CN118201499A - 改善精子表现的口服组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明改善了哺乳类动物，特别是男性不孕症患者的精子表现。该口服摄取用组合物包含有麦角硫因作为有效成分，可给需要改善精子表现的对象口服。

Description

改善精子表现的口服组合物
【技术领域】
本发明，包含麦角硫因作为有效成分，涉及一种可用于改善精子表现的口服摄取用组合物。
【背景技术】
占男性不孕症90％的少精症和精子无力症，大多没有特定原因具有特发性。对于特发性的少精症和精子无力症的治疗方法，以非特异性药物疗法为主。一般使用的药剂，大多着眼于精子的能量代谢、DNA合成和抗氧化作用等方面，虽然使用了维生素制剂和激肽释放酶制剂、各种酶制剂和微量元素制剂、中药等非分泌疗法，以及使用了氯米芬和促性腺激素制剂等内分泌疗法，但是对于特发性病例大规模的随机对照对象试验(RCT)的报告还是很少，现在，对于特发性男性不孕症治疗效果的依据几乎不为人所知。
麦角硫因，包含在北风菌等的菇类中，是作为抗氧化物质在化妆品中等被使用的氨基酸的一种。专利文献1中指出，每1克干燥重量的北风菌中，麦角硫因的含量为15.8±0.06mg。非专利文献1中显示，麦角硫因，作为食物被人类及动物摄取时，由于代谢需要时间，所以容易积存在人类及动物的许多组织及体液中。在In Vitro研究中已确认，麦角硫因，具有抗氧化作用及细胞保护作用，在人类及动物的体内，对参与组织损伤的修复等具有启发性作用。对于人类来说，麦角硫因，根据其抗氧化作用和细胞保护作用，对神经变形疾病、眼部疾病、循环系统疾病、肾脏疾病、糖尿病等具有治疗效果，作为一种高安全性的食物来源成分而被人类所期待。非专利文献1中指出，动物的精液中所含的麦角硫因含量，是血液中浓度的6倍以上。另外，非专利文献2中指出，将冷冻融化的羊精子与麦角硫因接触，可以提高精子的运动率、前进率、运动速度(VAP)。然而，关于口服摄取麦角硫因对于精液及精子的临床效果，目前为止还没有被报告过。
另一方面，有文献指出，将老鼠的精子和与能量代谢相关的肌酸接触，可以提高精子的运动率(非专利文献3)。
【现有技术文献】
【专利文献】
【专利文献1】特开2012-105618
【非专利文献】
【非专利文献1】Halliwell B.et al.,FEBS letters,vol.592,pp.3357-3366(2018)
【非专利文献2】Coyan Y.et al.,Cryobiology,Vol.63,pp.1-6(2003)
【非专利文献3】Umehara T.et al.,Hum.Reprod.,Vol.33,No.6,pp.1117-29(2018)
【发明概要】
【发明要解决的课题】
本发明的目的是提供一种用于改善精子表现的口服摄取用组合物。
【解决课题的方法】
本发明的发明者们，经过反复锐意研究，发现在哺乳类动物中，通过口服摄取麦角硫因可以改善其精子表现，最终完成了本发明。即，本发明提供以下内容。
(1)用于改善哺乳类动物的精子表现的口服摄取用组合物，包含麦角硫因作为有效成分。
(2)根据(1)所述的组合物，上述哺乳类动物为人类。
(3)根据(2)所述的组合物，上述人类，为男性不孕症患者。
(4)根据(3)所述的组合物，上述男性不孕症，为特发性的少精症及/或精子无力症。
(5)根据(3)或(4)所述的组合物，上述男性不孕症，精液中的精子具有浓度低下、精子运动率低下、及/或精子前进率低下的症状。
(6)根据权利要求(1)-(5)中任一项所述的组合物，调配以10～5000μg/kg体重/日的量摄取麦角硫因。
(7)根据(1)-(6)中任一项所述的组合物，进一步包含作为有效成分的肌酸。
(8)根据(7)所述的组合物，调配以50～300mg/kg体重/日的量摄取肌酸。
(9)根据(7)或(8)所述的组合物，所述麦角硫因和肌酸，每日摄取量的重量比被调配为1:3000～1:100。
(10)根据(1)-(9)中任一项所述的组合物，为食品。
(11)根据(1)-(9)中任一项所述的组合物，为药品。
(12)一种用于改善哺乳类动物的精子表现的口服摄取用组合物的制造方法，包含调配麦角硫因的工序。
