CN118236500A

CN118236500A - 康艾注射液作为肝癌治疗药物抗pd-1抗体的减毒增效剂的应用

Info

Publication number: CN118236500A
Application number: CN202211660249.6A
Authority: CN
Inventors: 于海洋; 邱玉玲; 王涛; 尹双双; 韩立峰; 蒲位凌; 刘二伟; 陈璐; 付志飞; 高秀梅
Original assignee: Tianjin University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Tianjin University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2022-12-23
Filing date: 2022-12-23
Publication date: 2024-06-25

Abstract

本发明公开了康艾注射液作为肝癌治疗药物抗PD‑1抗体的减毒增效剂的应用。本发明提供了PD‑1阻断剂和康艾注射液在制备治疗肝癌的药物中的应用。本发明还保护康艾注射液在制备增敏剂中的应用；所述增敏剂的功能为提高肝癌肿瘤组织对PD‑1阻断剂的敏感性。本发明还保护康艾注射液在制备增效剂中的应用；所述增效剂的功能为增强PD‑1阻断剂的抗肝癌活性。本发明还保护康艾注射液在制备减毒剂中的应用；所述减毒剂的功能为降低PD‑1阻断剂对生物体的心脏毒性和/或肺脏毒性。本发明开发了新的肝癌治疗策略，提高了免疫治疗的疗效和反应率，可以最大限度地提高临床效益，并将毒性效应极大限度的降到最低。

Description

康艾注射液作为肝癌治疗药物抗PD-1抗体的减毒增效剂的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及康艾注射液作为肝癌治疗药物抗PD-1抗体的减毒增效剂的应用。

背景技术

肝癌是我国最常见的消化系统恶性实体肿瘤之一，其发病率位居世界第六，也是导致癌症相关死亡的第三大原因。早期肝癌患者的临床症状并不明显，同时缺乏对其检测监测的医疗技术手段，多数患者在首次确诊时就被诊断为中晚期。虽然，治疗的技术手段已经有了巨大的革新，但是现有的治疗方法或药物很少会起到改善肝癌患者生存质量的效果，因而，肝癌患者的5年生存率仍然很低。寻找新的有效和有潜力的治疗策略来提高患者的生存质量，延长生存期仍然需要进行深入的探索。

肝癌的起始与发展阶段与其所处免疫微系统的消除、平衡、逃逸这三个重要阶段紧密相关，因而干扰其免疫微系统的治疗方法应运而生。近年来，免疫疗法的出现为肿瘤患者带来了新的高效治疗药物或方法。免疫检查点抑制剂药物，如CTLA-4，PD-1/PD-L1等，已在一些癌种治疗中具有重要作用，这也为改善晚期肝癌患者生存状况带来了新的希望。预测性生物标志物(如PD-L1的表达和肿瘤突变负荷)可预测对PD-1/PD-L1单克隆抗体有反应的肿瘤患者群体，但免疫治疗在许多方面受到限制，只有少数肝癌患者受益于这单一治疗。同时，PD-1/PD-L1单克隆抗体治疗会导致一系列的不良反应，尤其心脏毒性是严重影响临床预后的一大问题。

中医药在我国用于治疗多种疾病已有2500多年的历史。康艾注射液作为应用现代技术手段生产的中医药处方，已被广泛报道用于各种恶性实体瘤的临床治疗，如肝癌、肺癌和直肠癌等。该注射液是由黄芪、人参和苦参素提取物制成，具有显著的益气扶正、增强机体抵抗力的作用。康艾注射液的主要生物活性成分包括生物碱、黄酮和皂苷等。

