CN118225743A - 一种免疫原体外检测方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及生物检测领域，具体涉及一种免疫原体外检测方法。有过敏反应的患者体内会产生抗特异性抗原的抗体，通过用一系列的抗原检测血液中的特异性抗体，可以找到过敏原，具体为S1合成DNA底物体系：合成DNA底物，并在DNA底物中加入抗原与DNA底物末端交联得到交联DNA底物；S2建立外切酶体系：向S1的交联DNA底物中加入荧光标记物和核酸外切酶得到荧光标记交联DNA底物，通过荧光强度定量判断核酸外切酶对交联DNA底物的水解情况。S3抗原检测：向S2的荧光标记交联DNA底物中加入特异性抗体，通过荧光强度读取特异性抗体的浓度，进而判断抗原种类。本申请不仅大大提高检测的效率，且方便易操作，同时本申请选用的检测方法属于体外检测可以避免皮试。
Description
技术领域
本申请涉及生物检测领域，具体涉及一种免疫原体外检测方法。
背景技术
过敏原测试是指对过敏性疾病患者进行过敏原检测，找到引发过敏的真正原因，从而进行有针对性的预防和治疗。很多过敏性疾病的发生都与接触过敏原有关。在临床上很多皮肤病的发生与发展都与接触了过敏原有关。而临床上多数过敏性疾病的患者通常只是做缓解症状的治疗，而没有找到引发过敏的真正原因，因而也就做不到针对性的预防和治疗，导致病情反复加重、迁延不愈。因而建议经常过敏的患者，一定要做一下过敏原筛查检测。
UniCAP检测瑞典法玛西亚公司研制的UniCAP全自动体外诊断系统是目前国际上最先进的检查过敏原实验室系统，已获得国际临床实验室标准委员会的确认。以其安全性高、检测结果准确可靠，得到了世界卫生组织的确认，被国际上誉为“过敏原检测的金标准”。其主要测试原理为过敏原共价结合于CAP的纤维素固相载体上，与患者血清样品中的特异性IgE抗体反应。基于世界卫生组织(WHO)的IGE参考品绘制标准曲线，由荧光强度可推算出样品中的IgE浓度。检测种类可检测包括吸入、食物等600多种过敏原。通过简单的血样采集，就可快速而准确的得到检测结果，同时还可检测出过敏的程度。由于该检测精确并可以定量测出过敏程度，大大减少人为错误，保障检测结果的可信性，但是鉴于成本问题仍然得不到普及。
综上所述，目前过敏原的检测鉴于成本问题，依然没有办法得到普及。因此本申请提供一种免疫原体外检测方法。
发明内容
有过敏反应的患者体内会产生抗特异性抗原的抗体。通过用一系列的抗原检测血液中的特异性抗体，就可以找到过敏原。针对背景技术中存在的目前过敏原的检测鉴于成本问题，本申请提供一种免疫原体外检测方法，旨在降低检测成本，快速高效检测出抗原。
将抗原小分子交联在核酸的片段上，然后在抗体结合小分子抗原后会产生空间位阻的效应，从而可以抑制核酸酶对核酸的作用。这种原理可以用于对抗原抗体的特异性研究。本申请是根据核酸外切酶活性特点，它可以将DNA底物降解，核酸外切酶的活性可以通过底物的消失或产物的生成而测得。如果DNA上含有小分子物质，并不影响核酸外切酶的活性。但是反应体系中一旦有小分子抗原的特异性抗体或其特异性的结合物时，核酸外切酶的活性将被抑制。DNA底物将不会被降解。保留下来的DNA底物和产物都可以被测量。残留DNA底物的量和DNA外切酶的水解成反比，和反应系统中的抗体或小分子的结合物质成正比。相反，DNA外切酶的水解产物与系统中的抗体量成反比。所以，根据系统中残余双链DNA或产物的量可以计算得到反应体系中的抗体或抗原结合物存在的量。
本申请的技术方案：