(13)根据(12)所述的方法，进一步包含调配肌酸的工序。
(14)改善哺乳类动物的精子表现方法，包含向需要改善精子表现的对象口服给予麦角硫因的工序、方法。
(15)根据(14)所述的方法，所述对象为人类。
(16)根据(15)所述的方法，所述人类为男性不孕症患者。
(17)根据(16)所述的方法，所述男性不孕症，为特发性的少精症和/或精子无力症。
(18)前記男性不妊症が、精液中の精子濃度の低下、精子運動率の低下、及び/又は精子前進率の低下の症状を有する、(16)又は(17)に記載の方法。
(18)如(16)或(17)所述的方法，其中所述男性不孕症包括精液中的精子浓度降低、精子运动率降低和/或精子前进率降低的症状。
(18)根据权利要求(16)或(17)所述的方法，上述男性不孕症，精液中的精子具有浓度低下，精子运动率低下，及/或精子前进率低下的症状。
(19)根据(16)-(18)中任一项所述的方法，以10～5000μg/kg体重/日的剂量口服麦角硫因。
(20)根据(14)-(19)中任一项所述的方法，还可以给上述对象口服给予肌酸。
(21)根据(20)所述的方法，以50～300mg/kg体重/日的剂量口服肌酸。
(22)根据(20)或(21)所述的方法，口服麦角硫因和肌酸，使其每日给予量的重量比以1:3000～1:100。
(23)使用麦角硫因制造用于改善哺乳类动物精子表现的口服摄取用组合物。
(24)根据(23)所述的使用，所述哺乳类动物为人类。
(25)根据(24)所述的使用，所述人类为男性不孕症患者。
(26)根据(25)所述的使用，所述男性不孕症为特发性的少精症及/或精子无力症。
(27)根据(25)或(26)所述的使用，所述男性不孕症表现为，精液中的精子具有浓度低下、精子运动率低下、及/或精子前进率低下的症状。
(28)根据(23)-(27)中任一项所述的使用，以10～5000μg/kg体重/日的量，将麦角硫因配置到所述口服摄取用组合物中作为1天的用量被口服摄取。
(29)根据(23)-(28)中任一项所述的使用，所述口服摄取用组合物为食品。
(30)根据(23)-(28)中任一项所述的使用，所述口服摄取用组合物为药品。
(31)包含麦角硫因的精子用培养基。
(32)根据(31)所述的精子用培养基，进一步包含肌酸。
本说明书包含以日本国专利申请号2021-106397号公开的内容作为本申请优先权的基础。
【发明的效果】
根据本发明，可以提供一种用于改善精子表现的口服摄取用组合物。
【附图的简单说明】
【图1】是将猪精子悬置在含有各浓度麦角硫因的精子保存液的精子悬浮液中，精子直线速度(VSL)的图表。对5个猪的精子进行了测定(n＝5)。图中的黑色条表示标准误差。
【图2】是将猪精子悬置在含有各浓度麦角硫因的精子保存液的精子悬浮液中，精子曲线速度(VCL)的图表。对5个猪的精子进行了测定(n＝5)。图中的黑色条表示标准误差。
【图3】是将猪精子与麦角硫因和肌酸接触后的样本中精子运动率的图表。对5个猪的精子进行了测定(n＝5)。图中的黑色条表示标准误差。
【本发明的实施例】
在本说明书中，除非另有说明，“％”表示重量％。另外，如果没有特别说明，摩尔浓度(M)表示每1立方分米含有的摩尔量(mol/dm3)。
<1.口服摄取用组合物>
本发明用于改善哺乳类动物精子表现的口服摄取用组合物(以下，也称“本发明的组合物”)，其特征在于包含麦角硫因作为有效成分，被用于改善哺乳类动物的精子表现。
在本发明中，“哺乳类动物”是指包含人类及非人类在内，属于脊索动物门脊椎动物亚门哺乳网的动物，比如包括，包含人类、黑猩猩的灵长类、狗、猫等的宠物动物、牛、猪、马、羊、山羊等的家畜动物、老鼠、麝鼠等的啮齿类、动物园里被饲养的哺乳类动物等。本发明的口服摄取用组合物的给予对象优选为人类。
