CN118284684A - 细胞培养膜和生物体组织的制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明可以提供在细胞培养膜的两侧形成细胞层之后，能容易地使该细胞培养膜分解的细胞培养膜。一种在两面具备细胞的培养区域的细胞培养膜，其特征在于，以重均分子量为20000～190000的甲基纤维素为主要成分，或者以重均分子量为190000～400000的甲基纤维素为主要成分，并且含有溶解温度调整剂。溶解温度调整剂优选为苯乙烯磺酸钠、碘化钠或甲苯磺酸钠中的至少任意种。此外，细胞培养膜优选附加有难溶解性材料。
Description
技术领域
本发明涉及用于形成多个细胞层的细胞培养膜和使用了该细胞培养膜的生物体组织的制造方法。
背景技术
近年来，在制造生物体组织时，通过使用细胞培养膜的两面作为培养区域进行细胞培养，进行能得到具备多个细胞层的生物体组织的两面培养。两面培养由于可以形成分别由不同种类的细胞构成的多个细胞层，因此在分析不同种细胞之间的相互作用等中是有用的。
例如，可以使用器官芯片等进行两面培养。器官芯片通过层叠两张基板和细胞培养膜而构成，在基板上分别形成有流路(微流路)，各流路被细胞培养膜隔开，在各流路中能培养相同的细胞或不同的细胞。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2017-504320号公报
发明内容
发明所要解决的问题
然而，作为细胞培养膜广泛使用树脂制的半透膜时，由于细胞层的形成，半透膜的孔逐渐堵塞，介由细胞培养膜的液性成分的透过性降低，结果存在不能适当地用于所述相互作用的分析这样的问题。
另一方面，若使用孔径大(例如10μm以上)的细胞培养膜，则存在在细胞接种时细胞会穿过细胞培养膜、无法在细胞培养膜的两侧适当地形成细胞层这样的问题。
此外，还存在难以将形成于细胞培养膜上的细胞层从细胞培养膜分离并取出这样的问题。
例如，若使用胰蛋白酶等酶进行酶处理，则细胞破碎，不能作为细胞层从细胞培养膜中分离。
另一方面，在由聚N-异丙基丙烯酰胺(pNIPAM)构成的细胞培养膜上形成细胞层，通过使其溶解，可以不进行酶处理而从细胞培养膜中分离细胞层。然而，在pNIPAM的溶解中，存在担心单体的毒性这样的问题。
因此，本发明人等进行了深入研究，成功地开发了能解决上述问题的细胞培养膜。具体而言，以甲基纤维素为主要成分，在细胞培养膜上形成细胞层之后，通过使其低温化，使甲基纤维素溶解，由此可以得到不妨碍细胞层间的液性成分的透过的细胞培养膜。此外，根据该细胞培养膜，在从细胞培养膜分离细胞层时，不再用担心产生毒性。
再者，存在甲基纤维素的溶解通常需要1小时以上的时间这样的问题。然而，在将所形成的细胞层用于分析不同种细胞之间的相互作用等的情况下，理想的是，尽可能迅速地进行甲基纤维素的溶解，理想的是以10分钟以下进行。其原因在于，越长时间放置在低温环境中对细胞的损伤越大。
因此，本发明人等进一步研究，确定了能在10分钟以下溶解的甲基纤维素的重均分子量和温度范围，并且对于重均分子量在此以上的甲基纤维素，使细胞培养膜含有溶解温度调整剂，确定了能在10分钟以下溶解的甲基纤维素的重均分子量和温度范围。
在此，在专利文献1中，记载了使用在低剪切微流体器件中随时间溶解的生物相容性材料作为细胞培养膜。
然而，由于像这样地细胞培养膜随时间地溶解，细胞层不能在分析不同种细胞之间的相互作用等中适当地使用，也不能用于从细胞培养膜中分离细胞层。
本发明是鉴于上述情况而完成的，其目的在于，提供一种在细胞培养膜的两侧形成细胞层之后，能容易地使该细胞培养膜分解的细胞培养膜、以及使用了该细胞培养膜的生物体组织的制造方法。
技术方案
为了实现上述目的，本发明的细胞培养膜构成为在两面具备细胞的培养区域，且所述细胞培养膜以重均分子量为20000～190000的甲基纤维素为主要成分。
