CN118267376A - 一种核酸递送载体及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种核酸递送载体及其制备方法和用途，具体提供了一种脂质纳米颗粒组合物和制备方法以及在核酸递送中的应用。本发明提供的脂质纳米颗粒组合物具有的合成工艺简单、稳定性好。以其为基础制备mRNA药物或者疫苗兼具高效性、高稳定性和低毒性，且易于制备。从而具备优秀的核酸药物的传递性，可实现对活性物质(如示例的mRNA)的高效递送。解决了现有技术中存在的脂质纳米颗粒的不能稳定保存、安全性低的问题。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药制剂技术领域，具体涉及一种经过优化的阳离子脂质化合物、辅助磷脂、甾醇和PEG脂质组合、缓冲液系统所形成的脂质纳米颗粒组合物用于核酸药物的递送。
背景技术
核酸药物由于结构中存在磷酸二酯结构，高负电性导致其很难进入细胞内发挥作用。同时，由于核酸药物具有易降解的特点，核酸药物需要借助递送载体包封实现细胞内递送，因此，开发具有安全性和有效性的递送载体是核酸药物发展的重要瓶颈。
目前用于核酸药物的递送载体包括病毒类载体和非病毒类载体，其中非病毒类载体包括脂质纳米颗粒、聚合物纳米颗粒等。而脂质纳米颗粒目前是使用最为热门的递送载体，包括已经上市的两款mRNA疫苗，脂质纳米颗粒递送体系一般由可电离的脂质化合物(或者阳离子脂质化合物)、辅助脂质化合物、胆固醇、脂质PEG四种组分构成。已上市的两款新冠mRNA疫苗均采用的LNP作为递送载体，但两者稳定性都较差，如Moderna的mRNA-1273在-25到-15.C之间保存9个月，在2-8℃下保存30天；而Pfizer—BioNTech的BNT162b2在-90到-60℃保存9个月，2–8℃条件下1个月。因此，该类mRNA-LNP的使用范围收到一定的限制。
目前脂质纳米颗粒的制剂处方需要在稳定性和安全性方面做出一定的优化以满足长距离运输及大规模接种的需要。
发明内容
本发明旨在一种脂质纳米颗粒组合物用于递送核酸类药物，该类脂质纳米颗粒相比较于现有的脂质纳米颗粒载体具有更好的稳定性和更好的安全性。
本发明还提供包含上述脂质纳米颗粒复合物的制剂辅料。
本发明还提供包含上述载体的核酸脂质纳米颗粒组合物及比例。
本发明还提供包含或上述脂质载体、或上述核酸脂质纳米颗粒组合物的药物制剂。本发明所采取的技术方案是：
本发明提供一种用于核酸药物递送的脂质纳米颗粒组合物，原料包含：
(a)可电离阳离子脂质；优选地，其占所述脂质纳米颗粒中存在的总脂质的30％-80％的摩尔百分比；
(b)辅助磷脂，优选地，为DSPC；更优选地，其占所述脂质纳米颗粒中存在的总脂质的1％-20％摩尔百分比；
(c)甾醇类化合物，优选地，为胆固醇；更优选地，其占所述脂质纳米颗粒中存在的总脂质的10％-60％摩尔百分比；
(d)脂质聚乙二醇缀合物，优选地，为DMG-PEG2000、ALC-0159中的一种或多种；更优选地，其占所述脂质纳米颗粒中存在的总脂质的0.1％-15％摩尔比；
(e)缓冲液，优选地，选自tris缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液中的一种或几种。
具体地，可电离阳离子脂质为ALC-0315、SM-102中的一种或多种；更
具体地，所述缓冲液的pH为5～9，优选地，为pH为6～8.5。
具体地，所述的ALC-0315、辅助磷脂DSPC、胆固醇、DMG-PEG2000的摩尔比为(45％-60％)：(5％-15％)：(30％-45％)：(0.5％-5％)。
具体地，所述缓冲液的浓度为1～100mM；优选地，浓度为5～50mM。
具体的，所述的总脂质包括可电离阳离子脂质、辅助磷脂、甾醇类化合物和脂质聚乙二醇缀合物等。
具体地，所述组合物中还包含其他辅料，所述其他辅料包括醋酸钠、氨丁三醇、磷酸二氢钾、氯化钠、磷酸氢二钠、蔗糖中的一种或多种组合。
具体的，所述组合物中还包含核酸药物。
具体地，所述核酸药物包括ssDNA，dsDNA，mRNA，lncRNA，siRNA，saRNA，shRNA，ASO，质粒，circRNA，circDNA，miRNA，CRISPR-Cas，ployI:C，SamRNA，5’-pppRNA，优选的，核酸药物为mRNA。
