CN118252943A - 一种短肽偶联药物及其制备方法和应用 - Google Patents
一种短肽偶联药物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN118252943A CN118252943A CN202311385577.4A CN202311385577A CN118252943A CN 118252943 A CN118252943 A CN 118252943A CN 202311385577 A CN202311385577 A CN 202311385577A CN 118252943 A CN118252943 A CN 118252943A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- short peptide
- drug
- coupling
- peptide
- dimethylformamide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 44
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 238000005897 peptide coupling reaction Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 72
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 36
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims abstract description 29
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims abstract description 23
- 229960004135 idebenone Drugs 0.000 claims abstract description 23
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims abstract description 22
- JGPMMRGNQUBGND-UHFFFAOYSA-N idebenone Chemical compound COC1=C(OC)C(=O)C(CCCCCCCCCCO)=C(C)C1=O JGPMMRGNQUBGND-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 22
- 229960005293 etodolac Drugs 0.000 claims abstract description 21
- XFBVBWWRPKNWHW-UHFFFAOYSA-N etodolac Chemical compound C1COC(CC)(CC(O)=O)C2=N[C]3C(CC)=CC=CC3=C21 XFBVBWWRPKNWHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 19
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 claims abstract description 15
- 229960001259 diclofenac Drugs 0.000 claims abstract description 14
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 claims abstract description 13
- DCOPUUMXTXDBNB-UHFFFAOYSA-N diclofenac Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC=C1NC1=C(Cl)C=CC=C1Cl DCOPUUMXTXDBNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 claims abstract description 12
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 claims abstract description 5
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 63
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 26
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 18
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 16
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Substances CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 229960004889 salicylic acid Drugs 0.000 claims description 11
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 claims description 10
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 claims description 10
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 claims description 10
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N papa-hydroxy-benzoic acid Natural products OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 claims description 10
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 claims description 10
