CN118201598A - 用于抗原靶向递送的包含纳米颗粒的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了药物组合物，其包含纳米颗粒，其中所述纳米颗粒每个均包含a)包含两亲性聚合物的胶束，和b)至少一种肽，其中所述药物组合物包含含有SEQ ID NO：1‑4的肽。本发明还提供了用于治疗寻常天疱疮的相应药物组合物。

Description

用于抗原靶向递送的包含纳米颗粒的药物组合物
技术领域
本发明提供了包含纳米颗粒的药物组合物，其中所述纳米颗粒每个均包含含有两亲性聚合物的胶束和至少一种肽。本发明所述的药物组合物包含含有SEQ ID NO：1-4的肽。所述药物组合物可以用于治疗寻常天疱疮。
背景技术
肝脏在抑制对进入循环的血液传播的抗原，例如，食物抗原的不希望的免疫应答中起重要作用。可以使用肝脏的这种基本机制来特异性下调对外部蛋白抗原或自体抗原的不利的免疫应答。
非常规抗原递呈细胞(APC)，例如，肝窦内皮细胞(LSEC)在肝脏独特的耐受性环境中进行抗原递呈以维持免疫耐受性和稳衡。这通过肝脏中多种耐受性机制来实现，其包括细胞固有和活性调控机制，包括激活的T细胞的保留和缺失，以及调节性T细胞的诱导。
在小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎模型(一种多发性硬化的动物模型)中，肝脏中髓鞘质来源的抗原的异位表达可以防止自体免疫神经性炎症。
通过将抗原靶向肝脏以用于有效吸收和致耐受性递呈，肝窦内皮细胞(LSEC)的非常有效的清除功能可以用于清除血液传播的抗原。为此目的，将抗原性肽缀合至小(＜200nm)纳米颗粒，所述纳米颗粒设计以模拟血液传播的抗原。如血液传播的抗原一样，这些注射的纳米颗粒缀合物靶向肝脏，在此它们主要被LSEC吸收。在胞内吸收和加工后，肽结合至MHC/HLA分子并且在细胞表面递呈，在此这些肽/MHC复合物被抗原特异性T细胞识别。在肝脏的致耐受性环境内，这种T细胞抗原识别导致T细胞耐受。
使用每个均与疾病相关抗原性肽缀合的纳米颗粒，在几种不同的动物模型中已表明，MHC/HLA-I类和II类限制性肽两者均可以以抗原特异性方式诱导耐受性，进而防止或改善疾病或不希望的免疫应答。
自身免疫疾病是患者和医疗保健系统的巨大负担。当前疗法大多依赖于免疫抑制药物，但这些药物具有相当大的副作用。自体抗原特异性免疫疗法专门针对疾病特异性免疫病理，不影响患者的一般免疫状态，这类疗法被认为是未满足的医学需求。
寻常天疱疮(PV)被分类为稀有病症，并且被认定为特征明确的CD4+ T细胞依赖性自体抗体介导的自身免疫疾病。在人PV病中，主要见于疾病活动期的自体反应性致病性自体抗体是主要病理因素。它们主要针对桥粒芯蛋白-3，桥粒芯蛋白-3是一种稳定上皮角化细胞之间粘附的钙粘素。这些自体抗体对桥粒芯蛋白-3的干扰导致由粘膜和皮肤中的细胞粘附丧失所造成的水疱(称为棘层松解)。与PV相关的水疱是脆弱且易破裂的，从而导致屏障功能的严重丧失、感染和潜在的致死临床结果。由于自体反应性Dsg3肽特异性CD4+ T细胞被认为促进PV中的自体免疫B细胞应答，从而导致产生致病性抗Dsg3抗体，因此其目的在于治疗性靶向Dsg3肽特异性CD4+ T细胞以最终降低抗Dsg3抗体滴度。
为此，可以使用包含两亲性聚合物壳的纳米颗粒。聚合物壳形成胶束结构，其表面结构允许自体抗原性肽的共价结合。
WO 2013/072051公开了一种药物组合物，用于在受试者体内产生用于治疗或预防其中特异性免疫应答抑制有益的疾病的至少一种CD4+ T细胞表位特异的耐受性CD4+ T细胞的药物组合物。纳米颗粒包含含有两亲性聚合物的胶束和含有与胶束外部有关的至少一个T细胞表位的肽。每个均可以混合具有一种特异性肽的几个拷贝的纳米颗粒。这种不同纳米颗粒-肽缀合物的混合物被称为TPM(Topas颗粒混合物)。
EP 20157797.0涉及包含含有数均分子量(Mn)为20,000g/mol或以下的两亲性聚合物的胶束和含有至少一个T细胞表位的至少一个肽的纳米颗粒。
然而，已发现并非可以以高密度的偶联至纳米颗粒表面的肽产生所有肽纳米颗粒组合。在某些医学应用中，重要的是可以以极高肽加载密度以及使用有效纯化方法的高纯度密度产生纳米颗粒。
因此，本领域仍然需要适合于在人受试者中使用的改善的药物组合物。具体地，需要诱导广泛免疫耐受性的药物组合物。
发明概述
根据本发明，通过包含纳米颗粒的药物组合物解决了以上所描述的问题，其中所述纳米颗粒每个均包含
a)包含两亲性聚合物的胶束，和
b)至少一种肽，
其中所述药物组合物包含含有SEQ ID NO：1-4的肽。
所述纳米颗粒还可以包含至少部分被聚合物胶束涂覆的固体疏水性核，或者不包含固体疏水性核。
本发明所述的药物组合物利用天然的肝脏特异性耐受诱导机制，通过采用颗粒介导的递送方法直接靶向LSEC。均偶联至所述纳米颗粒的至少4种肽的混合物模拟了无害的食物抗原，其在静脉内注射后优先被LSEC吸收。LSEC将肽(在从所述纳米颗粒上切割下来并与MHC/HLA分子结合后)递呈至循环桥粒芯蛋白-3-特异性CD4+ T细胞，从而导致其耐受。通过这种方式，可以针对确定的免疫疾病致病抗原诱导肽特异性免疫耐受性，以旨在改善疾病。本发明人意外地发现通过使用纳米颗粒的混合物，几种自体抗原性肽可以同时诱导更广泛的免疫耐受性。
在人源化HLA转基因小鼠模型中，用人Dsg3免疫导致Dsg3-特异性IgG抗体的形成，其可以识别与来自PV患者血清的IgG自体抗体相同的Dsg3-表位谱。在体外注射入人上皮细胞后，这些抗体诱导与PV相当的病理表现。
通过以预防模式应用该混合物，均偶联至纳米颗粒的具有SEQ ID NO：1-4的4种肽的混合物已被证明在PV的HLA转基因人源化小鼠模型中是有效的，而在混合物中减少至仅3种肽导致耐受性效果显著降低。
