CN118284437A - 用于改善影响中枢神经系统的病症的治疗的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本文描述了用于治疗患有影响中枢神经系统(CNS)的病症(例如，神经认知障碍、神经肌肉障碍或神经变性病症(诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、ALS或相关的神经认知或运动神经元障碍)或溶酶体贮积症)或有发展所述病症的风险的受试者的方法。本公开的方法可包括施用表达治疗性蛋白质(例如，其活性的缺陷或缺乏与所述病症相关或者其补充可能使所述患者受益)的腺相关病毒(AAV)载体。本公开的所述AAV载体可例如以特定的量并通过特定的施用途径施用，所述特定的施用途径实现CNS中的基因表达，同时避免外周组织(例如肝、肺和脾)中的转导。
Description
技术领域
本公开涉及用于治疗影响受试者(例如，人类受试者)的中枢神经系统的疾病的组合物和方法。
背景技术
颗粒蛋白前体(PGRN)是一种68.5kD的糖蛋白，其长期以来与肿瘤发生、炎症和修复(包括生长因子信号传导途径)有关。PGRN主要在脑组织的小胶质细胞和神经元中表达，其中其可能发挥生长因子样功能。最近的发现表明PGRN与神经变性疾病有关，特别是额颞叶痴呆(FTD)，其中GRN基因中的常染色体显性突变被描述为潜在FTD表型。PGRN还被发现与阿尔茨海默氏病和其他淀粉样蛋白相关疾病(例如，路易体痴呆)中的β-淀粉样斑块相关，并且与反式激活反应元件TAR DNA结合蛋白43(TDP-43)相关，其是肌萎缩型侧索硬化症(ALS)患者中的主要疾病相关蛋白。此类神经变性疾病(例如FTD)的现有治疗致力于改善疾病症状。然而，缺乏靶向潜在神经变性的疗法，因此强调需要新的治疗途径。
发明内容
本公开提供了可用于治疗中枢神经系统病症的组合物和方法，所述病症例如神经认知或神经肌肉障碍(例如，神经变性疾病)或溶酶体贮积症，以及不利地影响中枢神经系统的其他病症。可使用本公开的组合物和方法治疗的示例性病症包括额颞叶痴呆(FTD)、阿尔茨海默氏病(AD)、帕金森氏病(PD)、路易体痴呆、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)以及相关的神经认知和运动神经元病症。使用本公开的组合物和方法，可向患有神经认知或神经肌肉障碍(例如，神经变性病症，诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、ALS或相关的神经认知或运动神经元障碍)或溶酶体贮积症以及本文所述的其他疾患的患者(例如，哺乳动物患者，诸如人类患者)施用腺相关病毒(AAV)，所述腺相关病毒含有编码治疗性蛋白质(例如，其活性的缺陷或缺乏与病症相关或其补充可能使患者受益)的转基因。可与本公开的组合物和方法结合使用的示例性转基因包括颗粒蛋白前体(PGRN)以及本文所述的其他治疗性蛋白质，其在一些实施方案中可以密码子优化的转基因形式递送以进一步增强蛋白质表达。本文所述的使用方法尤其是有益的，因为它们避免了外周组织(包括但不限于肝、肺和脾)中的显著转基因表达。
在第一方面，本公开提供了一种实现治疗性转基因(例如，PGRN以及本文所述的各种其他治疗性转基因)在患者的中枢神经系统(CNS)中表达，同时最小化或完全避免所述转基因在所述患者的外周组织(例如肝、肺和/或脾)中表达的方法。患者可以是患有影响中枢神经系统的病症(例如，神经认知障碍、神经肌肉障碍或神经变性病症(诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、ALS或相关的神经认知或运动神经元障碍)或溶酶体贮积症)的患者，并且所述方法包括向所述患者施用包含治疗性转基因的AAV载体。在一些实施方案中，AAV载体以约1x109vg/半球至约9x1012vg/半球(例如，约5x109vg/半球至约1x1012vg/半球、约1x1010vg/半球至约5x1011vg/半球或约5x1010vg/半球至约1x1011vg/半球)的量丘脑内施用于患者。
在另一方面，本公开提供了一种通过将治疗性转基因(例如，PGRN，以及本文所述的其他治疗性转基因)引入患者的CNS中来在有需要的患者中改善认知、减轻神经变性和/或改善神经肌肉功能的方法。所述方法可最小化或完全避免转基因在患者的外周组织(例如肝、肺和/或脾)中表达。患者可以是患有影响中枢神经系统的病症(例如，神经认知障碍、神经肌肉障碍或神经变性病症(诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、ALS或相关的神经认知或运动神经元障碍)或溶酶体贮积症)的患者，并且所述方法包括向所述患者施用包含治疗性转基因的AAV载体。在一些实施方案中，AAV载体以约1x109vg/半球至约9x1012vg/半球(例如，约5x109vg/半球至约1x1012vg/半球、约1x1010vg/半球至约5x1011vg/半球或约5x1010vg/半球至约1x1011vg/半球)的量丘脑内施用于患者。
在另一方面，本公开提供了一种治疗有需要的人类患者中影响中枢神经系统的病症(例如，神经认知障碍、神经肌肉障碍或神经变性病症(诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、ALS或相关的神经认知或运动神经元障碍)或溶酶体贮积症)的方法，所述方法包括向所述患者施用AAV载体，所述AAV载体包含编码治疗性蛋白质(例如，其活性的缺陷或缺乏与病症相关或者其补充可能使患者受益)，诸如PGRN以及本文所述的各种其他治疗性蛋白质的转基因。在一些实施方案中，AAV载体以约1x109vg/半球至约9x1012vg/半球(例如，约5x109vg/半球至约1x1012vg/半球、约1x1010vg/半球至约5x1011vg/半球或约5x1010vg/半球至约1x1011vg/半球)的量丘脑内施用于患者。
在另一方面，本公开提供了一种治疗有需要的人类患者中影响中枢神经系统的病症(例如，神经认知障碍、神经肌肉障碍或神经变性病症(诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、ALS或相关的神经认知或运动神经元障碍)或溶酶体贮积症)的方法，所述方法包括向所述患者施用AAV载体，所述AAV载体包含编码治疗性蛋白质(例如，其活性的缺陷或缺乏与病症相关或者其补充可能使患者受益)，诸如PGRN以及本文所述的各种其他治疗性蛋白质的转基因。在一些实施方案中，AAV载体以约1x109vg/半球至约9x1012vg/半球(例如，约5x109vg/半球至约1x1012vg/半球、约1x1010vg/半球至约5x1011vg/半球或约5x1010vg/半球至约1x1011vg/半球)的量丘脑内施用于患者。
在另一方面，本公开提供了一种在人类患者的脑(例如额叶皮层)中表达治疗性蛋白质(例如，PGRN或本文所述的另一种治疗性蛋白质)或恢复治疗性蛋白质的表达的方法，所述人类患者被诊断为患有影响中枢神经系统的病症(例如，神经认知障碍、神经肌肉障碍或神经变性病症(诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、ALS或相关的神经认知或运动神经元障碍)或溶酶体贮积症)的方法，所述方法包括向所述患者施用AAV载体，所述AAV载体包含编码治疗性蛋白质(例如，其活性的缺陷或缺乏与病症相关或者其补充可能使患者受益，诸如PGRN以及本文所述的各种其他治疗性蛋白质)的转基因。在一些实施方案中，AAV载体以约1x109vg/半球至约9x1012vg/半球(例如，约5x109vg/半球至约1x1012vg/半球、约1x1010vg/半球至约5x1011vg/半球或约5x1010vg/半球至约1x1011vg/半球)的量丘脑内施用于患者。
在任何前述方面的一些实施方案中，AAV载体以约1x1010vg/半球至约9x1012vg/半球(例如，5x1010vg/半球至约5x1011vg/半球，或约1x1011vg/半球)的量施用于患者。例如，在一些实施方案中，AAV载体以约1x1010vg/半球、2x1010vg/半球、3x1010vg/半球、4x1010vg/半球、5x1010vg/半球、6x1010vg/半球、7x1010vg/半球、8x1010vg/半球、9x1010vg/半球、1x1011vg/半球、2x1011vg/半球、3x1011vg/半球、4x1011vg/半球、5x1011vg/半球、6x1011vg/半球、7x1011vg/半球、8x1011vg/半球、9x1011vg/半球、1x1012vg/半球、2x1012vg/半球、3x1012vg/半球、4x1012vg/半球、5x1012vg/半球、6x1012vg/半球、7x1012vg/半球、8x1012vg/半球或9x1012vg/半球的量施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约5x1010vg/半球至约1x1011vg/半球的量施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约1x1010vg/半球的量施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约5x1010vg/半球的量施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约1x1011vg/半球的量施用于患者。
在任何前述方面的一些实施方案中，治疗性蛋白质是分泌性蛋白质。在一些实施方案中，治疗性蛋白质是本文表5中所列的蛋白质。在一些实施方案中，治疗性蛋白质是PGRN。
在任何前述方面的一些实施方案中，病症是神经认知障碍、神经肌肉障碍、神经变性病症或溶酶体贮积症。在一些实施方案中，病症是额颞叶痴呆(FTD)、阿尔茨海默氏病(AD)、帕金森氏病(PD)、路易体痴呆、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)或相关的神经认知或运动神经元障碍。
在任何前述方面的一些实施方案中，AAV载体以每半球单次剂量施用于患者，所述单次剂量包括所述量。
在一些实施方案中，AAV载体以每半球多个剂量(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)施用于患者，所述多个剂量一起包括所述量。
在任何前述方面的一些实施方案中，转基因(例如，编码PGRN以及本文所述的其他治疗性蛋白质的转基因)可操作地连接至在神经元细胞和/或神经胶质细胞中有活性的启动子。例如，在一些实施方案中，启动子是突触蛋白启动子、四环素控制的反式激活因子蛋白(tTA)启动子、反向四环素控制的反式激活因子蛋白(rTA)启动子、U1启动子、U6启动子、U7启动子、朊病毒启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、CB7启动子、H1启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、CMV-鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)启动子、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶III启动子、微管蛋白αI启动子、微管蛋白相关蛋白IB(MAP IB)启动子、神经元特异性烯醇化酶启动子、血小板源性生长因子β链启动子、神经丝轻链启动子、神经元特异性VGF基因启动子、神经元核(NeuN)启动子、腺瘤性结肠息肉病(APC)启动子、离子化钙结合衔接分子1(Iba-1)启动子或同源盒蛋白9(HB9)启动子。在一些实施方案中，启动子是突触蛋白启动子。
在一些实施方案中，突触蛋白启动子具有与SEQ ID NO:1的核酸序列至少85％(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一的核酸序列。例如，在一些实施方案中，突触蛋白启动子具有与SEQ ID NO:1的核酸序列至少90％同一的核酸序列，任选地其中突触蛋白启动子具有与SEQ ID NO:1的核酸序列至少95％、96％、97％、98％或99％同一的核酸序列。在一些实施方案中，突触蛋白启动子具有SEQ ID NO:1的核酸序列。
在任何前述方面的一些实施方案中，转基因编码PGRN。PGRN可例如具有与SEQ IDNO:2的氨基酸序列至少85％(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一的氨基酸序列。例如，在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列，任选地其中PGRN具有与SEQID NO:2的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
在一些实施方案中，转基因(例如，编码PGRN)是密码子优化的。例如，在一些实施方案中，编码PGRN的转基因具有与SEQ ID NO:3的核酸序列至少85％(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一的核酸序列。在一些实施方案中，编码PGRN的转基因具有与SEQ ID NO:3的核酸序列至少90％同一的核酸序列，任选地其中编码PGRN的转基因具有与SEQ ID NO:3的核酸序列至少95％、96％、97％、98％或99％同一的核酸序列。在一些实施方案中，编码PGRN的转基因具有SEQID NO:3的核酸序列。
在一些实施方案中，转基因(例如，编码PGRN的转基因)可操作地连接至人生长激素(hGH)内含子。例如，在一些实施方案中，hGH内含子是hGH内含子3。在一些实施方案中，hGH内含子具有与SEQ ID NO:4的核酸序列至少85％(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一的核酸序列。例如，在一些实施方案中，hGH内含子具有与SEQ ID NO:4的核酸序列至少90％同一的核酸序列，任选地其中hGH内含子具有与SEQ ID NO:4的核酸序列至少95％、96％、97％、98％或99％同一的核酸序列。在一些实施方案中，hGH内含子具有SEQ ID NO:4的核酸序列。
在一些实施方案中，转基因(例如，编码PGRN)可操作地连接至3'增强子元件。在一些实施方案中，3'增强子元件具有与SEQ ID NO:5的核酸序列至少85％(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一的核酸序列。例如，在一些实施方案中，3'增强子元件具有与SEQ ID NO:5的核酸序列至少90％同一的核酸序列，任选地其中3'增强子元件具有与SEQ ID NO:5的核酸序列至少95％、96％、97％、98％或99％同一的核酸序列。在一些实施方案中，3'增强子元件具有SEQ ID NO:5的核酸序列。
在任何前述方面的一些实施方案中，AAV具有与SEQ ID NO:6的核酸序列至少85％(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一的核酸序列。例如，在一些实施方案中，AAV具有与SEQ ID NO:6的核酸序列至少90％同一的核酸序列。在一些实施方案中，AAV具有与SEQ ID NO:6的核酸序列至少95％同一的核酸序列，任选地其中AAV具有与SEQ ID NO:6的核酸序列至少96％、97％、98％或99％同一的核酸序列。在一些实施方案中，AAV具有SEQ ID NO:6的核酸序列。
在任何前述方面的一些实施方案中，在施用AAV载体之前，患者表现出的内源性治疗性蛋白质(例如PGRN)的表达水平为在未患影响中枢神经系统的病症(例如，神经认知障碍、神经肌肉障碍或神经变性疾病(诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、ALS或相关的神经认知或运动神经元障碍)或溶酶体贮积症)的相同年龄、性别和/或体重指数的人类受试者中观察到的内源性治疗性蛋白质表达水平(例如，内源性PGRN表达水平)的水平的约1％至约40％。
在一些实施方案中，相对于在施用AAV载体之前获得的患者的治疗性蛋白质表达水平的测量值，在施用AAV载体之后，患者表现出治疗性蛋白质(例如，PGRN以及本文所述的其他治疗性蛋白质)的表达增加。在一些实施方案中，在患者的丘脑、额叶皮层、基底神经节、顶叶皮层、颞叶皮层、顶叶和颞叶皮层和/或脑脊液(CSF)中观察到治疗性蛋白质(例如，PGRN)表达的增加。
在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约2ng/mg至约100ng/mg(例如，3ng/mg至约99ng/mg、4ng/mg至约98ng/mg、5ng/mg至约97ng/mg、10ng/mg至约90ng/mg、20ng/mg至约80ng/mg、30ng/mg至约70ng/mg、40ng/mg至约60ng/mg或约50ng/mg)的治疗性蛋白质表达(例如PGRN表达)水平。
在任何前述方面的一些实施方案中，AAV载体以对流辅助方式施用于患者。
在另一方面，本公开提供了一种治疗有需要的人类患者中影响中枢神经系统的病症(例如，神经认知障碍、神经肌肉障碍或神经变性病症(诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、ALS或相关的神经认知或运动神经元障碍)或溶酶体贮积症)的方法，所述方法包括向所述患者施用包含编码治疗性蛋白质(例如PGRN)的转基因的AAV载体，其中所述AAV载体以足以在所述患者的脑(例如，额叶皮层)中实现与在以约1x109vg/半球至约9x1012vg/半球(例如，5x1010vg/半球至约5x1011vg/半球或约1x1011vg/半球)的量丘脑内施用本文所述的AAV载体(例如，具有SEQ ID NO:6的核酸序列的AAV2/9载体)后在患有影响中枢神经系统的病症(例如，神经认知障碍、神经肌肉障碍或神经变性病症(诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、ALS或相关的神经认知或运动神经元障碍)或溶酶体贮积症)的人类受试者中观察到的治疗性蛋白质(例如PGRN)的表达水平相当的治疗性蛋白质(例如，PGRN)表达水平的量施用于所述患者。
在另一方面，本公开提供了一种改善被诊断为患有影响中枢神经系统的病症(例如，神经认知障碍、神经肌肉障碍或神经变性病症(诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、ALS或相关的神经认知或运动神经元障碍)或溶酶体贮积症)的人类患者的认知功能的方法，所述方法包括向所述患者施用包含编码治疗性蛋白质(例如PGRN)的转基因的AAV载体，其中所述AAV载体以足以在所述患者的脑(例如，额叶皮层)中实现与在以约1x109vg/半球至约9x1012vg/半球(例如，5x1010vg/半球至约5x1011vg/半球或约1x1011vg/半球)的量丘脑内施用本文所述的AAV载体(例如，具有SEQ ID NO:6的核酸序列的AAV2/9载体)后在患有影响中枢神经系统的病症(例如，神经认知障碍、神经肌肉障碍或神经变性病症(诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、ALS或相关的神经认知或运动神经元障碍)或溶酶体贮积症)的人类受试者中观察到的治疗性蛋白质(例如PGRN)表达水平相当的治疗性蛋白质(例如，PGRN)的表达水平的量施用于所述患者。
在另一方面，本公开提供了一种在被诊断为患有影响中枢神经系统的病症(例如，神经认知障碍、神经肌肉障碍或神经变性病症(诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、ALS或相关的神经认知或运动神经元障碍)或溶酶体贮积症)的人类患者的脑(例如额叶皮层)中表达治疗性蛋白质(例如，PGRN)或恢复治疗性蛋白质的表达的方法，所述方法包括向所述患者施用包含编码治疗性蛋白质(例如PGRN)的转基因的AAV载体，其中所述AAV载体以足以在所述患者的脑(例如，额叶皮层)中实现与在以约1x109vg/半球至约9x1012vg/半球(例如，5x1010vg/半球至约5x1011vg/半球或约1x1011vg/半球)的量丘脑内施用本文所述的AAV载体(例如，具有SEQ ID NO:6的核酸序列的AAV2/9载体)后在患有影响中枢神经系统的病症(例如，神经认知障碍、神经肌肉障碍或神经变性病症(诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、ALS或相关的神经认知或运动神经元障碍)或溶酶体贮积症)的人类受试者中观察到的治疗性蛋白质(例如PGRN)表达水平相当的治疗性蛋白质表达(例如，PGRN表达)水平的量施用于所述患者。
在另一方面，本公开提供了一种治疗有需要的人类患者中影响中枢神经系统的病症(例如，神经认知障碍、神经肌肉障碍或神经变性病症(诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、ALS或相关的神经认知或运动神经元障碍)或溶酶体贮积症)的方法，所述方法包括向所述患者施用AAV载体，所述AAV载体包含编码治疗性蛋白质(例如，其活性的缺陷或缺乏与病症相关或者其补充可能使患者受益，诸如PGRN以及本文所述的其他治疗性蛋白质)的转基因。在一些实施方案中，AAV载体以足以在患者的脑(例如，额叶皮层)中实现约2ng/mg至约8ng/mg(例如，3ng/mg至约7ng/mg、4ng/mg至约6ng/mg或约5ng/mg)或更高(例如，约9ng/mg、约10ng/mg、约15ng/mg、约20ng/mg、约30ng/mg、约40ng/mg、约50ng/mg、约60ng/mg、约70ng/mg、约80ng/mg、约90ng/mg或约100ng/mg)的治疗性蛋白质(例如，PGRN)表达水平的量施用于患者。
在另一方面，本公开提供了一种改善被诊断为患有影响中枢神经系统的病症(例如，神经认知障碍、神经肌肉障碍或神经变性病症(诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、ALS或相关的神经认知或运动神经元障碍)或溶酶体贮积症)的人类患者的认知功能的方法，所述方法包括向所述患者施用包含编码治疗性蛋白质(例如，其活性的缺陷或缺乏与病症相关或者其补充可能使患者受益，诸如PGRN)的转基因的AAV载体，其中所述AAV载体以足以在所述患者的脑(例如，额叶皮层)中实现约2ng/mg至约8ng/mg(例如，3ng/mg至约7ng/mg、4ng/mg至约6ng/mg或约5ng/mg)或更高(例如，9ng/mg、约10ng/mg、约15ng/mg、约20ng/mg、约30ng/mg、约40ng/mg、约50ng/mg、约60ng/mg、约70ng/mg、约80ng/mg、约90ng/mg或约100ng/mg)的治疗性蛋白质(例如PGRN)表达水平的量施用于所述患者。
在另一方面，本公开提供了一种在被诊断为患有影响中枢神经系统的病症(例如，神经认知障碍、神经肌肉障碍或神经变性病症(诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、ALS或相关的神经认知或运动神经元障碍)或溶酶体贮积症)的人类患者的脑(例如额叶皮层)中表达治疗性蛋白质(例如，PGRN)或恢复治疗性蛋白质的表达水平的方法，所述方法包括向所述患者施用包含编码治疗性蛋白质(例如，其活性的缺陷或缺乏与病症相关或者其补充可能使患者受益，诸如PGRN)的转基因的AAV载体，其中所述AAV载体以足以在所述患者的脑(例如，额叶皮层)中实现约2ng/mg至约8ng/mg(例如，3ng/mg至约7ng/mg、4ng/mg至约6ng/mg或约5ng/mg)或更高(例如，9ng/mg、约10ng/mg、约15ng/mg、约20ng/mg、约30ng/mg、约40ng/mg、约50ng/mg、约60ng/mg、约70ng/mg、约80ng/mg、约90ng/mg或约100ng/mg)的治疗性蛋白质(例如PGRN)表达水平的量施用于所述患者。
在任何前述方面的一些实施方案中，AAV载体包含来自选自由AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh74、AAVrh.8和AAVrh.10组成的组的AAV血清型的衣壳蛋白。
在一些实施方案中，AAV是顺行运输的AAV或逆行运输的AAV。
在任何前述方面的一些实施方案中，AAV载体包含来自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh74、AAVrh.8或AAVrh.10的5’反向末端重复序列(ITR)和/或3’ITR，任选地其中所述AAV载体包括来自AAV2的5’ITR和3’ITR。例如，在一些实施方案中，AAV载体包含来自一种AAV血清型的5’ITR和3’ITR以及来自不同AAV血清型的衣壳蛋白。
在一些实施方案中，AAV载体是AAV2/9载体。
在任何前述方面的一些实施方案中，人类患者被诊断为患有由于GRN基因中的突变所致的FTD。
在任何前述方面的一些实施方案中，在施用AAV载体后，外周组织中的治疗性蛋白质(例如，PGRN)表达没有显著增加，或者治疗性蛋白质(例如，PGRN)表达的任何这种增加不大于10％(例如小于9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0％)。在一些实施方案中，外周组织包括但不限于肝、肺和/或脾。在一些实施方案中，PGRN转基因表达是相对于GAPDH表达计算的。
在另一方面，本公开提供了一种包括AAV载体的药盒，所述AAV载体包含编码治疗性蛋白质(例如，本文所述的治疗性蛋白质，诸如PGRN)的转基因，其中所述药盒进一步包括指导药盒的使用者根据任一前述方面的方法将AAV载体施用于患者的药品说明书。
附图说明
图1是编码密码子优化的人颗粒蛋白前体(hPGRN)基因的腺相关病毒(AAV)(本文缩写为“AAV9-SYN-PGRN”)的图谱。阴影箭头和矩形代表核酸分子，所述核酸分子从5’至3’包含第一AAV2反向末端重复序列(ITR)、人突触蛋白(hSyn)启动子、人生长激素内含子(hGHi3)、密码子优化的hGRN基因(PGRN-GS)、hPGRN 3’非翻译区(hPG RN-3’UTR)、牛生长激素聚腺苷酸化(poly(A))信号、噬菌体来源的复制起点(f1 ori)、弗氏柠檬酸杆菌ampCβ-内酰胺酶(AmpR)启动子、卡那霉素选择基因(KanR)和第二复制起点(ori)。
图2是丘脑内(ITM)输注低剂量1x1010vg/半球的如图1中所述的AAV9-SYN-PGRN的绵羊的六层皮层中的颗粒蛋白前体(PGRN)表达的显微照片。缩写：NeuN，神经元核；DAPI，4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚。
图3是一组图，显示ITM输注低(1x1010vg/半球)、中(5x1010vg/半球)或高(1x1011vg/半球)剂量的如图1中所述的AAV9-SYN-PGRN的绵羊活检组织的脑部区域中每μg的载体基因组(vg)。缩写：CD/PT，尾状核壳/顶颞叶。
图4是ITM输注低(1x1010vg/半球)、中(5x1010vg/半球)或高(1x1011vg/半球)剂量的如图1中所述的AAV9-SYN-PGRN的绵羊(例如KCL9-KCL13)的前额叶(PF)皮层中的hPGRN、NeuN和IBA1(例如小胶质细胞激活的标记物)表达的一组显微照片。
图5是一组图，显示ITM输注低(1x1010vg/半球)、中(5x1010vg/半球)或高(1x1011vg/半球)剂量的如图1中所述的AAV9-SYN-PGRN的绵羊的脑部区域中的hPGRN蛋白质水平。缩写：CD/PT，尾状核壳/顶颞叶。
图6是一组图，分别显示ITM输注1x1010vg/半球、5x1010vg/半球、1x1011vg/半球、5x1011vg/半球或5x1012vg/半球的如图1中所述的AAV9-SYN-PGRN的绵羊的额叶A皮层、额叶B皮层和丘脑中的hPGRN蛋白质水平。
图7是一组图，显示ITM输注低(1x1010vg/半球)、中(5x1010vg/半球)或高剂量(1x1011vg/半球)的如图1中所述的AAV9-SYN-PGRN的绵羊的脑部区域中的hPGRN蛋白质水平，针对丘脑中hPGRN蛋白质表达水平的百分比(％)归一化。缩写：CD/PT，尾状核壳/顶颞叶。
图8A和8B是显示脑脊液(CSF)中的hPGRN蛋白质水平的一组图。图8A是显示与健康对照受试者相比，在症状发作之前和之后(分别为症状前和症状后)被诊断为患有额颞叶痴呆(FTD)的患者CSF中的hPGRN水平的图。图8B是显示转导后四周ITM施用低(1x1010vg/半球)、中(5x1010vg/半球)或高(1x1011vg/半球)剂量的如图1中所述的AAV9-SYN-PGRN的绵羊CSF中的hPGRN水平的图。
图9A和9B是显示血清中的hPGRN蛋白质水平的一组图。图9A是显示与健康对照受试者相比，在症状发作之前和之后(分别为症状前和症状后)被诊断为患有FTD的患者血清中的hPGRN水平的图。图9B是显示转导前一周或转导后四周ITM施用低(1x1010vg/半球)、中(5x1010vg/半球)或高剂量(1x1011vg/半球)的如图1中所述的AAV9-SYN-PGRN的绵羊血清中的hPGRN水平的图。
