CN118240061A - 一种乙型肝炎病毒表位肽的t细胞受体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种乙型肝炎病毒表位肽的T细胞受体及其应用。该T细胞受体包含α链和β链；α链包含三个互补决定区，氨基酸序列分别如SEQ ID No：2的第47‑51位、第69‑73位和第108‑118位所示；β链包含三个互补决定区，氨基酸序列分别如SEQ ID No：4的第45‑49位、第67‑72位和第110‑123位所示。实验证明，该T细胞受体具有HBV多肽表位依赖杀伤肝癌细胞的活性。本发明提供的HBV特异性TCR具有重要的应用价值。

Description

一种乙型肝炎病毒表位肽的T细胞受体及其应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及一种乙型肝炎病毒表位肽的T细胞受体及其应用。
背景技术
肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)简称肝癌，其临床表现隐匿，早期缺乏典型症状，尽管近年来肝癌的诊断和治疗有了一定的进展，其预后仍然不理想，五年生存率极低。究其原因，一方面是肝癌对目前化疗药物不敏感，大多数肝癌患者缺乏有效的治疗方法；另一方面，肝癌往往在疾病的晚期才被诊断，这就排除了局部消融这些原本可以改善病人病情的方法。目前，手术切除与肝移植仍然是治疗肝癌最有效的方法。但是肝癌发展到一定阶段，肿瘤细胞可能转移到其它器官(如肺部、骨骼、脑等)，行肝移植前，现阶段的检查检测不到，术后因免疫抑制状态，潜伏在其它器官的微病灶可能导致肝癌复发，患者术后生存期不理想。因此，亟需找寻新的有效辅助治疗方案。
在实体肿瘤免疫细胞治疗领域，理想的目标抗原是仅在肿瘤细胞表面表达的肿瘤特异性抗原。不幸的是肿瘤表达的大多数抗原不具备肿瘤特异，因此大多数的CAR-T、TCR-T都以肿瘤相关性抗原作为靶点，但这往往会导致“脱靶”的可能性。目前使用较多的一些肿瘤相关抗原，甲胎蛋白、NY-ESO、MAGE等蛋白都属于这一状态。
在诸多肝癌相关环境危险因素中，乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)或丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)感染与肝癌的发生直接相关。高达80％的肝癌归因于HBV或HCV感染，在我国主要是HBV感染为主，90％肝癌患者HBsAg呈阳性。HBV感染人体后可刺激机体产生一系列体液免疫和细胞免疫反应，通常可以清除感染的病毒而痊愈；但如果机体免疫反应低下，不足以清除病毒，则病毒可持续存在，可发展成为慢性乙肝。慢性乙肝是肝硬化和肝癌发生的重要危险因素。慢性乙肝主要涉及免疫反应各个阶段的抗病毒免疫反应缺陷，尤其是HBV特异性CD8+T细胞的数量下降、功能降低，引起免疫耐受；同时伴随免疫介导的炎症性肝损伤。
目前，尚未发现能够治愈乙肝的药物。临床上针对慢性乙肝的治疗手段主要为抗病毒相关药物的治疗，包括干扰素类(IFNs)及核苷和核苷酸类药物等，通过免疫调节或干扰HBV复制发挥抗病毒作用。然而，这些治疗手段不能彻底清除病毒，使得患者容易出现耐药、病毒变异以及病情反复等情况。
HBV特异性CD8+T细胞在控制病毒的复制、清除病毒和HBV感染的临床恢复上起着决定性作用。HBV特异性TCR基因修饰的T细胞(TCR-T)过继转移，已初步证明有非常好的抗病毒活性。在肝癌领域，HBV也可作为一种独特的肿瘤相关性抗原。虽然已知的HBV-HCC肝癌细胞不表达完整的HBV抗原，但是在慢性乙型肝炎的自然史感染中，病毒往往将自身整合到人类基因组中，最终形成HCC细胞并携带这些HBV基因组。新加坡学者研究发现，尽管不表达完整HBV抗原，HBV-HCC肝癌细胞却带有短片段的HBVmRNAs，这些mRNAs可以编码能够被HBV特异性T细胞识别并活化的表位多肽，他们入组了2例肝移植患者肝癌复发和肺部转移瘤，根据肿瘤中HBVmRNA表达选择HBV特异性T细胞受体(TCRs)，利用基因工程手段让自体T细胞表达这些TCRs，并过继转移到病人体内。这些TCR-T细胞不影响肝功能，在1例患者中，5/6肺转移瘤在1年内体积减小。该结果提示在肝癌病人，特别是肝移植患者治疗中，将肝癌细胞上HBV抗原表位当做肿瘤相关抗原进行T细胞过继免疫治疗有可能将HBV-HCC肝癌细胞清除掉。这种肝特异性标记意味着肿瘤外的不良反应在很大程度上是可以预测的，很少或不涉及其它器官。此外，也有其它团队临床研究通过体外诱导TCR重定向的T细胞的方法，将特异识别乙肝病毒HLA-A2限制性表位HBs183-191的TCR-T细胞用于治疗肝移植患者中的肝癌转移，证明了这种重定向TCR-T细胞具有靶向特定肝癌细胞的活性，展现出巨大的应用潜力和价值。