此外，本发明的细胞培养膜构成为在两面具备细胞的培养区域，且所述细胞培养膜以重均分子量为190000～400000的甲基纤维素为主要成分，含有溶解温度调整剂。
此外，本发明的细胞培养膜优选构成为，所述溶解温度调整剂为苯乙烯磺酸钠、碘化钠或甲苯磺酸钠中的至少任意种。
此外，本发明的细胞培养膜优选构成为，所述难溶解性材料为聚对苯二甲酸乙二醇酯、玻璃纤维、纤维素酯、聚偏氟乙烯或聚碳酸酯中的至少任意种。
此外，本发明的细胞培养膜优选构成为，所述难溶解性材料为聚苯乙烯、环烯烃聚合物或环烯烃共聚物中的至少任意种。
此外，更优选构成为，在该细胞培养膜的至少一个表面具备细胞的支架材料的构成，进一步优选为所述支架材料为胶原、基质胶、纤连蛋白、层粘连蛋白、壳聚糖或丝绸中的至少任意种。
此外，更优选构成为，该细胞培养膜的至少一个表面经表面处理而成。
此外，还优选构成为，将本发明的细胞培养膜制成含有黏附附性细胞。
此外，本发明的生物体组织的制造方法是具有多个细胞层的生物体组织的制造方法，包括：向具备细胞培养膜和由所述细胞培养膜划分出的两个培养空间的生物体组织形成装置中的所述两个培养空间供给细胞和培养液的工序，所述细胞培养膜在两面具备细胞的培养区域，在培养了细胞后配置于多个细胞层之间，所述细胞培养膜以重均分子量为20000～190000的甲基纤维素为主要成分；在所述两个培养空间中培养所述细胞，在所述细胞培养膜的两面形成细胞层的工序；以及在15℃以下使所述细胞培养膜中的甲基纤维素溶解的工序。
此外，本发明的生物体组织的制造方法是具有多个细胞层的生物体组织的制造方法，包括：向具备细胞培养膜和由所述细胞培养膜划分出的两个培养空间的生物体组织形成装置中的所述两个培养空间供给细胞和培养液的工序，所述细胞培养膜在两面具备细胞的培养区域，在培养了细胞后配置于多个细胞层之间，所述细胞培养膜以重均分子量为190000～400000的甲基纤维素为主要成分，含有溶解温度调整剂；在所述两个培养空间中培养所述细胞，在所述细胞培养膜的两面形成细胞层的工序；以及在20℃以下使所述细胞培养膜中的甲基纤维素溶解的工序。
此外，本发明的生物体组织的制造方法优选设为以10分钟以下进行所述溶解的工序的方法。
此外，本发明的生物体组织的制造方法优选设为向所述细胞培养膜附加难溶解性材料，在甲基纤维素溶解后，使该难溶解性材料支承细胞层的方法。
发明效果
根据本发明，可以提供在细胞培养膜的两侧形成细胞层之后，能容易地使该细胞培养膜分解的细胞培养膜、以及使用了该细胞培养膜的生物体组织的制造方法。
附图说明
图1是示出利用本发明的第一实施方式和第二实施方式的细胞培养膜形成细胞层的工序的示意图。
图2是示出利用本发明的第三实施方式的细胞培养膜形成细胞层的工序的示意图。
图3是示出本发明的第三实施方式的细胞培养膜的制作工序(第一方法)的示意图。
图4是示出本发明的第三实施方式的细胞培养膜的制作工序(第二方法)的示意图。
图5是示出根据本发明的各实施方式的可使用细胞培养膜的微流体装置的构成构件的示意图。
图6是示出可使用本发明的各实施方式的细胞培养膜的微流体装置的构成的示意图。
图7是示出根据本发明的各实施方式的可使用细胞培养膜的微流体装置的部分剖面的示意图。
图8是示出为了确认本发明的第一实施方式和第二实施方式的细胞培养膜的溶解条件而进行的实验1的结果的图。
图9是示出为了确认本发明的第一实施方式和第二实施方式的细胞培养膜的溶解条件而进行的实验2的结果的图。
图10是示出为了确认本发明的第一实施方式和第二实施方式的细胞培养膜的溶解条件而进行的实验3的结果的图。
图11是示出利用现有的细胞培养膜形成细胞层的工序的示意图。
具体实施方式
以下，对本发明的细胞培养膜和生物体组织的制造方法的实施方式进行详细说明。但是，本发明并不限定于以下的实施方式和实施例的具体内容。
[第一实施方式]
首先，对本发明的第一实施方式的细胞培养膜进行说明。