在本发明中“精子表现”指的是哺乳类动物、优选人类精液的状态，具体是指，根据精液的量(射精量)、精子浓度、精子运动率、精子前进率、精子速度(平均速度(VAP)、直线速度(VSL)、及曲线速度(VCL)、头部振幅(ALH)等的指标被评估的状态。在本发明中，精子表现的各项指标，是指以《人类精液检测与技巧》世界卫生组织(WHO)试验室手册第5版(WHOlaboratory manual for the Examination and processing of human semen Fifthedition(2010))中所述的方法为基准方法所测定出的。这些指标，通常使用精子运动分析系统(CASA：Computer-Aided Sperm Analysis)测量。使用CASA在可测定的指标内，特别是VSL、VCL及ALH，被报告作为精子受精能力的指标非常有用(Hirano Y.,et al.,J.Assist.Reprod.Genet.,Vol.18,No.4,pp.213-218(2001))。
在上述对象为人类的情况下，特别是，作为摄取对象的男性不受限定，可以是希望女性伴侣怀孕的男性等。特别是，男性不孕症患者为优选对象。WHO将，外表健康的年轻男女在结婚后，正常的同居且没有采取避孕措施的性生活持续1年，但是没有怀孕的情况，定义为不孕。据了解，不孕，约占健全人的15％，其中约三分之一不孕的原因是男性，五分之一不孕的原因是男性和女性双方。因此，男性约占不孕原因的50％，据悉近年来有增加的趋势。
健康男性的生殖能力的平均值从40岁左右开始下降，和30岁的男性相比，据悉45岁男性的生殖能力下降25％左右。随着结婚年龄的高龄化，不仅是女性，男性生殖能力低下也成为问题。并且，40岁以下年轻男性不孕症的原因，已知有，精子形成和成熟的过程中出现问题的造精功能障碍、精子的输送路径受阻的精路通过障碍、精囊和前列腺炎症导致精子受到影响的副性器引起的障碍、无法进行性行为和阴道射精等的性功能障碍。从病因来看，造精功能障碍约占90％、精路通过障碍约占5％、性功能障碍约占3％、其他原因约占2％，不明原因的特发性造精功能障碍占男性不孕症的大多数。
关于本发明的组合物，在上述原因中，优选地用于因特发性造精功能障碍引起的男性不孕症的精子表现的症状，比如，精液中的精子浓度低下(少精症：精子数低于2×107/mL)、精子运动率低下(精子无力症：精子运动率低于40％)、精子运动率低下、形态异常(精子畸形症：正常精子的比率低于40％)，或者是这些症状的组合，特别是，能用于改善特发性少精症及/或特发性精子无力症的精子表现。作为这些精子表现的症状，能举例出精液中的精子浓度低下、精子运动率低下、及/或精子前进率低下等。
在本发明中，“麦角硫因”，指下述式1表示的化合物及其衍生物。包含下述式1的结构式的全部立体异构体。这里所说的作为衍生物可以是盐(钙盐、钠盐、钾盐、镁盐、盐酸盐、柠檬酸盐等)、水合物、酯等，只要具有下述式1的骨架，就不特别限定。
【化1】
麦角硫因，是一些真菌及细菌所产生的硫醇/硫酮，特别是包含在北风菌、平菇、杏鲍菇、花菇、金针菇、香菇等的菌类中，据悉在北风菌中含量尤其高。被哺乳类动物摄取后，通过转运体OCTN1的作用，进入动物体内。因为在动物体内麦角硫因的代谢速度较慢，所以麦角硫因容易积存在体内组织和体液中。
有研究表明，在动物的精液中，检测出血液浓度6倍以上的麦角硫因。但口服摄取麦角硫因，对于哺乳类动物，特别是对于人类精液状态的影响尚不明确。本发明的发明人发现口服摄取麦角硫因，可以改善哺乳类动物，更具体而言，可以改善人类的精液表现。
优选地，以10～5000μg/kg体重/日的量摄取麦角硫因来配置本发明的组合物。特别优选为超过20μg/kg体重/日、超过30μg/kg体重/日、超过40μg/kg体重/日或超过50μg/kg体重/日。另外优选，低于3000μg/kg体重/日、低于2000μg/kg体重/日、低于1000μg/kg体重/日、低于500μg/kg体重/日、低于300μg/kg体重/日。更具体地，摄取组合物的对象精浆中麦角硫因的浓度达到20～2000μM，特别是50～2000μM。配置成所述剂量的本发明组合物，可以1日一次或分多次摄取。
麦角硫因，可以从含有麦角硫因的菌类等原料中提炼，配置到本发明的组合物中。作为麦角硫因的提炼方法，例如可以使用专利文献1所示的方法。或者，麦角硫因在本发明的组合物中可以是作为含有麦角硫因的菌类等原料未提炼的细碎物、干燥粉末、浓缩精华等。本发明的组合物，也可以包含麦角硫因的菌类作为干燥粉末或浓缩精华，特别是北风菌作为干燥粉末或浓缩精华。