已证明如果在用Dsg3免疫前施用，与仅有3种肽的混合物相比，均偶联至纳米颗粒的具有SEQ ID NO：1-4的4种肽的混合物更有效地减少了小鼠中Dsg3-特异性IgG的形成，这表明在诱导对Dsg3的耐受性方面，含有4种Dsg3-肽的混合物优于含有3种Dsg3-肽的混合物。
附图说明
图1：示例性纳米颗粒的示意性结构
图2：油酸铁复合物合成的流程图；注意，在图2(以及在图3-5、7和8)中，图左侧的浅蓝色箭头指示了合成步骤，然而图右侧的深蓝色箭头指示了纯化步骤
图3：替代油酸铁复合物合成的流程图
图4：SPION合成的流程图
图5：LM-PMAOD合成的流程图
图6：LM-PMAcOD合成的流程图
图7：替代LM-PMAcOD合成的流程图
图8：SPION的聚合物涂覆
图9：PMAcOD-SPION颗粒合成的流程图
图10：肽偶联和纳米颗粒合成的流程图
图11：测试3种相对于4种TPC-Dsg3-肽缀合物的治疗效力的结果
图12：研究规程(图12A)和结果(图12B和12C)，其显示在用Dsg3免疫后7天，预防性施用Dsg3-TPC对HLA DRB1*0402转基因小鼠(TG1小鼠)中免疫细胞的激活
发明详述
根据本发明，提供了包含纳米颗粒的药物组合物。所述纳米颗粒每个均包含含有两亲性聚合物的胶束和至少一种肽。所述药物组合物包含含有SEQ ID NO：1-4的肽。因此，所述药物组合物包含含有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的序列的肽。SEQ ID NO：1-4的特征在于下列氨基酸序列：
SEQ-ID 1：LNSKIAFKIVSQEPA，
SEQ-ID 2：TPMFLLSRNTGEVRT，
SEQ-ID 3：NIKVKDVNDNFPMFR，和
SEQ-ID 4：REGIAFRPASKTFTV。
根据本发明申请，术语“纳米颗粒”与“纳米级颗粒”是可互换使用的。这些颗粒具有1至999nm，优选地，2至600nm、5至500nm、10至300nm、30至100nm或40至50nm的直径。
在本发明中，纳米颗粒是通过至少胶束和与所述胶束结合的肽所形成的结构。所述肽可以结合至胶束外部或包封在胶束内部。所述纳米颗粒还可以包含至少部分被胶束涂覆的固体疏水性核，或者不包含固体疏水性核。
本发明所述的药物组合物包含不同类型的纳米颗粒，优选地至少4种不同类型的纳米颗粒。每种类型可以包含至少一种肽序列，其不同于其它类型纳米颗粒的一种或多种肽序列。因此，所述纳米颗粒可以在肽序列方面不同。在优选的实施方式中，每种类型的纳米颗粒仅包含一种单一类型的肽(具有一种具体的氨基酸序列)。因此，每种纳米颗粒可以包含多种具有相同氨基酸序列的肽，并且该组合物可通过混合不同纳米颗粒获得。已产生并测试了包含纳米颗粒混合物的研究性医学产品(IMP)，所述纳米颗粒混合物包含由SEQID NO：1-4组成的肽。
在本发明的一个优选实施方式中，所述药物组合物包含4至6种不同类型的纳米颗粒，其中优选地，不同类型纳米颗粒的所有结合的肽包含至少一种T细胞表位。具体地，每种纳米颗粒可以与来源于桥粒芯蛋白-3的不同抗原性肽结合。
在本发明的一个优选实施方式中，所述药物组合物包含至少4种不同类型的纳米颗粒，其中所述不同类型的纳米颗粒在肽序列方面彼此不同，其中第一类型的纳米颗粒包含由SEQ ID NO：1组成的肽，第二类型的纳米颗粒包含由SEQ ID NO：2组成的肽，第三类型的纳米颗粒包含由SEQ ID NO：3组成的肽，并且第四类型的纳米颗粒包含由SEQ ID NO：4组成的肽。优选地，每种类型的纳米颗粒仅包含具有相同肽序列的肽。
在本发明的特别优选的实施方式中，所述药物组合物包含4种不同类型的纳米颗粒，其中所述不同类型的纳米颗粒可以通过它们的肽序列来区分，其中第一类型的纳米颗粒包含由SEQ ID NO：1组成的肽，第二类型的纳米颗粒包含由SEQ ID NO：2组成的肽，第三类型的纳米颗粒包含由SEQ ID NO：3组成的肽，第四类型的纳米颗粒包含由SEQ ID NO：4组成的肽。优选地，每种类型的纳米颗粒仅包含具有相同肽序列的肽。
在本发明的一个实施方式中，本发明所述的药物组合物包含纳米颗粒，所述纳米颗粒包含固体疏水性核、涂覆所述核的胶束，所述胶束包含数均分子量(Mn)为20,000g/mol或以下的两亲性聚合物，和至少一种肽。这具有另外的优势：可以更容易地产生所述纳米颗粒并达到更高的纯度。本发明人意外地发现低分子量的两亲性聚合物在固体核的涂覆过程中比高分子量的两亲性聚合物产生更少的聚集体。此外，与高分子量的两亲性聚合物相比，可以更有效地纯化低分子量的两亲性聚合物。具体地，当在本发明所述的纳米颗粒中使用低分子量的两亲性聚合物时，可以更有效地分离未结合的聚合物。
在本发明的一个优选实施方式中，所述药物组合物中的纳米颗粒包含
a)胶束，其包含含有以下分子砌块的两亲性聚合物
其中R是烃基或有取代烃基，优选地R是直链烷基，优选地直链C11至C17烷基，并且其中所述聚合物的数均分子量(Mn)为6,000至1,000g/mol，和
b)包含一种SEQ ID NO：1-4所示的序列的至少一种肽，其中所述肽与所述聚合物共价连接，和
c)至少部分被所述胶束涂覆的固体疏水性核，其中所述核包含选自氧化铁、硒化镉/硫化镉/硫化锌(CdSe/CdS/ZnS)、银和金的可示踪无机材料。
在特别优选的实施方式中，所有共价连接至一种纳米颗粒的聚合物的肽b)具有相同的氨基酸序列并且共价结合至包含两亲性聚合物壳的胶束结构a)的外部，所述胶束结构由低分子量聚(马来酸-alt-1-十八碳烯)和超顺磁氧化铁纳米颗粒(SPION)核c)组成(图1中显示了示意结构)。
在相关方面，本发明提供了包含至少4种不同类型的纳米颗粒的药物组合物，其中所述纳米颗粒具有10至300nm的直径，并且其中每个纳米颗粒包含
a)胶束，其包含含有以下分子砌块的两亲性聚合物或由其组成
其中R是烃基或有取代烃基，优选地R是直链烷基，优选地直链C11至C17烷基，并且其中所述聚合物的数均分子量(Mn)为6,000至1,000g/mol，和