发明内容

本发明的目的是提供康艾注射液作为肝癌治疗药物抗PD-1抗体的减毒增效剂的应用。

本发明提供了PD-1阻断剂和康艾注射液在制备治疗肝癌的药物中的应用。

所述药物中，PD-1阻断剂和康艾注射液共同作为药物的活性成分。

所述药物中，PD-1阻断剂和康艾注射液发挥协同作用，共同作为药物的活性成分。

所述药物中，康艾注射液作为PD-1阻断剂的增敏剂和/或增效剂和/或减毒剂。

所述药物中，康艾注射液作为PD-1阻断剂的增敏剂和/或增效剂和/或减毒剂，共同作为药物的活性成分。

本发明还保护用于治疗肝癌的药物，包括抗PD-1阻断剂和康艾注射液。

本发明还保护康艾注射液在制备增敏剂中的应用；所述增敏剂的功能为提高肝癌肿瘤组织对PD-1阻断剂的敏感性。

本发明还保护康艾注射液在制备增效剂中的应用；所述增效剂的功能为增强PD-1阻断剂的抗肝癌活性。

本发明还保护康艾注射液在制备减毒剂中的应用；所述减毒剂的功能为降低PD-1阻断剂对生物体的心脏毒性和/或肺脏毒性。

具体的，所述PD-1阻断剂为抗PD-1抗体。

具体的，所述抗PD-1抗体为卡瑞利珠单抗。

以上任一所述药物中，PD-1阻断剂和康艾注射液的配比为：

3.5mg PD-1阻断剂：4600μl康艾注射液。

以上任一所述药物中，PD-1阻断剂和康艾注射液的配比为：

3-4mg PD-1阻断剂：4600μl康艾注射液。

本发明开发了新的肝癌治疗策略，提高了免疫治疗的疗效和反应率，可以最大限度地提高临床效益，并将毒性效应极大限度的降到最低。

附图说明

图1为实施例1中每间隔2天测量小鼠体重的结果。

图2为实施例1中每间隔2天测量小鼠肿瘤体积的结果。

图3为实施例1中小鼠肿瘤组织拍照和称重的结果。

图4为实施例1中对照组和抗PD-1抗体组的心脏照片。

图5为实施例1中心脏组织切片后进行HE染色和天狼猩红染色的照片。

图6为实施例1中毒性指标检测的结果。

图7为实施例1中疾病负荷指标检测的结果。

图8为实施例1中的免疫指标检测的结果(肿瘤组织分离细胞)。

图9为实施例1中的免疫指标检测的结果(脾组织分离细胞)

图10为实施例2中步骤一和步骤二的结果。

图11为实施例2中步骤三的结果。

图12为实施例2中步骤四和步骤五的结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中的抗PD-1抗体为卡瑞利珠单抗(江苏恒瑞医药股份有限公司，国药准字S20190027)，用生理盐水溶解后注射，剂量以干品计。康艾注射液(KA注射液)：长白山制药股份有限公司，国药准字Z20026868。

所用实验数据均重复3次以上，表示为平均值±标准平均误差(s.e.m)。使用Graphad软件8进行统计分析。进行t检验或单向方差分析，以确定两组或多组之间差异的显著性。显著性表示为p<0.05(*p<005，**p<0.005，***p<0.001；#p<0.05，#p<0.002，#p<0.001)或无显著性(ns)。

实施例1、KA注射液增强抗PD-1抗体治疗反应性并降低其毒性

C57BL/6小鼠：北京维通利华实验动物技术有限公司。

H22细胞：小鼠肝癌细胞。

饲养条件：20-25℃，50％湿度，12小时光照/12小时黑暗。

一、分组处理

6-8周龄C57BL/6小鼠，分成4组，每组12-15只，分组处理如下：

对照组(用Con表示)：试验第1天，背上左右两侧分别皮下注射H22细胞(1×10⁵个细胞/侧)；试验第2天至第40天，每天腹腔注射1次生理盐水(单次注射量为200μL生理盐水/25g体重)；

KA注射液组(用KA表示)：试验第1天，背上左右两侧分别皮下注射H22细胞(1×10⁵个细胞/侧)；试验第2天至第7天，每天腹腔注射1次KA注射液(单次注射量为200μL KA注射液/25g体重)；试验第8天至第40天，每隔一天腹腔注射1次KA注射液(单次注射量为200μLKA注射液/25g体重)，共注射17次。