本发明的组合物，除了麦角硫因之外，还包括作为有效成分的肌酸。本发明的发明人发现，通过将精子与麦角硫因和肌酸同时接触，可以更显著地改善精子表现。本发明的组合物，在麦角硫因的基础上加入肌酸，可以显示出更高的精子表现改善效果。
肌酸，也被称为1-Methy Guanidinoacetic Acid甲胍基乙酸或MethyGlycocyamine，是主要存在于肌肉中的一种有机酸。肌酸，在肾脏及肝脏中由精氨酸和甘氨酸生物合成，并且在肌肉组织中，通过肌酸激酶的作用与ATP反应，转化为能量储存型的磷酸肌酸。磷酸肌酸，在像肌肉这样需要瞬时消耗大量能量的器官中，作为高能量磷酸结合的储存物质，在能量不足时通过提供磷酸基来生成ATP，从而获得能量。由此产生的肌酸通过肌酸激酶再次被磷酸化，作为肌酸磷酸被再次利用，或者经过不可逆的非酶脱水变成肝肌酸。肝肌酸最终经肾脏被排出到尿中。如上所述，肌酸在瞬间爆发力运动中的能量代谢有关，因此可以提高口服摄取肌酸的对象在运动时的瞬间爆发力。
本发明的组合物中包含的肌酸形态，包含肌酸的所有生理可用形态，比如，肌酸的游离酸、盐、或者也可以是它们的衍生物。肌酸的形态不受特别限制，例如，游离酸、钙盐、钠盐、钾盐、镁盐、盐酸盐、柠檬酸盐等盐、酯、内酯、或水合物等。其中以肌酸钙盐、肌酸-水合物及苹果酸三肌酸为优选。作为本发明中被使用的肌酸，可以通过已知的方法合成、也可以使用市场上出售的成品。
在根据本发明的口服摄取用组合物中，优选肌酸以50～300mg/kg体重/日的量被调配摄取。特别是，优选超过50mg/kg体重/日，或者超过100mg/kg体重/日。另外，优选低于250mg/kg体重/日，或者低于200mg/kg体重/日。
在本发明中的麦角硫因和肌酸，每日摄取量的重量比为1:3000～1:100，特别优选以1:2500～1:1000被调配。
本发明的组合物，可以是食品(比如，特殊用途食品、特定保健用食品、营养功能食品、经指定机构认可功效的功能性食品、营养保健品等)、或药品(包含药妆)、或一般食品，或可以作为食品添加剂使用。
本发明的组合物形状，只要对象哺乳类动物可以不勉强地摄取，就没有被特别限定，比如，可以是液体(饮料)、粉末、颗粒、片剂或胶囊剂等。另外，本发明的组合物，根据需要可以包含载体。载体可以是赋形剂、粘合剂、崩解剂、填充剂、乳化剂、流动添加调节剂、滑泽剂等。
作为赋形剂，可以列举出单糖、二糖、环糊精及多糖类等糖(更具体而言，包括但不限于葡萄糖、蔗糖、乳糖、棉子糖、甘露醇、山梨醇、肌醇、麦芽糖醇、糊精、麦芽糊精、淀粉及纤维素、及其加工品)、金属盐(比如，氯化钠、氯化钾、磷酸钠或磷酸钙、硫酸钙、硫酸镁、碳酸钙)、柠檬酸、酒石酸、甘氨酸、低、中、高分子量的聚乙二醇(PEG)、丙烯酸、高磷、硅磷、或者这些的组合。
粘合剂可以用玉米、小麦、大米，或马铃薯淀粉制成的淀粉糊、单糖浆、葡萄糖浆、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、虫胶和/或聚乙烯吡咯烷酮等。
崩解剂有上述淀粉、乳糖、羧甲基淀粉、交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、昆布多糖末、碳酸氢钠、碳酸钙、海藻酸或海藻酸钠、聚氧乙二醇脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油三酯或其盐。
作为填充剂，可以列举出上述糖和/或磷酸钙(例如，磷酸三钙、或磷酸氢钙)作为示例。
作为乳化剂，可以列举出山梨醇脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯作为例子。
作为流动添加调节剂及滑泽剂，可以列举出硅酸盐、滑石粉、硬脂酸盐或聚乙二醇作为例子。
这种载体，为了维持产品的形状和麦角硫因的效果而被使用，根据需要适当使用即可。除了上述添加剂外，必要时还可以包含矫味矫臭剂、可溶剂、悬浮剂、稀释剂、界面活性剂、稳定剂、吸收促进剂、增亮剂、吸湿剂、保湿剂、吸附剂、崩解抑制剂、防结块剂、涂层剂、着色剂、防腐剂、抗氧化剂、香料、调味剂、甜味剂、缓冲剂等。
本发明的组合物，可以直接摄取，也可以与其他组合物混合，或添加到饮用水中摄取。本发明的组合物1次的摄取量，优选地含有1日摄取量的1/5～3倍，特别优选包含1/3～1倍的有效成分。即，摄取频率为3日1次～1日5次，特别优选1日1次～1日3次。