b)一种由SEQ ID NO：1-4之一所示的序列组成的肽，其中所述肽与所述聚合物共价连接，和
c)至少部分被所述胶束涂覆的固体疏水性核，其中所述核包含选自氧化铁、硒化镉/硫化镉/硫化锌(CdSe/CdS/ZnS)、银和金的可示踪无机材料。
其中所述4种不同类型的纳米颗粒在肽序列方面彼此不同。
上述药物组合物可以用于治疗寻常天疱疮，具体地用于治疗被诊断患有寻常天疱疮的人。
因此，本发明提供了用于治疗寻常天疱疮的药物组合物，所述组合物包含至少4种不同类型的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒具有10至300nm的直径，并且其中每种纳米颗粒包含
a)胶束，其包含含有以下分子砌块的两亲性聚合物或由其组成
其中R是烃基或有取代烃基，优选地R是直链烷基，优选地直链C11至C17烷基，并且其中所述聚合物的数均分子量(Mn)为6,000至1,000g/mol，和
b)一种由SEQ ID NO：1-4之一所示的序列组成的肽，其中所述肽与所述聚合物共价连接，和
c)至少部分被所述胶束涂覆的固体疏水性核，其中所述核包含选自氧化铁、硒化镉/硫化镉/硫化锌(CdSe/CdS/ZnS)、银和金的可示踪无机材料。
其中所述4种不同类型的纳米颗粒在肽序列方面彼此不同。
纳米颗粒
本发明所述的药物组合物中的纳米颗粒可以另外包含一个部分，例如，将它们靶向至或增强它们对特定细胞，如肝窦内皮细胞和/或库柏法细胞的靶向的碳水化合物或蛋白质。这种部分可以(例如)经由受体介导的胞吞来增强或加速从循环中的吸收。适合的修饰的实例是碳水化合物，如甘露糖。
借助于聚合物形成胶束，所述纳米颗粒可以带负电或不带电；优选地，所述纳米颗粒在pH 6至7(测量期间的pH)带负电。聚合物涂层可以包含酸，例如羧酸基团，从而导致所述纳米颗粒带负电。
在本发明所述的药物组合物中所使用的纳米颗粒可以在pH 6至7(测量期间的pH)具有-20至-60mV之间，优选地-30至-50mV之间，更优选地-35至-45mV之间的ζ电位。可以使用Malvern Zetasizer Nano ZS仪测量ζ电位。
所述纳米颗粒可以具有通过动态光散射(DLS)测量出的10至100nm或10至70nm，优选地10至50nm，更优选地15至40nm，最优选地20至35nm之间的流体力学直径(z均)。
所述纳米颗粒可以具有通过动态光散射(DLS)测量出的小于0.50，优选地0.05至0.45之间，更优选地0.10至0.40之间的多分散指数。
流体力学直径和多分散指数的确定是使用电泳光散射分析法进行的，优选地使用Malvern Zetasizer进行。在一个实施方式中，使用电泳光散射、一次性聚苯乙烯比色皿、Zetasizer软件7.12、Milli-Q水实施用于确定流体力学直径和多分散指数的方法。在0.9％氯化钠水溶液中稀释20nm和100nm的纳米球尺寸标准品(NIST认证或等效)，并在水中稀释测试样品。所有水性试剂在使用前均经过0.22μm膜过滤。在本发明最优选的实施方式中，使用电泳光散射并结合以下分析条件实施用于确定流体力学直径和多分散指数的方法：
分析条件总览：
参数 设置
分散剂名称 水
分散剂RI 1.33
粘度(在25，0℃，cP) 0.8872
材料RI(样品) 2.42
材料RI(标准) 1.333
材料吸收 0.05
温度(℃) 25
测量位置(mm) 4.65
池描述 一次性定量比色皿
衰减器 自动
测量持续时间 自动
数据评价基于平均直径(Z均，nm，按强度)，这一参数在DLS中也称为累积量平均值和多分散指数(PDI)，其被用作尺寸分布的量度。
此外，本发明所述的药物组合物中的纳米颗粒可以具有0.1至5mg/mL，优选地0.5至4mg/mL，更优选地1至3mg/mL的总聚合物含量。通过GPC确定总聚合物含量。为了测量总聚合物含量，将肽水解，并破坏颗粒(例如，使用6M HCl溶液)。加入EDTA后提取聚合物。蒸发溶剂后，将残余物再溶解，并通过GPC确定聚合物含量。
总聚合物含量的确定优选地使用以下试剂和参考标准进行：水(HPLC级)、乙腈(HPLC级)、具有BHT的四氢呋喃(THF-HPLC级)、100％乙酸(分析级)、37％盐酸(分析级)、乙二胺四乙酸二钠盐二水合物(分析级)、乙酸乙酯(分析级)、氢氧化钠(分析级)和作为参比材料的聚(马来酸-alt-1-十八碳烯)。用于确定总聚合物含量的色谱条件为：
柱 Agilent PL-gel Mixed-D，300+75mm ID，5μm
柱温 40℃
流速 1.0mL/min
检测器 差示折光检测器，在35℃
采样率 2.31Hz或等价条件
进样体积 20uL
自动进样器温度 环境温度
运行时间 15min
流动相 THF/乙酸[90/10]％(v/v)
流动相程序 等度
本发明所述的药物组合物中的纳米颗粒包含大量的肽。具体地，所述药物组合物可以具有大于0.1mM，优选地0.2至1mM，更优选地0.3至0.8mM的总肽含量。可以通过在HPLC分析前用HCl水解肽并用邻苯二甲醛衍生所得氨基酸来测量总肽含量。可以通过氨基酸标准溶液的标准添加来分析样品。
在以下部分中更详细地描述了在本发明所述的药物组合物中所使用的纳米颗粒的不同组分。
胶束
在本发明中，术语“胶束”表示在水溶液中分散的两亲性分子的聚集体。两亲性分子的亲水性部分接触周围溶剂，从而隔离了位于胶束内部的两亲性分子的疏水性“尾”区域，因此提供了纳米颗粒在水液体中的溶解样分布行为，即使得纳米颗粒成为水溶性的。这类胶束也称为正相胶束(或水包油胶束)。
胶束可以由1个，但也可以由多于1个，例如，2、3或4个两亲性聚合物分子形成。可以通过相同或者通过不同的两亲性聚合物分子形成胶束。通常，除非具体说明，否则在说明书中，“一个”或“所述”不意欲限制为“一个”。
在优选的实施方式中，通过一层两亲性聚合物形成胶束。
这种胶束可以在结构上不同于通过两亲性聚合物所形成的双层或脂质体。在这种情况下，所述结构不包含或者不以显著的百分比(例如，不超过10％、不超过5％，或者优选地不超过1％)包含在本发明的纳米颗粒中。