具体地，所述组合物为液体制剂或冻干粉剂，优选的，所述组合物为口服制剂、肌肉注射制剂、静脉注射制剂或吸入制剂。
本发明提供一种脂质纳米颗粒组合物的制备方法，将所述可电离阳离子脂质、辅助磷脂、甾醇类化合物、PEG脂质缀合物溶解至溶剂后与核酸药物混合，然后使用所述缓冲溶液进行稀释、浓缩后制得。
具体地，脂质纳米颗粒(LNP)中总脂质与mRNA的质量比(w/w)在10-30：1之间。
具体地，所述脂质纳米颗粒的平均粒径为50～200nm；或所述脂质纳米颗粒在中性pH下具有净中性电荷；或所述脂质纳米颗粒具有小于0.4的多分散性。
具体地，其特征在于，脂质纳米颗粒包封mRNA时的N/P为1-10。
本发明提供一种脂质纳米颗粒组合物在制备预防或治疗性药物中的应用；优选的，所述药物为疫苗，更优选的，所述的疫苗为用于预防癌症、病毒感染、细菌感染、真菌感染的疫苗；更优选的，所述的病毒选自：诺如病毒、埃博拉病毒、冠状病毒、巨细胞病毒、登革热病毒、寨卡病毒、柯萨奇病毒、肠病毒、肝炎病毒、单纯疱疹病毒、人乳头瘤病毒、流感病毒、马尔堡病毒、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、轮状病毒、麻疹病毒。
本发明相比现有技术的有益效果为：本发明提供了一种脂质纳米颗粒复合物及其制剂辅料可用于递送核酸类药物，通过研究控制脂质纳米颗粒的包封率、粒径大小、PDI、电势高低以及调节优化脂质纳米颗粒复合物中阳离子脂质含量，得到的脂质纳米颗粒复合物制剂具有更好的免疫原性，该类脂质纳米颗粒复合物制剂相比较于现有的脂质纳米颗粒载体对mRNA药物具有更好的稳定性和更好的安全性。
附图说明
图1LNP制剂平均粒径数据图；
图2LNP制剂包封率数据图；
图3LNP制剂mRNA完整性数据图；
图4LNP制剂PDI数据图；
图5炎症反应打分图例0分；
图6炎症反应打分图例1分；
图7炎症反应打分图例2分；
图8炎症反应打分图例3分；
图9炎症反应打分数据图；
图10细胞因子检测值数据图；
图11抗体滴度检测值GMT(95％CI)数据图；
图12不同疫苗临床不良反应发生率对比图。
具体实施方式
下面将结合本发明的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：mRNA-LNP复合物的制备
以SARS-CoV2病毒S蛋白抗原mRNA为模型核酸，进行该类LNP-mRNA疫苗构建：将ALC-0315/SM-102、DSPC、胆固醇、ALC-0159/DMG-PEG2000按47:10:41.5:1.5的摩尔比溶解在乙醇溶液中，mRNA溶剂在pH 4.0醋酸缓冲液中，氮磷比为6：1，以脂质混合物：mRNA流速比1:3，通过微流控设备Precision Nanosystems的纳米颗粒制备仪器Ignite制备mRNA-LNP组合物。将包装好的mRNA-LNP透析并超滤浓缩到磷酸盐缓冲液中或者Tris盐缓冲溶液中，无菌过滤后获得用于后续动物实验的样品。实验样品组设置见表1。取样分别检测包封率、平均粒径、PDI及Zeta电位。
表1实验组设计
表2包封率、平均粒径、PDI及Zeta电位测定
结果表2所示，结果表明实验组a、b、c、d、h有≥92％的包封率，其中b组包封率最高，粒径各组相当，a、b、c、d、f组具有较低的PDI，其中b组最小，a、b、e、h组Zeta电势最高。包封率是LNP-mRNA关键的指标，表示包裹在脂质纳米颗粒内部的mRNA占全部mRNA的比例，封装在脂质纳米颗粒中的mRNA在传递过程中可以受到保护而不受酶降解，并有效地传递到细胞中，脂质纳米颗粒包封率的高低直接影响着纳米颗粒在应用中的稳定性和有效性。单分散度(PDI)表示的颗粒的大小分布均一性，PDI值越低表明脂质纳米颗粒大小越均一，从而保证了产品临床上的稳定性。表面电势维持在微负电性一方面可以提高LNP之间的电性斥力，维持单颗粒的稳定性，同时也避免电势电位绝对值过高导致的体内与相反电荷的蛋白或其他物质的结合，从而提高了纳米颗粒体内的安全性和生物利用度。一般情况下表面电势维持在-10mV以内的微负电性较佳。因此，由表2实验结果可以显示，b组制剂具有更高的包封率，更小PDI，表面电势也满足基本要求，预示着b组制剂应用效果和性能更好。
实施例2：稳定性研究