使对象摄取本发明的组合物的频率，没有特别限定，比如，作为频率，1日摄取1次也可以。摄取期也没有特别限定，比如，可以是1天～30天、3～21天或5～14天。
<2.用于改善哺乳类动物精子表现的口服摄取用组合物的制造方法>
本发明用于改善哺乳类动物精子表现的口服摄取用组合物的制造方法(以下，也称为“本发明的制造方法”)，其特征在于包含调配麦角硫因的工序。更具体而言，本发明的制造方法包括<1.用于改善哺乳类动物精子表现的口服摄取用组合物>一项所述的本发明组合物的制造方法。用本发明的制造方法所制造的组合物，能够改善摄取对象的精子表现。
本发明的制造方法可以进一步包含配置肌酸的工序。通过进一步配置肌酸，所制造的组合物，可以显示出更高的精子表现改善效果。麦角硫因及肌酸的配置顺序没有特别限定，可以用更容易制剂化的顺序配置。
本发明的制造方法中有效成分的配置量、制剂方法、是否添加其他成分等的详细条件，只要没有特别矛盾的，应与<1.用于改善哺乳类动物精子表现的口服摄取用组合物>一项所述的条件相同。
<3.改善哺乳类动物精子表现的方法>
本发明用于改善哺乳类动物精子表现的方法(以下，也称为“本发明的改善方法”)，特征在于，包含向需要改善精子表现的对象口服给予麦角硫因的工序。
在本发明的改善方法中，口服给予麦角硫因的对象为哺乳类动物。作为哺乳类动物，例如包括人类、黑猩猩的灵长类、狗、猫等的宠物动物、牛、猪、马、羊、山羊等的家畜动物、老鼠、麝鼠等的啮齿类、动物园里被饲养的哺乳类动物等。本发明的改善方法的对象，优选为人类。
上述对象为人类时，优选为男性不孕症患者。另外，上述男性不孕症，优选所述男性不孕症为特发性少精症及/或精子无力症。并且，上述男性不孕症的症状，优选所述男性不孕症精液中的精子浓度低下、精子运动率低下、及/或精子前进率低下。
在本发明的改善方法中，优选地，对象以10～5000μg/kg体重/天的量口服麦角硫因。特别优选为20μg/kg体重/天以上、30μg/kg体重/天以上、40μg/kg体重/天以上或50μg/kg体重/天以上。另外，优选为3000μg/kg体重/天以下、2000μg/kg体重/天以下、1000μg/kg体重/天以下、500μg/kg体重/天以下、或300μg/kg体重/天以下。更具体而言，对象精浆中麦角硫因的浓度，优选口服被给予达到20～2000μM，特别是50～1500μM。像这种量的麦角硫因，可以1天单次或分多次给药。
在本发明的改善方法中，进一步优选对象口服肌酸，可以作为与麦角硫因相同的组合物被给予，另外，也可以作为其他的组合物。作为其他的组合物被给予时，肌酸，可以与麦角硫因可以同时被给予，也可以单独被给予。
肌酸，优选50～300mg/kg体重/日的量口服。特别地，优选大于50mg/kg体重/日，或大于100mg/kg体重/日。另外，优选低于250mg/kg体重/日，或低于200mg/kg体重/日。
麦角硫因和肌酸每日的给予量，优选重量比1:3000～1:100，特别是1:2500～1:1000。
在本发明的改善方法中，有效成分的制剂方法、是否给予其他成分等的详细条件，只要没有特别矛盾的，应与<1.用于改善哺乳类动物精子表现的口服摄取用组合物>一项所述的条件相同。
<4.麦角硫因的使用>
本发明提供了在制造改善哺乳类动物精子表现的口服摄取用组合物中麦角硫因的使用。以下，上述使用也称为“本发明的使用”。本发明的使用，具体是指，<1.用于改善哺乳类动物精子表现的口服摄取用组合物>一项所述的用于本发明组合物制造的麦角硫因的使用。只要没有特别矛盾的，本发明使用的被制造口服摄取用组合物的摄取对象、用途、效果、制剂手法等的详细条件，与<1.用于改善哺乳类动物精子表现的口服摄取用组合物>一项所述的条件相同。
<5.精子用培养基>
本发明提供一种包含麦角硫因的精子用培养基。本发明的精子用培养基用于哺乳类动物的的精子，优选为人类男性的精子。另外，本发明的精子用培养基，能维持精子的运动性或提高精子的运动性，包括但不限于，被用于精子的清洗、保存、培养或体外受精或人工受精。本发明的精子用培养基，可以使用已知的精子用培养基，比如，HTF培养基、TYH培养基或特开2014-128219号公报中记载的培养基等，在其上添加麦角硫因制造而成。特别是，有研究表明这种培养基具有维持精子运动性的效果，因此优选使用特开2014-128219公报所述的培养基。精子用培养基所含的麦角硫因浓度，没有被特别限定，优选为0.01～3mM，特别是0.1～1mM。