图10是输注1x1010vg/半球、5x1010vg/半球或1x1011vg/半球剂量的如图1中所述的AAV9-SYN-PGRN的绵羊(例如KCL9-KCL13)苏木精染色切片的PF皮层和丘脑的一组显微照片。
图11是一组图，显示用1x1010vg/半球、5x1010vg/半球或1x1011vg/半球的如图1中所述的AAV9-SYN-PGRN ITM转导的绵羊脑部区域中的hPGRN蛋白水平，归一化为vg/μg。
图12是用1x1013的如图1中所述的AAV9-SYN-PGRN或分别表达编码PGRN的转基因(AAV9-CB7-PGRN和AAV1-CB7-PGRN)的AAV9或AAV1载体小脑延髓池内(ICM)转导的绵羊小脑中的hPGRN表达的一组显微照片。图A-C是PGRN、NeuN和DAPI的合并图像。图D-F表示仅用抗hPGRN抗体染色的组织。图G-I表示仅用抗NeuN抗体染色的组织。缩写：SYN：突触蛋白；CB7，具有巨细胞病毒增强子的鸡β-肌动蛋白启动子。
图13是分别ITM或ICM输注1x1010vg半球或1x1013的如图1中所述的AAV9-SYN-PGRN或分别表达编码hPGRN的转基因的AAV9或AAV1载体(AAV9-CB7-PGRN和AAV1-CB7-PGRN)的绵羊的PF皮层和丘脑中的PGRN表达的一组显微照片。缩写：CB7，具有巨细胞病毒增强子的鸡β-肌动蛋白启动子。
图14是一组图，显示用1x1010vg/半球、5x1010vg/半球或1x1011vg/半球(ITM)或用1x1013vg/动物(ICM)的如图12中所述的AAV9-SYN-PGRN、AAV1-CB7-PGRN或AAV9-CB7-PGRN转导的绵羊(例如，KCL-9-KCL-13)的活检脑组织区域中的vg/μg。阴影强度表示vg表达水平。
图15是一组图，显示用1x1010vg/半球、5x1010vg/半球、1x1011(ITM)或用1x1013(ICM)的分别如图12中所述的AAV1-C B7-PGRN、AAV9-CB7-PGRN或AAV9-SYN-PGRN转导的绵羊(例如，KCL-9-KCL-13)的脑部区域中的hPGRN表达。阴影强度表示hP GRN表达水平。
图16是显示用5x1010vg/半球的AAV9-SYN-PGRN ITM转导或用1x1013vg动物的如图12中所述的AAV9-SYN-PGRN、AAV 1-CB7-PGRN或AAV9-CB7-PGRN ICM转导的绵羊的皮层脑部区域中的hPGRN表达的图。
图17是显示用1x1010vg/半球、5x1010vg/半球或1x1011vg/半球的AAV9-SYN-PGRNITM转导或用1x1013vg/动物的如图12中所述的AAV9-SYN-PGRN、AAV1-CB7-PGRN或AAV9-CB7-PGRN ICM转导的绵羊额叶A皮层中的hPGRN表达的一组图。
图图18是显示用1x1010vg/半球、5x1010vg/半球或1x1011vg/半球的AAV9-SYN-PGRNITM转导或用1x1013vg/动物的如图12中所述的AAV9-SYN-PGRN、AAV1-CB7-PGRN或AAV9-CB7-PGRN ICM转导的绵羊额叶A皮层中的hPGRN表达的一组图。
图19是GRN-/-小鼠丘脑中的PGRN和如通过脂褐质沉积标记物亚基C线粒体ATP合酶(SCMAS)所测量的脂褐质沉积水平的一组显微照片，所述小鼠ITM输注极低剂量(2.3x107vg/半球，例如相当于1x1010vg/半球的绵羊剂量)、低剂量(1.1x108vg/半球，例如相当于5x1010vg/半球的绵羊剂量)、中剂量(2.3x108vg/半球，例如相当于1x1011vg/半球的绵羊剂量)或高剂量(2.3x109vg/半球，例如相当于1x1012vg/半球的绵羊剂量)的AAV9-SYN-PGRN。PBS注射用作SCMAS的对照。图A-E是PGRN和SCMAS合并的图像。图F-J表示仅用抗hPGRN抗体染色的组织。图K-O表示仅用抗SCMAS抗体染色的组织。
图20是显示通过在GRN-/-小鼠的脑中施用AAV-SYN-PGRN显著减少脂褐质沉积的图。通过GRN-/-小鼠中的SCMAS阳性颗粒来定量脂褐质沉积，所述小鼠ITM输注极低剂量(2.3x107vg/半球，相当于1x1010vg/半球的绵羊剂量)、低剂量(1.1x108vg/半球，例如相当于5x1010vg/半球的绵羊剂量)、中剂量(2.3x108vg/半球，例如相当于1x1011vg/半球的绵羊剂量)或高剂量(2.3x109vg/半球，例如相当于1x1012vg/半球的绵羊剂量)的AAV-SYN-PGRN，与野生型(WT)对照或GRN-/-家笼对照(“20w Hom”，例如在家笼中待了20周的未处理的小鼠)进行比较。缩写：ns，不显著。
图21是显示在绵羊脑中ITM施用AAV9-SYN-PGRN载体后4周，绵羊肝脏中的载体生物分布的图。对每个绵羊肝脏的六个部位进行活检，并且向每个载体剂量的两只绵羊施用所述载体。
图22是证明在ITM施用AAV9-PGRN载体后在血流中观察到PGRN表达水平的最小增加至无显著增加的图。数据是通过使用对流增强递送在食蟹猴中单次双侧ITM注射AAV9.PGRN(低剂量：2.5x1010vg/半球；高剂量：2.5x1011vg/半球)而获得的。在第0天、第2周、第4周、第8周和第12周采集血液样品，并通过ELISA分析PGRN蛋白。(注意：非人灵长类动物(例如食蟹猴)中的2.5x1011vg/半球相当于人类中的4x1012vg/半球。)
图23是证明在ITM施用AAV9-PGRN载体后在非神经组织中没有观察到PGRN的显著表达的表。数据是通过使用对流增强递送在食蟹猴中单次双侧ITM注射AAV9.PGRN(低剂量：2.5x1010vg/半球；高剂量：2.5x1011vg/半球)而获得的。第12周时从关键非神经系统器官取得终末活检物，并通过qPCR测定hPGRN RNA水平。(注意：非人灵长类动物(例如食蟹猴)中的2.5x1011vg/半球相当于人类中的4x1012vg/半球。)
定义
如本文所用，术语“约”是指在所述值的上下10％以内的值。
如本文所用，术语“腺相关病毒”(AAV)包括但不限于AAV1型、AAV 2型、AAV 3型(包括3A型和3B型)、AAV 4型、AAV 5型、AAV 6型、AAV 7型、AAV 8型、AAV 9型、AAV 10型、AAV 11型、AAV 12型、AAV 13型、蛇AAV、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、绵羊AAV、山羊AAV、虾AAV以及现在已知或后来发现的任何其他AAV。参见例如，Fields等人Virology,第4版Lippincott-Raven Publishers,Philadelphia,1996。最近已鉴定出其他AAV血清型和进化枝。(参见例如，Gao等人J.Virol.78:6381(2004)；Moris等人Virol.33:375(2004)。AAV的各种血清型的基因组序列以及天然ITR、Rep蛋白和衣壳亚基的序列是本领域已知的。此类序列可在文献或公共数据库如GenBank中找到。参见例如，GenBank登录号NC—002077、NC—001401、NC—001729、NC—001863、NC—001829、NC—001862、NC—000883、NC—001701、NC—001510、NC—006152、NC—006261、AF063497、U89790、AF043303、AF028705、AF028704、J02275、J01901、J02275、X01457、AF288061、AH009962、AY028226、AY028223、AY631966、AX753250、EU285562、NC—001358、NC—001540、AF513851、AF513852和AY530579；其公开内容以引用的方式并入本文以教导AAV核酸和氨基酸序列。还参见例如，Bantel-Schaal等人J.Virol.73:939(1999)；Chiorini等人J.Virol.71:6823(1997)；Chiorini等人J.Virol.73:1309(1999)；Gao等人Proc.Nat.Acad.Sci.USA 99:11854(2002)；Moris等人Virol.33:375(2004)；Muramatsu等人Virol.221:208(1996)；Ruffing等人J.Gen.Virol.75:3385(1994)；Rutledge等人J.Virol.72:309(1998)；Schmidt等人J.Virol.82:8911(2008)；Shade等人J.Virol.58:921(1986)；Srivastava等人J.Virol.45:555(1983)；Xiao等人J.Virol.73:3994(1999)；WO 00/28061、WO 99/61601、WO 98/11244；和US 6,156,303；其公开内容以引用的方式并入本文以用于教导AAV核酸和氨基酸序列。如本文所用，术语“AAV”涵盖顺行运输的AAV和/或逆行运输的AAV。
如本文所用，术语“肌萎缩性侧索硬化症”和“ALS”，也称为卢伽雷氏病，是指影响皮层、脑干和脊髓的运动神经元的致命疾病。在本发明的上下文中，术语“ALS”包括以经典(夏科氏)ALS、卢伽雷氏病、运动神经元病(MND)、进行性延髓麻痹(PBP)、进行性肌萎缩(PMA)、原发性侧索硬化症(PLS)、延髓发作型ALS、脊柱发作型ALS和多系统受累的ALS的名称已知的神经变性病症谱(Wijesekera L C和Leigh P N.Amyotrophic lateralsclerosis.Orphanet J.Rare Dis.2009,4:3)。
如本文所用，“阿尔茨海默氏病”和“AD”是指迟发型神经变性病症，其表现为认知衰退、短期和长期记忆丧失、注意力缺陷、语言特异性问题、定向障碍、冲动控制、社交退缩、快感缺乏以及其他症状。AD患者的脑组织表现出神经病理学特征，诸如淀粉样蛋白-β蛋白的胞外聚集体和过度磷酸化微管相关tau蛋白的神经原纤维缠结。这些聚集体的积聚与许多脑部区域的神经元损失和萎缩相关，包括大脑皮层的额叶、颞叶和顶叶，以及皮层下结构，诸如基底前脑胆碱能系统和脑干内的蓝斑。AD还与以反应性神经胶质增生和促炎细胞因子水平升高为特征的神经炎症增加相关。
如本文所用的“衣壳蛋白”是指作为AAV病毒颗粒的组分的任何AAV衣壳蛋白，包括AAV8和AAV9。
如本文所用的术语“密码子”是指给定信使RNA分子或DNA编码链中的三个连续核苷酸碱基的任何组，其指定特定氨基酸或翻译的起始或终止信号。术语“密码子”还指DNA链中的碱基三联体。
如本文所用，“密码子优化”是指根据编码DNA中同义密码子(例如，编码相同氨基酸的密码子)出现频率在不同物种中存在偏差的原理来修饰核酸序列的过程。这种密码子简并性使得相同的多肽可由多个核苷酸序列编码。以这种方式修饰的序列在本文中被称为“密码子优化的”。可对本说明书中描述的任何序列进行此过程以增强表达或稳定性。密码子优化可通过本领域已知的任何方式进行，诸如例如美国专利号7,561,972、7,561,973和7,888,112中描述的方式，所述专利各自以引用的方式整体并入本文。可根据已知方法将翻译起始位点周围的序列转化为共有Kozak序列。参见例如，Kozak等人,Nucleic AcidsRes.15(20):8125-8148，以引用的方式整体并入本文。可并入多个终止密码子。
在整个说明书以及权利要求中，词语“包括(comprise)”或变体例如“包括(comprises/comprising)”应当被理解为是指包含了一个提到的整体或多个整体的组，但不是排除任何其他的整体或多个整体的组。
如本文所用，术语“保守突变”、“保守取代”和“保守氨基酸取代”是指一个或多个氨基酸取代成表现出相似物理化学特性(诸如极性、静电荷和空间体积)的一个或多个不同的氨基酸。下表1中汇总了二十种天然存在的氨基酸中的每一种的这些特性。
表1.天然存在的氨基酸的代表性物理化学性质
于A3中的体积：50-100是小的，100-150是中等的，
150-200为大，且>200为巨大
根据此表应了解，保守氨基酸家族包括例如(i)G、A、V、L、I、P和M；(ii)D和E；(iii)C、S和T；(iv)H、K和R；(v)N和Q；和(vi)F、Y和W。因此，保守突变或取代是一个氨基酸被同一氨基酸家族的成员取代的突变或取代(例如Ser取代Thr或Lys取代Arg)。
“CpG位点”是指DNA的区域，其中胞嘧啶核苷酸沿着其长度在核苷酸的线性核酸序列中紧邻鸟嘌呤核苷酸出现，例如，—C—磷酸盐—G—，胞嘧啶和鸟嘌呤仅由一个磷酸酯隔开，或胞嘧啶在鸟嘌呤核苷酸的5'。
如本文所用，术语“路易体痴呆(dementia with Lewy bodies)”和“路易体痴呆(Lewy body dementia)”可互换使用来指包括波动性认知障碍、其中重复出现特定详细事件的幻觉和/或帕金森症的痴呆症状的病症。
如本文所用，术语本文所述的AAV载体的“有效量”、“治疗有效量”和“足够量”是指当施用于包括哺乳动物(例如人)的受试者时足以实现有益或所需结果(包括临床结果)的量。因此，“有效量”或其同义词取决于其所应用的上下文。例如，在治疗神经认知或神经肌肉障碍的情况下，其是与未施用AAV载体的情况下所获得的反应相比，足以实现治疗反应的AAV载体的量。将与这样的量相对应的本文所述的给定AAV载体的量将根据各种因素而变化，诸如药物制剂、受试者的身份(例如年龄、性别、体重)等，但是仍然可由本领域技术人员常规确定。同样，如本文所用，本公开的AAV载体的“治疗有效量”是与对照相比，在受试者中产生有益或所需结果的量。如本文所定义，本公开的AAV载体的治疗有效量可包括约1x109vg/半球至约9x1012vg/半球的量。
如本文所用，术语“内源性”描述了天然存在于特定生物体(例如，人)中或生物体内的特定位置(例如，器官、组织或细胞，诸如人细胞)中的分子(例如，多肽、核酸或辅因子)。
如本文所用，术语“额颞叶痴呆”和“FTD”是指由大脑额叶变性和可能延伸至颞叶的变性引起的病症。FTD是由额颞叶变性引起的三种综合征之一，并且是继AD之后早期痴呆的第二常见原因。根据隆德-曼彻斯特(Lund-Manchester)标准的诊断标准包括发病和逐渐进展、早期社会人际行为衰退、早期个人行为调节障碍、早期情绪迟钝和早期洞察力丧失。FTD的症状可能出现在约45岁至约65岁(例如，50岁至约60岁)之间。如本文所用，“FTD”旨在包括疾病的所有阶段(诸如临床前阶段)和亚型。
如本文所用，术语“GC含量”是指相对于核酸分子中存在的核苷的总量，特定核酸分子(诸如DNA或多核苷酸)中为鸟苷(G)或胞苷(C)的核苷的量。GC含量可例如根据以下公式表示为百分比：
Gc含量＝((鸟苷核苷的总量)+(胞苷核苷的总量)/
(核苷的总量))x100
如本文所用，患有“GRN突变”或“GRN相关FTD”的患者是已被诊断为患有FTD并且还在GRN基因中含有有害突变的那些患者。据报道，GRN基因中有超过70种致病性突变，其中大多数导致过早终止密码子和无义介导的截短GRN mRNA衰变。GRN突变在Gijselin ck等人,Hum.Mutat.29(12),1373-1386,(2012)和Pottier等人,J.Ne urochem.138(Suppl.1),32:53,(2016)中进行了描述，其涉及人GRN突变的公开内容以引用的方式并入本文。
如本文所用，术语“内含子”是指基因的编码区内其核苷酸序列不翻译成相应蛋白质的氨基酸序列的区域。术语内含子还指从基因转录的RNA的相应区域。在一些实施方案中，基因例如可含有至少两个内含子，所述内含子各自形成两个外显子之间的插入序列。内含子被转录成前体mRNA，但在加工过程中被去除，并且不包含于成熟mRNA中。
“ITR”是回文核酸，例如反向末端重复序列，其长度为约120个核苷酸至约250个核苷酸并且能够形成发夹。术语“ITR”包括可被细小病毒蛋白(例如Rep78/68)识别和结合的病毒基因组复制位点。ITR可来自任何腺相关病毒(AAV)，优选血清型2。ITR包括复制蛋白结合元件(RBE)和末端解链序列(TRS)。术语“ITR”不需要野生型细小病毒ITR(例如，野生型核酸序列可通过插入、缺失、截短或错义突变而改变)，只要ITR发挥介导病毒包装、复制、整合和/或原病毒拯救等的功能即可。“5’ITR”意指位于核酸分子的5'边界的细小病毒ITR；并且术语“3’ITR”意指位于核酸分子的3'边界的细小病毒ITR。
如本文所用，术语“经修饰的核苷酸”是指已通过一种或多种酶促或合成化学转化改变的核苷酸或其部分(例如，腺苷、鸟苷、胸苷、胞苷或尿苷)。在本文所述或本领域已知的经修饰的核苷酸中观察到的示例性改变包括在2-脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的一个或多个位置(例如，2'、3'和/或5'位置)引入化学取代基，诸如卤基、硫代、氨基、叠氮基、烷基、酰基或其他官能团。
如本文所用，术语“运动神经元障碍”和“运动神经元疾病”可互换地指一组破坏运动神经元的进行性神经病症，运动神经元是控制骨骼肌活动(诸如行走、呼吸、说话和吞咽)的细胞。示例性的非限制性运动神经元障碍包括ALS、进行性延髓麻痹、原发性侧索硬化、进行性肌萎缩、脊髓性肌萎缩、肯尼迪病和脊髓灰质炎后综合征。应理解，上述列表并不包括全部。
如本文所用，术语“突变”是指基因(例如GRN)的核苷酸序列的改变或蛋白质(例如PGRN)的多肽序列的改变。基因或蛋白质的突变可能由于例如DNA复制、DNA修复、辐射和暴露于致癌物质中的错误而自然发生，或者突变可能由于施用表达突变基因的转基因而诱导。突变可能由单个或多个核苷酸插入、缺失或取代引起。
如本文所用，术语“神经认知障碍”(NCD)是指一组临床障碍或综合征，其中主要临床缺陷是认知功能，诸如例如复杂注意力、执行功能、学习和记忆，语言、知觉运动功能和社会认知的缺陷。NCD的特征是获得性疾患，而不是发展性病症。例如，NCD是一种自出生或生命非常早期起认知扰乱并不明显的疾患，因此需要NCD的认知功能从先前获得的水平下降。NCD与患者出现认知障碍的其他病症的区别在于，NCD仅包括核心缺陷为认知性的病症。NCD可能是“重度NCD”或“轻度NCD”。重度NCD的特征在于显著认知能力下降，其干扰个人独立性和正常日常功能，而不是由于谵妄或其他精神障碍所致。轻度NCD的特征在于中度认知能力下降，其不干扰个人独立性和正常日常功能，并且不是由于谵妄或其他精神障碍所致。重度和轻度NCD也可根据上述任一种特定认知功能的定量认知测试来区分。例如，重度NCD的特征可在于，被鉴定为患有NCD或有发展NCD风险的受试者在认知测试中获得的分数，所述分数与参考群体的平均分数(例如，一般人群的平均分数)相差超过两个标准偏差，或为参考人群分数分布的第三个百分位数的分数。轻度NCD的特征在于，被鉴定为患有NCD或有发展NCD风险的受试者在认知测试中获得的分数，所述分数与参考人群的平均分数相差一至两个标准偏差，或介于参考人群分数分布的第3个百分位与第16个百分位之间的分数。可用于将NCD患者分类为患有重度或轻度NCD的认知测试的非限制性实例包括AD8、AWV、GPCOG、HRA、MIS、MMSE、MoCA、SLUMS和短IQCODE。此外，NCD包括指定NCD的特定病因学起源的综合征亚型，诸如例如FTD、AD或路易体痴呆。
如本文所用，术语“神经变性病症”和“神经变性疾病”可互换地指以神经元数量(例如，通过细胞死亡)、结构和/或功能进行性丧失为特征的病症。在一些情况下，神经认知或神经肌肉病症(例如神经变性疾病)可能与遗传缺陷(例如GRN基因的突变)、蛋白质错误折叠、蛋白质降解缺陷、程序性细胞死亡、膜损伤或其他过程相关。示例性的非限制性神经变性病症包括FTD、AD、PD、路易体痴呆、ALS、卢伽雷氏病、MND、PBP、PMA、PLS、延髓发作型ALS、脊髓发作型ALS和多系统受累的ALS，以及相关的运动神经元障碍。
如本文所用，术语“神经肌肉障碍”是指损害一个或多个神经元控制相关肌肉活动的能力的疾病。神经肌肉障碍的实例包括帕金森氏病(PD)、ALS、先天性肌无力综合征、先天性肌病、痉挛性肌束震颤综合征、杜氏肌营养不良、II型糖原贮积病、遗传性痉挛性截瘫、包涵体肌炎、艾萨克氏综合征、卡恩斯-塞尔综合征、兰伯特-伊顿肌无力综合征、线粒体肌病、肌营养不良、重症肌无力、强直性肌营养不良、周围神经病变、脊髓和延髓性肌萎缩、脊髓性肌萎缩、僵人综合征、特洛伊综合征和吉兰-巴利综合征等。
应当理解，上述列表并不包括全部，并且病症或疾病可属于各种类别。例如，AD可被认为是神经认知障碍，并且是神经变性疾病。同样，PD可被认为是神经肌肉病症和神经变性疾病。
如本文中可互换使用的“核酸”或“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的聚合物，并且包括DNA和RNA。
如本文所用的术语“可操作地连接”是指第一分子连结到第二分子，其中所述分子的排列使得第一分子影响第二分子的功能。两个分子可为或可不为单个邻接分子的一部分且可为或可不为相邻的。例如，如果启动子调节细胞中目标可转录多核苷酸分子的转录，那么所述启动子可操作地连接至所述可转录多核苷酸分子。另外，如果转录调控元件的两个部分相互连接，使得一部分的转录激活功能不受另一部分的存在的不利影响，那么所述两个部分彼此可操作地连接。两个转录调控元件可借助接头核酸(例如，居间的非编码核酸)彼此可操作地连接或可在不存在居间核苷酸的情况下彼此可操作地连接。
相对于参考多核苷酸或多肽序列而言的“序列同一性百分比(％)”定义为在将序列比对并且在需要时引入空位以实现最大序列同一性百分比之后，在候选序列中与参考多核苷酸或多肽序列中的核酸或氨基酸相同的核酸或氨基酸的百分比。用于确定核酸或氨基酸序列同一性百分比的比对可以以在本领域技术人员能力范围内的各种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2或Megalign软件。所属领域技术人员可确定适用于比对序列的参数，包括实现所比较序列的全长内的最大比对所需的任何算法。例如，可使用序列比较计算机程序BLAST生成序列同一性百分比值。例如，给定核酸或氨基酸序列A对、与或针对给定核酸或氨基酸序列B的序列同一性百分比(也可以可替代地表述为给定核酸或氨基酸序列A对、与或针对给定核酸或氨基酸序列B所具有的一定的序列同一性百分比)计算如下：
100×(分数X/Y)
其中X是通过序列比对程序(例如，BLAST)在所述程序的A和B的比对中评分为相同匹配的核苷酸或氨基酸的数目，并且其中Y是B中核酸的总数。应当理解，在核酸或氨基酸序列A的长度不等于核酸或氨基酸序列B的长度的情况下，A对于B的序列同一性百分比将不等于B对于A的序列同一性百分比。
术语“聚腺苷酸化信号”、“聚腺苷酸化位点”和“pA”在本文中可互换使用，意指足以指导将聚腺苷核糖核酸添加至细胞中表达的RNA分子的核酸序列。
如本文所用，术语“质粒”是指另外的DNA区段可连接到其中的染色体外环状双链DNA分子。质粒是一种载体，是能够转运已与其连接的另一核酸的核酸分子。某些质粒能够在其被引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌质粒和附加型哺乳动物质粒)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)可在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，由此随宿主基因组一起复制。某些质粒能够指导它们可操作地连接的基因的表达。
如本文所用，术语“颗粒蛋白前体”和“PGRN”是指分泌的营养因子和颗粒体蛋白的前体肽。所述基因位于染色体17q21.31上，并且被称为GRN。术语“颗粒蛋白前体”和“PGRN”还指野生型颗粒蛋白前体和编码所述野生型颗粒蛋白前体的核酸的变体，诸如与野生型PGRN肽的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO.2)具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％同一性或更高)的变体蛋白或与野生型GRN基因的核酸序列(例如SEQ ID NO.7)具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％同一性或更高)的多核苷酸，前提是所编码的PGRN类似物保留野生型PGRN的治疗功能。术语“颗粒蛋白前体”和“PGRN”也可指其中存在天然分泌信号肽的PGRN蛋白。如本领域技术人员将理解的，如本文所用，“PGRN”是指肽，而“GRN”是指编码此蛋白质的基因。
如本文所用，术语“帕金森氏病”和“PD”是指特征在于运动和非运动症状的神经变性疾病。运动症状主要包括运动障碍、肌张力减退、僵硬和进展等，其中运动障碍包括运动引起的松弛且甚至贫血。非运动症状包括疼痛、便秘、胃排空延迟、抑郁和睡眠障碍。
如本文所用，术语“启动子”是指DNA上由RNA聚合酶结合的识别位点。聚合酶驱动转基因的转录。适合与本文所述的组合物和方法一起使用的示例性启动子描述于例如Sandelin等人,Nat.Rev.Genet.8:424(2007)中，其涉及核酸调控元件的公开内容以引用的方式并入本文。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指适于与受试者诸如哺乳动物(例如人)的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应和其他问题并发症并与合理效益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
如本文所用，术语“分泌信号肽”是指前体蛋白内的短(通常在16-60个氨基酸之间)肽区域，其指导前体蛋白从宿主的细胞质分泌到周质空间或分泌到细胞外空间中。此类分泌信号肽通常位于前体蛋白的氨基末端。在一些实施方案中，分泌信号肽连接至氨基末端。通常，分泌信号肽在通过细胞分泌途径的过程中被裂解。只要分泌的蛋白质保留其所需的活性，裂解并不是必需的。示例性分泌信号肽包括PGRN分泌信号肽。
如本文所用，术语“治疗性蛋白质”是指(i)其活性的缺陷或缺乏与病症(例如，本文所述的神经系统病症)相关的蛋白质，以及(ii)不一定在患者中缺乏、但其补充对患者仍具有有益作用的蛋白质。可与本公开的组合物和方法结合使用的示例性治疗性蛋白质在本文的表5中列出。
如本文所用，术语“转染”是指通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞中的广泛多种技术中的任一种，例如电穿孔、脂质转染、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染、核转染、挤压-穿孔(squeeze-porati on)、声致穿孔、光学转染(optical transfection)、磁转染、穿刺转染(i mpalefection)等。
如本文所用，术语“转基因”是指编码基因产物(例如，PGRN)的重组核酸(例如，DNA或cDNA)。基因产物可以是RNA、肽或蛋白质。除基因产物的编码区之外，转基因还可包含或可操作地连接至一个或多个元件以促进或增强表达，如启动子、增强子、去稳定结构域、反应元件、报告元件、绝缘子元件、聚腺苷酸化信号和/或其他功能元件。本公开的实施方案可利用任何已知的合适启动子、增强子、去稳定结构域、反应元件、报告元件、绝缘子元件、聚腺苷酸化信号和/或其他功能元件。
如本文所用，术语“受试者”和“患者”是指动物(例如，哺乳动物，诸如人)。根据本文所述的方法治疗的受试者可以是已被诊断患有FTD或GRN相关的神经认知或神经肌肉障碍(例如神经变性病症诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍)的受试者，或有发展这些疾患中的一种或多种的风险的受试者。可通过本领域已知的任何方法或技术进行诊断。本领域技术人员将理解，待根据本公开治疗的受试者可能已经接受了标准测试，或可能由于存在一种或多种与疾病或疾患相关的风险因素而未经检查就被鉴定为有风险的受试者。
如本文所用，术语“转导(transduction)”和“转导(transduce)”是指将病毒载体构建体或其部分引入细胞并随后在细胞中表达由载体构建体或其部分编码的转基因的方法。
如本文所用，“治疗(treatment和treating)”是指用于获得有益的或期望的结果，例如临床结果的方法。有益或所需结果可包括但不限于减轻或改善一种或多种症状或疾患；减少疾病或疾患的程度；稳定(即，不恶化)疾病、病症或疾患的状态；防止疾病或疾患的传播；延迟或减缓疾病或疾患的进展；改善或缓解疾病或疾患；以及可检测的或不可检测的缓解(部分或全部)。“改善”或“减轻”疾病或疾患是指与在不治疗的情况下的程度或时间过程相比，疾病、病症或疾患的程度和/或不期望的临床表现减轻和/或进展的时间过程减慢或延长。“治疗”还可意指相比于不接受治疗时的预期存活，延长存活。需要治疗的那些包括已经患有疾患或病症的那些，以及易患疾患或病症的那些或将预防疾患或病症的那些。