本实施方式的细胞培养膜是温度响应性的细胞培养基材，可以通过在一定的温度以下保持规定的时间，使其溶解。
具体而言，本实施方式的细胞培养膜是在两面具备细胞的培养区域的细胞培养膜，其特征在于，以重均分子量(Mw)为20000～190000的甲基纤维素为主要成分。
本实施方式的细胞培养膜形成为膜状，其两面作为细胞的培养区域(培养部)使用。
甲基纤维素是生物相容性优异的材料，具有在60℃以上凝胶化、在30℃以下溶解的性质。此外，甲基纤维素通过使其水溶液干燥，能容易地形成为膜状。
本实施方式的细胞培养膜中的甲基纤维素的重均分子量为20000～190000。
以这样的重均分子量的甲基纤维素为主要成分，由此，本实施方式的细胞培养膜通过设为15℃或其以下的温度，能够在10分钟左右的短时间内容易地使之溶解。
即，由于细胞在低温环境下长时间放置时损伤变大，因此理想的是，在尽可能不低的温度下短时间内溶解甲基纤维素。
因此，本实施方式的细胞培养膜优选在0℃～15℃下溶解，更优选在5℃～15℃下溶解，进一步优选在10℃～15℃下溶解。
此外，作为使用本实施方式的细胞培养膜来培养的细胞，可以使用例如人工诱导多能干细胞(iPS细胞等)、胚胎干细胞(ES细胞)等。
在此，如图11所示，作为在两面具备细胞的培养区域的现有的细胞培养膜100，通常使用聚酯等半透膜，经由该半透膜在两个培养空间200、200′之间进行细胞间相互作用、液性成分的交换。
即，以往在培养空间200中填充培养液，在半透膜的一个表面上培养细胞300，并且在培养空间200′中填充培养液，在半透膜的另一个表面上培养细胞300′，形成两个细胞层。
但是，在本实施方式中培养的细胞的尺寸通常为8～10μm，与此相对，半透膜的孔径为3μm左右，因此，以往存在如下那样的问题：妨碍细胞层间的细胞彼此的接触，细胞层间的相互作用降低；随着细胞增殖，半透膜的孔堵塞，因此液性成分的交换效率降低。
另一方面，若使用孔径为10μm以上的细胞培养膜，则接种时细胞会穿过，因此无法在细胞培养膜上适当地形成两个细胞层。
与此相对，如图1所示，本实施方式的细胞培养膜10在培养空间20中填充培养液，在细胞培养膜10的一个表面上培养细胞30，并且在培养空间20′中填充培养液，在细胞培养膜10的另一个表面上培养细胞30′，从而能形成两个细胞层。
而且，在形成两个细胞层之后，通过溶解细胞培养膜10，在细胞层间细胞彼此可以接触，可以消除细胞层间的相互作用降低这样的问题，也可以消除两个细胞层间的液性成分的交换效率降低这样的问题。在使用以下第二实施方式的细胞培养膜的情况下，也可以得到同样的效果。
[第二实施方式]
接着，对本发明的第二实施方式的细胞培养膜进行说明。
本实施方式的细胞培养膜是温度响应性的细胞培养基材，以比较大的重均分子量的甲基纤维素为主要成分，通过在一定温度以下保持规定的时间，可以使其溶解。
具体而言，本实施方式的细胞培养膜是在两面具备细胞的培养区域的细胞培养膜，其特征在于，以重均分子量(Mw)为190000～400000的甲基纤维素为主要成分，含有溶解温度调整剂。此外，也可以以重均分子量为190000～500000的甲基纤维素为主要成分，更优选以重均分子量为190000～390000的甲基纤维素为主要成分，进一步优选以重均分子量为190000～330000的甲基纤维素为主要成分。
作为溶解温度调整剂，优选使用苯乙烯磺酸钠、碘化钠或甲苯磺酸钠中的至少任意种。
在本实施方式中，使甲基纤维素的重均分子量为190000～400000，并且含有溶解温度调整剂，由此，通过设为20℃或其以下的温度，可以在10分钟左右的短时间内容易地使其溶解。
此外，本实施方式的细胞培养膜优选在0℃～20℃下使其溶解，更优选在5℃～20℃下使其溶解，进一步优选在10℃～20℃下使其溶解，特别优选在15℃～20℃下使其溶解。这是为了尽量抑制低温环境对细胞的损伤。