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N dichloromethane Natural products ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 8
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 3
- 239000000863 peptide conjugate Substances 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 6
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 abstract description 5
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 abstract description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 25
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 24
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 22
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 12
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 8
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 8
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 4
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 4
- 229960005137 succinic acid Drugs 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 208000030453 Drug-Related Side Effects and Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 208000012641 Pigmentation disease Diseases 0.000 description 1
- 206010070863 Toxicity to various agents Diseases 0.000 description 1
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 1
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 1
- 108091000117 Tyrosine 3-Monooxygenase Proteins 0.000 description 1
- 102000048218 Tyrosine 3-monooxygenases Human genes 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- ACTIUHUUMQJHFO-UPTCCGCDSA-N coenzyme Q10 Chemical class COC1=C(OC)C(=O)C(C\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CCC=C(C)C)=C(C)C1=O ACTIUHUUMQJHFO-UPTCCGCDSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000003859 lipid peroxidation Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000008099 melanin synthesis Effects 0.000 description 1
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004898 mitochondrial function Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229940021182 non-steroidal anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 230000002000 scavenging effect Effects 0.000 description 1
- -1 small molecule compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种短肽偶联药物及其制备方法和应用，属于药物化学和生物化学领域。本发明短肽偶联药物是具有生物活性小分子和短肽通过共价键相互连接的结构，即使用的短肽序列为KKIIIIKK、KIIK、KKIIKK或KIIIIK，与依托度酸、双氯芬酸、艾地苯醌、维甲酸进行接枝偶联。经过接枝偶联后，产物的溶解度和稳定性显著提高，同时其毒性也得到明显降低。最重要的是，尽管进行了接枝偶联，但原始药物的生物学活性仍得以维持。本发明提供的方法对于改善药物的应用效果具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及药物化学和生物化学领域，尤其涉及一种短肽偶联药物及其制备方法和应用。该方法提高了药物的溶解度和稳定性，同时降低了药物的毒性，适用于依托度酸、双氯芬酸、艾地苯醌、维甲酸、烟酸、水杨酸等所有能与短肽偶联接枝的化合物/活性成份等。
背景技术
很多小分子化合物具有卓越的生物学功效，比如依托度酸、双氯芬酸作为非甾体抗炎药可以很好的抑制炎症因子的表达，具有抑制炎症发生发展的效果。艾地苯醌作为辅酶Q10的衍生物对线粒体功能有激活作用，具有清除自由基、抑制脂质过氧化、抑制炎症、抑制DNA损伤、光保护等作用。维A酸可影响黑色素细胞的黑色素生成，对酪氨酸羟化酶、多巴氧化酶及二羟基吲哚氧化酶等三型催化酶活性都有抑制作用，具有降低黑色素形成、减轻皮肤色素沉着等作用。