现有报道的治疗性T细胞的研究主要局限在HLA-A2人群的研究，而针对其它HLA人群的关注却明显不足。HLA-A3超家族(包含HLA-A11、HLA-A33、HLA-A68、HLA-A31等)在中国人群HLA分型中占着最大比例(约52.7％)。HLA-A3超家族成员的显著特征之一是不同的成员具有共同的多肽结合特性，即偏好结合C末端带碱性氨基酸的多肽表位。因此，针对HLA-A3超家族限制性的人群进行肝癌的治疗研究将具有很好的大众性和通用性。其中，HLA-A11是A3超家族中分布最广的，统计分析也表明中国乙肝患者中HLA-A11基因频率最高。
HLA转基因动物模型在临床前试验和基础实验研究中发挥了重要作用。HLA-A11转基因小鼠之前已有报道，然而多方面的证据表明，HLA-A11分子偏好结合C末端碱性的表位多肽，与小鼠自身抗原提呈系统中抗原相关转运蛋白(TAP)的多肽结合偏好性不符，因而HLA-A11转基因小鼠在递呈HLA-A11限制性表位上存在明显缺陷。
将含人源TAP-LMP基因簇的BAC转基因小鼠(hTAP-LMP转基因小鼠)与HLA-A11转基因小鼠杂交，得到优化型的HLA-A11/hTAP-LMP转基因小鼠。与HLA-A11转基因小鼠相比，HLA-A11/hTAP-LMP转基因小鼠具有更强的提呈HLA-A11限制性CTL表位的能力。
综上所述，免疫细胞技术治疗乙肝和肝癌进入到临床试验阶段并取得了进展，显示出广阔的应用前景。但是在中国人群为主的HLA-A11限制性肝癌治疗亟需进行深入的研究。
发明内容
本发明的目的是制备用于预防和/或治疗由HBV感染所致的疾病的药物。
本发明首先保护一种识别HLA-A11限制性乙型肝炎病毒HBc141-151表位肽的T细胞受体，可包含α链和β链。所述α链可包含三个互补决定区，氨基酸序列分别如SEQ IDNo：2的第47-51位、第69-73位和第108-118位所示；或这些序列的具有至多3个、2个或1个氨基酸改变的变体。所述β链包含三个互补决定区，氨基酸序列分别如SEQ ID No：4的第45-49位、第67-72位和第110-123位所示；或这些序列的具有至多3个、2个或1个氨基酸改变的变体。
所述T细胞受体中，所述α链的可变区的氨基酸序列可如SEQ ID No：2的第21-110位所示；或这些序列的具有至多3个、2个或1个氨基酸改变的变体。所述β链的可变区的氨基酸序列可如SEQ ID No：4的第19-113位所示；或这些序列的具有至多3个、2个或1个氨基酸改变的变体。
所述T细胞受体中，所述α链的氨基酸序列可如SEQ ID No：2所示。所述β链的氨基酸序列可如SEQ ID No：4所示。
编码上述任一所述T细胞受体的核酸分子也属于本发明的保护范围。
编码上述任一所述T细胞受体的核酸分子可包含编码所述T细胞受体的α链的核酸分子和编码所述T细胞受体的β链的核酸分子。
编码所述T细胞受体的α链中三个互补决定区的核苷酸序列分别可如SEQ ID No：1的第139-153位、第205-219位和第322-354位所示；或与这些序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码相同氨基酸残基的序列。
编码所述T细胞受体的β链中三个互补决定区的核苷酸序列分别可如SEQ ID No：3的第133-147位、第199-216位和第328-369位所示；或与这些序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码相同氨基酸残基的序列。
编码所述α链的可变区的核苷酸序列可如SEQ ID No：1的第61-330位所示；或与这些序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码相同氨基酸残基的序列。