如本文所用，术语“载体”包括核酸载体，例如DNA载体，诸如质粒、RNA载体、病毒或其他合适的复制子(例如，病毒载体)。已开发出多种载体，以用于将编码外源蛋白质的多核苷酸递送到原核或真核细胞中。此类表达载体的实例公开于例如WO 1994/011026；所述专利以引用的方式并入本文，因为它涉及适合于表达目标基因的载体。适于与本文所述的组合物和方法一起使用的表达载体包含多核苷酸序列，以及例如，用于表达蛋白质和/或将这些多核苷酸序列整合到哺乳动物细胞的基因组中的另外的序列元件。可用于表达如本文所述的PGRN的某些载体包括含有指导基因转录的调控序列(诸如启动子和增强子区域)的质粒。用于表达PGRN的其他可用载体含有提高这些基因的翻译速率或改善由基因转录产生的mRNA的稳定性或核输出的多核苷酸序列。这些序列元件包括，例如，5’和3’非翻译区、IRES和聚腺苷酸化信号位点，以便指导表达载体上携带的基因的有效转录。适于与本文所述的组合物和方法一起使用的表达载体还可含有编码用于选择含有此种载体的细胞的标志物的多核苷酸。合适标记物的实例是编码对抗生素(诸如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、诺尔丝菌素或博来霉素)具有抗性的基因。
具体实施方式
本文描述了用于治疗受试者(诸如哺乳动物受试者，例如人)中影响中枢神经系统(CNS)的病症(例如，神经认知障碍、神经肌肉障碍或神经变性病症(诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、ALS或相关的神经认知或运动神经元障碍)或溶酶体贮积症)的组合物和方法。本文所述的组合物和方法可用于刺激治疗性蛋白质的表达，诸如其活性的缺陷或缺乏与目标病症相关的蛋白质或不一定在患者中缺乏、但其补充可能对患者具有有益作用的蛋白质。本公开的示例性治疗性蛋白质是人颗粒蛋白前体(PGRN)蛋白，其特别适用于治疗与颗粒蛋白前体基因(GRN)突变相关的病症，诸如FTD。本文所述的组合物和方法还可用于刺激各种其他治疗性蛋白质的表达，所述治疗性蛋白质可改善或以其他方式使患有神经认知和/或神经肌肉障碍以及溶酶体贮积症的患者受益。可与本公开的组合物和方法结合使用的示例性治疗性蛋白质描述于下文表5中。
本文所述的组合物包含编码治疗性蛋白质的腺相关病毒(AAV)。可用于编码此类蛋白质的治疗性转基因可包括例如人GRN或其密码子优化的人GRN，其可用于在细胞中表达PGRN蛋白质。本文所述的AAV可以约1x109vg/半球至约9x1012vg/半球的量丘脑内施用于患者。不受机制限制，本文所述的组合物可通过有效刺激治疗性蛋白质(例如，PGRN，以及本文所述的其他蛋白质)的表达来改善与影响中枢神经系统的病症(例如，神经认知障碍、神经肌肉障碍或神经变性病症(诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、ALS或相关的神经认知或运动神经元障碍)或溶酶体贮积症)相关的病理。使用本文所述的组合物和方法，可通过施用本文所述的AAV来治疗一种或多种上述病症。
本发明至少部分地基于以下发现：丘脑内递送包含编码治疗性蛋白质(例如PGRN)的转基因的AAV导致出人意料的优异的转导皮层的能力(例如，通过AAV的顺行和/或逆行运输)并诱导皮层中治疗性蛋白质(例如PGRN)的表达。在PGRN基因疗法的背景下，鉴于哺乳动物基因组中(诸如在患有FTD的人类患者的基因组中)GRN基因突变的普遍存在，这一特性是特别有益的，FTD是以大脑皮层的额叶和颞叶中的神经变性为特征的病症。本发明还至少部分地基于对最佳给药范围的鉴定，以在丘脑内递送后实现治疗性蛋白质(例如PGRN)在皮层中的所述表达。最给药范围与递送方法相结合，可在CNS中相对于外周组织(例如肝、肺和脾)产生高度特异性的转导和随后的转基因表达。这种特异性是非常需要的，因为外周组织中升高的PGRN表达一直与某些有害作用相关，包括但不限于癌症生长和炎症相关的不良反应。因此，确保外周组织中很少或没有转基因表达的递送方法是非常有利的。使用本文所述的组合物和方法，例如，可在皮层中有效增强重要的、健康的GRN或其密码子优化变体以及它们编码的PGRN蛋白产物的表达。
以下部分提供了示例性密码子优化及其产生方法的描述，以产生密码子优化的治疗性转基因(例如，人GRN)，所述治疗性转基因可与本文所述的给药方案和编码此类构建体的AAV载体结合使用，以提供可用于治疗影响CNS的病症(例如，神经认知障碍、神经肌肉障碍或神经变性病症(诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、ALS或相关的神经认知或运动神经元障碍)或溶酶体贮积症)的方法。
神经认知和神经肌肉障碍
神经认知障碍被定义为特征在于以认知障碍为核心症状的一系列障碍，并且相对于先前较高的认知水平(例如，获得性障碍)显示出认知能力下降，而不是发育障碍；而神经肌肉障碍的特征是进行性肌无力。神经认知障碍可根据其病因学起源进行分类。例如，神经认知障碍的非限制性实例可包括由于AD所致的神经认知障碍、路易体神经认知障碍(例如，路易体痴呆)、由于PD所致的神经认知障碍、额颞叶神经认知障碍(例如，FTD)、由于脑白质营养不良所致的神经认知障碍(例如，PLOSL)、血管性神经认知障碍、由于创伤性脑损伤所致的神经认知障碍、由于HIV感染所致的神经认知障碍、物质/药物引起的神经认知障碍、由于亨廷顿氏病所致的神经认知障碍、由于朊病毒疾病所致的神经认知障碍、由于另一种医学疾患所致的神经认知障碍、由于多种病因所致的神经认知障碍以及未指明的神经认知障碍。神经肌肉障碍的非限制性实例包括PD、ALS、先天性肌无力综合征、先天性肌病、痉挛性肌束震颤综合征、杜氏肌营养不良、II型糖原贮积病、遗传性痉挛性截瘫、包涵体肌炎、艾萨克氏综合征、卡恩斯-塞尔综合征、兰伯特-伊顿肌无力综合征、线粒体肌病、肌营养不良、重症肌无力、强直性肌营养不良、周围神经病变、脊髓和延髓性肌萎缩、脊髓性肌萎缩、僵人综合征、特洛伊综合征和吉兰-巴利综合征以及相关的运动神经元障碍。本文公开的组合物和方法可用于治疗神经认知障碍和/或神经肌肉障碍。
与GRN突变相关的神经认知和神经肌肉障碍
FTD是一种以大脑皮层的额叶和颞叶中的进行性神经变性为特征的临床综合征。FTD的临床表现是复杂且异质的，但可能嗯表现为进行性失语、认知能力下降(例如工作记忆和执行功能下降)、冲动控制能力减弱、持续行为出现、失用症、冷漠和/或社交退缩。FTD患者脑中的神经元缺失与不同的神经病理学相关，包括GRN基因的突变、tau阳性神经元和神经胶质包涵体的存在；或泛素(ub)阳性和TAR DNA结合蛋白43(TDP43)阳性但tau阴性的包涵体。这些神经病理学被认为在FTD的病因学中很重要，并且还强调了PGRN被认为与之相互作用的一些其他蛋白质，从而也在其他神经变性疾病中发挥作用，诸如AD、路易性痴呆体、相关的神经认知障碍、ALS和相关的运动神经元障碍。例如，PGRN的减少与TDP-43的累积之间存在已知关系，TDP-43是已被证明是患有ALS的患者的死后组织中细胞质聚集体的主要组分的蛋白质。此外，近一半的FTD患者有痴呆、ALS或PD的一级家族成员，这表明与疾病的病因有很强的遗传关联，并且染色体17q21中的许多突变与FTD表现有关。
调查染色体17q21与FTD之间的关联的研究发现PGRN基因GRN中存在许多FTD相关的突变。这些突变常常导致FTD患者脑中ub阳性、TDP43阳性、tau阴性神经病理包涵体聚集和累积。PGRN是许多成熟颗粒蛋白的分泌前体肽，并且被认为主要作为神经营养生长因子发挥作用，从而促进神经元分化和存活。PGRN还被证明具有抗炎和神经保护功能。PGRN表达无处不在，但由于其与FTD的相关性，人们对中枢神经系统(CNS)给予了极大的关注，其中它在多种细胞类型中表达，包括神经元细胞、神经胶质细胞和内皮细胞。FTD中已鉴定出GRN基因的70多种功能丧失突变，其中绝大多数导致单倍剂量不足和血清PGRN水平降低50％以上。GRN突变描述于Gijselinck等人,Hum.Mutat.29(12),1373-86(2008)中，其涉及GRN突变的公开内容以引用的方式并入本文。GRN突变的影响是剂量依赖性的，因为完全缺乏功能性PGRN蛋白的纯合子患者发展称为CLN11神经元蜡样质脂褐质沉积症(NCL)的溶酶体贮积病，从而表明此蛋白质在正常溶酶体功能中具有额外作用。神经变性、痴呆和过早认知能力下降也是NCL症状学的标志。
神经认知或神经肌肉障碍(例如，神经变性病症，诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元病症)的临床管理主要用于改善疾病症状。例如，在FTD中，当前的临床管理方法通常采用选择性血清素再摄取抑制剂和抗精神病药物来管理伴随FTD的情感和行为变化。然而，这种策略的目标是改善疾病的症状，而不是解决其发展和进展。与这些治疗不同，本文所述的组合物和方法提供了治疗可能成为PGRN相关病理学发展基础的不同生化现象的益处。因此，本文所述的组合物和方法靶向疾病的生理原因，代表潜在的治愈性疗法。本文所述的组合物和方法可用于通过丘脑内施用包含编码PGRN的转基因的AAV载体来治疗神经认知或神经肌肉障碍(例如，神经变性病症，诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍)。这些组合物和方法可用于治疗具有任何病因，例如基因突变、环境毒素或散发性的神经认知障碍或神经肌肉障碍(例如，神经变性病症，诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍)。这些组合物和方法还可用于治疗患有GRN相关FTD的患者。本文所述的组合物和方法可用于治疗具有降低的PGRN活性和/或表达的患者(例如，内源性PGRN的表达水平为在具有相同年龄、性别和/或体重指数的人类受试者中观察到的内源性PGRN活性和/或表达水平的约1％至约40％，所述人类受试者未患神经认知或神经肌肉障碍(例如，神经变性病症，诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍)或GRN突变状态和/或PGRN活性水平未知的患者。在未患神经认知或神经肌肉障碍的人类受试者的CNS中观察到2-10ng/mL PGRN的健康生理水平。本文所述的组合物和方法还可作为预防性治疗施用于有发展神经认知或神经肌肉障碍风险的患者；具有降低的PGRN活性和/或表达的患者(例如，内源性PGRN的表达水平为在具有相同年龄、性别和/或体重指数的人类受试者中观察到的内源性PGRN活性和/或表达水平的约1％至约40％，所述人类受试者未患神经认知或神经肌肉障碍(例如，神经变性病症，诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍)；或具有GRN基因的突变的患者。
根据本文所述的方法，可向患者施用AAV载体，所述载体表达编码以下SEQ IDNO.2的氨基酸序列的转基因，或编码与SEQ ID NO.2的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如，90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性)的多肽的多核苷酸，或编码相对于SEQ ID NO.2含有一个或多个保守氨基酸取代(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个保守氨基酸取代)的多肽的多核苷酸，例如以下SEQ ID NO:3，前提是所编码的PGRN类似物保留野生型PGRN的治疗功能。在一些实施方案中，编码野生型PGRN的多核苷酸可以是密码子优化的多核苷酸，如下文详细描述的。
野生型人PGRN(Gen Bank登录号：NP_002078.1)具有以下氨基酸序列：
MWTLVSWVALTAGLVAGTRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRQLL
(SEQ ID NO.2)
野生型人GRN(GenBank登录号：NM_002087.3)具有以下核酸序列：
ATTCTCCAATCACATGATCCCTAGAAATGGGGTGTGGGGCGAGAGGAAGCAGGGAGGAGAGTGATTTGAGTAGAAAAGAAACACAGCATTCCAGGCTGGCCCCACCTCTATATTGATAAGTAGCCAATGGGAGCGGGTAGCCCTGATCCCTGGCCAATGGAAACTGAGGTAGGCGGGTCATCGCGCTGGGGTCTGTAGTCTGAGCGCTACCCGGTTGCTGCTGCCCAAGGACCGCGGAGTCGGACGCAGGCAGACCATGTGGACCCTGGTGAGCTGGGTGGCCTTAACAGCAGGGCTGGTGGCTGGAACGCGGTGCCCAGATGGTCAGTTCTGCCCTGTGGCCTGCTGCCTGGACCCCGGAGGAGCCAGCTACAGCTGCTGCCGTCCCCTTCTGGACAAATGGCCCACAACACTGAGCAGGCATCTGGGTGGCCCCTGCCAGGTTGATGCCCACTGCTCTGCCGGCCACTCCTGCATCTTTACCGTCTCAGGGACTTCCAGTTGCTGCCCCTTCCCAGAGGCCGTGGCATGCGGGGATGGCCATCACTGCTGCCCACGGGGCTTCCACTGCAGTGCAGACGGGCGATCCTGCTTCCAAAGATCAGGTAACAACTCCGTGGGTGCCATCCAGTGCCCTGATAGTCAGTTCGAATGCCCGGACTTCTCCACGTGCTGTGTTATGGTCGATGGCTCCTGGGGGTGCTGCCCCATGCCCCAGGCTTCCTGCTGTGAAGACAGGGTGCACTGCTGTCCGCACGGTGCCTTCTGCGACCTGGTTCACACCCGCTGCATCACACCCACGGGCACCCACCCCCTGGCAAAGAAGCTCCCTGCCCAGAGGACTAACAGGGCAGTGGCCTTGTCCAGCTCGGTCATGTGTCCGGACGCACGGTCCCGGTGCCCTGATGGTTCTACCTGCTGTGAGCTGCCCAGTGGGAAGTATGGCTGCTGCCCAATGCCCAACGCCACCTGCTGCTCCGATCACCTGCACTGCTGCCCCCAAGACACTGTGTGTGACCTGATCCAGAGTAAGTGCCTCTCCAAGGAGAACGCTACCACGGACCTCCTCACTAAGCTGCCTGCGCACACAGTGGGGGATGTGAAATGTGACATGGAGGTGAGCTGCCCAGATGGCTATACCTGCTGCCGTCTACAGTCGGGGGCCTGGGGCTGCTGCCCTTTTACCCAGGCTGTGTGCTGTGAGGACCACATACACTGCTGTCCCGCGGGGTTTACGTGTGACACGCAGAAGGGTACCTGTGAACAGGGGCCCCACCAGGTGCCCTGGATGGAGAAGGCCCCAGCTCACCTCAGCCTGCCAGACCCACAAGCCTTGAAGAGAGATGTCCCCTGTGATAATGTCAGCAGCTGTCCCTCCTCCGATACCTGCTGCCAACTCACGTCTGGGGAGTGGGGCTGCTGTCCAATCCCAGAGGCTGTCTGCTGCTCGGACCACCAGCACTGCTGCCCCCAGGGCTACACGTGTGTAGCTGAGGGGCAGTGTCAGCGAGGAAGCGAGATCGTGGCTGGACTGGAGAAGATGCCTGCCCGCCGGGCTTCCTTATCCCACCCCAGAGACATCGGCTGTGACCAGCACACCAGCTGCCCGGTGGGGCAGACCTGCTGCCCGAGCCTGGGTGGGAGCTGGGCCTGCTGCCAGTTGCCCCATGCTGTGTGCTGCGAGGATCGCCAGCACTGCTGCCCGGCTGGCTACACCTGCAACGTGAAGGCTCGATCCTGCGAGAAGGAAGTGGTCTCTGCCCAGCCTGCCACCTTCCTGGCCCGTAGCCCTCACGTGGGTGTGAAGGACGTGGAGTGTGGGGAAGGACACTTCTGCCATGATAACCAGACCTGCTGCCGAGACAACCGACAGGGCTGGGCCTGCTGTCCCTACCGCCAGGGCGTCTGTTGTGCTGATCGGCGCCACTGCTGTCCTGCTGGCTTCCGCTGCGCAGCCAGGGGTACCAAGTGTTTGCGCAGGGAGGCCCCGCGCTGGGACGCCCCTTTGAGGGACCCAGCCTTGAGACAGCTGCTGTGAGGGACAGTACTGAAGACTCTGCAGCCCTCGGGACCCCACTCGGAGGGTGCCCTCTGCTCAGGCCTCCCTAGCACCTCCCCCTAACCAAATTCTCCCTGGACCCCATTCTGAGCTCCCCATCACCATGGGAGGTGGGGCCTCAATCTAAGGCCTTCCCTGTCAGAAGGGGGTTGTGGCAAAAGCCACATTACAAGCTGCCATCCCCTCCCCGTTTCAGTGGACCCTGTGGCCAGGTGCTTTTCCCTATCCACAGGGGTGTTTGTGTGTGTGCGCGTGTGCGTTTCAATAAAGTTTGTACACTTTCTTAAAAAAAAAAAA
(SEQ ID NO.10)
治疗方法
本公开至少部分地基于以下发现：通过本文所述的施用途径(例如，丘脑内)并以本文所述的给药量递送至患者的编码PGRN的AAV载体能够实现患者CNS中约两位数ng/mL的PGRN表达水平(参见例如下文描述的工作实施例)。这一发现是重要的，因为健康人类受试者的CNS中PGRN蛋白的生理水平为约2-6ng/mL(在患者的脑脊液中测量的)。因此，本文所述的编码PGRN的组合物能够在人类受试者的CNS中产生生理PGRN表达水平。在这一发现的指导下，本发明人发现，使用本文所述的组合物和方法，可以生理学相关量递送其他治疗性蛋白质，因为多种其他治疗性蛋白质也在CNS中具有约高达两位数ng/mL的健康浓度水平。下表提供了本公开的示例性治疗性蛋白质及其在CNS中的相应生理表达水平的列表。
表2.
可如本文所述治疗的示例性受试者是患有神经认知或神经肌肉障碍(例如，神经变性病症)，诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍或处于发展所述神经认知或神经肌肉障碍风险的受试者。FTD的类型可以是GRN相关的FTD、散发性FTD、由环境毒素(例如除草剂或杀虫剂)引起的FTD或与非GRN突变(例如与FTD相关的一种或多种基因中的突变)相关的FTD。本文所述的组合物和方法可用于治疗具有降低的PGRN活性和/或表达的患者(例如，内源性PGRN的表达水平为在具有相同年龄、性别和/或体重指数的人类受试者中观察到的内源性PGRN表达水平的约1％至约40％，所述人类受试者未患神经认知或神经肌肉障碍(例如，神经变性病症，诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍)或GRN突变状态和/或PGRN活性水平未知的患者。本文所述的组合物和方法还可作为预防性治疗施用于处于发展神经认知或神经肌肉障碍(例如神经变性病症，诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关生物神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍)的风险的患者，例如具有GRN突变的患者，具有降低的PGRN活性和/或表达的患者(例如，内源性PGRN的表达水平为在具有相同年龄、性别和/或体重指数的人类受试者中观察到的内源性PGRN表达水平的约1％至约40％，所述人类受试者未患神经认知或神经肌肉障碍(例如，神经变性病症，诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍)；具有与神经认知或神经肌肉障碍(例如，神经变性病症，诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍)相关的一种或多种基因的突变的患者；或暴露于与神经认知或神经肌肉障碍(例如，神经变性病症，诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍)相关的环境毒素的患者。有神经认知或神经肌肉障碍(例如，神经变性病症，诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍)风险的患者可显示以下早期症状：神经认知或神经肌肉障碍(例如，神经变性病症，诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍)或在施用治疗时可能尚未出现症状。
在一些实施方案中，本文所述的方法和组合物可施用于具有GRN突变的患者，所述GRN突变包括例如移码突变(例如，p.C31LfsX35、p.C31LfsX35、p.S82VfsX174、p.L271LfsX174和/或p.T382NfsX32突变)、错义突变(p.C521Y、p.A9D、p.P248L、p.R432C、p.C139R、p.C521Y和/或p.C139R突变)、无义突变(例如p.Q125X突变)、插入突变(例如c.1145insA突变)和/或颠换突变(例如p.0(IVS1+5G>C突变)。在一些实施方案中，本文所述的方法和组合物可施用于在GRN基因中携带任何其他致病性突变的患者。例如，GRN基因中的致病性突变可以是Gijselinck等人,Human Mutation 29(12),1373-1386,(2012)中论述的任何突变，其涉及人GRN突变的公开内容以引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗有需要的人类患者的神经认知或神经肌肉障碍(例如，神经变性病症，诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍)的方法。
在一些实施方案中，本公开提供了改善被诊断为患有神经认知或神经肌肉障碍(例如，神经变性病症，诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍)的人类患者的认知功能的方法。
在一些实施方案中，本公开提供了在被诊断为患有神经认知或神经肌肉障碍(例如，神经变性病症，诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍)的人类患者的脑(例如额叶皮层)中表达PGRN或恢复PGRN的表达的方法。
编码PGRN的多核苷酸
PGRN活性在患有FTD的患者中降低。本文所述的组合物和方法通过施用表达编码PGRN的转基因的AAV载体来靶向这种功能障碍。可使用本领域技术人员众所周知的方法产生这样的构建体。
哺乳动物RNA聚合酶对编码PGRN的多核苷酸的识别和结合对于基因表达很重要。因此，可在多核苷酸内包括对募集RNA聚合酶并促进转录复合物在转录起始位点的组装的转录因子表现出高亲和力的序列元件。此类序列元件包括，例如，哺乳动物启动子，其序列可被特异性转录起始因子和最终的RNA聚合酶识别并结合。哺乳动物启动子的实例已经描述于Smith等人,Mol.Sys.Biol.,3:73，在线公布中，其公开内容以引用的方式并入本文。
适用于本文所述的组合物和方法的多核苷酸还包括编码哺乳动物启动子下游的PGRN的那些多核苷酸。可用于在哺乳动物细胞中表达GRN的启动子包括例如突触蛋白启动子、四环素控制的反式激活因子蛋白(tTA)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、反向四环素控制的反式激活因子蛋白(rTA)启动子、U1启动子、U6启动子、U7启动子、朊病毒启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、CB7启动子、H1启动子、CMV-鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)启动子、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶III启动子、微管蛋白αI启动子、微管蛋白相关蛋白IB(MAP IB)启动子、神经元特异性烯醇化酶启动子、血小板源性生长因子β链启动子、神经丝轻链启动子、神经元特异性VGF基因启动子、神经元核(NeuN)启动子、腺瘤性结肠息肉病(APC)启动子、离子化钙结合衔接分子1(Iba-1)启动子或同源盒蛋白9(HB9)启动子、延伸因子1-α(EF1α)启动子、CD68分子(CD68)启动子(参见Dahl等人,Mol.Ther.23:835(2015)，以引用的方式并入本文，因为其涉及使用PGK和CD68启动子来表达GRN)、C-X3-C基序趋化因子受体1(CX3CR1)启动子、整联蛋白亚基αM(ITGAM)启动子、同种异体移植物炎症因子1(AIF1)启动子、嘌呤能受体P2Y12(P2Y12)启动子、跨膜蛋白119(TMEM119)启动子和集落刺激因子1受体(CSF1R)启动子。在一些实施方案中，启动子是突触蛋白启动子。
在一些实施方案中，编码PGRN的转基因可操作地连接至在神经元细胞(例如，突触蛋白)和/或神经胶质细胞中具有活性的启动子。
可包括在用于在本文所述的组合物和方法中使用的多核苷酸中的其他DNA序列元件是增强子序列。增强子代表另一类调控元件，所述调控元件诱导含有目标基因的多核苷酸的构象变化，使得DNA采用有利于转录因子和RNA聚合酶在转录起始位点处结合的三维取向。因此，用于在本文所述的组合物和方法中使用的多核苷酸包括编码PGRN的那些，并且另外包括哺乳动物增强子序列。现在已知许多来自哺乳动物基因的增强子序列，并且实例是来自编码哺乳动物珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素的基因的增强子。用于在本文所述的组合物和方法中使用的增强子还包括源自自能够感染真核细胞的病毒的遗传物质的那些。实例是复制起点后侧(bp 100-270)的SV40增强子、CMV早期启动子增强子、复制起点后侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子。在Yaniv等人,Nature 297:17(1982)中公开了诱导真核基因转录的活化的另外增强子序列。
示例性PGRN
在一种方法中，本发明提供了PGRN，所述PGRN具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少85％(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一的氨基酸序列。例如，在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少86％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少87％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少88％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少89％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少91％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少92％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少93％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少94％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少96％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少97％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少98％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少99％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，PGRN编码与SEQ ID NO:2的氨基酸序列同一的蛋白质。
分泌信号肽
编码PGRN的多核苷酸可包括一种或多种编码分泌信号肽的多核苷酸。分泌信号肽可具有长度为5-30个残基的氨基酸序列，并且可位于编码PGRN的多核苷酸的上游(即5')。这些分泌信号肽允许信号识别颗粒在合成过程中识别新生多肽，导致易位至ER，包装到运输囊泡中，并且最终分泌。用于蛋白质分泌的示例性分泌信号肽是来自PGRN、IGF-II、α-1抗胰蛋白酶、IL-2、IL-6、CD5、免疫球蛋白、胰蛋白酶原、血清白蛋白、催乳素、弹性蛋白、组织纤溶酶原激活物信号肽(tPA-SP)和胰岛素的那些。在一些实施方案中，表达分泌形式的PGRN的多能细胞(例如，ESC、iPSC或CD34+细胞)可用作通过将缺失蛋白质输注到血流中来纠正蛋白质缺陷(例如，PGRN)的治疗策略。当血液灌注患者组织时，PGRN被细胞吸收并转运至其作用部位。
密码子优化
本文所述的组合物和方法可用于优化编码PGRN的GRN或其RNA等效物的核酸序列，以便实现例如特定细胞类型中PGRN的表达增强。例如，使用本文所述的组合物和方法，可优化基因及其RNA等效物以用于所编码的蛋白质(诸如PGRN)的组织特异性表达。使用本文所述的组合物和方法优化的基因及其RNA等效物可通过化学合成技术合成，并且可例如使用基于聚合酶链反应(PCR)的扩增方法或通过将基因转染到细胞中来扩增，诸如能够复制外源核酸的细菌细胞或哺乳动物细胞。