但很多药物或活性成分由于难溶于水、稳定性差等原因应用大大受限。因此，对其进行化学修饰以改善这些特性就显得尤为重要。然而，现有的改善这些药物特性的方法大多使用有机试剂溶解，应用中易出现毒副作用，效果并不理想。
发明内容
本发明提供了一种使用短肽接枝偶联改善药物特性的创新方法。该方法使用的短肽序列为KKIIIIKK、KIIK、KKIIKK或KIIIIK，与依托度酸、双氯芬酸、艾地苯醌、维甲酸进行接枝偶联。经过接枝偶联后，产物的溶解度和稳定性显著提高，同时其毒性也得到明显降低。最重要的是，尽管进行了接枝偶联，但原始药物的生物学活性仍得以维持。
本发明的第一个目的是提供一种短肽偶联药物，所述短肽偶联药物是具有生物活性小分子和短肽通过共价键相互连接的结构，其中所述短肽为KKIIIIKK(SEQ NO ID:1)、KIIK(SEQ NO ID:2)、KKIIKK(SEQ NO ID:3)、KIIIIK(SEQ NO ID:4)中的一种。
在本发明的一种实施方式中，所述生物活性小分子包括但不限于依托度酸、双氯芬酸、艾地苯醌、维甲酸、烟酸、水杨酸等物质。
本发明的第一个目的是提供所述短肽偶联药物的制备方法，包括如下步骤：
(1)前体药物活化；
(2)短肽与活化后的药物偶联
(3)纯化；
(4)干燥。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，所述前体药物活化是指药物经EDC(N-羟基丁二酰亚胺)和NHS(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)活化。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，活化过程中，前体药物、EDC和NHS的质量比为4～7:2～4:4～8。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，活化温度为10～70℃，时间为1～10h，活化时的溶剂优选为N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、二甲基亚砜，优选为N,N-二甲基甲酰胺，前体药物的浓度为20～100mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，所述短肽与活化后的药物偶联是指将短肽、N,N-二异丙基乙胺溶解至溶剂后，加入活化后的药物进行偶联反应得到的。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，所述短肽和药物的质量比为1:0.2～0.5
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，所述短肽和N,N-二异丙基乙胺的质量比为1:0.12～0.5。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，偶联反应的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜，优选为N,N-二甲基甲酰胺，短肽的浓度为20～100mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，所述偶联反应的温度为25～40℃，时间为1～6h。
在本发明的一种实施方式中，优选的，步骤(2)反应中使用高效液相色谱-质谱联用仪监测，确定反应是否完全反应及产物是否正确。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)所述纯化为利用高效液相色谱纯化、浓缩。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中纯化过程对收集到的液体进行纯度检测，所述浓缩优选为减压蒸馏浓缩。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中所述干燥优选为冷冻干燥。
为了解决难溶性药物/活性成分的应用困难，本发明使用短肽对前体药物/活性成分进行接枝偶联，该方法带来了多重效果：
首先，通过使用短肽接枝偶联，药物的溶解度提高了20倍以上，稳定性提高了10倍以上，这意味着药物可以更好地在生物体内发挥作用，且更能够抵抗环境变化。
其次，该方法还能显著降低药物的毒性，这意味着药物的副作用得到了降低，对患者的伤害更小。
最后，尽管进行了接枝偶联，但原始药物的生物学活性仍得以维持，比如接枝后的艾地苯醌很好的保持了艾地苯醌的抗氧化性能，这说明药物的主要药理作用不会因为接枝偶联而受到影响。因此，本发明提供的方法对于改善药物的应用效果具有重要的意义。
本发明的有益效果为：
1、本发明提供的短肽具有细胞穿透性，以此短肽作为载体，可促进细胞对配体药物的摄取，提高生物利用率。
2、本发明提供的短肽药物偶联化合物，可有效改善难溶性前体的溶解度。
3、本发明提供的短肽药物偶联化合物，可有效提高不稳定前体的稳定性。
4、本发明提供的短肽药物偶联化合物，可有效维持前体药物的生物学活性。
附图说明
图1本发明所使用自组装短肽的分子结构示意图；
图2短肽偶联依托度酸纯品的质谱(ESI-MS)分析谱图；
图3短肽偶联双氯芬酸纯品的质谱(ESI-MS)分析谱图；
图4短肽偶联维甲酸纯品的质谱(ESI-MS)分析谱图；
图5短肽偶联烟酸纯品的质谱(ESI-MS)分析谱图；
图6短肽偶联水杨酸纯品的质谱(ESI-MS)分析谱图；
图7短肽偶联艾地苯醌纯品的质谱(ESI-MS)分析谱图；
图8艾地苯醌单体的细胞毒性图；
图9短肽偶联艾地苯醌纯品的细胞毒性图；
图10短肽偶联艾地苯醌纯品的抗氧化性测试。
具体实施方式
下面结合实例作进一步详细说明，应当理解下面所举的实例只是为了解释说明本发明，并不包括本发明的所有内容。
实施例1：K8肽(KKIIIIKK)偶联依托度酸
1.依托度酸活化
称取依托度酸100mg，N-羟基丁二酰亚胺48mg,1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐80mg,溶于2ml N,N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌3小时
2.K8肽与依托度酸偶联
称取K8肽324mg,N,N-二异丙基乙胺55mg，加入5ml N,N-二甲基甲酰胺，适当搅拌至完全溶解，加入步骤1反应后的物料，室温搅拌2小时
3.监测反应
使用高效液相色谱-质谱联用仪监测，确定反应是否完全反应及产物是否正确
4.纯化步骤
①加入适量去离子水使样品能够较充分的溶解