一种免疫原体外检测方法，包括如下步骤：
S1.合成DNA底物体系：合成DNA底物，并在DNA底物中加入抗原与DNA底物末端交联得到交联DNA底物；
S2.建立外切酶体系：向S1的交联DNA底物中加入荧光标记物和核酸外切酶得到荧光标记交联DNA底物，通过荧光强度定量判断核酸外切酶对交联DNA底物的水解情况；
S3.抗原检测：向S2的荧光标记交联DNA底物中加入含有特异性抗体的患者血清或血浆样品，通过荧光强度读取特异性抗体的浓度，进而判断抗原种类。
优选的，S1所述DNA底物是双链DNA、单链DNA或dNMP中的任意一种，S1所述合成DNA底物需要的碱基对数目为几个至几千。
优选的，S1所述DNA底物是双链DNA；S1所述合成DNA底物需要的碱基对数目为100～1000。
优选的，S1所述抗原为天然小分子有机物或者人工合成小分子有机物。
优选的，所述小分子有机物为硫酸镍、羊毛脂醇、硫酸新霉素、重铬酸钾、卡因、香料、松香、环氧树脂、喹啉、秘鲁香脂、二盐酸乙二胺、对叔丁酚、芳香、卡巴、炭黑橡胶、异噻唑啉酮、巯基苯并噻唑、对苯二胺、硫柳汞或秋兰母中的任意一种。
优选的，S1所述抗原与DNA底物末端交联方式为通过共价键交联、直接在核苷酸的分子上交联或通过6～12个碳链接交联中的任意一种或多种。
优选的，S2所述荧光物质为能够标记DNA底物双链DNA、单链DNA或dNMP中的一种。
优选的，S2所述核酸外切酶为能够水解DNA底物双链DNA、单链DNA或dNMP中的一种。
优选的，S2所述荧光强度是以480nm波长作为激发波长，520nm波长为检测波长读取的数据。
优选的，S3所述荧光强度是以480nm波长作为激发波长，520nm波长为检测波长读取的数据。
本申请的有益效果：
(1)本申请基于核酸外切酶活性特点，将标记物与DNA底物末端交联，加入核酸外切酶和特异性抗体，通过荧光强度，测定引起过敏的抗原类型和相应的抗体含量。该方法不仅可以大大提高检测的效率，降低检测成本，且方便易操作，同时本申请选用的检测方法属于体外检测，这种检测方法可以避免皮试。
(2)本申请所选用的底物可以是双链DNA、单链DNA或dNMP，底物种类的的增加，同时扩大了核酸外切酶的可选种类，减少了客观条件的限制。
附图说明
图1为本申请的反应的原理图，没有特异性抗体存在下，DNA外切酶降解DNA双链底物，有特异抗体存在时，抑制DNA外切酶的反应，保留双链DNA；
图2为本申请Lambda核酸外切酶降解双链DNA活性的荧光测定结果图；
图3为本申请双链DNA底物的荧光强度和体系中的特异性抗体浓度的关系图。
具体实施方式
本申请主要提供的教导涉及一种检测特异抗体活性的新方法。此方法可以用来对例如过敏原产生的特异性抗体进行检测。方法中的试剂主要有核酸外切酶和核酸外切酶的双链DNA模板。双链DNA的末端和小分子的抗原交联形成小分子-双链DNA的底物。利用交联的复合物可以通过DNA外切酶活性检测该小分子特异抗体的量。不同小分子抗原可以形成不同抗原复合物可以检测不同抗体的存在和特异抗体存在的量。由此可以建立一整套检测试剂，其中包含一系列的相关小分子抗原，比如，硫酸镍、羊毛脂醇、硫酸新霉素、重铬酸钾、卡因、香料、松香、环氧树脂、喹啉、秘鲁香脂、二盐酸乙二胺、对叔丁酚、芳香、卡巴、炭黑橡胶、异噻唑啉酮、巯基苯并噻唑、对苯二胺、硫柳汞、秋兰母。如果用一系列的过敏原分子和双链DNA底物交联，则可以制作出可以检测所有相关特异性抗体的过敏原检测系统。由该方法所创造的系统抗体建立一个快速、简便、免洗的体外过敏原筛查检测技术。