在本发明的一个实施方式中，使用所述两亲性聚合物产生至少70％，优选地至少90％的胶束。在优选的实施方式中，所述胶束由所述两亲性聚合物组成。
在本发明的一些实施方式中，所述纳米颗粒不包含固体疏水性核。在其它实施方式中，所述纳米颗粒包含胶束和固体疏水性核。
在本发明的一个实施方式中，可以通过其它组分，如脂肪酸或磷脂酰胆碱共稳定所述胶束。在这方面，优选的脂肪酸是硬脂酸或油酸。优选的磷脂酰胆碱选自Lipoid S100、Lipoid S PC3和DSPC。胆固醇也可用作助稳定剂。
两亲性聚合物
所述两亲性聚合物通常包含疏水性区，其包含长度8至23，优选地8至21，最优选地16至18个碳原子的疏水性脂肪链。所述两亲性聚合物的亲水性区在水溶液中可以带负电荷。
在本发明优选的实施方式中，所述两亲性聚合物在溶液中自发形成胶束。当存在固体疏水性核时，所述两亲性聚合物在固体核周围形成胶束，从而使所述纳米颗粒成为水溶性的。
所述两亲性聚合物的数均分子量(Mn)可以为20,000g/mol或以下，优选地10,000g/mol或以下，或者6,000g/mol或以下，更优选地6,000至1,000g/mol，最优选地3,000至6,000g/mol。
可以使用凝胶渗透色谱(GPC)，优选地使用聚苯乙烯作为校准标准品确定数均分子量。
在优选的实施方式中，在40℃的温度下使用PL-凝胶混合D柱，以四氢呋喃/乙酸90/10％(v/v)组成流动相，使用1.0ml/min的流速，结合在35℃温度下的差示折光检测器并且以聚苯乙烯作为校准标准品确定数均分子量。
在最优选的实施方式中，数均分子量的确定使用GPC以及下列测量条件：
所述两亲性聚合物可以是交替共聚物。交替共聚物是包含以交替顺序分布的两种单体单元的共聚物。
在本发明的一个实施方式中，所述两亲性聚合物是马来酸酐和至少一个烯烃的共聚物。
在两亲性聚合物生产中所使用的烯烃可以选自以下中的一个或多个：1-癸烯、1-十一碳烯、1-十二碳烯、1-十三碳烯、1-十四碳烯、1-十五碳烯、1-十六碳烯、1-十七碳烯、1-十八碳烯、1-十九碳烯或1-二十碳烯，优选地所述烯烃为1-十八碳烯。
在本发明的一个优选实施方式中，所述两亲性聚合物是马来酸酐和烯烃的共聚物。
在本发明的一个优选实施方式中，所述两亲性聚合物具有主亲水性聚马来酸酐主链，所述聚马来酸酐主链具有疏水性烷基侧链。通常，所述侧链可以具有5至23个碳原子，具体地9至21个原子。在最优选的实施方式中，所述侧链是直链并且具有10至18个碳原子。
所述两亲性聚合物可以包含以下分子砌块
其中R是烃基或有取代烃基。在本发明优选的实施方式中，R是C4至C22烷基，如C7至C19烷基。
在甚至更优选的实施方式中，R是直链烷基，优选地直链C7至C17烷基，最优选地R是直链十五烷基或直链壬基。
两亲性聚合物可以由以上定义的分子砌块组成。
在根据本发明的其它实施方式中，所述两亲性聚合物包含至少50％，优选地至少70％，最优选地大于90％的以上定义的分子砌块。
在优选的实施方式中，所述两亲性聚合物选自聚(马来酸-1-十八碳烯)、聚(马来酸-1-十四碳烯)或聚(马来酸-1-十二碳烯)，优选地所述聚合物是聚(马来酸-1-十八碳烯)并且所述聚合物的数均分子量为6,000至1,000g/mol。
在特别优选的实施方式中，所述两亲性聚合物选自聚(马来酸-alt-1-十八碳烯)、聚(马来酸-alt-1-十二碳烯)和聚(马来酸-alt-1-十四碳烯)，优选地所述聚合物是聚(马来酸-alt-1-十八碳烯)并且所述聚合物的数均分子量为5000至1000g/mol。
肽
本发明所述的药物组合物包含含有SEQ ID NO：1-4的肽，其形成纳米颗粒的一部分。
SEQ-ID 1：H2N-LNSKIAFKIVSQEPA-COOH，
SEQ-ID 2：H2N-TPMFLLSRNTGEVRT-COOH，
SEQ-ID 3：H2N-NIKVKDVNDNFPMFR-COOH，和
SEQ-ID 4：H2N-REGIAFRPASKTFTV-COOH。
在优选的实施方式中，至少一种所述肽由SEQ ID NO：1-4所示的序列之一组成。在另一个实施方式中，至少一种肽包含不超过2个，优选地不超过1个另外的氨基酸(除SEQ IDNO：1-4所示的序列之外)。
优选地，本发明所述的药物组合物仅包含具有序列SEQ ID NO：1-4的肽。这意味着，在该实施方式中，只有这些肽可以存在，但这并不排除所述组合物中其它组分的存在。
可以合成、重组表达或从天然来源分离或修饰肽。
肽可以与胶束的外部结合或包封在胶束的内部(在其中所述纳米颗粒中不存在固体疏水性核的实施方式中)。因此，所述肽可以定位在所述胶束的外部或所述胶束的内部。
所述肽可以与所述胶束共价连接或非共价结合，优选地与所述胶束共价连接。
在优选的实施方式中，使用本领域中已知的共价偶联肽的方法，如碳二亚胺或琥珀酰亚胺偶联，将所述肽共价连接至所述胶束。优选地，使用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)化学将所述肽共价连接至所述胶束。
固体疏水性核
在本发明的一个实施方式中，所述纳米颗粒包含至少部分被所述胶束涂覆的固体疏水性核。所述核可以是无机核，优选地包含氧化铁、硒化镉(CdSe)、银或金。
所述核的直径可以是2至500nm，优选地，3至25nm，更优选地，5至15nm。可以使用透射电子显微镜术(TEM)或小角度X射线散射(SAXS)确定所述核的直径。
示例性的无机核是通过油酸或另一种羧酸(C14-C22，优选地，C16-C18)稳定的氧化铁纳米颗粒、量子点(例如，通过三辛基膦氧化物(trioctyloxinphosphinoxide)稳定的硒化镉/硫化镉/硫化锌(CdSe/CdS/ZnS))、例如通过磺酸化合物稳定的金纳米颗粒。