抗PD-1抗体组(用PD-1表示)：试验第1天，背上左右两侧分别皮下注射H22细胞(1×10⁵个细胞/侧)；试验第7天、第9天、第12天、第14天、第17天、第19天、第22天、第24天、第27天、第29天、第32天、第34天、第37天和第39天，尾静脉注射卡瑞利珠单抗(单次注射剂量为10mg卡瑞利珠单抗/kg体重)。

抗PD-1抗体和KA注射液联合用药组(用KA+PD-1表示)：试验第1天，背上左右两侧分别皮下注射H22细胞(1×10⁵个细胞/侧)；试验第2天至第7天，每天腹腔注射1次KA注射液(单次注射量为200μL KA注射液/25g体重)；试验第8天至第40天，每隔一天腹腔注射1次KA注射液(单次注射量为200μL KA注射液/25g体重)，共注射17次；试验第7天、第9天、第12天、第14天、第17天、第19天、第22天、第24天、第27天、第29天、第32天、第34天、第37天和第39天，尾静脉注射卡瑞利珠单抗(单次注射剂量为10mg卡瑞利珠单抗/kg体重)。

试验第10天，对照组小鼠均可以观察到皮下肿瘤直径达到5mm。

二、体重指标检测

试验第1天至第40天，每间隔2天测量小鼠体重。

结果见图1。各组小鼠体重无显著差异。

三、肿瘤指标检测

试验第1天至第40天，每间隔2天测量小鼠肿瘤体积。结果见图2。

试验第40天，处死小鼠，分离肿瘤组织，拍照并称重。结果见图3(左图为照片，右图为肿瘤重量)。

三个药物处理组小鼠的肿瘤体积均小于对照组小鼠的肿瘤体积，差异显著；联合用药组小鼠的肿瘤体积小于两个单独用药组小鼠的肿瘤体积，差异显著。

以上结果表明，KA注射液对于抗PD-1抗体的抗肝癌功能具有增效作用。

四、毒性指标检测

现有技术已知，抗PD-1抗体存在一定的心脏毒性和肺毒性。

试验第40天，处死小鼠，分离心脏和肺脏。

对照组和抗PD-1抗体组的心脏照片见图4。与对照组相比，抗PD-1抗体组小鼠心脏显著变小，证明抗PD-1抗体确实存在心脏毒性，引起心脏变小。

心脏组织切片后进行HE染色和天狼猩红染色，结果见图5。与对照组小鼠相比，抗PD-1抗体组小鼠心脏显示肌纤维紊乱、心肌细胞变薄和纤维化面积增加。与抗PD-1抗体组小鼠相比，联合用药组小鼠心脏的上述情况均显著改善。

分别称重心脏和肺脏，除以相应小鼠的尾长度，结果见图6。与对照组小鼠相比，抗PD-1抗体组小鼠的心脏和肺脏的参比重量降低，证明抗PD-1抗体确实存在心脏毒性和肺脏毒性，引起心脏和肺脏变小。与抗PD-1抗体组小鼠相比，联合用药组小鼠的心脏和肺脏的参比重量显著增高。

以上结果表明，KA注射液具有降低抗PD-1抗体的心脏毒性和肺脏毒性的功效。

五、疾病负荷指标

疾病发展反映在脾脏和肝脏重量上。

试验第40天，处死小鼠，分离脾脏和肝脏。

分别称重脾脏和肝脏，除以相应小鼠的尾长度，结果见图7。与对照组小鼠相比，联合用药组小鼠的脾脏和肝重量减少，即相对对照小鼠联合用药组小鼠的疾病负荷显著减小。

六、免疫指标

试验第40天，处死小鼠，收集肿瘤组织并将其消化成单个细胞，用荧光抗体染色，然后用PBS缓冲液洗涤，然后用PBS缓冲液悬浮细胞，使用细胞仪(Thermo FisherScientific，Attune NxT)检测。结果见图8。