在此，如上所述，甲基纤维素具有在30℃以下溶解的性质，但重均分子量越大，为了使其溶解，越需要长时间保持低温。但是，越长时间放置在低温环境中，对细胞的损伤越大，因此理想的是尽可能快地完成降温后的甲基纤维素的溶解，若为10分钟以下，则可以抑制对细胞的损伤，因此优选。
因此，如后述的实施例所示，本发明人等使用各种重均分子量的甲基纤维素的样品，对能以10分钟溶解的重均分子量和溶解条件进行了研究。
并且可知，在甲基纤维素的重均分子量为20000～190000的范围的情况下，通过降温至15℃，可以在10分钟以下溶解细胞培养膜。
另一方面，在甲基纤维素的重均分子量为190000～400000的范围的情况下，即使降温至15℃并保持10分钟，也不能溶解细胞培养膜。
然而，可知通过使细胞培养膜中含有溶解温度调整剂，通过降温至20℃，可以在10分钟以下溶解细胞培养膜。
如此，根据本实施方式的细胞培养膜，即使在以重均分子量比较大的甲基纤维素为主要成分的情况下，通过使细胞培养膜中含有溶解温度调整剂，也可以在使其溶解。
此外，本实施方式的细胞培养膜能在20℃这样的比第一实施方式高的温度下溶解细胞培养膜，因此能进一步降低对所形成的细胞层中的细胞造成损伤的可能性。
[第三实施方式]
接着，对本发明的第三实施方式的细胞培养膜进行说明。
本实施方式的细胞培养膜的特征在于，在第一实施方式的细胞培养膜或第二实施方式的细胞培养膜中附加有难溶解性材料。其他方面与各实施方式分别相同。
作为难溶解性材料，可以使用具有细胞黏附性的、或不具有细胞黏附性的难溶解性材料。
作为具有细胞黏附性的难溶解性材料，可以优选使用例如聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、玻璃纤维、纤维素酯、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚碳酸酯等。
作为没有细胞黏附性的难溶解性材料，可以优选使用聚苯乙烯、环烯烃聚合物(COP)、环烯烃共聚物(COC)等。
在使用没有细胞黏附性的材料作为难溶解性材料的情况下，为了使细胞适当地黏附于表面，优选设置细胞的支架材料。
即，优选在细胞培养膜的表面附加细胞的支架材料后，使细胞黏附而进行培养。
作为细胞的支架材料，可以优选使用例如胶原、基质胶、纤连蛋白、层粘连蛋白、壳聚糖、丝绸等，此外，也可以将这些材料中的两种以上组合使用。
作为在细胞培养膜的表面附加细胞支架材料的方法，可列举出在表面涂布的方法、将难溶解性材料和细胞支架材料混合的方法、使用偶联剂等试剂使细胞支架材料与难溶解性材料化学结合的方法、或将预先将胶原或壳聚糖加工成纤维状的物质贴附在细胞培养膜的表面的方法等。
此外，在使用没有细胞黏附性的材料作为难溶解性材料的情况下，还优选对细胞培养膜的至少一个表面进行表面处理。作为表面处理，优选进行电晕处理、准分子处理或等离子体处理等。
通过进行这样的表面处理，可以提高细胞培养膜表面的亲水性，可以提高细胞对细胞培养膜表面的黏附性。
如图2所示，本实施方式的细胞培养膜11中，在培养空间21中填充培养液，在细胞培养膜11的一个表面上培养细胞31，并且在培养空间21′中填充培养液，在细胞培养膜11的另一个表面上培养细胞31′，可以形成两个细胞层。
而且，通过在形成细胞层之后使甲基纤维素111溶解，仅细胞培养膜11中的难溶解性材料112作为细胞层的支承体残留。由此，形成贯通细胞培养膜11的孔。
即，在甲基纤维素111溶解后，难溶解性材料112成为细胞层的支承体。
此外，作为由甲基纤维素111溶解后的难溶解性材料构成的多孔膜的孔径，优选直径为10微米以上。若使该孔径设为如此，则可以高效地进行两个细胞层间的细胞间相互作用、液性成分的交换。
如此，根据本实施方式的细胞培养膜11，通过在细胞层形成后使甲基纤维素111溶解，可以在多个细胞层之间适当地进行细胞间相互作用、液性成分的透过。