本发明的精子用培养基，也可以进一步包含肌酸。进一步包含肌酸叠加或成倍地获得维持和提高精子运动性的效果。精子用培养基包含肌酸时，肌酸的浓度没有被特别限定，优选0.01～1mM，特别是0.05～0.5mM。
【実施例】
<实施例1：北风菌摄取试验>
对13名28～51岁的男性受试者，北风菌粉末1.98g/日(相当于麦角硫因10mg/日的量)，口服2周。采集北风菌粉末给药前后各受试者的精液。精液，在诊所内通过自慰采集。被采集的精液，在37℃下静置30分钟，进行充分液化，测定液体重量(精液量)。使用精子运动解析系统CASA/IVOS(注册商标)II(Hamilton Thorne公司生产)测定精子的浓度、运动率、前进率及平均速度(VAP)。
表1表示北风菌粉末给药前后的精液量、精子浓度、精子的运动率、前进率及VAP。精子浓度、运动率、前进率、VAP在给药后上升。特别是，精子的运动率和前进率已确认显著上升。
【表1】
项目 给予前(0周) 给予后(2周) P值
精液量(mL) 4.25±1.45 3.92±1.45 0.868*
精子浓度(×105/mL) 32.7±28.20 37.22±26.36 0.507**
运动率(％) 28.23±12.08 36.89±12.80 0.026*
前进率(％) 8.50±6.20 12.67±10.10 0.054**
VAP(μm/S) 34.28±14.03 37.27±9.16 0.301*
*对应的t检验；**Willcoxon的符号顺序检验
<实施例2：向猪精液里添加麦角硫因试验(in vitro)>
从5个个体的公猪里采集新鲜的精子，悬置于含0、0.1或1.0mM麦角硫因的精子保存液(30mM葡萄糖、120mM乳糖、6.9g/L柠檬酸钠、1g/L NaHCO3、2.35g/LEDTA-2Na、2.9g/L柠檬酸、5.65g/L Tris、5mM乳酸、1mM甘氨酸)，制备精子悬浮液。各精子悬浮液在37℃、5％CO2条件下静置6小时后，使用精子运动解析系统CASA/IVOS(注册商标)II(HamiltonThorne公司生产)测定精子的直线速度(VSL(μm/S))及曲线速度(VCL(μm/S))。
各精子悬浮液中精子的VSL及VCL分别如图1及图2所示。VSL、VCL已确认添加0.1mM以上的麦角硫因后均显著上升(p＜0.05)。本研究中使用的精子保存液，具有维持精子运动性的效果(参见特开2014-128219号公报)。在其上加入麦角硫因，已证实能进一步提高精子的运动性。
<实施例3：麦角硫因和肌酸的共存试验(in vitro)>
从5个个体的公猪里采集新鲜的精子，播撒到包含如图3所示的麦角硫因及肌酸、添加了0.1％的白蛋白的HTF(Human tubal fluids)培养基里。将培养基在37℃、5％ CO2的条件下培养4小时，用与实施例1相同的方法能测定出精子的运动率。
图3表示各样本的运动率。单独给予麦角硫因及单独给予肌酸后样本的运动率没有显著被改善。另一方面，添加了1mM麦角硫因的样本，运动精子的比例依赖肌酸的浓度而提高，添加了1mM麦角硫因和500μM肌酸的样本得到了最高的运动率。二元分布分散分析的结果，显示了无添加区和肌酸单独区存在显著性差异(p＝0.0374)、麦角硫因和肌酸间的相互效应(p＝0.0478)。HTF培养基，被认为是诱导精子受精时运动的培养液，但经确认，通过使麦角硫因与肌酸共存，能进一步提高精子运动率的效果。
<实施例4：北风菌+肌酸的摄取试验>
给9名男性受试者口服北风菌粉末及肌酸调配组合物(包含北风菌粉末275mg、肌酸粉末5g、香料、甜味剂、盐类)7g，1天2次，口服2周。采集组合物给予前后各受试者的精液。精液采集前的禁欲期规定为3天以内。采集精液后，立即使用精子运动解析系统CASA/IVOS(注册商标)II(Hamilton Thorne公司生产)测定原液的精液表现(精子浓度、前进运动率、总运动精子数)及精子运动性(VAP、VCL、VSL及ALH)。将检查后的精液以400rpm进行10分钟离心分离，分离精浆。得到的精浆在约-20℃下最长冷冻保存__60天。分离后的精子在37℃、5％ CO2的条件下播种到HTF培养基(北里公司)里。在O2的条件下培养3小时，用与实施例1相同的方法测定精子的运动率。关于培养后的精子，使用CASA/IVOS(注册商标)II，测定精子运动性(VAP、VCL、VSL及ALH)。