编码所述β链的可变区的核苷酸序列如SEQ ID No：3的第55-339位所示；或与这些序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码相同氨基酸残基的序列。
编码所述α链的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
编码所述β链的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示。
含有上述任一所述核酸分子的表达盒、载体或细胞也属于本发明的保护范围。
所述细胞可为Jurkat细胞或T细胞。所述T细胞具体可为人T细胞或小鼠T细胞。
所述载体可为慢病毒载体。
所述慢病毒载体可为向慢病毒包装载体pCDH-MSCV-MCS-2A-GFP(SystemBiosciences，编号：CD731B-1)的多克隆位点(如限制性内切酶EcoRI与BamHI)之间插入编码所述T细胞受体的α链的核酸分子和编码所述T细胞受体的β链的核酸分子，得到的重组质粒。
在本发明的一个实施例中，所述慢病毒载体可为重组质粒pCDH-MSCV-TCR-GFP。所述重组质粒pCDH-MSCV-TCR-GFP为将慢病毒包装载体pCDH-MSCV-MCS-2A-GFP的限制性内切酶EcoRI与BamHI之间的DNA小片段替换为核苷酸序列如SEQ ID No：5所示的TCRDNA片段，其它序列均不变，得到的重组质粒。SEQ ID No：5中，第1至795位为α链的完整编码基因，第796至861位为P2A自剪切多肽的编码基因，第862至1779位为β链的完整编码基因。
具有上述任一所述T细胞受体的T细胞也属于本发明的保护范围。
含有上述任一所述载体或细胞或含有上述任一所述T细胞的药物组合物也属于本发明的保护范围。所述药物组合物可用于预防和/或治疗由HBV感染所致的疾病。
本发明还保护上述任一所述T细胞受体、上述任一所述核酸分子、上述任一所述载体或细胞或上述任一所述T细胞受体的T细胞的应用，可为A1)-A4)中的至少一种：
A1)制备预防和/或治疗由HBV感染所致的疾病的药物；
A2)预防和/或治疗由HBV感染所致的疾病；
A3)体内或体外杀伤靶细胞；
A4)清除HBV的慢性感染。
上述应用中，所述靶细胞为肝癌HepG2.2.15细胞。所述HepG2.2.15细胞具体可为表达多肽HBc141-151的HLA-A11阳性HepG2.2.15肿瘤细胞。
本发明还要求保护一种预防和/或治疗由HBV感染所致疾病的方法，可包括如下步骤：以前文所述的T细胞受体、或、所述核酸分子、或、“所述表达盒、载体或细胞”、或、含有上述任一所述T细胞受体的T细胞来预防和/或治疗由HBV感染所致疾病。
上述任一所述由HBV感染所致的疾病可为慢性乙型肝炎或肝细胞癌。
本发明的发明人经过大量实验，分离并鉴定了一对HBV特异性的TCR序列，成功构建了对应的TCR-T细胞，确定这对TCR序列特异性的识别并结合HBV表位肽/HLA-A11复合物；同时，在体外验证了TCR转基因阳性的人CD8细胞(TCR-T)具有HBV表位肽依赖性的杀伤人肝癌细胞的能力。本发明提供的HLA-A11限制性HBc141-151表位肽的T细胞受体具有重要的应用价值。
附图说明
图1为小鼠免疫HBc141-151多肽后CTL检测。
图2为HBV特异性CD8分选。
图3为调取HBV特异性TCR序列。
图4为表达HBV特异性TCR的Jurkat细胞的染色结果。
图5为稳转HLA-A11的HepG2.2.15细胞的构建。
图6为慢病毒包装制备TCR-T细胞。
图7为HumanTCR-T细胞具有体外杀伤靶细胞的功能。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
HLA-A11/hTAP-LMP转基因小鼠、辅助多肽HBc128-140和多肽HBc141-151记载于如下文献中：Man Huang，Wei Zhang，Jie Guo，Xundong Wei，Krung Phiwpan，Jianhua Zhang，XuyuZhou.Improved Transgenic Mouse Model for Studying HLA Class I AntigenPresentation.Scientific Report.2016，doi:10.1038/srep33612.
下述实施例中，尾静脉高压注射法记载于如下文献中：Liu F，Song Y，LiuD.Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration ofplasmid DNA.Gene Therapy.1999，doi:10.1038/sj.gt.3300947。
下述实施例中，pAAV/HBV1.2质粒记载于如下文献中：Huang，L.R.，Wu，H.L.，Chen，P.J.&Chen，D.S.An immunocompetent mouse model for the tolerance of humanchronic hepatitis B virus infection.Proc Natl Acad Sci USA 103.17862–17867，doi:10.1073/pnas.0608578103(2006)
10×PCR buffer、dNTPmix和Taq DNA polymerase均为TAKARA公司的产品。
实施例1、TCR-T细胞的获得及其应用
一、应用HLA-A11/hTAP-LMP转基因小鼠筛选获得A11限制性HBc141-151表位肽特异性TCR序列
1、HBc141-151表位肽免疫实验
(1)将100μL含50μg多肽HBc141-151和100μg辅助多肽HBc128-140的PBS缓冲液和100μLIFA混合、乳化；然后皮下多点注射至HLA-A11/hTAP-LMP转基因小鼠。
HLA-A11/hTAP-LMP转基因小鼠体内将诱导出针对HBc141-151表位的初次CTL免疫应答。
(2)完成步骤(1)后第7天，采用尾静脉高压注射法向HLA-A11/hTAP-LMP转基因小鼠的尾静脉注射pAAV/HBV1.2质粒，每只小鼠注射10μgpAAV/HBV1.2质粒，得到免疫HBc141-151小鼠。
pAAV/HBV1.2质粒包含HBV病毒1.2个拷贝的基因组，采用尾静脉高压注射法可瞬时转染小鼠肝细胞并表达乙肝病毒抗原以及产生病毒颗粒，因而可用于在小鼠体内模拟HBV的早期感染。进行该步骤的目的是HBV的早期感染后，诱导针对HBc141-151的二次CTL免疫应答，产生大量HBc141-151抗原特异性的CD8+T细胞。
(3)完成步骤(2)后第7天，取免疫HBc141-151小鼠的外周血，裂解红细胞后用多肽HBc141-151刺激4h，随后进行胞内IFNg染色。
取未免疫的HLA-A11/hTAP-LMP转基因小鼠的外周血，裂解红细胞后用多肽HBc141-151刺激4h，随后进行胞内IFNg染色，作为对照。
检测结果见图1(对照小鼠为未免疫的HLA-A11/hTAP-LMP转基因小鼠)。检测结果表明，免疫HBc141-151小鼠能够刺激特异性CD8T细胞产生CTL反应并释放IFNg。
2、取步骤1中(2)获得的免疫HBc141-151小鼠，对TetramerHBc141-151阳性CD8T细胞进行分选。
TetramerHBc141-151阳性CD8T细胞的分选效率以及纯度检测结果见图2。
3、TCR基因片段扩增与测序
提取TetramerHBc141-151阳性CD8T细胞的RNA，之后反转录，得到Tetramer HBc141-151阳性CD8T细胞的cDNA。以TetramerHBc141-151阳性CD8T细胞的cDNA为模板，分别采用保守区引物扩增TCRα链片段以及TCRβ链片段(见图3)。将扩增获得的TCRα链片段和β链片段分别连入T载体中，随后对T载体进行测序，分离出1对TCR。
α链可变区的编码基因如SEQ ID No：1的第61-330位所示；其中，SEQ ID No：1中，第139-153位、第205-219位和第322-354位分别为三个CDR的编码基因。
α链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No：2的第21-110位所示；其中，SEQ ID No：2中，第47-51位、第69-73位和第108-118位分别为三个互补决定区。
β链可变区的编码基因如SEQ ID No：3的第55-339位所示；其中，SEQ ID No：3中，第133-147位、第199-216位和第328-369位分别为三个CDR的编码基因。
β链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No：4的第19-113位所示；其中，SEQ ID No：4中，第45-49位、第67-72位和第110-123位分别为三个互补决定区。
这对α链序列和β链序列组成的TCR受体可能对HLA-A11限制性CTL表位HBc141-151具有高亲和力，并来自同一个T细胞克隆。
二、表达TCR的Jurkat细胞的获得及鉴定
1、根据步骤一得到的α链可变区和β链可变区的序列，参考NCBI上小鼠基因组α链和α链的恒定区序列，获得并人工合成HLA-A11限制性乙型肝炎病毒HBc141-151特异性TCR受体α链和β链的完整编码基因。
α链的完整编码基因如SEQ ID No：1所示，编码SEQ ID No：2所示的α链。
β链的完整编码基因如SEQ ID No：3所示，编码SEQ ID No：4所示的β链。
2、将慢病毒包装载体pCDH-MSCV-MCS-2A-GFP(System Biosciences，编号：CD731B-1)的限制性内切酶EcoRI与BamHI之间的DNA小片段替换为核苷酸序列如SEQ IDNo：5所示的TCRDNA片段，其它序列均不变，得到重组质粒pCDH-MSCV-TCR-GFP。SEQ ID No：5中，第1至795位为α链的完整编码基因，第796至861位为P2A自剪切多肽的编码基因，第862至1779位为β链的完整编码基因。
3、培养Jurkat细胞至数量2×107以上，收集细胞，用不含抗生素的1640培养基清洗2遍，最后一遍洗后用不含抗生素的1640培养基重悬至5×107/mL，将上述细胞分为400μL/份加至电转杯(BIO-RAD，货号：165-2088)，同时加入40μg重组质粒pCDH-MSCV-TCR-GFP，混匀，将电转杯放入电转仪(BIO-RAD，Gene Pulser XcellTM)中，电压250V，电容950μF电转，将重组质粒pCDH-MSCV-TCR-GFP导入Jurkat细胞，得到表达TCR的Jurkat细胞，命名为Teasy-1 Jurkat。
按照上述方法，将重组质粒pCDH-MSCV-TCR-GFP替换为慢病毒包装载体pCDH-MSCV-MCS-2A-GFP，其它步骤均不变，得到不表达TCR的Jurkat细胞，命名为对照Jurkat。
4、利用Tetramer(HLA-A11/HBc141-151)对步骤3得到的Teasy-1 Jurkat或对照Jurkat进行染色。
染色结果见图4。结果表明，TCR对HLA-A11限制性表位具有较强的亲和力。
三、HLA-A11阳性HepG2.2.15细胞的构建
1、浓缩慢病毒的获得
(1)将慢病毒包装载体pCDH-MSCV-MCS-2A-GFP的限制性内切酶EcoRI与BamHI之间的DNA小片段替换为核苷酸序列如SEQ ID No：6所示的HLA-A*1101DNA片段，得到pCDH-MSCV-HLA-A11-GFP质粒。
(2)将293T细胞吹打重悬成单细胞，计数，然后用含10％(v/v)FBS的DMEM培养基调节，得到浓度为5×105个/mL的细胞悬浮液。取培养皿(规格为10cm)，铺10mL细胞悬浮液，培养过夜。
(3)完成步骤(2)后，待293T细胞汇合度为75％时进行转染，转染前30min更换培养基为DMEM培养基。
(4)转染预混物(即PEI混合物)准备
①向500μLDMEM培养基中加入12μgpCDH-MSCV-HLA-A11-GFP质粒、9μgpsPAX2和6μgpMG2.D，涡旋充分混匀，得到质粒混合物(即PEI)。
psPAX2和pMG2.D均为北京天恩泽基因科技有限公司的产品。
②向500μLDMEM培养基中加入27μgPEI，涡旋混匀，静置5min，得到PEI混合物。
(5)完成步骤(4)后，向500μL质粒混合物中加入500μLPEI混合物，涡旋充分混匀，室温孵育20min；然后将孵育完成的混合物轻柔沿培养皿侧壁加入293T细胞中，轻晃培养皿混匀，37℃培养箱培养。6-8h后将培养基更换为10mL含10％(v/v)FBS的DMEM培养基。
(6)完成步骤(5)后第48h，收集第一次病毒上清，补充新鲜DMEM培养基，病毒上清4℃保存。
(7)完成步骤(5)后第72h，收集第二次病毒上清。将第一次病毒上清和第二次病毒上清合并，800g、室温离心5min，收集上清。
(8)完成步骤(7)后，将所述上清使用0.45μmPES滤膜过滤除去细胞碎片，收集病毒上清。
(9)完成步骤(8)后，将所述病毒上清转移至超速离心管，吸取2mL20％無菌蔗糖加入到管底。4℃、70000g离心120min，小心弃上清，收集沉淀(白色病毒颗粒)。
(10)完成步骤(9)后，取所述沉淀，加入100倍浓缩体积的1640培养基重悬，4℃溶解过夜，得到浓缩慢病毒。将浓缩慢病毒分装保存于-80℃超低温冰箱，备用。