②制备高效液相色谱纯化，收峰由线性梯度制备，并确定质谱是否正确
③为了符合纯度要求的液体量，实时对所收的液体进行纯度监测
④在40℃下，把收集合格的液体减压蒸馏浓缩至30-40ml
5.HPLC纯化后，冷冻干燥，得到K8-依托度酸偶联物
图2为实施例1制备得到的短肽偶联依托度酸纯品的质谱(ESI-MS)分析谱图。
实施例2：K8肽偶联双氯芬酸
1.双氯芬酸活化
称取双氯芬酸103mg，N-羟基丁二酰亚胺48mg,1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐80mg,溶于2ml N,N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌3小时
2.K8肽与双氯芬酸偶联
称取K8肽324mg,N,N-二异丙基乙胺55mg，加入5ml N,N-二甲基甲酰胺，适当搅拌至完全溶解，加入步骤1反应后的物料，室温搅拌2小时
3.监测反应
使用高效液相色谱-质谱联用仪监测，确定反应是否完全反应及产物是否正确
4.纯化步骤
①加入适量去离子水使样品能够较充分的溶解
②制备高效液相色谱纯化，收峰由线性梯度制备，并确定质谱是否正确
③为了符合纯度要求的液体量，实时对所收的液体进行纯度监测
④在40℃下，把收集合格的液体减压蒸馏浓缩至30-40ml
5.HPLC纯化后，冷冻干燥，及得到K8-双氯芬酸偶联物
图3为实施例2制备得到的短肽偶联双氯芬酸纯品的质谱(ESI-MS)分析谱图。
实施例3：K8肽偶联维甲酸
1.维甲酸活化
称取维甲酸95mg，N-羟基丁二酰亚胺48mg,1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐80mg,溶于2ml N,N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌3小时
2.K8肽与维甲酸偶联
称取K8肽324mg,N,N-二异丙基乙胺55mg，加入5ml N,N-二甲基甲酰胺，适当搅拌至完全溶解，加入步骤1反应后的物料，室温搅拌2小时
3.监测反应
使用高效液相色谱-质谱联用仪监测，确定反应是否完全反应及产物是否正确
4.纯化步骤
①加入适量去离子水使样品能够较充分的溶解
②制备高效液相色谱纯化，收峰由线性梯度制备，并确定质谱是否正确
③为了符合纯度要求的液体量，实时对所收的液体进行纯度监测
④在40℃下，把收集合格的液体减压蒸馏浓缩至30-40ml
5.HPLC纯化后，冷冻干燥，及得到K8-维甲酸偶联物
图4为实施例3制备得到的短肽偶联维甲酸纯品的质谱(ESI-MS)分析谱图。
实施例4：K8肽偶联烟酸
1.烟酸活化
称取烟酸95mg，N-羟基丁二酰亚胺48mg,1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐80mg,溶于2ml N,N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌3小时
2.K8肽与烟酸偶联
称取K8肽324mg,N,N-二异丙基乙胺55mg，加入5ml N,N-二甲基甲酰胺，适当搅拌至完全溶解，加入步骤1反应后的物料，室温搅拌2小时
3.监测反应
使用高效液相色谱-质谱联用仪监测，确定反应是否完全反应及产物是否正确
4.纯化步骤
①加入适量去离子水使样品能够较充分的溶解
②制备高效液相色谱纯化，收峰由线性梯度制备，并确定质谱是否正确
③为了符合纯度要求的液体量，实时对所收的液体进行纯度监测
④在40℃下，把收集合格的液体减压蒸馏浓缩至30-40ml
5.HPLC纯化后，冷冻干燥，及得到K8-维甲酸偶联物
图5为实施例4制备得到的短肽偶联烟酸纯品的质谱(ESI-MS)分析谱图。
实施例5：K8肽偶联水杨酸
1.水杨酸活化
称取水杨酸95mg，N-羟基丁二酰亚胺48mg,1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐80mg,溶于2ml N,N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌3小时
2.K8肽与水杨酸偶联
称取K8肽324mg,N,N-二异丙基乙胺55mg，加入5ml N,N-二甲基甲酰胺，适当搅拌至完全溶解，加入步骤1反应后的物料，室温搅拌2小时
3.监测反应
使用高效液相色谱-质谱联用仪监测，确定反应是否完全反应及产物是否正确
4.纯化步骤
①加入适量去离子水使样品能够较充分的溶解
②制备高效液相色谱纯化，收峰由线性梯度制备，并确定质谱是否正确
③为了符合纯度要求的液体量，实时对所收的液体进行纯度监测
④在40℃下，把收集合格的液体减压蒸馏浓缩至30-40ml
5.HPLC纯化后，冷冻干燥，及得到K8-水杨酸偶联物
图6为实施例5制备得到的短肽偶联水杨酸纯品的质谱(ESI-MS)分析谱图实施例6：K8肽偶联艾地苯醌
1.艾地苯醌丁二酸活化
称取艾地苯醌丁二酸138mg，N-羟基丁二酰亚胺48mg,1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐80mg,溶于2ml N,N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌3小时
2.K8肽与艾地苯醌丁二酸偶联
称取K8肽324mg,N,N-二异丙基乙胺55mg，加入5ml N,N-二甲基甲酰胺，适当搅拌至完全溶解，加入步骤1反应后的物料，室温搅拌2小时
3.监测反应
使用高效液相色谱-质谱联用仪监测，确定反应是否完全反应及产物是否正确
4.纯化步骤
①加入适量去离子水使样品能够较充分的溶解
②制备高效液相色谱纯化，收峰由线性梯度制备，并确定质谱是否正确
③为了符合纯度要求的液体量，实时对所收的液体进行纯度监测
④在40℃下，把收集合格的液体减压蒸馏浓缩至30-40ml
5.HPLC纯化后，冷冻干燥，及得到K8-艾地苯醌丁二酸偶联物
图7为实施例6制备得到的短肽偶联艾地苯醌纯品的质谱(ESI-MS)分析谱图。
图8和图9分别为艾地苯醌单体和实施例6制备得到的短肽偶联艾地苯醌纯品的细胞毒性图(参考G/B 16886)，可见本发明的方法能够显著降低药物的毒性。
测定制备得到的短肽偶联艾地苯醌的抗氧化性测试(参考G/B16886)，结果见图10，可见，本发明的方法能够有效保持艾地苯醌的抗氧化性能。
实施例7：K8肽偶联依托度酸
1.依托度酸活化
称取依托度酸100mg，N-羟基丁二酰亚胺50mg,1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐100mg,溶于2ml二甲基亚砜中，室温搅拌7小时