本文所述的基因和RNA等效物可具有重要的临床用途。例如，FTD是天然PGRN蛋白中的缺陷的表现。随着基因疗法的出现，已经开发了多种载体和基因递送技术，用于将外源蛋白质编码核酸引入靶细胞(例如，人类细胞)中。然而，仍然需要一套可遵循的统一指南，以优化编码PGRN的外源转基因的序列，从而实现目标细胞中蛋白质的稳健和稳定表达。
保留所编码蛋白质的氨基酸序列的单核苷酸突变可例如通过标准遗传密码得知，如下表3所示，由美国马里兰州贝塞斯达国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information，Bethesda，Maryland，USA)汇编。
表3.标准遗传密码
| 密码子 | 氨基酸 | 密码子 | 氨基酸 | 密码子 | 氨基酸 | 密码子 | 氨基酸 |
| GCG | Ala | CAT | His | CCG | Pro | TCT | Ser |
| GCA | Ala | CAC | His | CCA | Pro | TCC | Ser |
| GCT | Ala | ATA | Ile | CCT | Pro | ACG | Thr |
| GCC | Ala | ATT | Ile | CCC | Pro | ACA | Thr |
| TGT | Cys | ATC | Ile | CAG | Gln | ACT | Thr |
| TGC | Cys | AAG | Lys | CAA | Gln | ACC | Thr |
| GAT | Asp | AAA | Lys | AGG | Arg | GTG | Val |
| GAC | Asp | TTG | Leu | AGA | Arg | GTA | Val |
| GAG | Glu | TTA | Leu | CGG | Arg | GTT | Val |
| GAA | Glu | CTG | Leu | CGA | Arg | GTC | Val |
| TTT | Phe | CTA | Leu | CGT | Arg | TGG | Trp |
| TTC | Phe | CTT | Leu | CGC | Arg | TAT | Tyr |
| GGG | Gly | CTC | Leu | AGT | Ser | TAC | Tyr |
| GGA | Gly | ATG | Met | AGC | Ser | TGA | 终止 |
| GGT | Gly | AAT | Asn | TCG | Ser | TAG | 终止 |
| GGC | Gly | AAC | Asn | TCA | Ser | TAA | 终止 |
密码子优化过程可迭代进行。例如，本领域技术人员可从野生型基因序列(例如，排除内含子DNA)开始，并向此序列中引入取代，所述取代相对于在靶细胞内表达的基因(例如表达水平位于预期靶细胞中的基因表达水平的前1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更高的基因)降低所述基因的序列同一性。可重复此过程，直到对目标基因内的所有密码子进行了评估，以寻找引入单核苷酸取代的机会，所述单核苷酸取代可相对于在靶细胞内以高水平表达的基因降低序列同一性。或者，可从先前相对于基因的野生型序列进行了修饰的基因序列开始，例如，通过并入相对于野生型序列增加基因的GC含量和/或降低基因的CpG含量的密码子取代。所得基因的序列随后可与在所需靶细胞中表达的基因(例如，例如表达水平位于预期靶细胞中的基因表达水平的前1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更高的基因)的编码链进行比对，并且可在整个基因中引入迭代密码子取代，以相对于在靶细胞内以高水平表达的基因最小化先前修饰的基因的序列同一性。
密码子优化的基因的制备
一旦设计，最终的密码子优化的基因可例如通过本领域已知的固相核酸程序来制备。例如，为了进行核酸分子诸如DNA、RNA等的化学合成，可采用使用亚磷酰胺方法的固相合成方法。根据此程序，核酸通常通过以下步骤合成。
首先，将出现在待合成核酸的3'末端的5-OH保护的核苷通过将核苷附加到可裂解接头上而经由3'-OH功能酯化到固相载体上。然后，可将其上固定有核苷的用于固相合成的载体放置在反应柱中，然后将所述反应柱设置在自动核酸合成仪上。
此后，根据自动化核酸合成仪的合成程序，可在反应柱中进行包括以下步骤的迭代合成过程：
●(1)将受保护的固定化核苷的5'-OH部分脱保护(例如，用酸，诸如二氯甲烷溶液中的三氯乙酸等，以除去酸不稳定的羟基保护基团)的步骤；
●(2)在活化剂(例如四唑等)的存在下，将5-OH保护的核苷亚磷酰胺与固定化核苷的脱保护的5'-OH基团偶联的步骤；
●(3)将3'-末端核苷的未反应的5'-OH基团封端(例如，用乙酸酐等)的步骤；以及
●(4)将固定化的亚磷酸酯取代基氧化(例如，用碘水溶液等)的步骤。
可重复上述过程以根据需要沿3'至5'方向延长核酸。促进5'末端取向，并且合成具有所需序列的核酸。
最后，可裂解接头被水解(例如，用氨水、甲胺溶液等)以从固相载体上裂解所合成的核酸。用于核酸的化学合成的诸如前述的程序是本领域已知的，并且例如在美国专利号8,835,656中进行了描述，所述专利的公开内容以引用的方式并入本文，因为其涉及核酸分子的合成方案。
另外，可例如使用本文所述的或本领域已知的基于PCR的技术和/或通过用含有设计的基因的质粒转化DH5α大肠杆菌来扩增所制备的基因。随后可培养细菌以扩增其中的DNA，并且可通过本领域已知的质粒纯化技术分离基因，随后任选地对质粒进行限制性消化和/或测序以验证密码子优化的基因的身份。
示例性密码子优化的PGRN
在一种方法中，本发明提供了密码子优化的PGRN，所述PGRN具有与SEQ ID NO:3的核酸序列至少85％(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一的核酸序列。例如，在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ IDNO:3的核酸序列至少86％同一的核酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:3的核酸序列至少87％同一的核酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:3的核酸序列至少88％同一的核酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:3的核酸序列至少89％同一的核酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:3的核酸序列至少90％同一的核酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:3的核酸序列至少91％同一的核酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:3的核酸序列至少92％同一的核酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:3的核酸序列至少93％同一的核酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:3的核酸序列至少94％同一的核酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:3的核酸序列至少95％同一的核酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:3的核酸序列至少96％同一的核酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:3的核酸序列至少97％同一的核酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:3的核酸序列至少98％同一的核酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:3的核酸序列至少99％同一的核酸序列。在一些实施方案中，PGRN编码与SEQ IDNO:3的核酸序列同一的蛋白质。
用于将PGRN递送至靶细胞的AAV
病毒基因组提供可用于将目标基因有效递送到靶细胞(例如，哺乳动物细胞，诸如人细胞)的基因组中的丰富载体源。病毒基因组是尤其可用于基因递送的载体，这是因为含于此类基因组内的多核苷酸通常通过一般化或专门的转导纳入靶细胞的基因组中。这些过程作为天然病毒复制周期的一部分发生，并且不需要添加蛋白质或试剂来诱导基因整合。病毒载体的实例包括AAV。
本文所述的组合物和方法的核酸可并入重组AAV(rAAV)载体和/或病毒体中，以促进它们引入细胞中。AAV载体可用于中枢神经系统中，并且适当的启动子和血清型在Pignataro等人,J Neural Transm(2017)，付印前的电子版中进行了论述，其公开内容以引用的方式并入本文，因为其涉及可用于CNS基因疗法中的启动子和AAV血清型。可用于本文所述的组合物和方法中的rAAV载体是重组核酸构建体，所述重组核酸构建体包含(1)待表达的异源序列(例如，编码PGRN的多核苷酸)和(2)促进异源基因的整合和表达的病毒序列。病毒序列可包括AAV的将DNA顺式复制和包装(例如，功能性ITR)到病毒体中所需的那些序列。此类rAAV载体还可包含标志物或报告基因。可用的rAAV载体具有一个或多个整体或部分缺失但仍保留功能性侧翼ITR序列的AAV WT基因。AAV ITR可具有适于特定应用的任一血清型。使用rAAV载体的方法描述于例如Tai等人,J.Biomed.Sci.7:279(2000)以及Monahan和Samulski,Gene Delivery 7:24(2000)中，其各自涉及用于基因递送的AAV载体的公开内容以引用的方式并入本文。
本文所述的核酸和载体可并入rAAV病毒体中以促进核酸或载体引入细胞中。AAV的衣壳蛋白构成病毒体的外部非核酸部分并且由AAV cap基因编码。cap基因编码病毒体组装所需的三种病毒外壳蛋白VP1、VP2和VP3。rAAV病毒体的构建已描述于例如，US 5,173,414；US 5,139,941；US 5,863,541；US 5,869,305；US 6,057,152；和US 6,376,237；以及Rabinowitz等人,J.Virol.76:791(2002)和Bowles等人,J.Virol.77:423(2003)中，其各自涉及用于基因递送的AAV载体的公开内容以引用的方式并入本文。
可与本文所述的组合物和方法结合使用的rAAV病毒体包括源自多种AAV血清型的那些，所述血清型包括AAV 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和rh74。对于位于或递送至中枢神经系统的靶向细胞，AAV2、AAV9和AAV10可能特别有用。AAV载体和不同血清型的AAV蛋白的构建和使用描述于例如Chao等人,Mol.Ther.2:619(2000)；Davidson等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:3428(2000)；Xiao等人,J.Virol.72:2224(1998)；Halbert等人,J.Virol.74:1524(2000)；Halbert等人,J.Virol.75:6615(2001)；以及Auricchio等人,Hum.Molec.Genet.10:3075(2001)中，其各自涉及用于基因递送的AAV载体的公开内容以引用的方式并入本文。
还可与本文所述的组合物和方法结合使用的是假型化rAAV载体。假型化载体包括给定血清型(例如，AAV9)的AAV载体，其被源自除给定血清型之外的血清型(例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8等)的衣壳基因假型化。例如，代表性假型化载体是编码治疗性蛋白质(例如共济失调蛋白)的AAV8或AAV9载体，所述载体因衣壳基因源自AAV血清型2而假型化。涉及假型化rAAV病毒体的构建和使用的技术为本领域中已知且描述于例如Duan等人,J.Virol.75:7662(2001)；Halbert等人,J.Virol.74:1524(2000)；Zolotukhin等人,Methods,28:158(2002)；以及Auricchio等人,Hum.Molec.Genet.10:3075(2001)中。
可使用在病毒体衣壳内具有突变的AAV病毒体，以比非突变衣壳病毒体更有效地感染特定细胞类型。例如，合适的AAV突变体可具有用于促进AAV对特定细胞类型的靶向的配体插入突变。AAV衣壳突变体(包括插入突变体、丙氨酸筛选突变体和表位标签突变体)的构建和表征描述于Wu等人,J.Virol.74:8635(2000)中。可在本文所述的方法中使用的其他rAAV病毒粒子包括通过病毒的分子育种以及通过外显子改组而产生的那些衣壳杂合体。参见例如，Soong等人.,Nat.Genet.,25:436(2000)以及Kolman和Stemmer,Nat.Biotechnol.19:423(2001)。
示例性AAV载体
如本文所述，示例性AAV载体组分可包括启动子、内含子、编码PGRN或其密码子优化的PGRN的多核苷酸、3'增强子元件和/或牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化位点(pA)。
在一些实施方案中，AAV可包含突触蛋白启动子、四环素控制的反式激活因子蛋白(tTA)启动子、反向四环素控制的反式激活因子蛋白(rTA)启动子、U1启动子、U6启动子、U7启动子、朊病毒启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、CB7启动子、H1启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、CMV-鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)启动子、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶III启动子、微管蛋白αI启动子、微管蛋白相关蛋白IB(MAP IB)启动子、神经元特异性烯醇化酶启动子、血小板源性生长因子β链启动子、神经丝轻链启动子、神经元特异性VGF基因启动子、神经元核(NeuN)启动子、腺瘤性结肠息肉病(APC)启动子、离子化钙结合衔接分子1(Iba-1)启动子或同源盒蛋白9(HB9)启动子。例如，在一些实施方案中，启动子是突触蛋白启动子。在一些实施方案中，PGRN可操作地连接至在神经元细胞和/或神经胶质细胞中有活性的启动子。
在一些实施方案中，突触蛋白启动子具有与SEQ ID NO:1的核酸序列至少85％(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一的核酸序列。例如，在一些实施方案中，突触蛋白启动子具有与SEQ ID NO:1的核酸序列至少86％同一的核酸序列。在一些实施方案中，突触蛋白启动子具有与SEQ ID NO:1的核酸序列至少87％同一的核酸序列。在一些实施方案中，突触蛋白启动子具有与SEQ IDNO:1的核酸序列至少88％同一的核酸序列。在一些实施方案中，突触蛋白启动子具有与SEQID NO:1的核酸序列至少89％同一的核酸序列。在一些实施方案中，突触蛋白启动子具有与突触蛋白ID NO:1的核酸序列至少90％同一的核酸序列。在一些实施方案中，突触蛋白启动子具有与SEQ ID NO:1的核酸序列至少91％同一的核酸序列。在一些实施方案中，突触蛋白启动子具有与SEQ ID NO:1的核酸序列至少92％同一的核酸序列。在一些实施方案中，突触蛋白启动子具有与SEQ ID NO:1的核酸序列至少93％同一的核酸序列。在一些实施方案中，突触蛋白启动子具有与SEQ ID NO:1的核酸序列至少94％同一的核酸序列。在一些实施方案中，突触蛋白启动子具有与SEQ ID NO:1的核酸序列至少95％同一的核酸序列。在一些实施方案中，突触蛋白启动子具有与SEQ ID NO:1的核酸序列至少96％同一的核酸序列。在一些实施方案中，突触蛋白启动子具有与SEQ ID NO:1的核酸序列至少97％同一的核酸序列。在一些实施方案中，突触蛋白启动子具有与SEQ ID NO:1的核酸序列至少98％同一的核酸序列。在一些实施方案中，突触蛋白启动子具有与SEQ ID NO:1的核酸序列至少99％同一的核酸序列。在一些实施方案中，突触蛋白启动子具有与SEQ ID NO:1的核酸序列同一的核酸序列。
在一些实施方案中，PGRN可操作地连接至人生长激素(hGH)内含子。例如，在一些实施方案中，hGH内含子是hGH内含子3。
在一些实施方案中，hGH内含子具有与SEQ ID NO:4的核酸序列至少85％(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一的核酸序列。例如，在一些实施方案中，hGH内含子具有与SEQ ID NO:4的核酸序列至少86％同一的核酸序列。在一些实施方案中，hGH内含子具有与SEQ ID NO:4的核酸序列至少87％同一的核酸序列。在一些实施方案中，hGH内含子具有与SEQ ID NO:4的核酸序列至少88％同一的核酸序列。在一些实施方案中，hGH内含子具有与SEQ ID NO:4的核酸序列至少89％同一的核酸序列。在一些实施方案中，hGH内含子具有与ID NO:1的核酸序列至少90％同一的核酸序列。在一些实施方案中，hGH内含子具有与SEQ ID NO:4的核酸序列至少91％同一的核酸序列。在一些实施方案中，hGH内含子具有与SEQ ID NO:4的核酸序列至少92％同一的核酸序列。在一些实施方案中，hGH内含子具有与SEQ ID NO:4的核酸序列至少93％同一的核酸序列。在一些实施方案中，hGH内含子具有与SEQ ID NO:4的核酸序列至少94％同一的核酸序列。在一些实施方案中，hGH内含子具有与SEQ ID NO:4的核酸序列至少95％同一的核酸序列。在一些实施方案中，hGH内含子具有与SEQ ID NO:4的核酸序列至少96％同一的核酸序列。在一些实施方案中，hGH内含子具有与SEQ ID NO:4的核酸序列至少97％同一的核酸序列。在一些实施方案中，hGH内含子具有与SEQ ID NO:4的核酸序列至少98％同一的核酸序列。在一些实施方案中，hGH内含子具有与SEQ ID NO:4的核酸序列至少99％同一的核酸序列。在一些实施方案中，hGH内含子具有与SEQ ID NO:4的核酸序列同一的核酸序列。
在一些实施方案中，AAV可包含PGRN，所述PGRN具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少85％(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一的氨基酸序列。例如，在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少86％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少87％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少88％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少89％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少91％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少92％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少93％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少94％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少96％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少97％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少98％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少99％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，PGRN编码与SEQ ID NO:2的氨基酸序列同一的蛋白质。
在一些实施方案中，AAV可包含密码子优化的PGRN，所述密码子优化的PGRN具有与SEQ ID NO:3的核酸序列至少85％(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一的核酸序列。例如，在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:3的核酸序列至少86％同一的核酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:3的核酸序列至少87％同一的核酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ IDNO:3的核酸序列至少88％同一的核酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:3的核酸序列至少89％同一的核酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:3的核酸序列至少90％同一的核酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:3的核酸序列至少91％同一的核酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:3的核酸序列至少92％同一的核酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:3的核酸序列至少93％同一的核酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:3的核酸序列至少94％同一的核酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:3的核酸序列至少95％同一的核酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:3的核酸序列至少96％同一的核酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:3的核酸序列至少97％同一的核酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:3的核酸序列至少98％同一的核酸序列。在一些实施方案中，PGRN具有与SEQ ID NO:3的核酸序列至少99％同一的核酸序列。在一些实施方案中，PGRN编码与SEQ ID NO:3的核酸序列同一的蛋白质。
在一些实施方案中，PGRN可操作地连接至3'增强子元件。在一些实施方案中，3'增强子元件是人PGRN 3'非翻译区(UTR)。
在一些实施方案中，人PGRN 3’UTR具有与SEQ ID NO:5的核酸序列至少85％(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一的核酸序列。例如，在一些实施方案中，人PGRN 3’UTR具有与SEQ ID NO:5的核酸序列至少86％同一的核酸序列。在一些实施方案中，人PGRN 3’UTR具有与SEQ ID NO:5的核酸序列至少87％同一的核酸序列。在一些实施方案中，人PGRN 3’UTR具有与SEQ ID NO:5的核酸序列至少88％同一的核酸序列。在一些实施方案中，人PGRN 3’UTR具有与SEQ ID NO:5的核酸序列至少89％同一的核酸序列。在一些实施方案中，人PGRN 3’UTR具有与SEQ IDNO:5的核酸序列至少90％同一的核酸序列。在一些实施方案中，人PGRN 3’UTR具有与SEQID NO:5的核酸序列至少91％同一的核酸序列。在一些实施方案中，人PGRN 3’UTR具有与SEQ ID NO:5的核酸序列至少92％同一的核酸序列。在一些实施方案中，人PGRN 3’UTR具有与SEQ ID NO:5的核酸序列至少93％同一的核酸序列。在一些实施方案中，人PGRN 3’UTR具有与SEQ ID NO:5的核酸序列至少94％同一的核酸序列。在一些实施方案中，人PGRN 3’UTR具有与SEQ ID NO:5的核酸序列至少95％同一的核酸序列。在一些实施方案中，人PGRN 3’UTR具有与SEQ ID NO:5的核酸序列至少96％同一的核酸序列。在一些实施方案中，人PGRN3’UTR具有与SEQ ID NO:5的核酸序列至少97％同一的核酸序列。在一些实施方案中，人PGRN 3’UTR具有与SEQ ID NO:5的核酸序列至少98％同一的核酸序列。在一些实施方案中，人PGRN 3’UTR具有与SEQ ID NO:5的核酸序列至少99％同一的核酸序列。在一些实施方案中，人PGRN 3’UTR具有与SEQ ID NO:5的核酸序列同一的核酸序列。
在一些实施方案中，PGRN可操作地连接至bGH pA。
在一些实施方案中，bGH pA具有与SEQ ID NO:8的核酸序列至少85％(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一的核酸序列。例如，在一些实施方案中，bGH pA具有与SEQ ID NO:8的核酸序列至少86％同一的核酸序列。在一些实施方案中，bGH pA具有与SEQ ID NO:8的核酸序列至少87％同一的核酸序列。在一些实施方案中，bGH pA具有与SEQ ID NO:8的核酸序列至少88％同一的核酸序列。在一些实施方案中，bGH pA具有与SEQ ID NO:8的核酸序列至少89％同一的核酸序列。在一些实施方案中，bGH pA具有与SEQ ID NO:8的核酸序列至少90％同一的核酸序列。在一些实施方案中，bGH pA具有与SEQ ID NO:8的核酸序列至少91％同一的核酸序列。在一些实施方案中，bGH pA具有与SEQ ID NO:8的核酸序列至少92％同一的核酸序列。在一些实施方案中，bGH pA具有与SEQ ID NO:8的核酸序列至少93％同一的核酸序列。在一些实施方案中，bGH pA具有与SEQ ID NO:8的核酸序列至少94％同一的核酸序列。在一些实施方案中，bGH pA具有与SEQ ID NO:8的核酸序列至少95％同一的核酸序列。在一些实施方案中，bGHpA具有与SEQ ID NO:8的核酸序列至少96％同一的核酸序列。在一些实施方案中，bGH pA具有与SEQ ID NO:8的核酸序列至少97％同一的核酸序列。在一些实施方案中，bGH pA具有与SEQ ID NO:8的核酸序列至少98％同一的核酸序列。在一些实施方案中，bGH pA具有与SEQID NO:8的核酸序列至少99％同一的核酸序列。在一些实施方案中，bGH pA具有与SEQ IDNO:8的核酸序列同一的核酸序列。
可并入AAV中的示例性核酸描述于下表4中。
表4.可用于并入AAV中的示例性多核苷酸
在一些实施方案中，AAV具有与SEQ ID NO:6的核酸序列至少85％(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一的核酸序列。例如，在一些实施方案中，AAV具有与SEQ ID NO:6的核酸序列至少86％同一的核酸序列。在一些实施方案中，AAV具有与SEQ ID NO:6的核酸序列至少87％同一的核酸序列。在一些实施方案中，AAV具有与SEQ ID NO:6的核酸序列至少88％同一的核酸序列。在一些实施方案中，AAV具有与SEQ ID NO:6的核酸序列至少89％同一的核酸序列。在一些实施方案中，AAV具有与SEQ ID NO:6的核酸序列至少90％同一的核酸序列。在一些实施方案中，AAV具有与SEQ ID NO:6的核酸序列至少91％同一的核酸序列。在一些实施方案中，AAV具有与SEQ ID NO:6的核酸序列至少92％同一的核酸序列。在一些实施方案中，AAV具有与SEQID NO:6的核酸序列至少93％同一的核酸序列。在一些实施方案中，AAV具有与SEQ ID NO:6的核酸序列至少94％同一的核酸序列。在一些实施方案中，AAV具有与SEQ ID NO:6的核酸序列至少95％同一的核酸序列。在一些实施方案中，AAV具有与SEQ ID NO:6的核酸序列至少96％同一的核酸序列。在一些实施方案中，AAV具有与SEQ ID NO:6的核酸序列至少97％同一的核酸序列。在一些实施方案中，AAV具有与SEQ ID NO:6的核酸序列至少98％同一的核酸序列。在一些实施方案中，AAV具有与SEQ ID NO:6的核酸序列至少99％同一的核酸序列。在一些实施方案中，AAV具有与SEQ ID NO:6的核酸序列同一的核酸序列。