2、慢病毒感染人HepG2.2.15细胞
(1)取24孔板，每孔加入5×105个HepG2.2.15细胞和200μL浓缩慢病毒，然后用DMEM培养基补体积至500μL；最后加入polybrene并使其在体系中的浓度为8μg/mL。
(2)完成步骤(1)后，取24孔板，600g、32℃离心90min；然后将24孔板放入37℃培养箱感染24h。
(3)完成步骤(2)后，取所述24孔板，小心吸掉感染孔中350μL培养基，然后加入DMEM培养基补足至体积2mL并吹打混匀，37℃培养箱继续培养48h。
(4)完成步骤(3)后，取适量感染的HepG2.2.15细胞和未感染的HepG2.2.15细胞(作为对照HepG2.2.15细胞)进行流式检测感染效率；使用anti-HLA-A11抗体(MyBioSource，克隆号：8.L.170)对感染的HepG2.2.15细胞或未感染的HepG2.2.15细胞进行染色，4℃染色30min后进行上机检测。
检测结果见图5。结果表明，阳性细胞(即HLA-A11阳性HepG2.2.15细胞)的感染效率大于99％，阳性细胞即为稳转HLA-A11的HepG2.2.15细胞，用于后续杀伤实验。
四、HumanTCR-T细胞具有体外杀伤靶细胞的功能
为了体外验证Human TCR-T具有特异性的杀伤靶细胞的能力，进行体外杀伤实验。具体步骤如下：
1、慢病毒的包装与浓缩
(1)将慢病毒包装载体pCDH-MSCV-MCS-2A-GFP的限制性内切酶EcoRI与BamHI之间的DNA小片段替换为核苷酸序列如SEQ ID No：5所示的TCR DNA片段，其它序列均不变，得到重组质粒pCDH-MSCV-TCR-GFP。SEQ ID No：5中，第1至795位为α链的完整编码基因，第796至861位为P2A自剪切多肽的编码基因，第862至1779位为β链的完整编码基因。
(2)将293T细胞吹打重悬成单细胞，计数，然后用含10％(v/v)FBS的DMEM培养基调节，得到浓度为5×105个/mL的细胞悬浮液。
(3)取培养皿(规格为10cm)，每个培养皿铺10mL细胞悬浮液，培养至293T细胞汇合度为75％时进行转染，转染前30min更换培养基为DMEM培养基。
(4)转染预混物的制备
(4-1)向500μL DMEM培养基中加入12μg重组质粒pCDH-MSCV-TCR-GFP、9μgpsPAX2和6μg pMG2.D，涡旋充分混匀，得到质粒混合物。psPAX2和pMG2.D均为北京天恩泽基因科技有限公司的产品。
(4-2)向500μL DMEM培养基中加入27μg质粒混合物，涡旋混匀，静置5min，得到PEI混合物。PEI混合物即转染预混物。
(5)完成步骤(4)后，向500μL质粒混合物中加入500μL PEI混合物，涡旋充分混匀，室温孵育20min，得到混合物；然后将所述混合物轻柔的沿培养皿侧壁加入步骤(3)培养的293T细胞中，轻晃培养皿混匀，37℃培养箱培养6-8h后将培养基更换为10mL含10％(v/v)FBS的DMEM培养基，37℃培养48h。
(6)完成步骤(5)后，收集上清液(即第一次病毒上清)，之后补充新鲜DMEM培养基，37℃培养72h，收集上清液(即第二病毒上清)。
(7)完成步骤(6)后，将第一次病毒上清和第二次病毒上清合并，室温、800g离心5min，收集上清。
(8)将步骤(7)收集的上清使用0.45μm PES滤膜过滤除去细胞碎片，收集病毒上清。
(9)将步骤(8)收集的病毒上清转移至超速离心管，将2mL 20％(m/v)无菌蔗糖水溶液加入管底，4℃、70000g离心120min，小心弃上清，收集沉淀(即白色病毒颗粒)。
(10)完成步骤(9)后，向所述沉淀中加入100倍浓缩体积的1640培养基重悬，4℃溶解过夜，得到浓缩慢病毒。将浓缩慢病毒分装保存于-80℃超低温冰箱，备用。
2、人外周T淋巴细胞的分离
(1)抽取人外周静脉血5mL。
(2)完成步骤(1)后，取离心管(规格为50mL)，加入5mL外周血和5mLPBS缓冲液，充分混匀。
(3)完成步骤(2)后，向离心管中加入5mL人外周血淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品科技有限公司，货号：LTS1077)，使用一次性无菌滴管取稀释后外周血沿管壁小心叠加于分离液液面之上，注意保持清楚界面。
(4)完成步骤(3)后，将离心管置于离心机中，调节升速和降速为最低，800g离心20min。
(5)完成步骤(4)后，管内由上而下分为四层，第一层为血浆和PBS，第二层为环状乳白色淋巴细胞层，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞和粒细胞层。用移液器小心吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层至无菌离心管(规格为50mL)，向离心管中加入40mLPBS缓冲液，混匀细胞，800g离心5min，弃上清，之后使用1640培养基重悬细胞，计数备用，得到人外周T淋巴细胞。
3、人外周T淋巴细胞的活化
(1)取24孔板，每孔加入500μLanti-CD3抗体稀释液和500μLanti-CD28抗体稀释液，4℃包被过夜。
anti-CD3抗体稀释液：用PBS缓冲液稀释anti-CD3抗体(BioXcell，克隆号：OKT3)至浓度为3μg/mL获得。
anti-CD28抗体稀释液：用PBS缓冲液稀释anti-CD28抗体(BioXcell，克隆号：CD28.2)至浓度为1μg/mL获得。
(2)完成步骤(1)后，取所述24孔板，移除液体，并用PBS缓冲液清洗一次。
(3)完成步骤(2)后，取所述24孔板，加入500μL人外周T淋巴细胞稀释液，37℃培养48h；之后400g离心5min，收集沉淀并使用1640培养基重悬，得到活化的人外周T淋巴细胞。活化的人外周T淋巴细胞用于感染慢病毒。
人外周T淋巴细胞稀释液：用1640培养基将步骤2获得的人外周T淋巴细胞稀释至4×106个/mL获得。
4、慢病毒感染人外周T淋巴细胞
(1)取24孔板，每孔加入5×105个活化的人外周T淋巴细胞和200μL步骤(1)得到的浓缩慢病毒，然后用1640培养基补充体积至500μL；最后加入polybrene和IL-2，并使polybrene和IL-2在体系中的浓度分别为8μg/mL和40U/mL。
(2)完成步骤(1)后，取24孔板，32℃、600g离心90min；然后将24孔板放入37℃培养箱感染24h。
(3)完成步骤(2)后，取所述24孔板，小心吸掉感染孔中350μL培养基，然后加入1640培养基补足至体积2mL并吹打混匀，37℃培养箱继续培养48h，得到Human TCR-T细胞，命名为Teasy-1 T细胞。
(4)完成步骤(3)后，先取未感染慢病毒的人外周T淋巴细胞(对照T细胞)或适量感染后Human TCR-T细胞(Teasy-1 T细胞)进行流式检测感染效率；然后使用anti-mouseCD8a抗体(Biolegend，克隆号：53-6.7)和anti-mouse TCRβ抗体(Invitrogen，克隆号：H57-597)对感染后T细胞进行染色，4℃染色30min后进行上机检测。
检测结果见图6。结果表明，Teasy-1 T细胞的感染效率(TCRVβ阳性率)约为10％，阳性细胞即为成功转入TCR的Human TCR-T细胞，用于后续杀伤实验。
5、Human TCR-T体外具有杀伤靶细胞的功能
底物、终止液和细胞裂解液均为CytoToxNon-RadioactiveCytotoxicityAssay试剂盒(Promega公司，货号：G1780)中的组件。
(1)消化稳转HLA-A11的HepG2.2.15细胞并计数。该细胞能够稳定表达HLA-A11以及HBV相关蛋白，可作为靶细胞进行杀伤实验。
(2)将步骤(1)得到的靶细胞(即稳转HLA-A11的HepG2.2.15细胞)加入96孔板中，2×104个/孔；随后按效靶比例为10:1或1:1加入Human TCR-T细胞(Teasy-1 T细胞或对照T细胞)，37℃、5％CO2培养5h。
(3)取完成步骤(2)的96孔板，250g离心4min，然后将50μL上清转移至新的96孔板，每孔加入50μL底物，室温、避光孵育30min；之后每孔加入50μL终止液，使用酶标仪(波长490nm)读取数值，即实验组数值。
(4)杀伤实验本底数值检测
①按照上述步骤(1)-(3)，将步骤(2)替换为步骤2A)，其它步骤均不变，得到T细胞自释放值。步骤2A)为：取96孔板，加入与实验组同等数量的Human TCR-T细胞，37℃、5％CO2培养5h。
②按照上述步骤(1)-(3)，将步骤(2)替换为步骤2B)，其它步骤均不变，得到靶细胞自释放值。步骤2B)为：取96孔板，加入与实验组同等数量的靶细胞，37℃、5％CO2培养5h。
③按照上述步骤(1)-(3)，将步骤(2)替换为步骤2C)，其它步骤均不变，得到靶细胞最大释放值。步骤2C)为：取96孔板，加入与实验组同等数量的靶细胞和10μL细胞裂解液，37℃、5％CO2培养5h。
6、计算杀伤活性
杀伤活性＝(实验组数值-T细胞自释放值-靶细胞自释放值)/(靶细胞最大释放值-靶细胞自释放值)
将上述方法中的HumanTCR-T替换为未转染TCR的HumanT细胞，其它步骤均不变，作为对照。
HumanTCR-T细胞体外杀伤靶细胞的检测结果见图7(E∶T表示HumanTCR-T细胞和靶细胞的比例，对照T细胞为不表达Teasy-1的CD8T细胞，Teasy-1T细胞为经过慢病毒感染稳定表达Teasy-1TCR的CD8T细胞)。结果表明，HumanTCR-T细胞在体外可以有效的杀伤靶细胞。
综上所述，本发明的发明人分离并鉴定了一对HBV特异性的TCR序列，成功构建了对应的TCR-T细胞，确定这对TCR序列特异性的识别并结合HBV表位肽
/HLA-A11复合物；同时，在体外验证了TCR转基因阳性的人CD8细胞(TCR-T)具有HBV表位肽依赖性的杀伤人肝癌细胞的能力。本发明提供的HLA-A11限制性HBc141-151表位肽的T细胞受体具有重要的应用价值。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (13)

1.一种识别HLA-A11限制性HBc141-151表位肽的T细胞受体，包含α链和β链；
所述α链包含三个互补决定区，氨基酸序列分别如SEQ ID No：2的第47-51位、第69-73位和第108-118位所示；
所述β链包含三个互补决定区，氨基酸序列分别如SEQ ID No：4的第45-49位、第67-72位和第110-123位所示。
2.根据权利要求1所述T细胞受体，其特征在于：
所述α链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID No：2的第21-110位所示；
所述β链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID No：4的第19-113位所示。
3.根据权利要求1或2所述T细胞受体，其特征在于：
所述α链的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示；
所述β链的氨基酸序列如SEQ ID No：4所示。
4.编码权利要求1至3任一所述T细胞受体的核酸分子。
5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于：编码权利要求1至3任一所述T细胞受体的核酸分子包含编码所述T细胞受体的α链的核酸分子和编码所述T细胞受体的β链的核酸分子；
编码所述T细胞受体的α链中三个互补决定区的核苷酸序列分别如SEQ ID No：1的第139-153位、第205-219位和第322-354位所示；
编码所述T细胞受体的β链中三个互补决定区的核苷酸序列分别如SEQ ID No：3的第133-147位、第199-216位和第328-369位所示。
6.根据权利要求4或5所述的核酸分子，其特征在于：
编码所述α链的可变区的核苷酸序列如SEQ ID No：1的第61-330位所示；
编码所述β链的可变区的核苷酸序列如SEQ ID No：3的第55-339位所示。
7.根据权利要求4至6任一所述的核酸分子，其特征在于：
编码所述α链的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示；
编码所述β链的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示。
8.含有权利要求4至7任一所述核酸分子的表达盒、载体或细胞。
9.如权利要求8所述的载体，其特征在于：所述载体为慢病毒载体；所述慢病毒载体为向慢病毒包装载体pCDH-MSCV-MCS-2A-GFP的多克隆位点之间插入编码所述T细胞受体的α链的核酸分子和编码所述T细胞受体的β链的核酸分子，得到的重组质粒。
10.如权利要求8所述的细胞，其特征在于：所述细胞为T细胞或Jurkat细胞。
11.具有权利要求1至3任一所述T细胞受体的T细胞。
12.含有权利要求8至10任一所述载体或细胞、或、含有权利要求11所述T细胞的药物组合物。
13.权利要求1至3任一所述T细胞受体、或、权利要求4至7任一所述的核酸分子、或、权利要求8至10任一所述载体或细胞、或、权利要求11所述T细胞受体的T细胞的应用，为A1)-A4)中的至少一种：
A1)制备预防和/或治疗由HBV感染所致的疾病的药物；
A2)预防和/或治疗由HBV感染所致的疾病；
A3)体内或体外杀伤靶细胞；
A4)清除HBV的慢性感染。
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