此外，可以使细胞培养膜11中的难溶解性材料112残留在多个细胞层之间，可以将难溶解性材料112作为支承体使细胞层不易破坏。
本实施方式的细胞培养膜11例如可以通过以下两种方法制作。
首先，在第一方法中，如图3A所示，在基材40a上制作由难溶解性材料112a构成的支承体。接着，通过在该难溶解性材料112a上涂布甲基纤维素111a，可以使具备难溶解性材料112a的细胞培养膜11a形成在基材40a上。图3B中示出所得到的细胞培养膜11a的剖面。
当使细胞层形成于这样的细胞培养膜11a的两面、使甲基纤维素111a溶解时，两个细胞层被难溶解性材料112a支承，并且能经由因甲基纤维素111a的溶解而产生的孔进行细胞间相互作用、液性成分的交换。
接着，在第二方法中，如图4A所示，在基材40b上制作由难溶解性材料112b构成的支承体。此外，另外制作由甲基纤维素111b构成的膜。然后，将由难溶解性材料112b构成的支承体从基材40b上取下，层叠在由甲基纤维素111b构成的膜上，由此可以形成具备难溶解性材料112b的细胞培养膜11b。图4B中示出所得到的细胞培养膜11b的剖面。
若在这样的细胞培养膜11b的两面形成细胞层，并使甲基纤维素111b溶解，则可以成为在细胞培养膜11b的上侧形成的细胞层被难溶解性材料112b支承，在细胞培养膜11b的下侧形成的细胞层不被难溶解性材料112b支承的形态。
根据这样的细胞培养膜11b，通过甲基纤维素111b的溶解，可以更有效地进行两个细胞层间的细胞间相互作用、液性成分的交换。
此外，也可以进行如下使用方法：最初仅在细胞培养膜11b的上侧形成细胞层之后，使甲基纤维素111b溶解，接着在细胞培养膜11b的下侧形成细胞层。
需要说明的是，还优选使上述各实施方式的细胞培养膜含有黏附性细胞而形成。此时，可以构成为具有将黏附性细胞固定于细胞培养膜的表面，也可以构成为具有将黏附性细胞内包于细胞培养膜。
若细胞培养膜设为这样的构成，则在接下来说明的生物体组织的制造方法中，可以省略向培养空间供给细胞。
[生物体组织的制造方法]
本发明的实施方式的生物体组织的制造方法是具有多个细胞层的生物体组织的制造方法，其特征在于，包括以下的工序。
(A1)向具备细胞培养膜和由细胞培养膜划分出的两个培养空间的生物体组织形成装置中的两个培养空间供给细胞和培养液的工序，细胞培养膜在两面具备细胞的培养区域，在培养了细胞后配置于多个细胞层之间，细胞培养膜以重均分子量为20000～190000的甲基纤维素为主要成分。
(A2)在两个培养空间中培养细胞，在细胞培养膜的两面形成细胞层的工序。
(A3)在15℃以下使细胞培养膜中的甲基纤维素溶解的工序。
此外，本实施方式的生物体组织的制造方法优选包括以下的工序。
(B1)向具备细胞培养膜和由细胞培养膜划分出的两个培养空间的生物体组织形成装置中的两个培养空间供给细胞和培养液的工序，细胞培养膜在两面具备细胞的培养区域，在培养了细胞后配置于多个细胞层之间，细胞培养膜以重均分子量为190000～400000的甲基纤维素为主要成分，含有溶解温度调整剂。
(B2)在两个培养空间中培养细胞，在细胞培养膜的两面形成细胞层的工序。
(B3)在20℃以下使细胞培养膜中的甲基纤维素溶解的工序。
进而，优选使本实施方式的生物体组织的制造方法具有以下构成。
即，优选使(A3)和(B3)溶解的工序分别进行10分钟以下的方法。
此外，优选向细胞培养膜附加难溶解性材料，在甲基纤维素溶解后，使该难溶解性材料支承细胞层的方法。
作为本实施方式的生物体组织的制造方法中使用的细胞培养膜，可以使用上述实施方式中的细胞培养膜中的任意种。此外，培养的细胞也可以使用与上述实施方式中相同的细胞。
在本实施方式的生物体组织的制造方法的(A3)工序中，优选使甲基纤维素在0℃～15℃下溶解，更优选在5℃～15℃下溶解，进一步优选在10℃～15℃下溶解。