如本文所述，具有SEQ ID NO:6的核酸序列的示例性AAV在下文示出：
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCACGCGTTGCAAAGATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAGGAATCTTTGCAGCTAATGGACCTTCTAGGTCTTGAAAGGAGTGGGAATTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAGCAAATGGTTAATTAATCTAGACTGCAGAGGGCCCTGCGTATGAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCGGTGGGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAGTCGAGAGGATCCGTGAGTGGATGCCTTCTCCCCAGGCGGGGATGGGGGAGACCTGTAGTCAGAGCCCCCGGGCAGCACAGCCAATGCCCGTCCTTCCCCTGCAGACCGGTGCCACCATGTGGACTCTGGTCTCCTGGGTCGCTCTGACCGCTGGCCTGGTCGCTGGGACAAGATGCCCCGATGGACAGTTTTGCCCCGTCGCTTGCTGTCTGGACCCAGGAGGAGCCAGCTACTCCTGCTGTCGGCCACTGCTGGATAAGTGGCCCACCACACTGTCCCGCCACCTGGGAGGACCATGCCAGGTGGACGCACACTGTTCCGCCGGACACTCTTGCATCTTCACAGTGTCTGGCACCAGCTCCTGCTGTCCATTTCCTGAGGCAGTGGCATGCGGCGACGGACACCACTGCTGTCCCAGGGGCTTCCACTGTAGCGCCGATGGCAGGTCCTGCTTTCAGAGAAGCGGCAACAATTCCGTGGGCGCCATCCAGTGTCCTGACAGCCAGTTCGAATGCCCAGATTTTTCCACCTGCTGCGTGATGGTGGACGGCTCTTGGGGCTGCTGTCCAATGCCACAGGCCAGCTGCTGTGAGGACAGGGTGCACTGCTGTCCTCACGGAGCCTTCTGTGATCTGGTGCACACACGCTGCATCACCCCCACAGGCACCCACCCTCTGGCCAAGAAGCTGCCAGCACAGAGGACCAACAGGGCAGTGGCCCTGAGCAGCAGCGTGATGTGCCCCGACGCCAGGTCTAGATGCCCTGATGGCAGCACCTGCTGTGAGCTGCCAAGCGGCAAGTACGGCTGCTGTCCTATGCCAAACGCCACATGCTGTTCCGACCACCTGCACTGCTGTCCTCAGGACACCGTGTGCGATCTGATCCAGTCTAAGTGCCTGAGCAAGGAGAATGCCACCACAGACCTGCTGACAAAGCTGCCTGCCCACACCGTGGGCGACGTGAAGTGTGATATGGAGGTGTCCTGCCCAGATGGCTATACATGCTGTAGGCTGCAGTCTGGAGCATGGGGATGCTGTCCCTTCACCCAGGCCGTGTGCTGTGAGGACCACATCCACTGCTGTCCTGCCGGCTTTACATGTGATACCCAGAAGGGCACATGCGAGCAGGGCCCTCACCAGGTGCCATGGATGGAGAAGGCACCAGCACACCTGTCCCTGCCCGACCCTCAGGCCCTGAAGAGAGACGTGCCTTGTGATAACGTGTCTAGCTGCCCATCCTCTGATACATGCTGTCAGCTGACCTCTGGCGAGTGGGGCTGCTGTCCAATCCCCGAGGCCGTGTGCTGTAGCGACCACCAGCACTGCTGTCCTCAGGGCTATACCTGCGTGGCAGAGGGACAGTGCCAGAGGGGCTCCGAGATCGTGGCAGGCCTGGAGAAGATGCCAGCCAGGAGAGCCTCTCTGAGCCACCCCAGAGACATCGGCTGTGATCAGCACACAAGCTGCCCAGTGGGACAGACCTGCTGTCCATCCCTGGGAGGCTCTTGGGCATGCTGTCAGCTGCCTCACGCCGTGTGCTGTGAGGATAGGCAGCACTGCTGTCCAGCCGGCTACACATGCAATGTGAAGGCCAGATCCTGCGAGAAGGAGGTGGTGTCTGCCCAGCCAGCCACCTTCCTGGCACGCAGCCCTCACGTGGGCGTGAAGGACGTGGAGTGTGGCGAGGGCCACTTTTGCCACGACAACCAGACATGCTGTAGGGATAATAGACAGGGCTGGGCCTGCTGTCCATATAGGCAGGGCGTGTGCTGTGCAGATCGGCGCCACTGCTGTCCAGCAGGCTTTCGGTGCGCAGCCAGGGGCACCAAGTGCCTGCGCAGAGAAGCCCCCCGGTGGGACGCCCCCCTGCGAGACCCCGCCCTGAGACAGCTGCTGTGAGTCGCTGGTTTAAACGGGACAGTACTGAAGACTCTGCAGCCCTCGGGACCCCACTCGGAGGGTGCCCTCTGCTCAGGCCTCCCTAGCACCTCCCCCTAACCAAATTCTCCCTGGACCCCATTCTGAGCTCCCCATCACCATGGGAGGTGGGGCCTCAATCTAAGGCCTTCCCTGTCAGAAGGGGGTTGTGGCAAAAGCCACATTACAAGCTGCCATCCCCTCCCCGTTTCAGTGGACCCTGTGGCCAGGTGCTTTTCCCTATCCACAGGGGTGTTTGTGTGTGTGCGCGTGTGCGTTTCGCTAGCCTCGAGAGATCGATCTGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGACACGTGCGGACCGAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGGGCGCCACTAGTTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGCTTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGAAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAACTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAATAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCAGGCCTACATGT
其他治疗性转基因和蛋白质
本文所述的AAV可包括编码可用于治疗影响CNS的病症(例如神经认知或神经肌肉障碍(例如神经变性疾病)或溶酶体贮积症以及不利地影响CNS的其他病症的治疗性蛋白质的多核苷酸。可与本公开的组合物和方法结合使用的示例性治疗性蛋白质显示于下文表5中。
表5.本公开的示例性治疗性蛋白质
编码表5中描述的蛋白质的转基因的示例性AAV可用于在未患神经认知或神经肌肉障碍的健康人类受试者的CNS中表达所述蛋白质或恢复所述蛋白质的健康生理浓度。例如，CNS中GDNF的健康生理浓度低于10ng/mL。BDNF的健康生理浓度在脑脊液(CSF)中小于或等于50pg/mL，并且在前额皮层中高达大约25pg/mL。CSF中ApoE的健康生理浓度是4.5ng/mL。CSF中GC酶的健康生理浓度是0.02-0.14ng/mL。
本文所述的AAV可包括编码与溶酶体贮积症相关的CNS蛋白的多核苷酸。示例性蛋白质包括但不限于α-半乳糖苷酶a、α-1-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖酸硫酸酯酶、溶酶体酸性α-葡萄糖苷酶、鞘磷脂酶、己糖胺酶A(HexA)、己糖胺酶B(HexB)、芳基硫酸酯酶A(ARSA)、溶酶体酸性脂肪酶、酸性神经酰胺酶、半乳糖基神经酰胺酶、α-岩藻糖苷酶、α-甘露糖苷贮积症、β-甘露糖苷贮积症、天冬氨酸氨基葡萄糖苷酶、神经酰胺酶、乙酰肝素-N-硫酸酯酶、N-乙酰基-α-氨基葡萄糖苷酶、乙酰基-CoA:α-氨基葡糖苷N-乙酰基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙酰基半乳糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、芳基硫酸酯酶B(ARSB)和β-葡糖醛酸糖苷酶。编码与溶酶体贮积症相关的蛋白质的转基因的示例性AAV可用于在未患神经认知或神经肌肉障碍的健康人类受试者的CNS中表达所述蛋白质或恢复所述蛋白质的健康生理浓度。例如，CNS中ARSA的健康生理浓度是100ng/mg。血浆中HexA的健康生理浓度是20ng/mL，并且血浆中HexB的健康生理浓度是40ng/mL。
施用途径
本文所述的AAV可丘脑内施用于患有FTD的受试者。在一些实施方案中，AAV载体以对流辅助方式施用于患者。
在一些实施方案中，施用可包括对流辅助施用，例如诸如Bobo等人PNAS.91:6(1994):2076-2080中所描述，其涉及对流辅助施用的公开内容以引用的方式并入本文。
给药方案
使用本公开的组合物和方法，可以约1x109vg/半球至约9x1012vg/半球的量向患有神经认知或神经肌肉障碍(例如，神经变性病症，诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍)的患者丘脑内施用含有编码PGRN(例如密码子优化的PGRN)的转基因的AAV载体。
在一些实施方案中，AAV载体以约1x109vg/半球至约9x1012vg/半球(例如，1x109vg/半球至约5x1012vg/半球、2x109vg/半球至约4x1012vg/半球、3x109vg/半球至约3x1012vg/半球、4x109vg/半球至约2x1012vg/半球、5x109vg/半球至约1x1012vg/半球、1x1010vg/半球至约9x1011vg/半球、2x1010vg/半球至约8x1011vg/半球、3x1010vg/半球至约7x1011vg/半球、4x1010vg/半球至约6x1011vg/半球、5x1010vg/半球至约5x1011vg/半球或约1x1011vg/半球)的量丘脑内施用于患者。例如，在一些实施方案中，AAV载体以约2x109vg/半球至约4x1012vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约3x109vg/半球至约3x1012vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约4x109vg/半球至约2x1012vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约5x109vg/半球至约1x1012vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约1x1010vg/半球至约9x1011vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约2x1010vg/半球至约8x1011vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约3x1010vg/半球至约7x1011vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约4x1010vg/半球至约6x1011vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约5x1010vg/半球至约5x1011vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约1x1011vg/半球的量丘脑内施用于患者。
在一些实施方案中，AAV载体以约1x1010vg/半球至约1x1012vg/半球(例如，1x1010vg/半球至约1x1012vg/半球、2x1010vg/半球至约9x1011vg/半球、3x1010vg/半球至约8x1011vg/半球、4x1010vg/半球至约7x1011vg/半球、5x1010vg/半球至约6x1011vg/半球、6x1010vg/半球至约5x1011vg/半球、7x1010vg/半球至约4x1011vg/半球、8x1010vg/半球至约3x1011vg/半球、9x1010vg/半球至约2x1011vg/半球或约1x1011vg/半球)的量丘脑内施用于患者。例如，在一些实施方案中，AAV载体以约2x1010vg/半球至约9x1011vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约3x1010vg/半球至约8x1011vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约4x1010vg/半球至约7x1011vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约5x1010vg/半球至约6x1011vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约6x1010vg/半球至约5x1011vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约7x1010vg/半球至约4x1011vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约8x1010vg/半球至约3x1011vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约9x1010vg/半球至约2x1011vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约1x1011vg/半球的量丘脑内施用于患者。
在一些实施方案中，AAV载体以约5x1010vg/半球至约1x1011vg/半球(例如，5x1010vg/半球至约1x1011vg/半球、6x1010vg/半球至约9x1010vg/半球或7x1010vg/半球至约8x1010vg/半球)的量丘脑内施用于患者。例如，在一些实施方案中，AAV载体以约6x1010vg/半球至约9x1010vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约7x1010vg/半球至约8x1010vg/半球的量丘脑内施用于患者。
在一些实施方案中，AAV载体以约1x109vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约2x109vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约3x109vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约4x109vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约5x109vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约6x109vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约7x109vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约8x109vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约9x109vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约1x1010vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约2x1010vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约3x1010vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约4x1010vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约5x1010vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约6x1010vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约7x1010vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约8x1010vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约9x1010vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约1x1011vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约2x1011vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约3x1011vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约4x1011vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约5x1011vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约6x1011vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约7x1011vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约8x1011vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约9x1011vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约1x1012vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约2x1012vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约3x1012vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约4x1012vg/半球的量丘脑内施用于患者。在一些实施方案中，AAV载体以约5x1012vg/半球的量丘脑内施用于患者。
在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现与在以约1x109vg/半球至约9x1012vg/半球(例如，1x109vg/半球至约5x1012vg/半球、2x109vg/半球至约4x1012vg/半球、3x109vg/半球至约3x1012vg/半球、4x109vg/半球至约2x1012vg/半球、5x109vg/半球至约1x1012vg/半球、1x1010vg/半球至约9x1011vg/半球、2x1010vg/半球至约8x1011vg/半球、3x1010vg/半球至约7x1011vg/半球、4x1010vg/半球至约6x1011vg/半球、5x1010vg/半球至约5x1011vg/半球或约1x1011vg/半球)的量丘脑内施用具有SEQ ID NO:6的核酸序列的AAV2/9载体后在患有神经认知或神经肌肉障碍(例如，神经变性病症诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍)的人类受试者中观察到的PGRN表达水平相当的PGRN表达水平的量施用于所述患者。例如，在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现与在以约2x109vg/半球至约4x1012vg/半球的量丘脑内施用具有SEQ ID NO:6的核酸序列的AAV2/9载体后在患有神经认知或神经肌肉障碍(例如，神经变性病症诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍)的人类受试者中观察到的PGRN表达水平相当的PGRN表达水平的量施用于所述患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现与在以约3x109vg/半球至约3x1012vg/半球的量丘脑内施用具有SEQ ID NO:6的核酸序列的AAV2/9载体后在患有神经认知或神经肌肉障碍(例如，神经变性病症诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍)的人类受试者中观察到的PGRN表达水平相当的PGRN表达水平的量施用于所述患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现与在以约4x109vg/半球至约2x1012vg/半球的量丘脑内施用具有SEQID NO:6的核酸序列的AAV2/9载体后在患有神经认知或神经肌肉障碍(例如，神经变性病症诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍)的人类受试者中观察到的PGRN表达水平相当的PGRN表达水平的量施用于所述患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现与在以约5x109vg/半球至约1x1012vg/半球的量丘脑内施用具有SEQ ID NO:6的核酸序列的AAV2/9载体后在患有神经认知或神经肌肉障碍(例如，神经变性病症诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍)的人类受试者中观察到的PGRN表达水平相当的PGRN表达水平的量施用于所述患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现与在以约1x1010vg/半球至约9x1011vg/半球的量丘脑内施用具有SEQ ID NO:6的核酸序列的AAV2/9载体后在患有神经认知或神经肌肉障碍(例如，神经变性病症诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍)的人类受试者中观察到的PGRN表达水平相当的PGRN表达水平的量施用于所述患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现与在以约2x1010vg/半球至约8x1011vg/半球的量丘脑内施用具有SEQ ID NO:6的核酸序列的AAV2/9载体后在患有神经认知或神经肌肉障碍(例如，神经变性病症诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍)的人类受试者中观察到的PGRN表达水平相当的PGRN表达水平的量施用于所述患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现与在以约3x1010vg/半球至约7x1011vg/半球的量丘脑内施用具有SEQ ID NO:6的核酸序列的AAV2/9载体后在患有神经认知或神经肌肉障碍(例如，神经变性病症诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍)的人类受试者中观察到的PGRN表达水平相当的PGRN表达水平的量施用于所述患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现与在以约4x1010vg/半球至约6x1011vg/半球的量丘脑内施用具有SEQ ID NO:6的核酸序列的AAV2/9载体后在患有神经认知或神经肌肉障碍(例如，神经变性病症诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍)的人类受试者中观察到的PGRN表达水平相当的PGRN表达水平的量施用于所述患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现与在以约5x1010vg/半球至约5x1011vg/半球的量丘脑内施用具有SEQ ID NO:6的核酸序列的AAV2/9载体后在患有神经认知或神经肌肉障碍(例如，神经变性病症诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍)的人类受试者中观察到的PGRN表达水平相当的PGRN表达水平的量施用于所述患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现与在以约1x1011vg/半球的量丘脑内施用具有SEQ ID NO:6的核酸序列的AAV2/9载体后在患有神经认知或神经肌肉障碍(例如，神经变性病症诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍)的人类受试者中观察到的PGRN表达水平相当的PGRN表达水平的量施用于所述患者。
在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约2ng/mg至约8ng/mg(例如，3ng/mg至约7ng/mg、4ng/mg至约6ng/mg或约5ng/mg)或更高(例如，约9ng/mg、约10ng/mg、约15ng/mg、约20ng/mg、约30ng/mg、约40ng/mg、约50ng/mg、约60ng/mg、约70ng/mg、约80ng/mg、约90ng/mg或约100ng/mg)的PGRN表达水平的量施用于患者。例如，在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约2ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约3ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约4ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约5ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约6ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约7ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约8ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约9ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约10ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约11ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约12ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约13ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约14ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约15ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约16ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约17ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约18ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约19ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约20ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约21ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约22ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约23ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约24ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约25ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约26ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约27ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约28ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约29ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约30ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约31ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约32ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约33ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约34ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约35ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约36ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约37ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约38ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约39ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约40ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约41ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约42ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约43ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约44ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约45ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约46ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约47ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约48ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约49ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约50ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约51ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约52ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约53ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约54ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约55ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约56ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约57ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约58ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约59ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约60ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约61ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约62ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约63ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约64ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约65ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约66ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约67ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约68ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约69ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约70ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约71ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约72ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约73ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约74ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约75ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约76ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约77ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约78ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约79ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约80ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约81ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约82ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约83ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约84ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约85ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约86ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约87ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约88ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约89ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约90ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约91ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约92ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约93ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约94ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约95ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约96ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约97ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约98ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约99ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约98ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。在一些实施方案中，包含编码PGRN的转基因的AAV载体以足以在患者的额叶皮层中实现约100ng/mg的PGRN表达水平的量施用于患者。
在一些实施方案中，AAV载体以每半球单次剂量施用于患者，所述单次剂量构成所述量。
在一些实施方案中，AAV载体以每半球多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)剂量施用于患者，所述多个剂量一起构成所述量。
在一些实施方案中，AAV载体以每半球两个或更多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)剂量施用于患者，所述两个或更多个剂量单独地构成所述量。
在一些实施方案中，每半球的两个或更多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)剂量彼此间隔一年或更长时间(例如，一年、一年零一天、一年零一个月、一年零六个月、两年、三年、四年或五年)。
在一些实施方案中，在彼此约12个月(例如，约12个月、约11个月、约10个月、约9个月、约8个月、约7个月、约6个月、约5个月、约4个月、约3个月、约2个月或约1个月)内向患者施用每半球的两个或更多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)剂量。
在一些实施方案中，AAV载体包含编码与神经认知障碍、神经肌肉障碍或溶酶体贮积症相关的蛋白质(诸如表5中描述的蛋白质)的转基因。在一些实施方案中，AAV载体包含编码与溶酶体贮积症相关的蛋白质的转基因，所述蛋白质诸如α-半乳糖苷酶a、α-1-艾杜糖苷酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、溶酶体酸性α-葡萄糖苷酶、鞘磷脂酶、己糖胺酶A、己糖苷酶B、芳基硫酸酯酶A、溶酶体酸性脂肪酶、酸性神经酰胺酶、半乳糖基神经酰胺酶、α-岩藻糖苷酶、α-甘露糖苷贮积症、β-甘露糖苷贮积症、天冬氨酸氨基葡萄糖苷酶、神经酰胺酶、乙酰肝素-N-硫酸酯酶、N-乙酰基-α-氨基葡萄糖苷酶、乙酰基-CoA:α-氨基葡萄糖苷N-乙酰基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙酰基半乳糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、芳基硫酸酯酶A、芳基硫酸酯酶B和β-葡糖醛酸糖苷酶。
本文所述的AAV可以足以改善神经认知或神经肌肉障碍(例如神经变性病症，诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍)中的一种或多种病理学特征的量施用。本文所述的AAV的施用可改善受试者的认知表现，恢复由额叶皮层中的转基因编码的蛋白质在表达(例如，约2ng/mg至约8ng/mg(例如，3ng/mg至约7ng/mg、4ng/mg至约6ng/mg或约5ng/mg)或更多(例如，约9ng/mg、约10ng/mg、约15ng/mg、约20ng/mg、约30ng/mg、约40ng/mg、约50ng/mg、约60ng/mg、约70ng/mg、约80ng/mg、约90ng/mg或约100ng/mg)，改善受试者的运动功能，降低受试者的脑组织中α-突触核蛋白水平、tau阳性神经元包涵体水平和/或TAR DNA结合蛋白43(TDP-43)阳性包涵体水平。可在治疗之前和之后使用标准神经学测试来评估认知和运动功能，并且可使用ELISA检测血浆和脑脊液(CSF)中的蛋白质水平(例如PGRN)。神经变性可使用F18-氟脱氧葡萄糖PET扫描或MRI扫描进行评估。可在施用AAV之后1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或更长时间对患者进行评价。根据评价结果，患者可接受另外的治疗。
药物组合物
本文所述的AAV可配制为药物组合物，以用于以适合体内施用的生物相容形式施用于患者，诸如表现出神经认知或神经肌肉障碍或处于神经认知或神经肌肉障碍(例如，神经变性病症，诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍)的人类患者。含有例如本文所述的包含一种或多种编码PGRN的转基因的AAV的药物组合物通常包含药学上可接受的稀释剂或载体。药物组合物可包含例如无菌盐水溶液和核酸(例如由其组成)。无菌盐水通常是药用级盐水。药物组合物可包含例如无菌水和核酸(例如由其组成)。无菌水通常是药用级水。药物组合物可包含例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)和核酸(例如由其组成)。无菌PBS通常是药用级PBS。
在某些实施方案中，药物组合物包含一种或多种组合物或核酸分子和一种或多种赋形剂。在某些实施方案中，赋形剂是选自水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、淀粉酶、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素以及聚乙烯吡咯烷酮。
在某些实施方案中，核酸分子可与药学上可接受的活性和/或惰性物质混合以制备药物组合物或制剂。组合物和用于配制药物组合物的方法取决于许多标准，包括但不限于施用途径、疾病的程度或待施用的剂量。
在某些实施方案中，包含核酸分子的药物组合物涵盖抑制剂的任何药学上可接受的盐、抑制剂的酯或此类酯的盐。在某些实施方案中，包含核酸分子的药物组合物在施用于受试者(例如，人)后，能够提供(直接地或间接地提供)其生物活性代谢物或残留物。因此，例如，本公开还涉及抑制剂的药学上可接受的盐、前药、此类前药的药学上可接受的盐以及其他生物等效物。合适的药学上可接受的盐包括但不限于钠盐和钾盐。在某些实施方案中，前药包含一个或多个与核酸分子附接的缀合物基团，其中所述缀合物基团被体内的内源性核酸酶裂解。
脂质部分已用于各种方法中的核酸疗法中。在某些所述方法中，将核酸引入到由阳离子脂质和中性脂质的混合物制成的预先形成的脂质体或脂质复合物中。在某些方法中，在不存在中性脂质的情况下形成具有单阳离子脂质或聚阳离子脂质的DNA复合物。在某些实施方案中，对脂质部分进行选择，以增加药剂至具体细胞或组织的分布。在某些实施方案中，选择脂质部分以增加药物剂至脂肪组织的分布。在某些实施方案中，对脂质部分进行选择，以增加药剂至肌肉组织的分布。
在某些实施方案中，药物组合物包含递送系统。递送系统的实例包括但不限于脂质体和乳剂。某些递送系统可用于制备某些药物组合物，包括包含疏水性化合物的那些药物组合物。在某些实施方案中，使用了某些有机溶剂如二甲亚砜。
在某些实施方案中，药物组合物包含被设计用于将一种或多种本发明的药物剂递送至特定组织或细胞类型的一种或多种组织特异性递送分子。例如，在某些实施方案中，药物组合物包括涂覆有组织特异性抗体的脂质体。
在某些实施方案中，药物组合物包含共溶剂系统。某些此类共溶剂系统包含例如苄醇、非极性表面活性剂、水不可混溶的有机聚合物以及水相。在某些实施方案中，此类共溶剂系统用于疏水性化合物。这种共溶剂系统的非限制性实例是VPD共溶剂系统，其是包含3％w/v苄醇、8％w/v非极性表面活性剂聚山梨酯80TM和65％w/v聚乙二醇300的无水乙醇溶液。此类共溶剂系统的比例可在不显著改变其溶解度和毒性特征的情况下明显改变。此外，共溶剂组分的特性可以改变：例如，可使用其他表面活性剂替代聚山梨酯80TM；可改变聚乙二醇的分数大小；其他生物相容的聚合物可替代聚乙二醇，例如聚乙烯吡咯烷酮；以及其他糖或多糖可取代右旋糖。
在某些实施方案中，药物组合物被制备用于丘脑内施用。在此类实施方案中，药物组合物可包含载体并且配制在水溶液中，如水或生理上相容的缓冲液如汉克斯溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液。在一些实施方案中，包括其他成分(例如，有助于溶解或充当防腐剂的成分)。在一些实施方案中，使用适当的液体载体、悬浮剂等制备可注射悬浮液。某些注射用药物组合物是以单位剂型，例如在安瓿中或在多剂量容器中提供。某些注射用药物组合物为油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液，并且可含有配制剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。某些适用于注射用药物组合物的溶剂包括但不限于亲脂溶剂和脂肪油(如芝麻油)、合成脂肪酸酯(如油酸乙酯或甘油三酯)以及脂质体。
监测功效
可使用生物标志物以及其他方法来监测临床疗效。用于监测功效的可测量生物标志物包括但不限于监测神经认知或神经肌肉障碍(例如神经变性病症，诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍)的一种或多种身体症状。这些可包括震颤、肌肉痉挛或无力(例如，影响手臂、腿、颈部或膈肌)、僵硬(例如，肌肉僵硬)、协调性和/或平衡性差、咀嚼或吞咽困难、暴饮暴食所致的体重增加、肌肉僵硬、走路时拖着脚走、站立或坐在椅子上有困难、疲劳、膀胱控制困难、癫痫发作、无法控制的抽搐(例如手臂、腿、肩膀或舌头的肌束震颤)、运动迟缓、姿势受损、自主运动丧失、言语变化、书写变化、身体功能调节不良(例如自主神经)、睡眠困难、笨拙、绊倒、言语不清或肌肉消耗。观察到一种或多种症状的稳定、改善和/或逆转表明治疗或预防方案是有效的。观察到一种或多种症状的进展、增加或恶化表明治疗或预防方案无效。用于评估神经认知或神经肌肉障碍(例如，神经变性病症，诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍)的治疗的优选生物标志物是PGRN的水平。优选地在蛋白质水平下评估这种标志物，但编码PGRN的mRNA的测量也可以用作PGRN表达的替代测量。这种水平可在血液样品中进行测量。这种水平在患有神经认知或神经肌肉障碍(例如神经变性病症，诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍)的受试者中相对于对照未患病个体群体降低(例如，患者表现出的内源性PGRN的表达水平为在具有相同年龄、性别和/或体重指数的人类受试者中观察到的内源性PGRN表达水平的约1％至约40％，所述人类受试者未患神经认知或神经肌肉障碍(例如，神经变性病症，诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍)。因此，水平的增加提供了有利治疗反应的指示，而水平不变或降低提供了不利的或至少非最佳的治疗反应的指示。
在某些实施方案中，监测方法可能需要在施用本文所述的AAV剂量之前确定受试者中可测量生物标志物或疾病参数的基线值，并将其与治疗过程后的相同可测量生物标志物或参数的值进行比较。
在其他方法中，确定对照群体的可测量生物标志物或参数的对照值(即平均值和标准偏差)。例如，在一些实施方案中，在施用AAV载体之前，患者表现出的内源性PGRN表达水平为在具有相同年龄、性别和/或体重指数的人类受试者中观察到的内源性PGRN表达水平的约1％至约40％，所述人类受试者未患神经认知或神经肌肉障碍(例如，神经变性病症，诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍)。在某些实施方案中，对照群体中的个体未接受过先前治疗并且未患神经认知或神经肌肉障碍(例如神经变性病症，诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍)，也不处于发展神经认知或神经肌肉障碍(例如神经变性病症，诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍)的风险。在此类情况下，如果可测量生物标志物或临床参数的值接近对照值，则治疗被认为是有效的。在其他实施方案中，对照群体中的个体未接受过先前治疗并且已被诊断患有神经认知或神经肌肉障碍(例如神经变性病症，诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍)。在此类情况下，如果可测量生物标志物或临床参数的值接近对照值，则治疗被认为是无效的。
在其他方法中，监测当前未接受治疗但已经历前一疗程的受试者的一种或多种生物标志物或临床参数以确定是否需要恢复治疗。可将受试者中一种或多种生物标志物或临床参数的测量值与前一疗程之后在所述受试者中先前实现的值进行比较。或者，可将受试者中测量的值与在经历疗程后的受试者群体中确定的对照值(平均值加标准偏差)进行比较。或者，可将受试者中的测量的值与保持无疾病症状的预防性治疗的受试者群体或显示疾病特征的改善的治疗性治疗的受试者群体中的对照值进行比较。在此类情况下，如果可测量生物标志物或临床参数的值接近对照值，则治疗被认为是有效的并且不需要恢复。在所有这些情况下，相对于对照水平的显著差异(即，超过标准偏差)是应在受试者中恢复治疗的指标。
在一些实施方案中，在施用AAV载体之后，相对于在施用AAV载体之前获得的患者PGRN表达水平的测量值，患者表现出PGRN表达的增加。在一些实施方案中，在患者的丘脑、额叶皮层、基底神经节、顶叶皮层、颞叶皮层、顶叶和颞叶皮层和/或CSF中观察到PGRN表达的增加。
在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约2ng/mg至约100ng/mg(例如，3ng/mg至约99ng/mg、4ng/mg至约98ng/mg、5ng/mg至约97ng/mg、10ng/mg至约90ng/mg、20ng/mg至约80ng/mg、30ng/mg至约70ng/mg、40ng/mg至约60ng/mg或约50ng/mg)的PGRN表达水平。例如，在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约3ng/mg至约99ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约4ng/mg至约98ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约5ng/mg至约97ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约10ng/mg至约90ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出约20ng/mg至约80ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出约30ng/mg至约70ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出约40ng/mg至约60ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出约50ng/mg的PGRN表达水平。
在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约2ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约3ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约4ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约5ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约6ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约7ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约8ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约9ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约10ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约11ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约12ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约13ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约14ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约15ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约16ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约17ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约18ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约19ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约20ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约21ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约22ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约23ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约24ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约25ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约26ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约27ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约28ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约29ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约30ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约31ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约32ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约33ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约34ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约35ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约36ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约37ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约38ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约39ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约40ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约41ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约42ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约43ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约44ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约45ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约46ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约47ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约48ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约49ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约50ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约51ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约52ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约53ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约54ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约55ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约56ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约57ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约58ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约59ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约60ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约61ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约62ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约63ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约64ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约65ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约66ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约67ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约68ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约69ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约70ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约71ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约72ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约73ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约74ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约75ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约76ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约77ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约78ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约79ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约80ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约81ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约82ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约83ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约84ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约85ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约86ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约87ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约88ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约89ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约90ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约91ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约92ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约93ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约94ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约95ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约96ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约97ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约98ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约99ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约98ng/mg的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出额叶皮层中约100ng/mg的PGRN表达水平。
在一些实施方案中，在AAV载体施用后，患者表现出额叶皮层中与在以约1x109vg/半球至约9x1012vg/半球(例如，约5x109vg/半球至约1x1012vg/半球、约1x1010vg/半球至约5x1011vg/半球或约5x1010vg/半球至约1x1011vg/半球)的量丘脑内施用具有SEQ ID NO:6的核酸序列的AAV2/9载体后在患有神经认知或神经肌肉障碍(例如，神经变性病症诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍)的人类受试者中观察到的PGRN表达水平相当的PGRN表达水平。例如，在一些实施方案中，在AAV载体施用后，患者表现出额叶皮层中与在以约5x109vg/半球至约1x1012vg/半球的量丘脑内施用具有SEQID NO:6的核酸序列的AAV2/9载体后在患有神经认知或神经肌肉障碍(例如，神经变性病症诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍)的人类受试者中观察到的PGRN表达水平相当的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在AAV载体施用后，患者表现出额叶皮层中与在以约1x1010vg/半球至约5x1011vg/半球的量丘脑内施用具有SEQ ID NO:6的核酸序列的AAV2/9载体后在患有神经认知或神经肌肉障碍(例如，神经变性病症诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍)的人类受试者中观察到的PGRN表达水平相当的PGRN表达水平。在一些实施方案中，在AAV载体施用后，患者表现出额叶皮层中与在以约5x1010vg/半球至约1x1011vg/半球的量丘脑内施用具有SEQ ID NO:6的核酸序列的AAV2/9载体后在患有神经认知或神经肌肉障碍(例如，神经变性病症诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍)的人类受试者中观察到的PGRN表达水平相当的PGRN表达水平。
在一些实施方案中，在ITM施用AAV载体后，患者未表现出一种或多种(例如，两种、三种、四种或更多种)外周组织(例如，肝脏、肺和脾)中PGRN表达的显著增加，诸如小于约10％(例如，小于约9％、小于约8％、小于约7％、小于约6％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％，诸如0％)的增加。例如，在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出一种或多种(例如，两种、三种、四种或更多种)外周组织(例如，肝脏、肺和脾)中小于约9％的PGRN表达的增加。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出一种或多种(例如，两种、三种、四种或更多种)外周组织(例如，肝脏、肺和脾)中小于约8％的PGRN表达的增加。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出一种或多种(例如，两种、三种、四种或更多种)外周组织(例如，肝脏、肺和脾)中小于约7％的PGRN表达的增加。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出一种或多种(例如，两种、三种、四种或更多种)外周组织(例如，肝脏、肺和脾)中小于约6％的PGRN表达的增加。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出一种或多种(例如，两种、三种、四种或更多种)外周组织(例如，肝脏、肺和脾)中小于约5％的PGRN表达的增加。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出一种或多种(例如，两种、三种、四种或更多种)外周组织(例如，肝脏、肺和脾)中小于约4％的PGRN表达的增加。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出一种或多种(例如，两种、三种、四种或更多种)外周组织(例如，肝脏、肺和脾)中小于约3％的PGRN表达的增加。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出一种或多种(例如，两种、三种、四种或更多种)外周组织(例如，肝脏、肺和脾)中小于约2％的PGRN表达的增加。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出一种或多种(例如，两种、三种、四种或更多种)外周组织(例如，肝脏、肺和脾)中小于约1％的PGRN表达的增加。在一些实施方案中，在施用AAV载体后，患者表现出一种或多种(例如，两种、三种、四种或更多种)外周组织(例如，肝脏、肺和脾)中约0％的PGRN表达的增加。
在一些实施方案中，外周组织包括但不限于肝脏、肺和脾。
在一些实施方案中，PGRN的表达是相对于GAPDH的表达来测量的。
药盒
本文所述的组合物可以药盒的形式提供，以用于治疗神经认知或神经肌肉障碍(例如神经变性病症，诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍)。在一些实施方案中，药盒可包括一种或多种如本文所述的AAV。药盒可包括药品说明书，其指示药盒的使用者(诸如具有本领域技能的医师)执行本文所述的任一种方法。药盒可任选地包括注射器或用于施用组合物的其他装置。在一些实施方案中，药盒可包括一种或多种额外治疗剂。
实施例
提出以下实施例以便为本领域普通技术人员提供对本文所述的组合物和方法可如何使用和评价的描述，并且旨在纯粹是对本发明的举例说明且不旨在限制本发明人所认定的其发明的范围。
实施例1.用于颗粒蛋白前体的有效皮层表达的密码子优化的人颗粒蛋白前体构建体的开发
用于人颗粒蛋白前体(hPGRN)的有效表达的GRN基因的密码子优化
人类GRN基因序列(不包括内含子DNA)如下：
ATTCTCCAATCACATGATCCCTAGAAATGGGGTGTGGGGCGAGAGGAAGCAGGGAGGAGAGTGATTTGAGTAGAAAAGAAACACAGCATTCCAGGCTGGCCCCACCTCTATATTGATAAGTAGCCAATGGGAGCGGGTAGCCCTGATCCCTGGCCAATGGAAACTGAGGTAGGCGGGTCATCGCGCTGGGGTCTGTAGTCTGAGCGCTACCCGGTTGCTGCTGCCCAAGGACCGCGGAGTCGGACGCAGGCAGACCATGTGGACCCTGGTGAGCTGGGTGGCCTTAACAGCAGGGCTGGTGGCTGGAACGCGGTGCCCAGATGGTCAGTTCTGCCCTGTGGCCTGCTGCCTGGACCCCGGAGGAGCCAGCTACAGCTGCTGCCGTCCCCTTCTGGACAAATGGCCCACAACACTGAGCAGGCATCTGGGTGGCCCCTGCCAGGTTGATGCCCACTGCTCTGCCGGCCACTCCTGCATCTTTACCGTCTCAGGGACTTCCAGTTGCTGCCCCTTCCCAGAGGCCGTGGCATGCGGGGATGGCCATCACTGCTGCCCACGGGGCTTCCACTGCAGTGCAGACGGGCGATCCTGCTTCCAAAGATCAGGTAACAACTCCGTGGGTGCCATCCAGTGCCCTGATAGTCAGTTCGAATGCCCGGACTTCTCCACGTGCTGTGTTATGGTCGATGGCTCCTGGGGGTGCTGCCCCATGCCCCAGGCTTCCTGCTGTGAAGACAGGGTGCACTGCTGTCCGCACGGTGCCTTCTGCGACCTGGTTCACACCCGCTGCATCACACCCACGGGCACCCACCCCCTGGCAAAGAAGCTCCCTGCCCAGAGGACTAACAGGGCAGTGGCCTTGTCCAGCTCGGTCATGTGTCCGGACGCACGGTCCCGGTGCCCTGATGGTTCTACCTGCTGTGAGCTGCCCAGTGGGAAGTATGGCTGCTGCCCAATGCCCAACGCCACCTGCTGCTCCGATCACCTGCACTGCTGCCCCCAAGACACTGTGTGTGACCTGATCCAGAGTAAGTGCCTCTCCAAGGAGAACGCTACCACGGACCTCCTCACTAAGCTGCCTGCGCACACAGTGGGGGATGTGAAATGTGACATGGAGGTGAGCTGCCCAGATGGCTATACCTGCTGCCGTCTACAGTCGGGGGCCTGGGGCTGCTGCCCTTTTACCCAGGCTGTGTGCTGTGAGGACCACATACACTGCTGTCCCGCGGGGTTTACGTGTGACACGCAGAAGGGTACCTGTGAACAGGGGCCCCACCAGGTGCCCTGGATGGAGAAGGCCCCAGCTCACCTCAGCCTGCCAGACCCACAAGCCTTGAAGAGAGATGTCCCCTGTGATAATGTCAGCAGCTGTCCCTCCTCCGATACCTGCTGCCAACTCACGTCTGGGGAGTGGGGCTGCTGTCCAATCCCAGAGGCTGTCTGCTGCTCGGACCACCAGCACTGCTGCCCCCAGGGCTACACGTGTGTAGCTGAGGGGCAGTGTCAGCGAGGAAGCGAGATCGTGGCTGGACTGGAGAAGATGCCTGCCCGCCGGGCTTCCTTATCCCACCCCAGAGACATCGGCTGTGACCAGCACACCAGCTGCCCGGTGGGGCAGACCTGCTGCCCGAGCCTGGGTGGGAGCTGGGCCTGCTGCCAGTTGCCCCATGCTGTGTGCTGCGAGGATCGCCAGCACTGCTGCCCGGCTGGCTACACCTGCAACGTGAAGGCTCGATCCTGCGAGAAGGAAGTGGTCTCTGCCCAGCCTGCCACCTTCCTGGCCCGTAGCCCTCACGTGGGTGTGAAGGACGTGGAGTGTGGGGAAGGACACTTCTGCCATGATAACCAGACCTGCTGCCGAGACAACCGACAGGGCTGGGCCTGCTGTCCCTACCGCCAGGGCGTCTGTTGTGCTGATCGGCGCCACTGCTGTCCTGCTGGCTTCCGCTGCGCAGCCAGGGGTACCAAGTGTTTGCGCAGGGAGGCCCCGCGCTGGGACGCCCCTTTGAGGGACCCAGCCTTGAGACAGCTGCTGTGAGGGACAGTACTGAAGACTCTGCAGCCCTCGGGACCCCACTCGGAGGGTGCCCTCTGCTCAGGCCTCCCTAGCACCTCCCCCTAACCAAATTCTCCCTGGACCCCATTCTGAGCTCCCCATCACCATGGGAGGTGGGGCCTCAATCTAAGGCCTTCCCTGTCAGAAGGGGGTTGTGGCAAAAGCCACATTACAAGCTGCCATCCCCTCCCCGTTTCAGTGGACCCTGTGGCCAGGTGCTTTTCCCTATCCACAGGGGTGTTTGTGTGTGTGCGCGTGTGCGTTTCAATAAAGTTTGTACACTTTCTTAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO:10)。
人PGRN氨基酸序列是如下：
MWTLVSWVALTAGLVAGTRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRQLL(SEQ IDNO:2)。
SEQ ID NO:10的分析揭示了整个基因中各种氨基酸的特定密码子偏好。对密码子频率的检查揭示，对于某些氨基酸，特定密码子占主导地位，而其他密码子的使用频率较低或根本不使用。本领域技术人员可以本领域已知的任何方式进行密码子优化，例如，诸如例如在美国专利号7,561,972、7,561,973和7,888,112中描述的方式，所述专利各自以引用的方式整体并入本文。
最终的密码子优化的基因可表现出与SEQ ID NO:3的核酸序列的至少85％序列同一性。例如，最终的密码子优化的基因可表现出与SEQ ID NO:3的核酸序列的至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在另一个实例中，最终的密码子优化的基因可具有与SEQ ID NO:3的核酸序列同一的核酸序列。
一旦设计，最终的密码子优化的基因可例如通过本领域已知的固相核酸程序来制备。用于固相合成多核苷酸的技术是本领域已知的，并且例如在美国专利号5,541,307中进行了描述，所述专利涉及固相多核苷酸合成和纯化的公开内容以引用的方式并入本文。另外，可例如使用本领域已知的基于PCR的技术和/或通过用含有设计的基因的质粒转化DH5α大肠杆菌来扩增所制备的基因。随后可培养细菌以扩增其中的DNA，并且可通过本领域已知的质粒纯化技术分离基因，随后任选地对质粒进行限制性消化和/或测序以验证密码子优化的基因的身份。
密码子优化的人类PGRN构建体
PCR引物被设计用于结合至并扩增来自通过聚合酶链反应从培养细胞中分离的基因组DNA的GRN核酸序列。使用上述密码子优化方法，通过定点诱变对分离的GRN进行修饰。将所得经修饰的扩增产物通过本领域已知的方法进行凝胶纯化和测序。
使用假型化腺相关病毒(AAV)2/9(AAV 2/9)亲本载体作为密码子优化的人PGRN(hPGRN)的目标载体。亲本载体含有具有以下组分的核酸分子：第一AAV2反向末端重复序列、人突触蛋白(hSyn)启动子、人生长激素内含子(hGHi3)、牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化位点(pA)、第二AAV2 ITR(ITR2)、噬菌体来源的复制起点(f1 ori)、弗氏柠檬酸杆菌ampCβ-内酰胺酶(AmpR)启动子、卡那霉素选择基因(KanR)和第二复制起点(ori)。将密码子优化的hPGRN克隆到亲本载体中(图1；本文称为“AAV9-SYN-PGRN”)。
实施例2.在皮层中建立hPGRN的治疗性表达，同时避免毒性副作用
目标
本研究的目的是评估成年绵羊中如实施例1中所述的AAV9-SYN-PGRN的顺行和/或逆行运输以及全身毒性和/或表达，以挽救皮层中PGRN的表达。此外，本研究旨在细化AAV9-SYN-PGRN的有效给药范围，如通过皮层脑组织中PGRN的超生理水平所鉴定。
材料和方法
在大约90分钟内分别向成年(约2岁)野生型绵羊(n＝2/剂量)丘脑内(ITM)输注(例如，对流辅助施用)1x1010vg/半球(本文称为“低剂量”)、5x1010vg/半球(本文称为“中剂量”)或1x1011vg/半球(本文称为“高剂量”)的AAV9-SYN-PGRN(250μL/丘脑)。ITM施用后28天，处死动物并收集脑活检物。分析脑、脑脊液(CSF)和血清中的hPGRN蛋白质表达和vg水平，同时对脑进行免疫荧光成像以评估hPGRN表达和对病毒载体的潜在炎症反应(例如炎症标志物的表达)。
结果
结果，我们观察到，本文所述的载体制剂在输注到丘脑中时有效地转导了皮层(图2)，即使在低剂量下，皮层中的hPGRN也具有正常至超生理水平。此外，我们观察到所有脑部区域中的hPGRN水平呈剂量依赖性增加，并且动物间一致性较高(图3)。在所有绵羊的前额叶(PF)皮层中观察到这种效应，并且如通过IBA1的表达水平所测量，没有观察到反应性小胶质细胞的证据(图4)。评估跨皮层区域(例如，额叶A皮层(取自皮层前部的冠状切片)、额叶B皮层(取自皮层后部的冠状切片)、尾状壳核/顶颞叶(CD/PT)皮层)、基底神经节(例如尾核和壳核)、丘脑和海马的剂量表达反应，我们观察到即使是最低测试剂量也使hPGRN蛋白表达升高至基础水平之上(图5和6)。此外，在将此数据针对丘脑中hPGRN表达的百分比归一化后，我们观察到低剂量趋向于向皮层的更大相对hPGRN递送(图7)。在CSF中，中剂量和高剂量使hPGRN水平升高以达到10-30ng/ml范围内的超生理学人CSF PGRN水平，表明恢复作用(图8)。在所述相应绵羊的血清中没有观察到可检测的hPGRN表达(图9)。在针对组织病理学的研究中，苏木精和伊红染色揭示，所有动物显示大脑白质和/或丘脑中的单侧或双侧局灶性炎症病变，与剂量施用期间造成的损伤一致。没有证据表明hPGRN表达位点处特异性地组织病理学变化(图10)。在少数动物中观察到神经胶质增生，但考虑到其最小、局灶性质以及在不同区域的白质和灰质中的散发性发生，被认为与hPGRN的表达无关。这也可能与给药和/或自发背景变化相关。总而言之，这些数据证明，在所有剂量水平下，AAV9-SYN-PGRN均有效地转导皮层并介导皮层hPGRN表达水平升高，而不会引发针对AAV载体的免疫反应。
实施例3.确立hPGRN在皮层中的给药效率
目标
本研究的目标是检查成年绵羊中ITM施用AAV9-SYN-PGRN的皮层转导效率。
材料和方法
实施例1和2中描述了材料和方法。
结果
图11显示在分别ITM施用低、中或高剂量的野生型绵羊的脑部区域域中的hPGRN表达水平，如通过定量的AAV9-SYN-PGRN的vg/μg(图3)归一化。我们观察到，低剂量通常更有效地将hPGRN递送至皮层。
实施例4.比较中枢施用途径中皮质中的hPGRN转导效率
目标
本研究的目标是比较成年绵羊中通过ITM或小脑延髓池内(ICM)施用编码hPGRN转基因的病毒载体的皮层转导效率。
材料和方法
分别向成年(约2岁)野生型绵羊(分别n＝2/剂量或2/载体)ITM输注(例如对流辅助施用)1x1010(250μL/丘脑，在大约90分钟内)vg/半球或ICM施用1x1013vg(2mL，在大约1分钟内，CSF置换)的AAV9-SYN-PGRN或编码可操作地连接至具有巨细胞病毒增强子的鸡β-肌动蛋白启动子的hPGRN转基因的AAV1或AAV9(CB7；分别AAV1-CB7-PGRN和AAV9-CB7-PGRN)或对照欧乃派克(omnipaque)。对来自脑的区域进行活检并分析hPGRN蛋白质表达和vg水平，同时对脑进行免疫荧光成像以评估hPGRN表达。
结果
对小脑切片的hPGRN的初步评估证实了成功的ICM施用(图12)。尽管观察到差异，但所有动物均在小脑中显示hPGRN。AAV1-CB7-PGRN表现出强烈的、表面的且几乎完全是神经胶质的染色。AAV9-SYN-PGRN和AAV9-CB7-PGRN均表现出hPGRN更好地渗透到小脑组织中，其中AAV9-CB7-PGRN在神经胶质细胞中更普遍，并且AAV9-SYN-PGRN在神经元中更普遍。在PF皮层和丘脑中，ICM施用介导很少的表达，与使用哪种AAV载体无关(图13)。相比之下，这项比较研究强调了ITM施用介导了PF皮层中hPGRN的强烈表达。在脑部区域中获得了类似的结果，在于与ICM施用相比，ITM施用产生了增强的转导(图14)。
在评估hPGRN蛋白质表达水平时，我们观察到了类似的结果模式。具体地说，我们观察到，在ICM处理的绵羊的皮层和皮层下检测到的水平处于在对照(未处理的绵羊)中检测到的背景水平之内，而ITM输注了5x1010vg/半球的AAV9-SYN-PGRN的绵羊与ICM施用了AAV9-SYN-PGRN或AAV1-CB7-PGRN或AAV9-CB7-PGRN载体的绵羊相比展现了更高的hPGRN皮层水平(图15-18)。在ICM输注动物的皮层中，我们观察到可忽略不计的hPGRN水平，范围至在ICM处理的绵羊的丘脑和顶叶/颞叶皮层中检测到的少量hPGRN。
总而言之，这些结果表明ICM施用产生较差的皮层转导，而ITM施用实现优异的皮层转导。
实施例5.评估在成年绵羊中通过ITM施用编码hPGRN转基因的病毒载体递送AAV后，与外周组织相比，皮层组织中的hPGRN组织表达
目标
本研究的目标是评估成年绵羊中ITM施用编码hPGRN转基因的病毒载体后，与外周组织(例如肝、脾和肺)相比，中枢神经系统(CNS)中的hPGRN表达。
材料和方法
分别向成年(约2岁)野生型绵羊(分别n＝2/剂量或2/载体，以及一只对照绵羊)ITM输注(例如对流辅助施用)1x1010、5x1010或1x1011(250μL/丘脑，在大约90分钟内)vg/半球的AAV9-SYN-PGRN或编码可操作地连接至具有巨细胞病毒增强子的鸡β-肌动蛋白启动子的hPGRN转基因的AAV1或AAV9(CB7；分别AAV1-CB7-PGRN和AAV9-CB7-PGRN)或对照欧乃派克。对来自脑、肝、脾和肺的区域进行活检并分析hPGRN蛋白质表达和vg水平，同时对脑、肝、脾和肺进行免疫荧光成像以评估hPGRN表达。
结果