2.K8肽与依托度酸偶联
称取K8肽324mg,N,N-二异丙基乙胺150mg，加入5ml二甲基亚砜，适当搅拌至完全溶解，加入步骤1反应后的物料，室温搅拌5小时
3.监测反应
使用高效液相色谱-质谱联用仪监测，确定反应是否完全反应及产物是否正确
4.纯化步骤
①加入适量去离子水使样品能够较充分的溶解
②制备高效液相色谱纯化，收峰由线性梯度制备，并确定质谱是否正确
③为了符合纯度要求的液体量，实时对所收的液体进行纯度监测
④在40℃下，把收集合格的液体减压蒸馏浓缩至30-40ml
5.HPLC纯化后，冷冻干燥，得到K8-依托度酸偶联物。
药物溶解度实验：在10毫升具玻璃磨口的量筒加入0.1克的待测样品，逐渐增加水的体积，在每次加入一定量水后，搅拌混合10min,用肉眼检查是否纯在样品不溶。继续加水，并换至100毫升量筒中继续。取上述溶解样品量的5倍放入具有玻璃瓶塞的3个玻璃容器中。将1体积的水加到每一个容器中，用塞子塞紧容器，在30℃不断搅拌。一天后，将其中的一个容器在实验温度下24小时不时摇动以达到平衡。在实验温度下，容器中的内容物被离心分离，用液相测定澄清水溶液中的被测物质。计算最后样品的溶解度。
经过本发明的偶联方法，维甲酸地浓度由原来的不溶于水(小于1mg/ml)增加至溶解度5mg/ml：艾地苯醌的溶解度液提高至5mg/ml；依托度酸也增加至4mg/ml，同样的双氯芬酸，烟酸、水杨酸等溶解度都有所增加。
稳定性实验：将上述偶联样品相同浓度，相同条件下，观测溶液的外观及测试其剩余样品溶度，评估其是否有降解情况发生，实验证明，3天后，样品溶液及样品无变化。
当将实施例1～7中的K8肽(KKIIIIKK)替换为KIIK、KKIIKK、KIIIIK时，同样能够有效改善难溶性前体的溶解度、提高不稳定前体的稳定性，降低药物毒性，以及维持前体药物的生物学活性。
对比例1
实验偶联的配体数是实验样品性质的影响很大。例如对于依托度酸偶联物，根据短肽的结构构象，短肽的接枝配体数量可以是1或2.但实验证明两种配体数量的偶联样品的生物细胞毒性有很大差别，接枝一个依托度酸的偶联物表现出明显的减毒效果，但是接枝两个配体的物质则没有减毒效果，对细胞仍然具有毒性。
对比例2
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，偶联反应的溶剂尝试使用去离子水或二氯甲烷，反应物添加后，有大量固体物析出，持续反应5h后，经高效液相色谱-质谱联用仪监测，仅有少量产物生成，大部分仍为未反应物。后续改用N,N-二甲基甲酰胺作为溶剂，反应约2h后，经高效液相色谱-质谱联用仪监测，大部分反应物均反应完全，得到目标产物。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
Claims (10)
1.一种短肽偶联药物，其特征在于，所述短肽偶联药物是具有生物活性小分子和短肽通过共价键相互连接的结构，其中所述短肽为KKIIIIKK、KIIK、KKIIKK、KIIIIK中的一种。
2.根据权利要求1所述的一种短肽偶联药物，其特征在于，所述生物活性小分子包括依托度酸、双氯芬酸、艾地苯醌、维甲酸、烟酸、水杨酸的一种或几种。
3.权利要求1或2所述的一种短肽偶联药物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)前体药物活化；(2)短肽与活化后的药物偶联(3)纯化；(4)干燥。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述前体药物活化是指药物经N-羟基丁二酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐活化。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，活化温度为10～70℃，时间为1～10h，活化时的溶剂优选为N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、二甲基亚砜，优选为N,N-二甲基甲酰胺，前体药物的浓度为20～100mg/mL。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述短肽与活化后的药物偶联是指将短肽、N,N-二异丙基乙胺溶解至溶剂后，加入活化后的药物进行偶联反应得到的。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述短肽和药物的质量比为1:0.2～0.5；所述短肽和N,N-二异丙基乙胺的质量比为1:0.12～0.5。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，偶联反应的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜，优选为N,N-二甲基甲酰胺，短肽的浓度为20～100mg/mL。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述偶联反应的温度为25～40℃，时间为1～6h。
10.根据权利要求3～9任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述纯化为利用高效液相色谱纯化、浓缩。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311385577.4A CN118252943A (zh) | 2023-10-25 | 2023-10-25 | 一种短肽偶联药物及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311385577.4A CN118252943A (zh) | 2023-10-25 | 2023-10-25 | 一种短肽偶联药物及其制备方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118252943A true CN118252943A (zh) | 2024-06-28 |
Family
ID=91606887