这是因为，细胞在低温环境中放置越长时间，损伤越大，因此理想的是，在尽可能不低的温度下在短时间内使甲基纤维素溶解。
此外，基于同样的理由，在本实施方式的生物体组织的制造方法的(B3)工序中，优选使甲基纤维素在0℃～20℃下溶解，更优选在5℃～20℃下溶解，进一步优选在10℃～20℃下溶解，特别优选在15℃～20℃下溶解。
此外，在本实施方式的生物体组织的制造方法中，作为生物体组织形成装置，例如可以优选使用器官芯片、微流体器件等。
但是，本实施方式的生物体组织的制造方法并不限定于使用这些器件的情况，也包括使用在该方法中使用上述各实施方式的细胞培养膜的其他全部装置的情况。
在本实施方式的生物体组织的制造方法中，在使用微流体器件作为生物体组织形成装置的情况下，可以使用例如图5～图7所示的装置。图7中示出将图6所示的本实施方式的微流体器件50的长轴方向中央沿垂直方向切断的剖面中央的部分剖面。
具体而言，可以使用上述各实施方式的细胞培养膜的微流体器件50可以通过层叠上部基板51、细胞培养膜10(或细胞培养膜11)和下部基板52而构成。
上部基板51具有流路511，下部基板52具有流路521，这些流路被细胞培养膜10隔开。
上部基板51和细胞培养膜10、以及下部基板52和细胞培养膜10分别通过黏附片53黏附。此外，在黏附片53中的与流路511、521对应的位置也具备流路531。
本实施方式的微流体器件50在上部基板51、细胞培养膜10以及黏附它们的黏附片53上分别具有用于向流路511、521进行送液的送液孔，能经由这些送液孔来输送培养基或试剂等。
通过在这样的微流体器件50中使用上述各实施方式的细胞培养膜，能适当地制造各种生物体组织，例如能制造具备由肾小管上皮细胞构成的组织和由血管内皮细胞构成的组织的近端小管模型中的生物体组织、肾小球模型、小肠模型、肝脏模型、肺模型中的生物体组织等各种生物体组织。
如以上说明地，根据本实施方式的细胞培养膜和生物体组织的制造方法，在细胞培养膜的两侧形成细胞层之后，能容易地使该细胞培养膜分解。因此，能防止妨碍细胞层间的细胞间相互作用、液性成分的透过。
此外，根据本实施方式的细胞培养膜和生物体组织的制造方法，对于含有不同范围的重均分子量的甲基纤维素的细胞培养膜，均可以以10分钟以下的短时间内使细胞培养膜溶解。因此，在形成的细胞层中，可以抑制低温环境对细胞的损伤。
实施例
以下，对为了确认本发明的实施方式的细胞培养膜的溶解条件而进行的实验进行说明。
[实验1]
首先，使用各种重均分子量的甲基纤维素，进行用于确认可以利用于本实施方式的细胞培养膜的条件的实验。
具体而言，作为甲基纤维素，准备粘度不同的五种，将样品名分别设为MC-4(粘度η＝3.2～4.8，信越化学工业株式会社制，MCE-4)、MC-400(粘度η＝280～560，信越化学工业株式会社制，MCE-400)、MC-1500(粘度η＝1000～1800，东京化成工业株式会社制，M0294)、MC-4000(粘度η＝2800～5600，信越化学工业株式会社制，MCE-4000)、MC-10000(粘度η＝7000～10000，东京化成工业株式会社制，M0295)。
此外，使用下述算式，基于粘度η(MPa·s)算出各样品的重均分子量Mw。
重均分子量Mw＝40000×(Logη)+880×(Logη)4
其结果是，MC-4的重均分子量为20263～27439，MC-400的重均分子量为129446～160123，MC-1500的重均分子量为191280～229028，MC-4000的重均分子量为262145～323615，MC-10000的重均分子量为346163～385280。
需要说明的是，与粘度η＝4对应的重均分子量为24198，与粘度η＝400对应的重均分子量为144424，与粘度η＝1500对应的重均分子量为216591，与粘度η＝4000对应的重均分子量为292227，与粘度η＝10000对应的重均分子量为385280。