具体实施方法如下：
实施例1
S1.使用75个碱基对底物合成双链DNA，随后在双链DNA末端交联有地高辛类似物分子Dig得到Dig交联双链DNA底物。
S2.建立外切酶体系：在90ul的缓冲液为甘氨酸pH9.4系统中，其中含2.5mMMgCl2，50ug/ml BSA，10nM Dig交联双链DNA底物以及1：200稀释的Pico green，在37℃条件下加入2.5单位的lambda核酸外切酶,采用DS-11FX超微荧光分度计，在荧光分光光度计上记录荧光，以480nm波长作为激发波长，520nm波长为检测波长。随时间的延长荧光逐渐减弱。说明lambda核酸外切酶对带有Dig小分子的双链DNA进行了水解反应，随着反应时间延长双链DNA逐渐减小，结果如图2所示，其中横坐标表示时间，单位为秒，纵横坐标为吸光度。
S3.抗原检测：反应在96孔的ELISA板上进行，在90ul的缓冲液为甘氨酸pH9.4系统中，其中含2.5mM MgCl2，50ug/ml BSA，17nM Dig双链DNA底物以及1：200稀释的Picogreen。设置6组上述反应体系，在每组中分别加入抗Dig小分子特异性抗体，抗体浓度分别为0nM，20nM，40nM，80nM，160nM，320nM，37℃保温5分钟，然后加入2.5单位的Lambda核酸外切酶，并在37℃继续保温5分钟，测试在特异性抗体对lambda核酸外切酶水解活性的抑制，然后检测荧光强度，结果如图3。
实施例2
S1.使用100个碱基对底物合成双链DNA，随后在双链DNA末端交联有D-生物素得到D-生物素交联双链DNA底物。
S2.建立外切酶体系：在90ul的缓冲液为甘氨酸pH9.4系统中，其中含2.5mMMgCl2，50ug/ml BSA，10nM D-生物素交联双链DNA底物以及1：200稀释的Pico green，在37℃条件下加入2.5单位的lambda核酸外切酶,采用DS-11FX超微荧光分度计，在荧光分光光度计上记录荧光，以480nm波长作为激发波长，520nm波长为检测波长。记录随时间的延长荧光强度的变化。
S3.抗原检测：反应在96孔的ELISA板上进行,在90ul的缓冲液为甘氨酸pH9.4系统中，其中含2.5mM MgCl2，50ug/ml BSA，17nM D-生物素双链DNA底物以及1：200稀释的Picogreen。设置6组上述反应体系，在每组中分别加入抗D-生物素特异性抗体，抗体浓度分别为0nM，20nM，40nM，80nM，160nM，320nM，37℃保温5分钟，然后加入2.5单位的Lambda核酸外切酶，并在37℃继续保温5分钟，测试在特异性抗体对lambda核酸外切酶水解活性的抑制，随后记录荧光强度随时间的变化。
实施例3
本实施例与实施例1的主要区别特征在于碱基对数目为1000对。
结果分析
由于实施例2和实施例3与实施例1的荧光强度随时间的变化趋势相似，因此本申请只展示实施例1的结果。
结合实施例1和图2可以看出，随之时间的延长，随着lambda核酸外切酶将双链DNA底物分解，荧光强度刚开始逐步减弱，但是随着时间的延长，荧光强度区域稳定，这可能lambda核酸外切酶分解双链DNA底物处于动态平衡，所以荧光强度区域稳定，同时也说明，lambda核酸外切酶分解双链DNA底物不受抗原小分子物质的影响，可以基于对核酸酶活性抑制的技术，进行小分子抗原检测。
结合实施例1、图2及图3可以看出，随着Dig特异性抗体浓度的逐渐增加，残留的荧光强度也相应增加，这说明Dig特异性抗体与Dig小分子抗原结合，抑制lambda核酸外切酶分解双链DNA底物。