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311385577.4A Pending CN118252943A (zh) | 2023-10-25 | 2023-10-25 | 一种短肽偶联药物及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN118252943A (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040018206A1 (en) * | 1999-12-03 | 2004-01-29 | Paola Minoprio | Cloning, sequencing and expression of a gene encoding an eukaryotic amino acid racemase, and diagnostic, therapeutic, and vaccination applications of parasite and viral mitogens |
| CN102133407A (zh) * | 2002-03-01 | 2011-07-27 | 图兰恩教育基金管理人 | 治疗剂或细胞毒性剂与生物活性肽的偶联物 |
| US20150352220A1 (en) * | 2012-12-24 | 2015-12-10 | Agency For Science, Technology And Research | Self-assembling ultrashort peptides modified with bioactive agents by click chemistry |
| US20180016304A1 (en) * | 2015-03-06 | 2018-01-18 | Agency For Science, Technology And Research | Self-assembling ultrashort aliphatic depsipeptides for biomedical applications |
| CN110179972A (zh) * | 2019-07-10 | 2019-08-30 | 杭州纽安津生物科技有限公司 | 自组装多肽新生抗原肿瘤疫苗及其制备方法 |
-
2023
- 2023-10-25 CN CN202311385577.4A patent/CN118252943A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040018206A1 (en) * | 1999-12-03 | 2004-01-29 | Paola Minoprio | Cloning, sequencing and expression of a gene encoding an eukaryotic amino acid racemase, and diagnostic, therapeutic, and vaccination applications of parasite and viral mitogens |
| CN102133407A (zh) * | 2002-03-01 | 2011-07-27 | 图兰恩教育基金管理人 | 治疗剂或细胞毒性剂与生物活性肽的偶联物 |
| US20150352220A1 (en) * | 2012-12-24 | 2015-12-10 | Agency For Science, Technology And Research | Self-assembling ultrashort peptides modified with bioactive agents by click chemistry |
| US20180016304A1 (en) * | 2015-03-06 | 2018-01-18 | Agency For Science, Technology And Research | Self-assembling ultrashort aliphatic depsipeptides for biomedical applications |
| CN110179972A (zh) * | 2019-07-10 | 2019-08-30 | 杭州纽安津生物科技有限公司 | 自组装多肽新生抗原肿瘤疫苗及其制备方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| DANZHU ZHU ET AL.: "Recent advance in tailoring the structure and functions of self-assembled peptide nanomaterials for biomedical applications", COORDINATION CHEMISTRY REVIEWS, 4 August 2023 (2023-08-04) * |
| LI DENG ET AL.: "Molecular Origin of the Self-Assembled Morphological Difference Caused by Varying the Order of Charged Residues in Short Peptides", THE JOURNAL OF PHYSICAL CHEMISTRY B, 8 October 2014 (2014-10-08) * |
| 林代武 等: "多肽超分子手性自组装与应用", 化学进展, no. 12, 24 December 2019 (2019-12-24) * |
| 王军 等: "氨基酸及短肽对天然药物的结构修饰", 中国现代应用药学, no. 12, 28 December 2011 (2011-12-28) * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Suh et al. | Site-selective copper-catalyzed azidation of benzylic C–H bonds | |
| Roy et al. | Transition metal catalyzed neoglycoconjugate syntheses | |
| Gao et al. | Interactions of some modified mono-and bis-β-cyclodextrins with bovine serum albumin | |
| FI60877C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt aktiva i vatten laett dispergerbara polyenmakrolidantibiot-n-glykosylderivat | |