试验第40天，处死小鼠，收集脾脏，并将其消化成单个细胞，用荧光抗体染色，然后用PBS缓冲液洗涤，然后用PBS缓冲液悬浮细胞，使用细胞仪(Thermo Fisher Scientific，Attune NxT)检测。结果见图9。

结果表明：PD-1治疗组中的巨噬细胞和T细胞的百分比与对照组中的巨噬细胞和T淋巴细胞的百分比不可比，具体如CD4+T细胞、CD8+T细胞，M1样巨噬细胞和M2样巨噬细胞，这表明抗PD-1抗体处理不会影响免疫细胞的数量；前期研究已经表明KA注射液可升高巨噬细胞在肿瘤部位的浸润以及T细胞的生成，同时降低促生长型M2巨噬细胞的比例，因而联合治疗后KA注射液可使免疫细胞明显改变，协同抗PD-1抗体发挥药效。

本实施例的结果表明：KA注射液可以提高肝癌肿瘤组织对PD-1阻断剂的敏感性，并减轻由抗PD-1抗体引起的几种不良反应，最有代表性的是减轻心脏毒性。

实施例2、康艾注射液可调节巨噬细胞极化并发挥抗肿瘤活性

一、康艾注射液诱导M2型巨噬细胞的复极化

为了确定KA注射液对巨噬细胞的较小毒性或无直接毒性浓度，使用MTT法评估KA注射液治疗24小时后巨噬细胞的细胞活力。结果如图10的A和B所示。低于40μL/mL是KA注射液对巨噬细胞的最高无毒浓度。接下来，选择40μL/mL KA注射液浓度进行后续的探索实验。

Arg-1和IL-10是M2巨噬细胞的特征性标志物。CD206也称为巨噬细胞甘露糖受体(MMR)，是M2巨噬细胞的高度特异性特征标志物。将M2巨噬细胞复极为M1表型可以增强其抗肿瘤功能。

巨噬细胞与肿瘤条件培养基(TCM)共培养24小时以诱导M2极化，然后巨噬细胞与KA注射液培养24小时。首先进行蛋白质印迹分析以评估极化状态。结果如图10的A和B所示，TCM诱导的巨噬细胞高度表达Arg-1与IL-10，而KA注射液治疗后Arg-1及IL-10显著下调。为了进一步验证这一结果，发明人观察到TCM诱导的巨噬细胞呈长纺锤形或三角形或不规则形状，KA注射液可显著逆转这种情况(见图10的C和D)。

二、康艾注射液阻断脂质积累，诱导M2样巨噬细胞复极

脂质代谢重编程对肿瘤相关巨噬细胞的极化和功能至关重要。发明人进一步检测了KA注射液诱导的M2复极是否受到脂质代谢的调节。

评估巨噬细胞中的脂质含量，与单独治疗的TCM相比，联合KA注射液治疗后，作为脂质主要成分的甘油三酯(TG)显著降低(图10的F和H)。油红O染色结果证实，KA注射液减轻了M2样巨噬细胞中丰富的脂质积累(图10的E和G)。硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD1)是脂质合成的关键酶，免疫蛋白印迹分析表明，与单独治疗的TCM相比，联合KA注射治疗后SCD1的蛋白表达显著下降(图10的I和J所示)。M2巨噬细胞中积累的脂质是为其活动产生能量的燃料来源，分析参与脂肪酸代谢的基因的表达，通过免疫蛋白印迹分析检测了CPT1A、HSL和ATGL是脂肪酸β氧化的限速酶，发现M2样巨噬细胞具有升高的CPT1A表达，而HSL和ATGL的表达没有变化，然而KA注射液可以部分逆转TCM诱导的CPT1A上调(见图10的I和J)。综上所述，上述数据表明，KA注射液可以阻碍脂质积累和代谢，以抵抗TCM诱导的M2样巨噬细胞极化。

三、康艾注射液负调节肝癌细胞的恶性行为并阻断巨噬细胞与肝癌细胞之间的相互作用

癌症很难治愈，因为它们具有很强的侵袭性。上皮间充质转化(EMT)在肿瘤侵袭和转移过程中经常被激活。因此，发明人探索了KA注射液治疗后肝癌细胞EMT过程的几个经典基因表达的情况。

首先，应用免疫荧光染色检测上皮表型标记物E-cad。发现KA注射液处理的HCC细胞中E-cad显著增加(见图11的A)。免疫印迹试验中，在肝癌细胞与不同浓度的KA注射液共培养后，E-cad异常升高，而N-cad和Vim明显降低(见图11的B)。结果表明，KA注射液确实显著破坏了肿瘤细胞的侵袭性。

考虑到M1和M2巨噬细胞在肿瘤微环境中的不同作用，以及单独或联合KA注射治疗后巨噬细胞的不同极化状态。发明人对KA注射复极化M2巨噬细胞后，是否增强其抗肿瘤功能感到困惑。在此，伤口愈合试验用于检测复极巨噬细胞的条件培养基对肿瘤细胞迁移能力的影响。如图11的E所示，表明KA注射液治疗后能够降低伤口闭合率，并抑制M2型巨噬细胞条件培养基增加的迁移性肝癌细胞的数量。RM2-CM下调E-cad、上调N-cad和Vim的能力也被KA注射液减弱。此外，来自KA注射液治疗的条件培养基(RKA-CM)也显著抑制HCC细胞的迁移(图11的F)。

巨噬细胞具有趋化性，可以迁移到肿瘤部位，肿瘤细胞可以分泌某些因子对巨噬细胞进行影响，并将其诱导为促肿瘤表型，以助于癌症的发生和发展进程，如免疫逃逸和肿瘤细胞迁移。因此，发明人通过用KA注射液预处理巨噬细胞、肿瘤细胞或两者来检测KA注射液对肿瘤细胞-巨噬细胞粘附的影响。Transwell分析用于检测KA注射治疗是否阻断M2巨噬细胞辅助的HCC细胞侵袭。如图11的G所示，这表明KA注射液削弱了M2巨噬细胞显著提高的HCC细胞的侵袭能力。值得注意的是，还发现KA注射液显著抑制了HCC细胞募集的迁移巨噬细胞的数量(见图11的H)，表明KA注射可以抑制肿瘤细胞诱导巨噬细胞迁移。

综上，这些数据表明KA注射液在负调节HCC细胞的恶性行为和阻断巨噬细胞与HCC细胞相互作用中起着至关重要的作用。

四、康艾注射液在体内发挥肿瘤抑制功能

为了进一步研究KA注射液对荷瘤小鼠的潜在抗HCC活性，构建了HCC皮下肿瘤小鼠模型(图12的A)。通过肿瘤体积和肿瘤重量测量，KA注射液治疗的肿瘤生长显著变慢(图12的C和D)。此外，与对照组相比，KA注射液治疗后体重没有显著差异(图12的B)。与健康人相比，肿瘤患者的免疫细胞数量或杀伤活性明显降低，免疫功能严重降低可能是肿瘤发生的重要原因。接下来，进一步检测并证明，KA注射液不仅增加了肿瘤组织中巨噬细胞的浸润，而且抑制了TAM中M2样极化和并促进M1样极化，这阻碍了肿瘤的发生(图12的E和F)。数据表明，KA注射液通过刺激巨噬细胞发挥肿瘤抑制功能。T细胞在维持先天性毒性淋巴细胞的稳态中起着关键作用。KA注射液提高了脾脏中的T细胞群占比(图12的G)，KA注射液治疗小鼠的肿瘤部位也增加了活化的CD4+和CD8+T细胞(图12的I)。随着研究的深入，研究人员越来越关注淋巴细胞类别的精细分型。有趣的是，CD3+CD4-CD8-双阴性T细胞(DNT)作为成熟T细胞的罕见亚群，在肿瘤区域显著下调(图12的I)，而KA注射液治疗小鼠的脾脏组织几乎没有变化(图12的H)。

综上，这些结果证实KA液注射液显著抑制肿瘤生长并减轻体内免疫抑制微环境。

五、康艾注射液可以诱导PD-L1的增加

证据表明，PD-L1升高可提高抗PD-1或PD-L1免疫治疗的疗效。通过免疫组织化学检测KA注射液治疗后肿瘤组织中PD-L1表达水平，如图12的J所示，PD-L1显著上调。接下来，HCC细胞用KA注射液明进行处理，随后应用蛋白质印迹来确认KA注射液诱导的肝癌细胞中PD-L1在蛋白质水平上的积累(图12的K)。

综上，KA注射液可以诱导PD-L1的增加。

六、步骤一至五中的相关试验的试验方法

1、MTT法测定细胞活力

将细胞(5000个/孔)接种到96孔板中，并在37℃和5％CO₂培养条件下至于培养箱中孵育过夜。用康艾注射液处理24小时后，用含有5mg/mL MTT(Sigma Aldrich)的新鲜培养基继续培养细胞，在培养箱中孵育4小时。最后，将二甲基亚砜(Sigma-Aldrich)加入该96孔板的细胞中，并测量550nm处的吸光度，以此值计算细胞生存活力。

2、细胞培养

人肝癌细胞系(HuH-7和HepG2)小鼠肝癌细胞系Hepa1-6、人急性单核细胞白血病细胞系THP-1和小鼠RAW 264.7巨噬细胞从中国科学院典型培养物保藏细胞库获得，并根据其指南进行培养。THP-1细胞在RPMI 1640培养基(Biological Industries，USA)中培养，其他细胞在补充有10％胎牛血清的DMEM(Biologic Industrie，USA，在恒温箱(ThermoScientific，USA)中培养(温度保持在37℃，CO2浓度为5％)。

3、蛋白质印迹分析

给予药物处理后，在含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液中裂解细胞或组织(上海桑根生物科技有限公司)，并在冰上孵育30分钟。在12000g，4℃下离心5分钟后获得总蛋白质，并通过BCA蛋白质测定试剂盒(翌圣生物科技(上海)股份有限公司)测量浓度。加入适量的4×SDS上样缓冲液(Sigma-Aldrich)，将此蛋白裂解液在金属浴上温度为100℃煮10分钟。最后，通过SDS-PAGE分离裂解液中的蛋白质，并在4℃下与一级抗体培养过夜，根据制造商的方案稀释使用抗体。使用化学发光试剂盒(Affinity Biosciences ECL试剂盒(femtogram)KF8003)进行显影处理。使用的抗体如下：IL-10抗体，Arg-1抗体，TNF-α抗，LC-3B抗体体为CST公司(Danvers，MA，USA)的产品。COX-2抗体，PD-L1抗体，E-cad抗体，Vim抗体，N-cad抗体购于武汉爱博泰克生物科技有限公司。SCD-1抗体，HSL抗体，ATGL抗体，CD206抗体，CD8抗体，CPT1A抗体购于英国Abcam公司。抗β-肌动蛋白(A5441)抗体为Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)产品。

4、免疫荧光染色

将细胞接种在24孔板中的DMEM完全培养基或RPMI 1640完全培养基中过夜。处理后，将细胞固定在4％多聚甲醛中15分钟，然后用PBS洗涤两次。随后，将平板用0.5％TritonX-100(Sigma-Aldrich)孵育5分钟、10％山羊血清孵育30分钟和一级抗体在4℃下共孵育过夜。第二天，将平板与二级抗体在室温下孵育1小时。用PBST洗涤三次后，用DAPI对细胞核染色5分钟。最后，通过使用倒置荧光显微镜(尼康，日本)获得图像。所用试剂：GFP荧光标签购于汉恒生物科技(上海)有限公司，F4/80流式抗体购于美国Thermo Fisher科技有限公司。