接着，分别制备甲基纤维素的2％水溶液20ml，将它们制成无添加剂的样品。此外，对各自在各甲基纤维素的2％水溶液20ml中添加了以苯乙烯磺酸钠(NaSS，富士胶片和光纯药株式会社制，192-03292)0.1M而成的物质进行制备，将它们制成有添加剂的样品。
并且，将各溶液注入1.5cm见方的框中，使其干燥，调制厚度，制作每个样品1.5cm见方的细胞培养膜。各样品的厚度以10～30μm左右为目标。
将各样品在37℃的温水中保管一周使其溶胀后，从温水中取出，通过目视确认在15℃下静置10分钟的状态下的各样品的溶解状态。需要说明的是，在刚从温水中取出后，各样品保持了1.5cm见方的膜的状态。
将实验1的结果示于图8。在该图8中，将样品完全溶解的情况记为◎，将存在凝胶状态下的溶解残留的情况记为Δ，将存在膜状态下的溶解残留的情况记为×。这在以后的实验的结果中也是同样的。
如图8所示，在没有添加剂的情况下，MC-4和MC-400的样品溶解，而MC-1500、MC-4000以及MC-10000的样品没有充分溶解。另一方面，在有添加剂的情况下，全部样品溶解。
即，重均分子量为约20000～190000的甲基纤维素在没有添加剂的情况下可以在15℃下以10分钟溶解。
此外，重均分子量为约190000～400000的甲基纤维素在有添加剂的情况下可以在15℃下以10分钟溶解。
[实验2]
接着，使用各种重均分子量的甲基纤维素，进行用于确认能溶解本实施方式的细胞培养膜的温度条件的实验。
在本实验中，作为甲基纤维素，准备MC-4、MC-400、MC-1500以及MC-4000这四种，与实施例1同样地分别制备三个无添加剂的样品和有添加剂的样品。
然后，将各样品在37℃的温水中保管一周使其溶胀后，从温水中取出，通过目视确认在15℃、20℃、25℃的各温度下静置10分钟时的各样品的溶解状态。
将实验2的结果示于图9。如该图9所示，在没有添加剂的情况下，在15℃下静置10分钟时，MC-4和MC-400的样品溶解，但MC-1500和MC-4000的样品未充分溶解。此外，在20℃或25℃下静置10分钟时，全部样品未充分溶解。
另一方面，在有添加剂的情况下，在15℃或20℃下静置10分钟时，MC-400、MC-1500以及MC-4000的全部样品溶解。此外，在25℃下静置10分钟时，这些全部样品没有充分溶解。
即，重均分子量为约20000～190000的甲基纤维素在没有添加剂的情况下可以在15℃下以10分钟溶解。
此外，重均分子量为约190000～330000的甲基纤维素在有添加剂的情况下可以在15℃和20℃下以10分钟溶解。
[实验3]
进而，基于本实施方式的细胞培养膜中含有的添加剂的各种浓度，进行了用于确认能否溶解细胞培养膜的实验。
在本实验中，准备MC-4000作为甲基纤维素，对各自在各甲基纤维素的2％水溶液20ml中添加了以苯乙烯磺酸钠(NaSS，富士胶片和光纯药株式会社制，192-03292)0.05M、0.1M、0.3M、0.5M而成的样品与实施例1同样地制备。
然后，将各样品在37℃的温水中保管一周使其溶胀后，从温水中取出，通过目视确认在15℃、20℃的各温度下静置10分钟时的各样品的溶解状态。
将实验3的结果示于图10。如该图10所示，全部样品都溶解。
在此，在添加了添加剂0.5M的样品中，细胞培养膜脆，操作繁杂。因此，细胞培养膜中含有的添加剂的浓度可以设为0.05M～0.5M，优选设为0.05M～0.3M，更优选设为0.05M～0.2M。
本发明不限于以上的实施方式和实施例，在本发明的范围内，当然可以进行各种变更实施。
例如，可以将附加有难溶解性材料的细胞培养膜的制作方法设为上述以外的方法，或者将细胞培养膜用于微流体器件以外的生物体组织形成装置等进行适当变更。
工业上的可利用性