这些无机核本身通常在水溶剂，如水中不稳定，但将它们包埋在聚合物胶束中会使其具有水溶性。所述两亲性聚合物的疏水性部分与所述纳米颗粒的疏水性核相互作用，从而导致形成围绕所述核的聚合物的单一涂覆层。在涂覆过程中，所述两亲性聚合物可以通过配基交换来替换所述核的疏水性部分，并因此在所述核周围形成双层胶束。在本发明的一个实施方式中，所述聚合物至少部分替换了所述核颗粒表面上的油酸，并且所述聚合物的亲水性部分与氧化铁核的表面相互作用，并且所述聚合物的疏水性部分彼此相互作用，从而在氧化铁核周围形成双层胶束，进而产生涂覆有聚合物的氧化铁。
根据本发明的优选实施方式，所述核是超顺磁的。
在本发明的一个特别优选的实施方式中，所述核是超顺磁氧化铁纳米颗粒(SPION)，其可以通过油酸稳定。
所述核优选地使本发明所述的纳米颗粒可示踪，例如，通过它们在荧光、电子显微镜或其它检测方法中的特征。
纳米颗粒的生产
可以通过包括以下步骤的方法生产本发明所述的药物组合物中存在的纳米颗粒：
a)获得疏水性核纳米颗粒，
b)获得两亲性聚合物，优选地使用自由基共聚合，
c)任选地纯化所述两亲性聚合物，
d)将所述疏水性核纳米颗粒和所述两亲性聚合物混合以形成胶束，
e)添加至少一种肽以形成纳米颗粒。
如果所述肽被所述胶束包封，则在步骤d)之前进行步骤e)。这种情况下，在胶束形成之前将所述肽加入至所述两亲性聚合物。
可以在溶液中使用适当的反应物合成步骤a)的疏水性核。优选地，在存在有机溶剂的情况下，使用金属盐和羧酸盐作为反应物合成疏水性核。优选地，在高温下，在氧气限制下实施反应。
可以使用自由基引发剂通过自由基共聚合制备在本发明的纳米颗粒中所使用的两亲性聚合物。
获得数均分子量(Mn)为20,000g/mol或以下的两亲性聚合物的一种方法是使用二步法合成所述两亲性聚合物，所述方法包括产生酸酐聚合物的步骤和水解所述酸酐以获得酸的步骤。可以通过改变反应物浓度或自由基引发剂的量控制聚合物的分子量。可以通过凝胶渗透色谱分析聚合物的分子量。可以在有机溶剂，如1，4二恶烷、二甲苯或氯苯中实施共聚合。
多种自由基引发剂在本领域中是已知的；它们包括多种过氧化物和偶氮类型化合物。适合的过氧化物的实例为过氧化苯甲酰、月桂基过氧化物、二叔丁基过氧化物、2，4-二氯苄基过氧化物、叔丁基氢过氧化物、氢过氧化枯烯、二乙酰过氧化物、过氧碳酸二乙酯、叔丁基过苯甲酸酯和过硼酸酯。适合的偶氮类型化合物包括2，2′-偶氮二(2-甲基丙腈)、p-溴重氮苯氟硼酸盐、p-甲苯基重氮胺基苯、p-溴重氮苯氢氧化物、偶氮甲烷和苯基-重氮卤化物。优选地，自由基引发剂为2，2′-偶氮二(2-甲基丙腈)。
可以在高温，如70至120℃，优选地90至110℃下实施共聚合。优选地，通过将混合物加热至70至120℃，优选地90至110℃启动共聚合。
步骤b)可以包括将反应物混合、将混合物除氧、加热混合物，然后冷却混合物的步骤。然后，可以将聚合物溶解并搅拌过夜。可以回收，优选地使用离心回收所形成的固体。
步骤b)可以包括向聚合物添加碱(例如，NaOH)。优选地，碱在高温下，优选地50℃至70℃之间，如60℃，与聚合物反应直至几乎所有固体溶解。可以使所得混悬液酸化(例如，pH＜2)。然后，可以用有机溶剂，如乙酸乙酯萃取反应混合物。可以用氢氧化钠溶液萃取有机层。可以用有机溶剂，如乙酸乙酯再次萃取水溶液，然后干燥以获得纯化的两亲性聚合物。
可以进一步纯化所述聚合物(步骤c)。优选地，通过用正己烷或正庚烷萃取聚合物来进一步纯化聚合物。可以以大于10g/L，优选地100g/l的浓度进行萃取。此外，可以添加两亲性聚合物的额外纯化步骤。在该额外纯化步骤中，将聚合反应的粗反应产物溶解并沉淀。在优选的实施方式中，所述溶剂是二氯甲烷并且使用甲醇/庚烷或者乙腈/异丙醇的混合物沉淀聚合物。所使用的混合物可以含有(例如)95/5％(v/v％)甲醇/庚烷、10/90(v/v％)乙腈/异丙醇或者5/95(v/v％)乙腈/异丙醇。在优选的实施方式中，在-10至10℃，优选地-5至5℃的温度添加沉淀混合物。
在水解并检查后，可以通过1H NMR测量两亲性聚合物的纯度。
可以通过形成含有两亲性聚合物的溶液形成胶束(步骤d)。优选地，在水溶液中形成胶束。可以将助稳定剂添加至两亲性聚合物以改善胶束形成。优选地，步骤d)包括如下子步骤：溶解两亲性聚合物和核颗粒，除去溶剂直至形成薄膜，在升高的温度和环境压力下添加碱性水溶液以形成水性胶体分散体，稀释溶液并任选地过滤。然后，可以采用一些清洗步骤。
可以使用现有技术固相化学合成要在步骤e)中使用的肽。
可以使用固相肽合成(SPPS)，经由Fmoc化学，从C端至N端方向完成肽的合成。用芴-9-基甲氧基羰基(Fmoc)保护每个氨基酸的α氨基，还用多种适合的保护基封闭侧链官能团。通常，SPPS由N末端脱保护，然后偶联反应的重复循环组成。将第一个Fmoc-保护的氨基酸偶联至树脂。然后，用哌啶在二甲基甲酰胺(DMF)中的混合物使胺基脱保护，然后与第二个Fmoc-保护的氨基酸的游离酸偶联。重复循环直至获得所期望的序列。在每个步骤之间清洗树脂。通过定性茚三酮测试监测每个偶联反应的完成。在最后一个合成步骤中，依次用DMF和甲醇清洗粗肽-树脂并干燥。然后，从肽除去保护基并使用三氟乙酸(TFA)从树脂上切割肽。通过乙醚沉淀将所获得的粗肽与切割混合物分离。此外，通过制备型HPLC纯化肽以达到纯度要求，并且通过使用适当的溶剂-缓冲系统用氯化物代替反离子TFA。最终，将纯化的肽冻干。
可以使用彻底清洗和过滤步骤纯化所得纳米颗粒以除去偶联剂和任何低分子量组分。
组合物
本发明所述的药物组合物可以包含液体或冻干载体。很明显，具体地对于向人受试者的施用，所述组合物优选地为无菌的并且是生物学相容的。
在优选的实施方式中，所述药物组合物包含处于液体载体中的纳米颗粒。所述液体载体优选地为水或为水基的，例如，水性缓冲液，如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、林格氏溶液、TRIS缓冲液或氯化钠溶液。液体载体可以含有或不含有适合的防腐剂。