| CN111529716A (zh) | 一种多肽-紫杉醇偶联物及其应用 | |
| de Paz et al. | Exploration of the use of an acylsulfonamide safety-catch linker for the polymer-supported synthesis of hyaluronic acid oligosaccharides | |
| Sedlák et al. | Synthesis of pH-sensitive amphotericin B–poly (ethylene glycol) conjugates and study of their controlled release in vitro | |
| Yin et al. | Native conjugation between proteins and [60] fullerene derivatives using SpyTag as a reactive handle | |
| CN118252943A (zh) | 一种短肽偶联药物及其制备方法和应用 | |
| Agramunt et al. | Inverse Electron-Demand Diels–Alder Bioconjugation Reactions Using 7-Oxanorbornenes as Dienophiles | |
| Han et al. | A novel chitosan antioxidant bearing sulfhydryl group: Synthesis, characterization and activity assessment | |
| Fraier et al. | A sensitive procedure for the quantitation of free and N-(2-hydroxypropyl) methacrylamide polymer-bound doxorubicin (PK1) and some of its metabolites, 13-dihydrodoxorubicin, 13-dihydrodoxorubicinone and doxorubicinone, in human plasma and urine by reversed-phase HPLC with fluorimetric detection | |
| Tennyson et al. | Selective fluorescence detection of nitroxyl over nitric oxide in buffered aqueous solution using a conjugated metallopolymer | |
| Liu et al. | Application of the four-component Ugi condensation for the preparation of sulfated glycoconjugate libraries | |
| EP1967854B1 (en) | Method for determining the amount of conjugated taxane in polyglutamic acid-taxane conjugates | |
| Balijepalli et al. | Cationic poly-amido-saccharides: stereochemically-defined, enantiopure polymers from anionic ring-opening polymerization of an amino-sugar monomer | |
| Lim et al. | Synthesis and characterization of a triazine dendrimer that sequesters iron (III) using 12 desferrioxamine B groups | |
| Van der Merwe et al. | Macromolecular prodrugs: X. Kinetics of fenoprofen release from PHEA-fenoprofen conjugate | |
| Zhu et al. | Iodine substitution compromises the aggregation-induced emission (AIE) property and enhances the biothiol sensitivity of quinoline–malononitrile-based fluorescent probes | |
| Marinec et al. | Synthesis of orthogonally reactive FK506 derivatives via olefin cross metathesis | |
| Bouamaied et al. | Porphyrin-substituted dinucleotides: Synthesis and spectroscopy | |
| Lee et al. | Synthesis of a fluorescent and star-shaped 4-arm PEG with different functional groups at its ends | |
| Salnikov et al. | Kinetics and mechanism of the reaction of cyanocobalamin with potassium hydroxide in non-aqueous media | |
| EP2974744A1 (en) | Strain-promoted oxidation controlled cycloaddition with high reaction rate | |
| Grishchenko et al. | Pd-catalyzed cross-coupling of arabinogalactan propargyl ethers with 5-bromosalicylic acid |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |