主细胞进行转化的工序。
〔2〕如〔1〕所述的方法，其中，优选使用至少2种、更优选为10种以上、进一步优选为20种以上、进一步优选为30种以上、更进一步优选为50种以上、更进一步优选为70种以上、更进一步优选为100种以上、更进一步优选为150种以上、更进一步优选为200种以上、更进一步优选为300种以上的上述突变导入用引物对。
〔3〕如〔1〕或〔2〕所述的方法，其中，上述模板DNA优选为碱基序列的一部分不同的多种、即至少2种、更优选为50种以上、进一步优选为100种以上、进一步优选为300种以上、更进一步优选为500种以上、更进一步优选为1000种以上、更进一步优选为2000种以上、更进一步优选为3000种以上、更进一步优选为5000种以上、更进一步优选为10000种以上的DNA的混合物。
〔4〕如〔1〕～〔3〕中任一项所述的方法，其中，还包括将上述工序(a)中所得到的DNA片段混合的工序、将上述工序(b)中所得到的DNA混合的工序、或将上述工序(c)中所得到的转化体混合的工序。
〔5〕如〔1〕～〔4〕中任一项所述的方法，其中，上述模板DNA优选为编码要导入突变的蛋白质的DNA。
〔6〕如〔1〕～〔5〕中任一项所述的方法，其中，上述突变导入部位的碱基序列优选为NNK、NNS、NNB、NNN、NDT或DBK，更优选为NNK、NNS或NNB。
〔7〕如〔5〕或〔6〕所述的方法，其中，优选使用上述蛋白质的氨基酸残基数相当的种类的上述突变导入用引物对。
〔8〕如〔1〕～〔7〕中任一项所述的方法，其中，上述突变文库池的DNA序列多样性优选为104以上、更优选为105以上、进一步优选为106以上、进一步优选为107以上。
〔9〕一种突变文库池的制作方法，其中，包括以下的工序(a)～(c)：
(a)使用模板DNA和多种突变导入用引物对，对每对该突变导入用引物对利用DNA聚合酶进行DNA合成反应，获得具有5’突出末端的DNA片段的工序，其中，该模板DNA是通过〔1〕～〔8〕中任一项所述的方法制得的突变文库池，该突变导入用引物对与该模板DNA进行退火，具有相互互补的区域，并且在至少一方包含突变导入部位；
(b)使DNA连接酶作用于工序(a)中所得到的DNA片段的工序；和
(c)用工序(b)中所得到的DNA对宿主细胞进行转化的工序。
〔10〕一种突变文库池的制作方法，其中，包括以下的工序(a’)～(c)：
(a’)使用模板DNA和突变导入用引物对，利用DNA聚合酶进行DNA合成反应，获得具有5’突出末端的DNA片段的工序，其中，该模板DNA是碱基序列的一部分不同的多种DNA的混合物，该突变导入用引物对与该模板DNA进行退火，具有相互互补的区域，并且在至少一方包含突变导入部位；
(b)使DNA连接酶作用于工序(a’)中所得到的DNA片段的工序；和
(c)用工序(b)中所得到的DNA对宿主细胞进行转化的工序。
〔11〕如〔10〕所述的方法，其中，上述模板DNA优选为碱基序列的一部分不同的至少2种、更优选为50种以上、进一步优选为100种以上、进一步优选为300种以上、更进一步优选为500种以上、更进一步优选为1000种以上、更进一步优选为2000种以上、更进一步优选为3000种以上、更进一步优选为5000种以上、更进一步优选为10000种以上的DNA的混合物。
〔12〕如〔10〕或〔11〕所述的方法，其中，上述模板DNA是通过〔1〕～〔9〕中任一项所述的方法制得的突变文库池。
〔13〕如〔10〕～〔12〕中任一项所述的方法，其中，使用优选至少2种、更优选为10种以上、进一步优选为20种以上、进一步优选为30种以上、更进一步优选为50种以上、更进一步优选为70种以上、更进一步优选为100种以上、更进一步优选为150种以上、更进一步优选为200种以上、更进一步优选为300种以上的上述突变导入用引物对，对每对该突变导入用引物对利用DNA聚合酶进行DNA合成反应。
〔14〕如〔13〕所述的方法，其中，还包括将上述工序(a’)中所得到的DNA片段混合的工序、将上述工序(b)中所得到的DNA混合的工序、或将上述工序(c)中所得到的转化体混合的工序。
〔15〕如〔10〕～〔14〕中任一项所述的方法，其中，上述模板DNA优选为编码要导入突变的蛋白质的DNA。
〔16〕如〔10〕～〔15〕中任一项所述的方法，其中，上述突变导入部位的碱基序列优选为NNK、NNS、NNB、NNN、NDT或DBK，更优选为NNK、NNS或NNB。
〔17〕如〔15〕或〔16〕所述的方法，其中，优选使用上述蛋白质的氨基酸残基数相当的种类的上述突变导入用引物对。
〔18〕如〔10〕～〔17〕中任一项所述的方法，其中，上述突变文库池的DNA序列多样性优选为104以上、更优选为105以上、进一步优选为106以上、进一步优选为107以上。
〔19〕一种突变文库池，其中，所述突变文库池是通过〔1〕～〔18〕中任一项所述的方法制得的。
〔20〕如〔19〕所述的突变文库池，其中，DNA序列多样性优选为104以上、更优选为105以上、进一步优选为106以上、进一步优选为107以上。
〔21〕一种具有所期望的性质的DNA的筛选方法，其中，包括：从通过〔1〕～〔18〕中任一项所述的方法制得的突变文库池，以所期望的性质为指标，筛选具有该所期望的性质的DNA的工序。
〔22〕如〔21〕所述的方法，其中，上述DNA的性质是以编码的多肽的活性、编码的多肽的稳定性、编码的多肽的表达量、编码的启动子的活性、含有该DNA的质粒的拷贝数、或者含有该DNA的质粒上的与该DNA不同的区域的DNA所编码的多肽的表达量来表示。
实施例
以下，基于实施例进一步详细地说明本发明，但是，本发明不限定于此。
实施例1饱和突变导入用引物对的设计
将在突变导入氨基酸的密码子以及其上游15个碱基、下游17个碱基共计35个碱基中对突变导入氨基酸的密码子变更为NNK的序列作为正向引物。将突变导入氨基酸的密码子的上游24个碱基的互补序列作为反向引物。因此，引物对成为在突变导入氨基酸的密码子的上游15个碱基的部分相互互补。作为一例，在图1中图示了用于在质粒pHY300PLK(TAKARABIO)中在作为氨苄西林抗性基因编码β-内酰胺酶的第24个残基的组氨酸导入饱和突变的引物设计的概要。将β-内酰胺酶的氨基酸序列示于序列号1，将编码β-内酰胺酶的碱基序列示于序列号2，将用于在β-内酰胺酶的第24个残基的组氨酸导入饱和突变的正向引物(CTTCCTGTTTTTGCTNNKCCAGAAACGCTGGTGA A)和反向引物(AGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGC)的碱基序列分别示于序列号3和4。
实施例2使用了互补的引物对通过PCR导入位点特异性的突变
分别与实施例1同样设计用于在质粒pHY300PLK中作为氨苄西林抗性基因编码β-内酰胺酶的第24个残基、第25个残基、第26个残基导入饱和突变的引物合计6个序列，合成寡聚DNA。根据KOD One(TOYOBO)的推荐操作，使用作为模板DNA的质粒pHY300PLK和各引物对进行PCR反应。通过电泳确认目标片段的扩增后，混合全部PCR反应液，用DpnI消化模板后，使用High Pure PCR Product Purification Kit(Roche)对PCR片段进行纯化。使用DNA100ng，根据试剂盒推荐操作，进行向作为文库构建用的高效率大肠杆菌感受态细胞的E.cloni(R)10G SUPREME Electrocompetent Cells(SOLOs)(Lucigen)的转化。作为模板的质粒pHY300PLK在氨苄西林抗性基因以外还包含四环素抗性基因，因此，在缺乏氨苄西林耐性时也能够在含有四环素的培养基增殖。将转化后的菌液适当稀释，涂布于含有四环素LB琼脂培养基，在37℃孵育过夜后对所形成的克隆进行计数，由此求出转化效率(CFU)。转化效率为8.2×104CFU。这对于具有105以上的多样性的突变文库池的构建是不充分的转化效率。
实施例3转化效率的提高1
对实施例2中的引物的5’末端预先进行磷酸化修饰，同样地制备PCR片段。根据Ligation high Ver.2(TOYOBO)的推荐操作进行PCR片段的连接反应，通过乙醇沉淀进行纯化。使用该DNA100ng，与实施例2同样进行转化，求出转化效率。转化效率为3.8×106CFU。对多个克隆确认质粒的序列，结果，在β-内酰胺酶的第24个残基、第25个残基、第26个残基均导入了突变。
根据以上的结果显示，在使用互补的引物对通过PCR进行位点特异性的突变导入法中，通过组合连接反应，转化效率飞跃性提高，能够制备大规模的突变文库池。
实施例4转化效率的提高2
将实施例2中的经纯化的PCR片段与含有5’核酸外切酶活性、DNA聚合酶活性和DNA连接酶活性的NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix(New England Biolabs)等量混合，在50℃孵育1小时后，通过乙醇沉淀进行纯化。使用该DNA 100ng，与实施例2同样进行转化，求出转化效率。转化效率为9.3×107CFU。对多个克隆确认质粒的序列，结果，在β-内酰胺酶的第24个残基、第25个残基、第26个残基均导入了突变。
根据以上的结果显示，通过组合5’核酸外切酶活性、DNA聚合酶活性、DNA连接酶活性，在使用无磷酸化修饰的互补的引物对的PCR产物中，转化效率也飞跃性提高，能够制备大规模的突变文库池。
实施例5YR288dRT表达质粒的构建
将作为使来自芽孢杆菌YR288株(Bacillus sp.YR288株)的α-淀粉酶(WP＿100346362.1)的R178位和T180位缺失的483个氨基酸所构成的突变体的YR288dRT的氨基酸序列示于序列号5，将编码YR288dRT的DNA的碱基序列示于序列号6。将pET22b(+)(Novagen)作为模板，使用引物stop＿pET22b＿fw(TGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCC：序列号7)和pelB＿rv(GGCCATCGCCGGCTGGGC：序列号8)进行PCR，扩增包含PelB信号和stop密码子的载体片段。另外，将编码YR288dRT的DNA作为模板，使用引物pelB＿YR288＿fw(CAGCCGGCGATGGCCGCAGCTCAAAACGGTACGATGATGCAG：序列号9)和pET22b＿YR288＿rv(AGCAGCCGGATCTCACTGTTGAACGTACACGGAGACTGAGC：序列号10)进行PCR，扩增编码YR288dRT的片段。使用这些片段，利用In-Fusion(注册商标)HD Cloning Kit(TAKARA BIO)进行In-Fusion反应，将所得到的In-Fusion反应液向大肠杆菌ECOSTM Competent E.coli DH5α(NIPPON GENE)转化，构建质粒pET22b(+)-YR288dRT。
实施例6YR288dRT单突变文库池的制作
将pET22b(+)-YR288dRT作为模板，分别与实施例1同样设计用于对YR288dRT的全长483个氨基酸导入饱和突变的引物、每1个氨基酸残基分别具有正向引物和反向引物的2个序列的合计966个序列，合成寡聚DNA。作为例子，分别将用于在YR288dRT的第10个残基的酪氨酸导入饱和突变的正向引物和反向引物的碱基序列示于序列号11(GGTACGATGATGCAGNNKTTTGAATGGTATGTACC)和12(CTGCATCATCGTACCGTTTTGAGC)。根据KOD One(TOYOBO)的推荐操作，使用作为模板DNA的质粒pET22b(+)-YR288dRT和各引物对进行合计483个PCR反应。通过电泳确认目标片段的扩增后，混合全部PCR反应液，用DpnI消化模板后，使用High PurePCR Product Purification Kit(Roche)对PCR片段进行纯化。将纯化后的片段与NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix(New England Biolabs)等量混合，在50℃孵育1小时后，通过乙醇沉淀进行纯化。使用该DNA 1μg，与实施例2同样进行转化。将转化后的菌液1μL适当稀释，涂布于含有氨苄西林的LB琼脂培养基，在37℃孵育过夜后对所形成的克隆进行计数，由此求出转化效率(CFU)。将剩余的菌液全量(约1mL)在20mL的含有50ppm羧苄西林(Carbenicillin)的LB培养基接种，在37℃培养过夜后，对质粒进行提取，作为YR288dRT单突变文库池。YR288dRT单突变文库池的理论上的DNA序列多样性为1.5×104，氨基酸序列多样性为9.2×103，从转化效率求出的文库大小为2.7×108。根据该结果，可以认为制得的突变文库池能够充分网罗由全部单突变构成的多样性。
实施例7YR288dRT双重突变文库池的制作
作为模板DNA使用实施例6中制得的YR288dRT单突变文库池，使用与实施例6中所使用的引物对同样的引物组，进行合计483个PCR反应。通过电泳确认目标片段的扩增后，混合全部PCR反应液，用DpnI消化模板后，使用High Pure PCR Product Purification Kit(Roche)对PCR片段进行纯化。将纯化后的片段与NEBuilder HiFi DNA Assembly MasterMix(New England Biolabs)等量混合，在50℃孵育1小时后，通过乙醇沉淀进行纯化。使用该DNA 1μg，与实施例2同样进行转化。将转化后的菌液1μL适当稀释，涂布于含有氨苄西林的LB琼脂培养基，在37℃孵育过夜后对所形成的克隆进行计数，由此求出转化效率(CFU)。将剩余的菌液全量(约1mL)在20mL的含有50ppm羧苄西林的LB培养基接种，在37℃培养过夜后，对质粒进行提取，作为YR288dRT双重突变文库池。YR288dRT双重突变文库池的理论上的DNA序列多样性为1.2×108，氨基酸序列多样性为4.2×107，从转化效率求出的文库大小为9.5×107。根据该结果，可以认为制得的突变文库池能够网罗由全部双重突变构成的多样性的大部分。
实施例8YR288dRT突变文库池的品质确认
将pET22b(+)-YR288dRT、实施例6中制得的YR288dRT单突变文库池和实施例7中制得的YR288dRT双重突变文库池作为模板，使用引物pET22b＿NGS＿fw(GCGAAATTAATACGACTCACTATAG：序列号13)和pET22b＿NGS＿rv(GCCAATCCGGATATAGTTCC：序列号14)分别进行PCR，扩增包含YR288dRT(及其突变体)的编码区域全长的片段。将各PCR产物提供给琼脂糖凝胶电泳后，仅切出凝胶的目标带部分，使用High Pure PCR ProductPurification Kit(Roche)进行纯化。根据NEBNext(注册商标)dsDNA Fragmentase(NewEngland Biolabs)的推荐操作分别进行片段化，根据NEBNext Ultra(商标)IIDNA LibraryPrep Kit for Illumina(注册商标)(New England Biolabs)的推荐操作制备二代测序仪用文库。利用GenNext NGS Library Quantification Kit(TOYOBO)测定浓度后，使用MiSeqReagent Micro Kit v2(300个循环(300-cycles))(illumina)并使用MiSeq系统(illumina)进行测序。用CLC Genomics Workbench(QIAGEN)进行剪切(trimming)和测序，输出读取(Read)信息。
在各密码子中，将包含该密码子的读取(Read)中导入了突变的读取(Read)数的比例作为突变率(Mutation Rate)算出。全长的突变率的总和为各突变文库池的平均突变导入数。对于各突变文库池算出突变率的总和，将除以作为空白的pET22b(+)-YR288dRT的突变率(MiSeq的Error导致的突变率)的总和得到的值作为平均突变导入数。单突变文库池的平均突变导入数为0.91，双重突变文库池的平均突变导入数为1.73。