在优选的实施方式中，本发明所述的药物组合物包含分散在水性缓冲液中的纳米颗粒，其中所述缓冲液优选地包含至少一种糖、至少一种伯胺和/或至少一种氨基酸。在特别优选的实施方式中，所述组合物包含分散在D-甘露醇、三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)和/或L-乳酸的水溶液中的纳米颗粒。使用该缓冲液的优势在于所述颗粒在该缓冲液中非常稳定并且可以随后冻干。
本发明所述的药物组合物可以包含至少4种不同类型的纳米颗粒。优选地，每种类型包含至少一种肽序列，所述肽序列不同于其它类型纳米颗粒的一种或多种肽序列。所述药物组合物可以包含浓度低于100μM，优选地0.5至80μM，最优选地1至50μM的每种类型的纳米颗粒。本发明所述的药物组合物可以以等摩尔浓度包含不同类型的纳米颗粒。
在本发明的一个优选实施方式中，本发明所述的药物组合物包含等摩尔浓度的4种不同类型的纳米颗粒，其优选地分散在水性缓冲液中。
在本发明的一个优选实施方式中，本发明所述的药物组合物包含纳米颗粒，所述纳米颗粒包含
a)胶束，其包含含有以下分子砌块的两亲性聚合物
其中R是烃基或有取代烃基，优选地R是直链烷基，优选地直链C11至C17烷基，并且其中所述聚合物的数均分子量(Mn)为6,000至1,000g/mol，和
b)包含SEQ ID NO：1-4之一所示的序列的至少一种肽；和
c)至少部分被所述胶束涂覆的固体疏水性核，其中所述核包含选自氧化铁、硒化镉/硫化镉/硫化锌(CdSe/CdS/ZnS)、银和金的可示踪无机材料。
在优选的实施方式中，所述药物组合物包含4种不同类型的纳米颗粒，其中每种纳米颗粒包含
a)胶束，其包含含有以下分子砌块的两亲性聚合物
其中R是烃基或有取代烃基，优选地R是直链烷基，优选地直链C11至C17烷基，并且其中所述聚合物的数均分子量(Mn)为6,000至1,000g/mol，和
b)选自SEQ ID NO：1-4所示的序列的一种肽；和
c)至少被所述胶束部分涂覆的固体疏水性核，其中所述核包含可示踪无机材料，其选自氧化铁、硒化镉/硫化镉/硫化锌(CdSe/CdS/ZnS)、银和金；和
其中4种不同类型的纳米颗粒在肽序列方面彼此不同，其中第一类型的纳米颗粒包含具有SEQ ID NO：1的肽，第二类型的纳米颗粒包含具有SEQ ID NO：2的肽，第三类型的纳米颗粒包含具有SEQ ID NO：3的肽，并且第四类型的纳米颗粒包含具有SEQ ID NO：4的肽。
在特别优选的实施方式中，所述药物组合物包含4种不同类型的纳米颗粒，其中每种纳米颗粒由以下组成
a)胶束，其包含含有以下分子砌块的两亲性聚合物
其中R是烃基或有取代烃基，优选地R是直链烷基，优选地直链C11至C17烷基，并且其中所述聚合物的数均分子量(Mn)为6,000至1,000g/mol，和
b)具有相同氨基酸序列的多种肽，所述序列选自SEQ ID NO：1-4；和
c)固体氧化铁核。
组合物的用途
本发明所述的药物组合物可以用于治疗寻常天疱疮。根据本发明，术语“治疗”用于表示受试者中特定疾病症状的减轻，和/或与特定病症有关的可确定的测量的改善。本发明提供了用于诱导对寻常天疱疮自体抗原的免疫耐受性的组合物。
可以向对其有需要的受试者施用所述药物组合物。
可以由负责的医务护理人员根据病例的事实和情况确定对于向受试者施用所要求的剂量和浓度。例如，对于人受试者，示例性剂量可以包括0.03μmol至0.90μmol每患者体重。
可以重复进行施用，例如，两次、三次或四次，例如，施用之间间隔1、2、3、4、5、6、7、10或14天。还可以在延长的时间段内重复施用，包括一年一次、两次、三次或四次。
实施例
通过以下实施例说明本发明，其详细描述了根据本发明的纳米颗粒的合成。
这些实施例不应被认为是对本发明范围的限制，而是对本发明的说明。
实施例1：超顺磁氧化铁晶核(SPION)的制备
a)SPION核的制备
在图2中示意性显示了用于合成油酸铁复合物的方法；在图3中显示了替代方法。在图4中示意性显示了SPIONS的合成。
通过在70℃的正庚烷回流条件下混合乙醇中的油酸、NaOH水溶液和FeCl3·6H2O水溶液制备油酸铁复合物。反应后，通过在反应器中的几个萃取清洗步骤纯化产物。用无水硫酸钠干燥有机相，然后最终在旋转蒸发器中浓缩。在图3所示的替代方法中，还要在真空条件下将油酸铁复合物在80℃下进一步加热24小时，并将最终产物储存在5±3℃。
在图4中所示的第二步中，将油酸铁复合物与油酸一起在室温下溶于1-十八碳烯中并搅拌直至完全溶解。将溶液脱氧，在110℃脱水，然后在300℃加热用于形成氧化铁纳米晶体。产物冷却后，使用磁力分离，通过用丙酮和四氢呋喃的几个清洗步骤进行纯化。然后，将纯化的SPION在氯仿中稀释，在旋转蒸发器中浓缩并最终在氯仿中稀释以供在以下所描述的其它生产步骤中使用。
b)低分子量聚(马来酸-alt-1-十八碳烯)(LM-PMAcOD)的制备
在图5-8中示意性显示的两步法中进行低分子量聚(马来酸-alt-1-十八碳烯)(LM-PMAcOD)的合成。
在第一步(图5)中，1十八碳烯和马来酸酐在1，4二恶烷中的2，2′-偶氮二(2甲基丙腈)(AIBN)的引发下进行起始的1十八碳烯和马来酸酐的共聚合。通过与二氯甲烷共蒸发并用异丙醇和乙腈沉淀纯化产物，从而提供了数均分子量(Mn)为2500-4000g/mol的低分子量聚(马来酸酐-alt-1十八碳烯)或LM-PMAOD。
在第二步(图6)中，在氢氧化钠溶液中将LM-PMAOD水解为聚(马来酸-alt-1十八碳烯)(LM-PMAcOD)。使用H2SO4、乙酸乙酯和NaOH进行两个酸-碱萃取步骤以用于纯化产物并除去杂质，如残留的1十八碳烯。用硫酸镁干燥产物，与氯仿共蒸发并最终通过在庚烷中固-液萃取进行纯化。
图7中显示了替代方法，其包括上述水解步骤以及使用H2SO4和乙酸乙酯的单一酸-碱萃取步骤以用于纯化产物。替代方法的其它步骤与图6中所示的相同。
c)SPION的聚合物涂覆
图8中示意性显示了SPIONS的聚合物涂覆。图9中显示了PMAcOD-SPION颗粒合成的流程图。