5、条件培养基(CM)的收集

肝癌细胞在DMEM基础培养基中培养1天，回收培养基并作为肿瘤条件培养基(TCM)并过滤。RAW 264.7或THP-1用KA注射液培养1天，取出培养基旧培养液并用新鲜的DMEM完全培养基或RPMI 1640完全培养基培养1天，回收培养基并过滤为RKA-CM或TKA-CM。M2型RAW264.7或THP-1用KA注射液培养1天，取出培养基并用新鲜的DMEM完全培养基或RPMI 1640完全培养基替换1天，回收培养基并过滤为RM2KA-CM或TM2KA-CM。

6、免疫组织化学

组织在4％多聚甲醛中固定24小时。第二天，将组织包埋在石蜡中，并切成5μm的切片。将组织切片浸入柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中进行抗原修复，然后用10％的山羊血清封闭，在一级抗体中孵育过夜，并用四羟基氯化二氨基联苯胺(DAB)溶液进行可视化。最后，用苏木精对组织的细胞核进行染色，并使用图像J进行分析。

7、流式细胞术分析

免疫细胞的检测：收集脾脏和肿瘤组织并将其消化成单个细胞。肿瘤(脾脏)单细胞悬浮液在4℃的黑暗中用抗体染色20-30分钟。之后，用PBS洗涤细胞两次，并加入300-500μL PBS稀释。使用细胞仪(Thermo Fisher Scientific，Attune NxT)测量细胞。

8、巨噬细胞制备和极化

用200ng/mL PMA(Sigma-Aldrich)预处理THP-1细胞24小时以诱导分化为巨噬细胞。巨噬细胞与TCM培养24小时以诱导分化为M2巨噬细胞。KA注射治疗后，收集巨噬细胞进行进一步分析。

9、细胞侵袭分析

将1×10⁵HCC细胞或M2型巨噬细胞接种到跨孔膜的上侧，并将2×10⁵M2型细胞或HCC细胞接种到24孔板(康宁公司)的下腔室中。在指定时间用KA注射处理后，用4％多聚甲醛固定附着在膜背面的细胞，并用结晶紫染色。图像通过光学显微镜拍摄并通过ImageJ软件分析。

10、伤口愈合迁移试验

肝癌细胞在培养箱中以5×10⁵细胞/孔的密度在6孔板中播种过夜。第二天，移除插入物后产生无细胞间隙，此时，用光学显微镜拍摄照片作为对照(con)组，之后，用RKA-CM、TKA-CM或RM2KA-CM、TM2KA-CM处理细胞48小时。将细胞处理至指定时间并再次拍照。

11、油红O染色

油红O的测定：采用油红O染色法检测细胞脂质含量。巨噬细胞用4％多聚甲醛固定10分钟，用油红O(Sangon Biotech)染色1小时，然后用光学显微镜捕获图像。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims

1.PD-1阻断剂和康艾注射液在制备治疗肝癌的药物中的应用。

2.康艾注射液在制备增敏剂中的应用；所述增敏剂的功能为提高肝癌肿瘤组织对PD-1阻断剂的敏感性。

3.康艾注射液在制备增效剂中的应用；所述增效剂的功能为增强PD-1阻断剂的抗肝癌活性。

4.康艾注射液在制备减毒剂中的应用；所述减毒剂的功能为降低PD-1阻断剂对生物体的心脏毒性和/或肺脏毒性。

5.如权利要求1至4中任一所述的应用，其特征在于：所述PD-1阻断剂为抗PD-1抗体。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述抗PD-1抗体为卡瑞利珠单抗。

7.用于治疗肝癌的药物，包括抗PD-1阻断剂和康艾注射液。

8.如权利要求7所述的药物，其特征在于：所述PD-1阻断剂为抗PD-1抗体。

9.如权利要求8所述的药物，其特征在于：所述抗PD-1抗体为卡瑞利珠单抗。