在各密码子中，算出64种DNA三联体的出现频率，制作热图。将假设为均等导入突变时的理论值(单突变文库池中为0.0065％，双重突变文库池中为0.013％)作为热图的上限值，下限值设为0。单突变文库池(图2)、双重突变文库池(图3)中均以高的覆盖范围包含了包含混合碱基NNK的32种DNA三联体。关于单突变文库池，理论值0.0065％的1/10以上的出现频率的突变体数为13401，显示理论上的DNA序列多样性的80％的覆盖范围。而作为通过易错PCR所能够获得的突变体，在图4中描绘了对各密码子仅导入1个碱基的取代而得到的突变。由于通过仅1个碱基的取代而得到的突变体数为4347，因此，单突变文库池与通过易错PCR所能够制作的突变文库池相比，具有3倍以上的单突变多样性。
根据以上的结果显示，制得的单突变文库池和双重突变文库池是具有高的多样性、高的突变导入率和高的覆盖范围的突变文库池。

Claims (10)

1.一种突变文库池的制作方法，其中，
包括以下的工序(a)～(c)：
(a)使用模板DNA和多种突变导入用引物对，对每对该突变导入用引物对利用DNA聚合酶进行DNA合成反应，获得具有5’突出末端的DNA片段的工序，其中，该突变导入用引物对与该模板DNA进行退火，具有相互互补的区域，并且在至少一方包含突变导入部位；
(b)使DNA连接酶作用于工序(a)中所得到的DNA片段的工序；和
(c)用工序(b)中所得到的DNA对宿主细胞进行转化的工序。
2.如权利要求1所述的方法，其中，
使用10种以上的突变导入用引物对。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，
所述模板DNA是碱基序列的一部分不同的多种DNA的混合物。
4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，
还包括：混合所述工序(a)中所得到的DNA片段的工序；混合所述工序(b)中所得到的DNA的工序；或混合所述工序(c)中所得到的转化体的工序。
5.一种突变文库池的制作方法，其中，
包括以下的工序(a)～(c)：
(a)使用模板DNA和多种突变导入用引物对，对每对该突变导入用引物对利用DNA聚合酶进行DNA合成反应，获得具有5’突出末端的DNA片段的工序，其中，该模板DNA是通过权利要求1～4中任一项所述的方法制得的突变文库池，该突变导入用引物对与该模板DNA进行退火，具有相互互补的区域，并且在至少一方包含突变导入部位；
(b)使DNA连接酶作用于工序(a)中所得到的DNA片段的工序；和
(c)用工序(b)中所得到的DNA对宿主细胞进行转化的工序。
6.一种突变文库池的制作方法，其中，
包括以下的工序(a’)～(c)：
(a’)使用模板DNA和突变导入用引物对，利用DNA聚合酶进行DNA合成反应，获得具有5’突出末端的DNA片段的工序，其中，该模板DNA是碱基序列的一部分不同的多种DNA的混合物，该突变导入用引物对与该模板DNA进行退火，具有相互互补的区域，并且在至少一方包含突变导入部位；
(b)使DNA连接酶作用于工序(a’)中所得到的DNA片段的工序；和
(c)用工序(b)中所得到的DNA对宿主细胞进行转化的工序。
7.如权利要求6所述的方法，其中，
所述模板DNA是碱基序列的一部分不同的50种以上的DNA的混合物。
8.如权利要求6或7所述的方法，其中，
所述模板DNA是通过权利要求1～5中任一项所述的方法制得的突变文库池。
9.一种突变文库池，其中，
所述突变文库池是通过权利要求1～8中任一项所述的方法制得的。
10.一种具有所期望的性质的DNA的筛选方法，其中，
所述方法包括：
从通过权利要求1～9中任一项所述的方法制得的突变文库池，以所期望的性质为指标，筛选具有该所期望的性质的DNA的工序。
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