通过在SPION核周围布置两亲性聚合物PMAcOD形成胶束结构。通过配基交换，SPION表面上存在的大部分油酸盐分子被PMAcOD单元替换，其中疏水性聚合物侧链形成构成带负电荷的胶束结构。胶束表面上的带电羧酸盐基团起到了肽锚点的作用。
对于涂覆程序，将聚合物和SPION溶于氯仿。经由旋转蒸发除去溶剂直至形成薄膜。添加氢氧化钠溶液，并在升高的温度和环境压力下旋转烧瓶直至形成透明深棕色水性胶体分散体。在氢氧化钠溶液中稀释分散体并通过0.2μm-过滤器过滤。然后，使用切向流过滤(TFF)实施用水和NaOH/NaCl的水溶液的几个清洗步骤以分离低分子量组分，随后通过0.1μm-过滤器过滤以除去较大颗粒和聚集体以及进行PMAcOD-SPION分散体的灭菌。将最终的纳米颗粒分散在水中(图9)。
d)肽和肽偶联
图10中示意性显示了肽偶联和纳米颗粒合成。
使用固相肽合成(SPPS)，经由Fmoc化学，从C端至N端方向完成肽的合成。用芴-9-基甲氧基羰基(Fmoc)保护每个氨基酸的α氨基，还用多种适合的保护基封闭侧链官能团。
通过制备型HPLC纯化肽以达到纯度要求，并且通过使用适当的溶剂-缓冲系统用氯化物代替反离子TFA。最终，将纯化的肽冻干。
通过LC-MS进行游离肽(起始材料)的鉴定。通过多模式电喷雾大气压化学离子化质谱测量肽的分子量。
*单一同位素质量，理论值，以Da为单位
在硼酸/四硼酸钠十水合物(SBB)缓冲液中，使用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)化学，将肽偶联至聚合物表面。然后，过滤所得TPC(Topas颗粒缀合物)制剂并通过TFF纯化进行纯化。将最终的纳米颗粒分散在水中，通过0.2μm过滤器过滤，并收集到无菌容器中。
实施例2：包含3个肽缀合物的组合物相对于包含4个肽缀合物的组合物的治疗效力
在该实验中，比较了包含不同纳米颗粒的不同组合物的治疗效力。简要地，将包含3种不同肽的组合物与包含含有4种不同肽的纳米颗粒的组合物进行比较。图11显示了结果。
下列所测试的不同混合物为：
混合物1：以3种不同浓度(3、2.1、1.05μmol/kg)测试的三种不同纳米颗粒的等摩尔混合物，每种纳米颗粒偶联至具有SEQ ID NO：1、2和4的肽之一。
混合物2：4种不同纳米颗粒的非等摩尔混合物，每种纳米颗粒偶联至具有SEQ IDNO：1-4的肽之一。(3.05μmol/kg)
混合物3：4种不同纳米颗粒的等摩尔混合物，每种纳米颗粒偶联至具有SEQ IDNO：1-4的肽之一。(3.05μmol/kg)
混合物4：在3种不同的纳米颗粒中测试的三种TPC-Dsg3-肽的非等摩尔混合物，每种纳米颗粒偶联至具有SEQ ID NO：1、2和4的肽之一(2.62μmol/kg)
对照：PBS缓冲液
在甘露醇-Tris-乳酸缓冲液(5％甘露醇+5mM Tris+6mM L-乳酸)中制备研究PoC5和6中所使用的不同混合物。仅在PoC5中，在100mM NaCl溶液中配制混合物2。
为了诱导抗Dsg3抗体，如其它处所述(Eming等人，J Immunol.193，4391-9(2014))，通过在第0天腹膜内注射明矾中的重组Dsg3蛋白使8-12周大的雌性和雄性HLA-DRB1*04：02-转基因小鼠免疫，随后在第14天进行第二次免疫。这种Dsg3-免疫规程从第21天开始诱导了抗体滴度的可检测增加，在第28天具有稳健的IgG滴度。
在用Dsg3进行的两次免疫中的每一次的前一天，将纳米颗粒的不同混合物以及相关对照注射至HLA-转基因小鼠的尾静脉中，借此产生类似于预防方法的情况。
免疫后28天完成实验。如在Eming等人，J Immunol.193，4391-9(2014)中所述，抗-Dsg3抗体的产生，作为TPC治疗效力的主要读数，在实验过程中通过抗-Dsg3 ELISA监测。
为此目的，在免疫前的基线(如第-2天)和在免疫后第12、21和28天采集血清样品。在进行D′Agostino&Pearson正态检验后，使用曼-惠特尼检验对Dsg3-IgG ELISA值进行统计分析。将数据显示为平均值和SEM。
那些仅接受缓冲液(媒介物)的免疫小鼠在28天后产生高水平的抗Dsg3 IgG，并将其用作对照。
如图10中的左图所示，与混合物2显著降低抗Dsg3-IgG滴度相反，在所测试的任何三个浓度，未观察到混合物1产生效果。
另外，如图10中的右图所示，仅在对其施用4种TPC-Dsg3-肽混合物(混合物2和混合物3)的那些动物组中观察到了治疗效果，其中非等摩尔混合物2具有显著效果，等摩尔混合物3具有明显趋势。与这种效果相反，3种TPC-Dsg3-肽的非等摩尔混合物(混合物4)未显示出抗Dsg3-IgG滴度的明显降低。
实施例3：在小鼠中诱导调节性T细胞
在免疫后第7天，分析预防性施用Dsg3-TPC对HLA DRB1*0402转基因小鼠(TG1小鼠)的脾脏、淋巴结和肝脏中的免疫细胞的组成和激活的影响。
材料和方法
TPC(Topas颗粒缀合物)
如以上所描述的，产生了纳米颗粒的以下三种制剂：
12A.1：处于0.5μmol/kg的浓度的4种不同的纳米颗粒的等摩尔混合物，每种纳米颗粒偶联至具有SEQ ID NO：1-4之一的一种肽。
12A.2：处于2μmol/kg的浓度的4种不同的纳米颗粒的等摩尔混合物，每种纳米颗粒偶联至具有SEQ ID NO：1-4之一的肽中的一种。
12A.3：空对照颗粒，其铁含量调节至相当于12A.1和12A.2的平均铁含量。
加载TPC以导致每20g小鼠应用2.5nmol每种肽(10nmol总肽剂量)或每20g小鼠应用10nmol每种肽(40nmol总肽剂量)。将TPC分散在配制缓冲液(5％甘露醇+5mM Tris+6mML-乳酸，pH 7.4)中。
产生TPC样品并在4℃(2-8℃)下储存在标准冰箱中直至使用。
在使用前(注射到小鼠中)，用指尖轻轻振荡含有TPC的试管(不涡旋)。
小鼠
使用三组7-10周大的雄性和雌性DRB1*04：02tg小鼠(TG1小鼠)：