综上所述，本申请基于核酸外切酶活性特点，将标记物与DNA底物末端交联，加入核酸外切酶和特异性抗体，通过荧光强度，测定引起过敏的抗原类型和相应的抗体含量。该方法不仅可以大大提高检测的效率，降低检测成本，且方便易操作，同时本申请选用的检测方法属于体外检测，这种检测方法可以避免皮试。本申请所选用的底物可以是双链DNA、单链DNA或dNMP，底物种类的的增加，同时扩大了核酸外切酶的可选种类，减少了客观条件的限制。
以上所述，仅是本申请的较佳实施例而已，并非对本申请作任何形式上的限制，虽然本申请已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本申请，任何本领域技术人员，在不脱离本申请技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本申请技术方案内容，依据本申请的技术实质对以上实施例所作的任何简介修改、等同变化与修饰，均仍属于本申请技术方案的范围内。
Claims (10)
1.一种免疫原体外检测方法，其特征在于，包括如下步骤:
S1.合成DNA底物体系：合成DNA底物，并在DNA底物中加入抗原与DNA底物末端交联得到交联DNA底物；
S2.建立外切酶体系：向S1的交联DNA底物中加入荧光标记物和核酸外切酶得到荧光标记交联DNA底物，通过荧光强度定量判断核酸外切酶对交联DNA底物的水解情况；
S3.抗原检测：向S2的荧光标记交联DNA底物中加入含有特异性抗体的患者血清或血浆样品，通过荧光强度读取特异性抗体的浓度，进而判断抗原种类。
2.根据权利要求1所述的一种免疫原体外检测方法，其特征在于，S1所述DNA底物是双链DNA、单链DNA或dNMP中的任意一种，S1所述合成DNA底物需要的碱基对数目为几个至几千。
3.根据权利要求2所述的一种免疫原体外检测方法，其特征在于，S1所述DNA底物是双链DNA；S1所述合成DNA底物需要的碱基对数目为100～1000。
4.根据权利要求1所述的一种免疫原体外检测方法，其特征在于，S1所述抗原为天然小分子有机物或者人工合成小分子有机物。
5.根据权利要求4所述的一种免疫原体外检测方法，其特征在于，所述小分子有机物为硫酸镍、羊毛脂醇、硫酸新霉素、重铬酸钾、卡因、香料、松香、环氧树脂、喹啉、秘鲁香脂、二盐酸乙二胺、对叔丁酚、芳香、卡巴、炭黑橡胶、异噻唑啉酮、巯基苯并噻唑、对苯二胺、硫柳汞或秋兰母中的任意一种。
6.根据权利要求1所述的一种免疫原体外检测方法，其特征在于，S1所述抗原与DNA底物末端交联方式为通过共价键交联、直接在核苷酸的分子上交联或通过6～12个碳链接交联中的任意一种或多种。
7.根据权利要求1所述的一种免疫原体外检测方法，其特征在于，S2所述荧光物质为能够标记DNA底物双链DNA、单链DNA或dNMP中的一种。
8.根据权利要求1所述的一种免疫原体外检测方法，其特征在于，其特征在于，S2所述核酸外切酶为能够水解DNA底物双链DNA、单链DNA或dNMP中的一种。
9.根据权利要求1所述的一种免疫原体外检测方法，其特征在于，S2所述荧光强度是以480nm波长作为激发波长，520nm波长为检测波长读取的数据。
10.根据权利要求1所述的一种免疫原体外检测方法，其特征在于，S3所述荧光强度是以480nm波长作为激发波长，520nm波长为检测波长读取的数据。
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