解冻冷冻保存的精浆，测定8-羟基-2’-脱氧鸟苷(8-OHdG)、精胺、肌酸、睾酮及锌的含量。精浆中8-OhdG浓度，用以下方法测定。8-OhdG-BSA复合体用PBS稀释，96微孔板分注50μL，室温下摇晃1小时。用0.01％ Tween 20-PBS(TPBS)清洗4次后，添加1％ BSA/PBS250μL在室温下孵化1小时。用TPBS清洗4次后，添加精浆、已知浓度的8-OhdG标准液各添加50μL。分注HRP标记抗8-OhdG抗体溶液各50μL。摇晃10分钟后，在室温下孵化50分钟。用TPBS清洗4次后，分注四甲基联苯胺(TMB)100μL静置10分钟使其变色，分注1M磷酸50μL，使其停止。用微孔板测定450nm/570nm的吸光度。根据标准液的吸光度数据制成检量线，计算出各精浆的8-OhdG浓度。
精胺，是精液的成分，是与细胞分裂和蛋白质合成有关的物质。精胺，J.Chromatogr A.2008Sep 26；1205(1-2):94-102中所述的使用4-(N，N-二甲氨基磺酰基)-7-氟-2，1，3-苯并恶二唑(DBD-F)通过衍生化根据UPLC进行测定。即，在精液中加入甲醇，在4℃、15000×g的条件下经过20分钟离心分离后得到除去蛋白质后的上清，与DBD-F反应进行衍生化后，用UPLC进行分析。色谱图条件，如下所示。
液体色谱图装置：ACQUITYTM Ultra Performance Liquid Chromatography andMicromass LCT PremierTM XE Mass Spectrometer(High sensitivity orthogonaltime-of-flight instrument；Waters,Milford,USA)
列：ACQUITY UPLC BEH C18 column(1.7μm,100×2.1mm i.d.；Waters)
流速：0.4mL/分移动相：A；0.1％甲酸水溶液、B；0.1％甲酸乙腈溶液(梯度条件：B％＝20(0分)－60(8分)－90(10分)－98(11分)－98(12分)－20(13分)－20(20分)检测：550nm(激发波长：450nm)
精浆中的肌酸浓度，将精浆样本稀释40倍，使用酶法进行测定。具体来说，将稀释后的样本中所含的肌酸，使用肌酸激酶及与肌氨酸氧化酶相关的一系列酶促反应转化为过氧化氢。产生的过氧化氢，在过氧化物酶的存在下，使4-氨基安替比林和苯酚类缩合生成色素，通过测定产生色素的吸光度来定量。
精浆中的睾酮浓度用以下方法测定。用PBS稀释抗睾酮抗体，96微孔板分注50μL，室温下摇晃1小时。用0.01％ Tween 20-PBS(TPBS)清洗4次后，添加1％ BSA/PBS250μL，在室温下孵化1小时。用TPBS清洗4次后，分别添加50μL的HRP标记睾酮、精浆、或浓度已知的睾酮标准液。摇晃10分钟后，在室温下孵化50分钟。用TPBS清洗4次后，分注四甲基联苯胺(TMB)100μL静置15分钟使其变色，分注1M磷酸50μL使其停止。用微孔板测定450nm/570nm的吸光度。根据标准液的吸光度数据制作检量线，计算出各精浆的睾酮浓度。
精浆中锌浓度的测定，用以下方法进行。精浆样本溶化后稀释20倍，通过使用三氯乙酸和氟化钾共沉去除精浆中的铁和铜。之后，与包含2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-[N-n-丙基-N-(3-异丙基氨基]-苯酚(5-Br-PAPS)的试剂反应，测定吸光度定量。
对于组合物给予前后的精液，刚采集后的精子浓度、前进运动率、总运动性指数如表2所示。另外，运动率、VAP、VCL、VSL、ALH如表3所示。数值表示平均值±标准差。精子浓度、前进运动率、及总运动性指数，已确认均在组合物给药后显著上升。另外，关于运动率、VAP、VCL、VSL、ALH也显著上升。特别是VCL、VSL及ALH，是精子受精能力的指标，这些数据的上升表明精子受精能力的提高。