A：对照组(n＝2)：PBS
B：处理组1(n＝6)：12A.1-TPM203，10nmol
C：处理组2(n＝6)：12B.1-TPM203，40nmol
D：处理组3(n＝6)：12C.1-空TP
处理规程
第-1天：抽血和血清采集
第-1天：对组A、B和C中的小鼠，按每20g体重120μl的量静脉注射相应TPC混悬液；处理与以上实施例2中相同。
第0天：根据标准规程，通过腹腔注射Dsg3蛋白/明矾使来自组B、C和D的所有小鼠致敏。组A是仅腹腔注射PBS的假致敏组(背景对照)。
第7天：动物准备和生物材料采集。
图12A中也显示了规程。
通过流式细胞术分析所收集的样品。简要地，从脾脏产生单细胞悬液，进行红细胞溶胞，并使用以下试剂对1百万个细胞进行染色：
·使用PacO-NHS，P30253，排除死细胞；
·CD3-PE-Cy7(克隆17A2)，
·CD4-PE-Dazzle(克隆：GK1.5)，
·Foxp3-FITC(克隆：FJK-16s)。
使用eBioscience Foxp3试剂盒进行Foxp3的染色。
使用BD Fortessa流式细胞仪进行分析，并应用以下设门策略：除去双联体(FSC-Avs.FSC-H)--＞对淋巴细胞设门(FSC-A vs.SSC-A)--＞对CD3+CD4+设门--＞对Foxp3+CD4+设门。
因此，基于它们在流式细胞术中的Foxp3表达来定义调节性T细胞或Treg。
在图12B和12C中显示了结果，并且结果表明在使用Dsg3免疫HLA DRB1*0402转基因小鼠之前一天单次注射TPM203诱导了脾脏中Foxp3+调节性T细胞的稳健升高(左图；右侧为代表性图像)。在免疫后第7天进行分析。经由克鲁斯凯-沃利斯检验计算P值；*p＜0.05；***p＜0.001。对照反映了用PBS假免疫的未处理的小鼠。
通常，Treg是熟知的免疫耐受性的原因(Sakaguchi等人，Cell.2008 May 30；133(5)：775-87.doi：0.1016/j.cell.2008.05.009)。在寻常天疱疮患者中，已知Treg以比健康对照低的浓度存在(Sugiyama等人，Dermatology，2007；214(3)：210-20.doi：10.1159/000099585)。因此，图12B和12C中所示的Treg浓度的升高指示了用TPC治疗所引起的有益调节作用。

Claims (16)

1.药物组合物，其包含纳米颗粒，其中所述纳米颗粒每个均包含
a)包含两亲性聚合物的胶束，和
b)至少一种肽，
其中所述药物组合物包含含有SEQ ID NO：1-4的肽。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述纳米颗粒还包含至少部分被所述胶束涂覆的固体疏水性核，其中所述核包含选自氧化铁、硒化镉/硫化镉/硫化锌(CdSe/CdS/ZnS)、银和金的可示踪无机材料。
3.根据以上权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述至少一种肽与所述胶束的外部结合。
4.根据以上权利要求中任一项所述的药物组合物，其中每种肽由序列SEQ 1-4之一组成。
5.根据以上权利要求中任一项所述的药物组合物，其包含至少4种不同类型的纳米颗粒，其中所述不同类型的纳米颗粒在肽序列方面彼此不同，并且其中第一类型的纳米颗粒包含具有SEQ ID NO：1的肽，第二类型的纳米颗粒包含具有SEQ ID NO：2的肽，第三类型的纳米颗粒包含具有SEQ ID NO：3的肽，并且第四类型的纳米颗粒包含具有SEQ ID NO：4的肽。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其中每种类型的纳米颗粒以等摩尔的量存在。
7.根据以上权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物仅包含具有序列SEQ ID NO：1-4的肽。
8.根据以上权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述两亲性聚合物的数均分子量(Mn)为20,000g/mol或以下，优选地10,000g/mol或以下，最优选地6,000至1,000g/mol。
9.根据以上权利要求所述的药物组合物，其中所述两亲性聚合物包含下列分子砌块
其中R是烃基或有取代烃基，优选地R是C4至C22烷基，优选地C8至C20烷基。
10.根据以上权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述两亲性聚合物选自聚(马来酸-alt-1-十八碳烯)、聚(马来酸-alt-1-十二碳烯)和聚(马来酸-alt-1-十四碳烯)，优选地，所述聚合物是聚(马来酸-alt-1-十八碳烯)并且所述聚合物的数均分子量为6,000至1,000g/mol。
11.根据以上权利要求中任一项所述的药物组合物，其中每种肽与所述胶束共价连接或非共价结合。
12.根据以上权利要求中任一项所述的药物组合物，还包含水性缓冲液，其中所述水性缓冲液优选地包含至少一种糖、至少一种伯胺和至少一种氨基酸。
13.根据权利要求12所述的药物组合物，其中所述缓冲液含有D-甘露醇、三(羟甲基)氨基甲烷和L-乳酸。
14.根据以上权利要求中任一项所述的药物组合物，其中每种纳米颗粒包含氧化铁核和包含数均分子量为6,000至1,000g/mol的聚(马来酸-alt-1-十八碳烯)的胶束。
15.根据以上权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物向患者的施用提高了所述患者中Foxp3+调节性T细胞的数目。
16.用于治疗寻常天疱疮的根据以上权利要求中任一项所述的药物组合物。
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