将实施例1中a-h组mRNA-LNP复合物分别置于-20摄氏度冰箱中保存，每隔3个月取样检测包封率、平均粒径、PDI、和mRNA完整性，结果如下图1、图2、图3、图4、表3、表4、表5和表6所示。
表3储存稳定性-平均粒径
表4储存稳定性-包封率(％)
表5储存稳定性-mRNA完整性(％)
表6储存稳定性-PDI变化
结果表明，b组样品的包封率和mRNA完整性在12个月内没有明显下降，平均粒径和PDI在12个月内没有发生明显增大，相较于其他组，展现出更好的稳定性。
实施例3：安全性研究
将6-8周龄的雌性CD1小鼠按6只/组随机分成8组，采用后腿肌肉注射的免疫途径进行免疫。单词免疫剂量为30μg mRNA-LNP。在给药前和给药后5小时(5H)以及第3天(D3)检测小鼠检测IL-6等细胞因子指标，并在D3处死小鼠，固定注射部位肌肉组织，常规染色检测炎症情况并进行4级(0-3分)法打分，以评估局部组织耐受性。
1级，参考图例5：炎症无＝0分；
2级，参考图例6：炎症轻微＝1分；
3级，参考图例7：炎症中等＝2分；
4级，参考图例8，炎症严重(超过50％炎性细胞侵润)＝3分。
表7炎症反应打分
表8细胞因子检测值
结果如图9、图10、表7和表8所示。结果表明，b组样品脂质纳米颗粒引起的局部炎症反应最轻微，同时引起的炎症相关细胞因子水平更低，细胞因子风暴发生风险低，展现出更好的安全性。
实施例4：生物活性研究
将6-8周龄的雌性BALB/c小鼠按6只/组随机分成8组，采用后腿肌肉注射的免疫途径进行免疫。分别在第0天和第14天免疫，免疫剂量为5μg mRNA-LNP。免疫第28天采血并分离血清，用ELISA法(以80000倍为稀释起点，二倍梯度稀释)检测针对SARS-CoV2病毒S蛋白抗原的特异性抗体滴度，如表9和图11所示。
表9小鼠免疫抗体滴度检测值(log10)
结果表明b组样品的脂质纳米颗粒形成的mRNA疫苗组合物的抗体滴度水平更高。
实施例5：不同pH稀释缓冲液的LNP的稳定性
依照实施例1操作方法，按表1组b配方进行mRNA-LNP制备，并将LNP分别稀释到pH5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0Tris缓冲液中，考察-20℃长期放置1个月的稳定性。
表10不同pH缓冲液mRNA-LNP稳定性变化
根据上述实验结果，如表10所示，在低pH(pH 5.0)和高pH(pH 9.0)mRNA的完整性略有降低。pH的高低影响mRNA的完整性，进而影响mRNA-LNP制剂的稳定性。本发明通过实验优化得到适宜的pH范围在6.0～8.5之间，mRNA-LNP的包封率、平均粒径、PDI和mRNA的完整性变化差异较小。表明在本发明提供的缓冲液pH值范围内(pH6.0-8.5)之间mRNA-LNP具有更好的稳定性。
实施例6：不同脂质配方LNP的效力试验
依照实施例1操作方法，分别配制不同配方的LNP配方进行mRNA-LNP制备，并在小鼠上考察其免疫原性。
表11不同脂质配方制备LNP结果对比
根据上述实验结果，如表11所示，本发明提供的配方在阳离子脂质含量为30％～80％时，包封率不低于90％且抗体滴度在6.7左右，有较好的包封效果及免疫原性；提供的配方在阳离子脂质含量为38％～52时，包封率均不低于96％且抗体滴度均在6.9左右，无明显差异。表明本发明通过调节阳离子脂质在脂质体中的含量提供的脂质配方具有更好的包封效果及免疫原性。
实施例7：mRNA-LNP疫苗临床试验结果
参照实施例1的制备方法，依据本发明的LNP配方(ALC-0315：DSPC：胆固醇：DMG-PEG2000＝47:10:41.5:1.5)和pH 7.5Tris稀释缓冲液进行新冠病毒COVID-19mRNA-LNP新冠疫苗的制备，并在临床试验中考察疫苗在人群中的有效性和安全性。结果如表11所示。
表12：不同疫苗临床试验副反应统计
注1、数据引自文献文章Baden,L.R.,et al.,Efficacy and Safety of themRNA-1273
SARS-CoV-2Vaccine.N Engl J Med,2021.384(5):p.403-416.
注2、数据引自文献文章Polack,F.P.,et al.,Safety and Efficacy of theBNT162b2
mRNA Covid-19 Vaccine.N Engl J Med,2020.383(27):p.2603-2615.