【表2】
项目 给予前 给予后 P值*
精子浓度(×106/mL) 53.4±50.8 74.8±54.7 0.032
前进率(％) 40.5±29.0 54.1±25.0 0.00237
总运动精子数(×106) 58.8±97.5 113±96.3 0.00309
*Mann-Whitney U检验
【表3】
项目 给予前 给予后 P值*
运动率(％) 44.8±27.5 53.8±26.7 0.0699
VAP(μm/S) 30.6±14.4 36.0±8.11 0.0112
VCL(μm/S) 53.2±27.6 63.8±14.9 0.00816
VSL(μm/S) 20.1±9.54 23.9±6.9 0.0113
ALH(μm/S) 4.11±1.96 4.73±0.968 0.0268
*Mann-Whitney U检验
关于组合物给药前后的精液，采集后，培养3小时的精子VAP、VCL、VSL、ALH如表4所示。数值表示平均值±标准差。进行人工授精时，精子经过3小时的培养工序后与卵子接触。另外，自然怀孕时，据说射精后的精子到达卵子的时间约为3小时。如表4所示，关于VSL及ALH，组合物给药后有显著上升。据此表明，组合物给药后的精子，培养3小时后仍能维持显著的高受精能力。
【表4】
项目 给予前 给予后 P值
VAP(μm/S) 40.6±9.42 43.4±6.24 0.0677
VCL(μm/S) 77.1±19.1 83.5±14.0 0.047
VSL(μm/S) 27.7±7.99 28.8±7.35 0.444
ALH(μm/S) 5.29±1.38 5.78±0.953 0.0353
*Mann-Whitney U检验
关于组合物给药前后的精液，精浆中的8-OHdG、精胺、肌酸、睾酮及锌含量的测定结果如表5所示。数值表示平均值±标准差。精浆中的肌酸浓度，摄取后有显著上升，表明摄取的肌酸会转移到精液里。而其他的成分，在给予组合物前后无显著差异。8-OHdG、精胺、睾酮及锌都是提示对妊娠性有正或负影响的成分，但通过组合物给药确认不受显著影响。
【表5】
项目 给予前 给予后 P值*
8-OHdG(ng/mL) 16±4.45 15.7±3.42 0.928
精胺(mM) 0.976±0.283 0.977±0.277 0.829
肌酸(μg/mL) 155±63.3 233±78.3 0.0188
睾酮(ng/mL) 18.2±4.91 20.7±5.12 0.316
锌(mg/dL) 9.93±3.79 10.8±3.68 0.566
*Mann-Whitney U检验
本说明书引用的所有刊物、专利及专利申请均应原封不动地引用编入本说明书。

Claims (13)

1.用于改善哺乳类动物的精子表现的口服摄取用组合物，包含麦角硫因作为有效成分。
2.根据权利要求1所述的组合物，所述哺乳类动物为人类。
3.根据权利要求2所述的组合物，所述人类，为男性不孕症患者。
4.根据权利要求3所述的组合物，所述男性不孕症，为特发性的少精症及/或精子无力症。
5.根据权利要求3或4所述的组合物，所述男性不孕症，精液中的精子具有浓度低下、精子运动率低下、和/或精子前进率低下的症状。
6.根据权利要求1所述的组合物，调配以10～5000μg/kg体重/日的量摄取麦角硫因。
7.根据权利要求1所述的组合物，进一步还包含作为有效成分的肌酸。
8.根据权利要求7所述的组合物，调配以50～300mg/kg体重/日的量摄取肌酸。
9.根据权利要求7或8所述的组合物，其中麦角硫因和肌酸，每日摄取量的重量比被调配为1:3000～1:100。
10.根据权利要求1所述的组合物，为食品。
11.根据权利要求1所述的组合物，为药品。
12.一种用于改善哺乳类动物的精子表现的口服摄取用组合物的制造方法，包含调配麦角硫因的工序。
13.根据权利要求12所述的方法，进一步包含调配肌酸的工序。
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