本发明可以优选地利用于制造包含多个细胞层的生物体组织的情况等中。
将本说明书中记载的文献和作为本申请的巴黎公约优先权的基础的日本申请说明书的内容全部引用于此。
附图标记说明
10、11、11a、11b：细胞培养膜；
101、111、111a、111b：甲基纤维素；
112、112a、112b：难溶解性材料；
20、20′、21、21′：培养空间；
30，30′，31，31′：细胞；
40a、40b：基材；
50：微流体器件；
51：上部基板；
511：流路；
512：送液孔；
52：下部基板；
521：流路；
53：黏附片；
531：流路。
Claims (14)
1.一种细胞培养膜，其特征在于，在两面具备细胞的培养区域，
所述细胞培养膜以重均分子量为20000～190000的甲基纤维素为主要成分。
2.一种细胞培养膜，其特征在于，在两面具备细胞的培养区域，
所述细胞培养膜以重均分子量为190000～400000的甲基纤维素为主要成分，含有溶解温度调整剂。
3.根据权利要求2所述的细胞培养膜，其特征在于，
所述溶解温度调整剂为苯乙烯磺酸钠、碘化钠或甲苯磺酸钠中的至少任意种。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的细胞培养膜，其特征在于，
所述细胞培养膜附加有难溶解性材料。
5.根据权利要求4所述的细胞培养膜，其特征在于，
所述难溶解性材料为聚对苯二甲酸乙二醇酯、玻璃纤维、纤维素酯、聚偏氟乙烯或聚碳酸酯中的至少任意种。
6.根据权利要求4所述的细胞培养膜，其特征在于，
所述难溶解性材料为聚苯乙烯、环烯烃聚合物或环烯烃共聚物中的至少任意种。
7.根据权利要求6所述的细胞培养膜，其特征在于，
在所述细胞培养膜的至少一个表面具备细胞的支架材料。
8.根据权利要求7所述的细胞培养膜，其特征在于，
所述支架材料为胶原蛋白、基质胶、纤连蛋白、层粘连蛋白、壳聚糖或丝绸中的至少任意种。
9.根据权利要求6所述的细胞培养膜，其特征在于，
所述细胞培养膜的至少一个表面经表面处理而成。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的细胞培养膜，其特征在于，
所述细胞培养膜含有黏附性细胞。
11.一种生物体组织的制造方法，其特征在于，是具有多个细胞层的生物体组织的制造方法，包括：
向具备细胞培养膜和由所述细胞培养膜划分出的两个培养空间的生物体组织形成装置中的所述两个培养空间供给细胞和培养液的工序，所述细胞培养膜在两面具备细胞的培养区域，在培养了细胞后配置于多个细胞层之间，所述细胞培养膜以重均分子量为20000～190000的甲基纤维素为主要成分；
在所述两个培养空间中培养所述细胞，在所述细胞培养膜的两面形成细胞层的工序；以及
在15℃以下使所述细胞培养膜中的甲基纤维素溶解的工序。
12.一种生物体组织的制造方法，其特征在于，是具有多个细胞层的生物体组织的制造方法，包括：
向具备细胞培养膜和由所述细胞培养膜划分出的两个培养空间的生物体组织形成装置中的所述两个培养空间供给细胞和培养液的工序，所述细胞培养膜在两面具备细胞的培养区域，在培养了细胞后配置于多个细胞层之间，所述细胞培养膜以重均分子量为190000～400000的甲基纤维素为主要成分，含有溶解温度调整剂；
在所述两个培养空间中培养所述细胞，在所述细胞培养膜的两面形成细胞层的工序；以及
在20℃以下使所述细胞培养膜中的甲基纤维素溶解的工序。
13.根据权利要求11或12所述的生物体组织的制造方法，其特征在于，
以10分钟以下进行所述溶解的工序。
14.根据权利要求11～13中任一项所述的生物体组织的制造方法，其特征在于，
向所述细胞培养膜附加难溶解性材料，在甲基纤维素溶解后，使所述难溶解性材料支承细胞层。
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