如实施例4中所论述，编码hPGRN转基因的AAV9载体的ITM施用介导了脑中，包括丘脑、额叶皮层、顶叶/颞叶皮层、枕叶皮层、壳核、尾核、海马以及来自左半球和右半球的血清中的hPGRN强表达。在评估hPGRN蛋白质表达水平时，在外周组织，包括肝(图21)、肺和脾中没有观察到hPGRN的显著表达(如通过病毒DNA所评估)。
值得注意的是，在食蟹猴中已经获得了类似的结果(参见例如图22和23)。
总而言之，这些结果表明这种载体的ITM施用实现hPGRN的CNS特异性表达。
实施例6.密码子优化的人PGRN对额颞叶痴呆模型中脂褐质沉积症的有效性
目标
额颞叶痴呆(FTD)是一种以大脑皮层的额叶和颞叶中的进行性神经变性为特征的临床综合征。FTD中已鉴定出GRN基因的70多种功能丧失突变，其中绝大多数导致单倍剂量不足和血清PGRN水平降低。
本研究的目标是证明AAV9-SYN-PGRN在早期疾病(例如FTD)小鼠模型中的功效。
材料和方法
额颞叶痴呆小鼠模型
GRN缺失的纯合小鼠(例如GRN-/-小鼠)被用作FTD的模型。在6-8周龄时，向小鼠输注如实施例1中所述的AAV9-SYN-PGRN，并允许12周进行病毒表达。
免疫荧光
将活检脑组织在10％福尔马林中固定过夜，然后保存在70％乙醇中。将组织包埋在石蜡中并切成5μm切片。
对于免疫荧光分析，对组织进行透化，并用5％兔血清洗涤载玻片并封闭30分钟。将切片分别与抗hPGRN、抗Iba1、抗CD68和抗亚基C线粒体ATP合酶(SCMAS)的第一抗体在室温下孵育1小时。将载玻片与第二抗体一起孵育30分钟。评估包括SCMAS免疫反应性的详细定量。
结果
结果，我们观察到反应性小胶质细胞(例如CD68和IBA1阳性变形虫形细胞)标记与hPGRN水平相关。图19显示，即使低水平的hPGRN表达，脂褐质的SCMAS标记在区域中也减少。这种趋势在所有剂量的AAV9-SYN-PGRN中明显，并且与区域表达(例如，丘脑中的hPGRN阳性表达)相关。定量后，揭示如通过SCMAS免疫反应性所检测到的，低剂量的AAV9-SYN-PGRN显著改善脂褐质沉积症(图20)。总而言之，这些结果证明编码密码子优化的hPGRN的示例性AAV2/9质粒改善了FTD小鼠模型中PF皮层、海马和丘脑中的脂褐质沉积症的功效。
实施例7.密码子优化的GRN基因用于治疗神经认知或神经肌肉障碍的用途
编码PGRN的基因可使用本文所述的程序(例如，如上面实施例1中所描述)进行密码子优化。例如，最终的密码子优化的GRN基因可表现出与SEQ ID NO:3的核酸序列的至少85％序列同一性。例如，最终的密码子优化的GRN基因可表现出与SEQ ID NO:3的核酸序列的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在另一实例中，最终的密码子优化的基因具有与SEQ ID NO:3的核酸序列同一的核酸序列。
随后可将基因并入质粒，诸如AAV2/9载体中，并施用于患有神经认知或神经肌肉障碍(例如神经变性病症，诸如FTD、阿尔茨海默氏病(AD)、帕金森氏病(PD)、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)或相关的运动神经元障碍)的患者。例如，可向患有FTD、与GRN基因中的突变相关的病症或AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍的患者施用AAV2/9载体，所述载体含有在合适的启动子控制下的密码子优化的GRN基因，以用于在人类细胞(诸如神经元)中表达。例如，可生成AAV载体，诸如AAV2/9载体，所述载体在载体的5'和3'反向末端重复序列之间并入密码子优化的GRN基因，并且可将所述基因置于神经元特异性启动子，诸如突触蛋白(Syn)启动子控制下。AAV载体可ITM施用于受试者。
本领域技术人员可通过多种方法监测密码子优化的GRN基因的表达。例如，本领域技术人员可用密码子优化的基因转染培养的神经元，以模拟密码子优化的基因在患者神经元中的表达。随后可使用例如本文所述的表达测定，诸如qPCR、RNA-Seq、ELISA或免疫印迹程序来监测所编码的蛋白质的表达。基于从基因表达测定获得的数据，可进行密码子优化程序的进一步迭代，例如，以进一步减少mRNA转录物中的CpG含量和均聚物含量。随后可制备具有最佳体外表达模式的候选基因序列以用于并入合适的AAV载体中并施用于哺乳动物受试者，诸如神经认知或神经肌肉障碍(例如神经变性病症，诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍)的动物模型或人类患者。
实施例8.通过丘脑内施用人PGRN治疗人类患者的神经认知或神经肌肉障碍
使用本公开的组合物和方法，可向患有神经认知或神经肌肉障碍(例如，神经变性病症，诸如FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍)的患者ITM施用(例如，对流辅助施用)包含编码人PGRN的核酸序列的AAV(例如，假型AAV2/9)载体。人PGRN序列可以是密码子优化的和/或可以可操作地连接至Syn启动子，例如具有SEQID NO:6的核酸的AAV载体。AAV可例如以约1x109vg/半球至约9x1012vg/半球(例如，5x109vg/半球至约5x1012vg/半球、1x1010vg/半球至约5x1012vg/半球、1x1011vg/半球至约5x1012vg/半球、1x1012vg/半球至约5x1012vg/半球或1x1013vg/半球至约5x1012vg/半球)的量施用。例如，AAV载体以约1x1010vg/半球、约5x1010vg/半球或约1x1011vg/半球的量施用于患者。
在向患者施用包含编码hPGRN的转基因的AAV载体后，患者表现出PGRN水平的变化。例如，在向患者施用包含编码hPGRN的核酸序列的AAV载体后，患者展示额叶皮层中PGRN表达的恢复。例如，患者展示额叶皮层中约2ng/mg至约8ng/mg(例如，3ng/mg至约7ng/mg、4ng/mg至约6ng/mg或约5ng/mg)或更高(例如，约9ng/mg、约10ng/mg、约15ng/mg、约20ng/mg、约30ng/mg、约40ng/mg、约50ng/mg、约60ng/mg、约70ng/mg、约80ng/mg、约90ng/mg或约100ng/mg)的PGRN表达水平。此外或可替代地，例如，在向患者施用包含编码hPGRN的转基因的AAV载体后，患者展示认知功能的改善。
其他实施方案
本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请以引用的方式并入本文，其引用的程度犹如每个独立的出版物或专利申请被具体地和单独地指出以引用的方式并入。
尽管本发明已经结合其具体的实施方案进行了描述，但应当了解能够对它进行进一步的修改并且本申请旨在涵盖任何基本根据本发明的原理而对本发明进行的变动、使用或适应性调整，并且包括虽然不属于本发明但属于本发明所属领域的已知或习用实施手段的和属于上文所述的实质特征的以及符合权利要求范围之内的变更。
其他实施方案在权利要求书内。
Claims (89)
1.一种治疗影响患者的中枢神经系统(CNS)的病症的方法，所述方法包括向所述患者施用包含编码治疗性蛋白质的转基因的腺相关病毒(AAV)载体，其中所述AAV载体以约1x109vg/半球至约9x 1012vg/半球的量丘脑内施用于所述患者。
2.一种改善被诊断为患有影响患者的CNS的病症的患者的认知功能的方法，所述方法包括向所述患者施用包含编码治疗性蛋白质的转基因的AAV载体，其中所述AAV载体以约1x109vg/半球至约9x1012vg/半球的量丘脑内施用于所述患者。
3.一种在被诊断为患有影响CNS的病症的患者的脑(例如额叶皮层)中表达治疗性蛋白质的方法，所述方法包括向所述患者施用包含编码所述治疗性蛋白质的转基因的AAV载体，其中所述AAV载体以约1x 109vg/半球至约9x 1012vg/半球的量丘脑内施用于所述患者。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述AAV载体以约1x 1010vg/半球至约5x1012vg/半球的量施用于所述患者，任选地其中所述AAV载体以约1x 1010vg/半球、2x1010vg/半球、3x 1010vg/半球、4x 1010vg/半球、5x 1010vg/半球、6x 1010vg/半球、7x1010vg/半球、8x 1010vg/半球、9x 1010vg/半球、1x 1011vg/半球、2x 1011vg/半球、3x1011vg/半球、4x 1011vg/半球、5x 1011vg/半球、6x 1011vg/半球、7x 1011vg/半球、8x1011vg/半球、9x 1011vg/半球、1x 1012vg/半球、2x 1012vg/半球、3x 1012vg/半球、4x1012vg/半球或5x 1012vg/半球的量施用于所述患者。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述AAV载体以约5x 1010vg/半球至约9x 1011vg/半球的量施用于所述患者。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述AAV载体以约1x 1010vg/半球的量施用于所述患者。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述AAV载体以约5x 1010vg/半球的量施用于所述患者。
8.如权利要求5所述的方法，其中所述AAV载体以约1x 1011vg/半球的量施用于所述患者。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述AAV载体以每半球单次剂量施用于所述患者，所述单次剂量构成所述量。
10.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述AAV载体以每半球多个剂量施用于所述患者，所述多个剂量一起构成所述量。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白质是其活性的缺陷或缺乏与所述病症相关的蛋白质。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白质是分泌性蛋白质或本文表5中列出的蛋白质。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白质是PGRN。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述病症是神经认知障碍、神经肌肉障碍、神经变性病症或溶酶体贮积症。
15.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述病症是溶酶体贮积症。
16.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述病症是额颞叶痴呆(FTD)、阿尔茨海默氏病(AD)、帕金森氏病(PD)、路易体痴呆、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)或相关的神经认知或运动神经元障碍。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述转基因可操作地连接至在神经元细胞和/或神经胶质细胞中具有活性的启动子，任选地其中所述转基因编码PGRN。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述启动子是突触蛋白启动子、四环素控制的反式激活因子蛋白(tTA)启动子、反向四环素控制的反式激活因子蛋白(rTA)启动子、U1启动子、U6启动子、U7启动子、朊病毒启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、CB7启动子、H1启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、CMV-鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)启动子、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶III启动子、微管蛋白αI启动子、微管蛋白相关蛋白IB(MAP IB)启动子、神经元特异性烯醇化酶启动子、血小板源性生长因子β链启动子、神经丝轻链启动子、神经元特异性VGF基因启动子、神经元核(NeuN)启动子、腺瘤性结肠息肉病(APC)启动子、离子化钙结合衔接分子1(Iba-1)启动子或同源盒蛋白9(HB9)启动子。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述启动子是突触蛋白启动子。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述突触蛋白启动子具有与SEQ ID NO:1的核酸序列至少85％同一的核酸序列。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述突触蛋白启动子具有与SEQ ID NO:1的核酸序列至少90％同一的核酸序列，任选地其中所述突触蛋白启动子具有与SEQ ID NO:1的核酸序列至少95％、96％、97％、98％或99％同一的核酸序列。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述突触蛋白启动子具有SEQ ID NO:1的核酸序列。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白质是PGRN，并且其中所述PGRN具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少85％同一的氨基酸序列。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述PGRN具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列，任选地其中所述PGRN具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述PGRN具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述转基因编码PGRN，并且其中所述编码PGRN的转基因是密码子优化的。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述编码PGRN的转基因具有与SEQ ID NO:3的核酸序列至少85％同一的核酸序列。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述编码PGRN的转基因具有与SEQ ID NO:3的核酸序列至少90％同一的核酸序列，任选地其中所述编码PGRN的转基因具有与SEQ ID NO:3的核酸序列至少95％、96％、97％、98％或99％同一的核酸序列。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述编码PGRN的转基因具有SEQ ID NO:3的核酸序列。
30.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述转基因可操作地连接至人生长激素(hGH)内含子，任选地其中：(i)所述hGH内含子是hGH内含子3和/或(ii)所述转基因编码PGRN。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述hGH内含子具有与SEQ ID NO:4的核酸序列至少85％同一的核酸序列。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述hGH内含子具有与SEQ ID NO:4的核酸序列至少90％同一的核酸序列，任选地其中所述hGH内含子具有与SEQ ID NO:4的核酸序列至少95％、96％、97％、98％或99％同一的核酸序列。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述hGH内含子具有SEQ ID NO:4的核酸序列。
34.如权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述转基因可操作地连接至3'增强子元件，任选地其中所述转基因编码PGRN。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述3'增强子元件具有与SEQ ID NO:5的核酸序列至少85％同一的核酸序列。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述3'增强子元件具有与SEQ ID NO:5的核酸序列至少90％同一的核酸序列，任选地其中所述3'增强子元件具有与SEQ ID NO:5的核酸序列至少95％、96％、97％、98％或99％同一的核酸序列。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述3'增强子元件具有SEQ ID NO:5的核酸序列。
38.如权利要求1-37中任一项所述的方法，其中所述AAV载体包含来自选自由AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh74、AAVrh.8和AAVrh.10组成的组的AAV血清型的衣壳蛋白。
39.如权利要求1-38中任一项所述的方法，其中所述AAV是顺行运输的AAV或逆行运输的AAV。
40.如权利要求1-39中任一项所述的方法，其中所述AAV载体包含来自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh74、AAVrh.8或AAVrh.10的5’反向末端重复序列(ITR)和/或3’ITR，任选地其中所述AAV载体包含来自AAV2的5’ITR和3’ITR。
41.如权利要求1-40中任一项所述的方法，其中所述AAV载体包含来自一种AAV血清型的5’ITR和3’ITR以及来自不同AAV血清型的衣壳蛋白。
42.如权利要求1-41中任一项所述的方法，其中所述AAV载体是AAV2/9载体。
43.如权利要求1-42中任一项所述的方法，其中所述AAV具有与SEQ ID NO:6的核酸序列至少85％同一的核酸序列。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述AAV具有与SEQ ID NO:6的核酸序列至少90％同一的核酸序列。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述AAV具有与SEQ ID NO:6的核酸序列至少95％同一的核酸序列，任选地其中所述AAV具有与SEQ ID NO:6的核酸序列至少96％、97％、98％或99％同一的核酸序列。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述AAV具有SEQ ID NO:6的核酸。
47.如权利要求1-46中任一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白质是PGRN，并且其中，在施用所述AAV载体之前，所述患者表现出的内源性PGRN表达水平为在具有相同年龄、性别和/或体重指数的人类受试者中观察到的内源性PGRN表达水平的约1％至约40％，所述人类受试者未患FTD、AD、PD、路易体痴呆、ALS或相关的运动神经元障碍。
48.如权利要求1-47中任一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白质是PGRN，并且其中，在施用所述AAV载体之后，相对于在施用所述AAV载体之前获得的所述患者的PGRN表达水平的测量值，所述患者表现出PGRN表达的增加。
49.如权利要求48所述的方法，其中在所述患者的丘脑、额叶皮层、基底神经节、顶叶皮层、颞叶皮层、顶叶和颞叶皮层和/或脑脊液(CSF)中观察到PGRN表达的所述增加。
50.如权利要求1-49中任一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白质是PGRN，并且其中，在施用所述AAV载体后，所述患者表现出额叶皮层中约2ng/mg至约100ng/mg的PGRN表达水平。
51.如权利要求1-50中任一项所述的方法，其中所述AAV载体以对流辅助方式施用于所述患者。
52.一种治疗影响患者的CNS的病症的方法，所述方法包括向所述患者施用包含编码治疗性蛋白质的转基因的AAV载体，其中所述AAV载体以足以在所述患者的脑(例如，额叶皮层)中实现与在以约1x 109vg/半球至约9x 1012vg/半球的量丘脑内施用包含编码所述治疗性蛋白质的转基因的AAV2/9载体后在患有所述病症的人类受试者中观察到的治疗性蛋白质表达水平相当的治疗性蛋白质表达水平的量施用于所述患者。
53.一种改善被诊断为患有影响患者的CNS的病症的人类患者的认知功能的方法，所述方法包括向所述患者施用包含编码治疗性蛋白质的转基因的AAV载体，其中所述AAV载体以足以在所述患者的脑(例如，额叶皮层)中实现与在以约1x 109vg/半球至约9x 1012vg/半球的量丘脑内施用包含编码所述治疗性蛋白质的转基因的AAV2/9载体后在患有所述病症的人类受试者中观察到的治疗性蛋白质表达水平相当的治疗性蛋白质表达水平的量施用于所述患者。
54.一种在被诊断为患有影响患者的CNS的病症的人类患者的脑(例如额叶皮层)中表达治疗性蛋白质的方法，所述方法包括向所述患者施用包含编码所述治疗性蛋白质的转基因的AAV载体，其中所述AAV载体以足以在所述患者的脑(例如，额叶皮层)中实现与在以约1x 109vg/半球至约9x 1012vg/半球的量丘脑内施用包含编码所述治疗性蛋白质的转基因的AAV2/9载体后在患有所述病症的人类受试者中观察到的治疗性蛋白质表达水平相当的治疗性蛋白质表达水平的量施用于所述患者。
55.一种治疗有需要的人类患者的FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍的方法，所述方法包括向所述患者施用包含编码PGRN的转基因的AAV载体，其中所述AAV载体以足以在所述患者的脑(例如额叶皮层)中实现约2ng/mg至约8ng/mg或更高的PGRN表达水平的量施用于所述患者。
56.一种改善被诊断为患有FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍的人类患者的认知功能的方法，所述方法包括向所述患者施用包含编码PGRN的转基因的AAV载体，其中所述AAV载体以足以在所述患者的脑(例如额叶皮层)中实现约2ng/mg至约8ng/mg或更高的PGRN表达水平的量施用于所述患者。
57.一种在被诊断为患有FTD、AD、PD、路易体痴呆、相关的神经认知障碍、ALS或相关的运动神经元障碍的人类患者的脑(例如额叶皮层)中表达PGRN的方法，所述方法包括向所述患者施用包含编码PGRN的转基因的AAV载体，其中所述AAV载体以足以在所述患者的脑(例如额叶皮层)中实现约2ng/mg至约8ng/mg或更高的PGRN表达水平的量施用于所述患者。
58.如权利要求52-54中任一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白质是其活性的缺陷或缺乏与所述病症相关的蛋白质。
59.如权利要求52-54中任一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白质是分泌性蛋白质或本文表5中列出的蛋白质。
60.如权利要求52-54中任一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白质是PGRN。
61.如权利要求52-54中任一项所述的方法，其中所述病症是神经认知障碍、神经肌肉障碍、神经变性病症或溶酶体贮积症。
62.如权利要求52-54中任一项所述的方法，其中所述病症是溶酶体贮积症。
63.如权利要求52-54中任一项所述的方法，其中所述病症是额颞叶痴呆(FTD)、阿尔茨海默氏病(AD)、帕金森氏病(PD)、路易体痴呆、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)或相关的神经认知或运动神经元障碍。
64.如权利要求52-54中任一项所述的方法，其中包含编码所述治疗性蛋白质的转基因的所述AAV2/9载体具有SEQ ID NO:6的核酸序列。
65.如权利要求52-64中任一项所述的方法，其中施用于所述患者的所述AAV载体是顺行运输的AAV或逆行运输的AAV。
66.如权利要求65所述的方法，其中施用于所述患者的所述AAV载体包含来自选自由AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh74、AAVrh.8和AAVrh.10组成的组的AAV血清型的衣壳蛋白。
67.如权利要求52-66中任一项所述的方法，其中施用于所述患者的所述AAV载体包含来自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh74、AAVrh.8或AAVrh.10的5’ITR和/或3’ITR，任选地其中施用于所述患者的所述AAV载体包含来自AAV2的5’ITR和3’ITR。
68.如权利要求52-67中任一项所述的方法，其中施用于所述患者的所述AAV载体包含来自一种AAV血清型的5’ITR和3’ITR以及来自不同AAV血清型的衣壳蛋白。
69.如权利要求52-68中任一项所述的方法，其中施用于所述患者的所述AAV载体是AAV2/9载体。
70.如权利要求1-69中任一项所述的方法，其中所述人类患者被诊断为患有由于GRN基因中的突变所致的FTD。
71.如权利要求1-70中任一项所述的方法，其中在施用所述AAV载体后，观察到外周组织中转基因表达的增加小于10％。
72.如权利要求71所述的方法，其中所述外周组织包括肝、肺和/或脾。
73.如权利要求71或72所述的方法，其中所述转基因表达是相对于GAPDH表达来计算的。
74.如权利要求1-73中任一项所述的方法，其中所述患者是哺乳动物。
75.如权利要求1-74中任一项所述的方法，其中所述患者是人。
76.一种用于治疗影响患者的中枢神经系统(CNS)的病症的腺相关病毒(AAV)载体，其中所述AAV载体包含编码治疗性蛋白质的转基因，并且其中所述AAV载体以约1x 109vg/半球至约9x 1012vg/半球的量丘脑内施用于所述患者。
77.根据权利要求76使用的AAV，其中所述AAV载体以约1x1010vg/半球至约5x 1012vg/半球的量施用于所述患者，任选地其中所述AAV载体以约1x 1010vg/半球、2x 1010vg/半球、3x1010vg/半球、4x 1010vg/半球、5x 1010vg/半球、6x 1010vg/半球、7x 1010vg/半球、8x1010vg/半球、9x 1010vg/半球、1x 1011vg/半球、2x 1011vg/半球、3x 1011vg/半球、4x1011vg/半球、5x 1011vg/半球、6x 1011vg/半球、7x 1011vg/半球、8x 1011vg/半球、9x1011vg/半球、1x 1012vg/半球、2x 1012vg/半球、3x 1012vg/半球、4x 1012vg/半球或5x1012vg/半球的量施用于所述患者。
78.根据权利要求76使用的AAV，其中所述AAV载体以约5x1010vg/半球至约9x 1011vg/半球的量施用于所述患者。
79.根据权利要求76使用的AAV，其中所述AAV载体以约1x1010vg/半球的量施用于所述患者。
80.根据权利要求76使用的AAV，其中所述AAV载体以约5x1010vg/半球的量施用于所述患者。
81.根据权利要求76使用的AAV，其中所述AAV载体以约1x1011vg/半球的量施用于所述患者。
82.根据权利要求76使用的AAV，其中所述AAV载体以每半球单次剂量施用于所述患者，所述单次剂量构成所述量。
83.根据权利要求76使用的AAV，其中所述AAV载体以每半球多个剂量施用于所述患者，所述多个剂量一起构成所述量。
84.根据权利要求76使用的AAV，其中所述治疗性蛋白质是其活性的缺陷或缺乏与所述病症相关的蛋白质。
85.根据权利要求76使用的AAV，其中所述治疗性蛋白质是分泌性蛋白质或本文表5中列出的蛋白质。
86.根据权利要求76使用的AAV，其中所述治疗性蛋白质是PGRN。
87.根据权利要求76使用的AAV，其中所述病症是神经认知障碍、神经肌肉障碍、神经变性病症或溶酶体贮积症。
88.根据权利要求76使用的AAV，其中所述病症是溶酶体贮积症。
89.一种包含AAV载体的药盒，所述AAV载体包含编码PGRN的转基因，其中所述药盒还包括指导所述药盒的使用者根据如权利要求1-75中任一项所述的方法将所述AAV载体施用于患者的药品说明书。
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| US63/232,053 | 2021-08-11 | ||
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