临床II期实验中完成免疫成人353人，其中年龄在18-59周岁的共计120人，60岁以上共计273人，在肌肉注射给药30μg后，统计在疫苗接种28天内不良反应发生情况，局部不良反应包括注射部位疼痛、肿胀、红斑、硬结等，全身性不良反应包含发热、头疼、疲乏、关节疼痛、肌肉疼痛、恶心、腹泻、恶心、咳嗽等，统计数据结果如表11和图12所示。相比较于已上市的mRNA-1273和BNT162b2两种疫苗公开的数据，本发明提供的疫苗具有更好的安全性，其局部不良反应率和全身不良反应率远低于mRNA-1273和BNT162b2。由此说明本发明提供的脂质纳米颗粒具有更好的安全性。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (13)
1.一种用于核酸药物递送的脂质纳米颗粒组合物，其特征在于，原料包含：
(a)可电离阳离子脂质；优选地，其占所述脂质纳米颗粒中存在的总脂质的30％-80％的摩尔百分比；
(b)辅助磷脂，优选地，为DSPC；更优选地，其占所述脂质纳米颗粒中存在的总脂质的1％-20％摩尔百分比；
(c)甾醇类化合物，优选地，为胆固醇；更优选地，其占所述脂质纳米颗粒中存在的总脂质的10％-60％摩尔百分比；
(d)脂质聚乙二醇缀合物，优选地，为DMG-PEG2000、ALC-0159中的一种或多种；更优选地，其占所述脂质纳米颗粒中存在的总脂质的0.1％-15％摩尔比；
(e)缓冲液，优选地，选自tris缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的脂质纳米颗粒组合物，其特征在于，可电离阳离子脂质为ALC-0315、SM-102中的一种或多种。
3.根据权利要求1-2任一项所述的脂质纳米颗粒组合物，其特征在于，所述缓冲液的pH为5～9，优选地，为pH为6～8.5。
4.根据权利要求1-3任一项所述的脂质纳米颗粒组合物，其特征在于，所述的ALC-0315占所述脂质纳米颗粒中存在的总脂质的38％-52％的摩尔百分比。
5.根据权利要求1-4任一项所述的脂质纳米颗粒组合物，其特征在于，所述缓冲液的浓度为1～100Mm；优选地，浓度为5～50mM。
6.根据权利要求1-5任一项所述的脂质纳米颗粒组合物，其特征在于，所述组合物中还包含其他辅料，所述其他辅料包括醋酸钠、醋酸、氨丁三醇、磷酸二氢钾、氯化钠、磷酸氢二钠、蔗糖中的一种或多种组合。
7.根据权利要求1-6任一项所述的脂质纳米颗粒组合物，其特征在于，所述组合物中还包括核酸药物，所述的核酸药物包括ssDNA，dsDNA，mRNA，lncRNA，siRNA，saRNA，shRNA，ASO，质粒，circRNA，circDNA，miRNA，CRISPR-Cas，ployI:C，SamRNA，5’-pppRNA，优选的，核酸药物为mRNA。
8.根据权利要求1-7任一项所述的脂质纳米颗粒组合物，其特征在于，所述组合物为液体制剂或冻干粉剂，优选的，所述组合物为口服制剂、肌肉注射制剂、静脉注射制剂、皮下注射剂、或吸入制剂。
9.一种权利要求1-8任一项所述的核酸脂质纳米颗粒组合物的制备方法，其特征在于，将所述可电离阳离子脂质、辅助磷脂、甾醇类化合物、PEG脂质缀合物溶解至溶剂后与核酸药物混合，然后使用所述缓冲溶液进行稀释、浓缩后制得。
10.根据权利要求9所述的脂质纳米颗粒组合物的制备方法，其特征在于，脂质纳米颗粒(LNP)中总脂质与mRNA的质量比(w/w)在10-30：1之间。
11.根据权利要求9-10任一项所述的脂质纳米颗粒组合物的制备方法，其特征在于，所述脂质纳米颗粒的平均粒径为50～200nm；或所述脂质纳米颗粒在中性pH下具有净中性电荷；或所述脂质纳米颗粒具有小于0.4的多分散性。
12.根据权利要求9-11任一项所述的脂质纳米颗粒组合物的制备方法，其特征在于，脂质纳米颗粒包封mRNA时的N/P为1-10。
13.一种权利要求1-12中任一项所述的脂质纳米颗粒组合物在制备预防或治疗性药物中的应用；优选的，所述药物为疫苗，更优选的，所述的疫苗为用于预防癌症、病毒感染、细菌感染、真菌感染的疫苗；更优选的，所述的病毒选自：诺如病毒、埃博拉病毒、冠状病毒、巨细胞病毒、登革热病毒、寨卡病毒、柯萨奇病毒、肠病毒、肝炎病毒、单纯疱疹病毒、人乳头瘤病毒、流感病毒、马尔堡病毒、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、轮状病毒、麻疹病毒。
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