CN118185044A - 基于柱芳烃和两性离子客体分子构筑的抗菌材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了基于柱芳烃和两性离子客体分子构筑新型抗菌材料，通过1,4‑双(2‑羟乙氧基)苯、三苯基磷和四溴化碳反应得到化合物A，化合物A与多聚甲醛在催化剂三氟化硼乙醚的作用下生成化合物B，化合物B与二乙胺反应生成产物H；客体G的合成，1,4‑二(2‑乙氧基溴)苯和咪唑反应得到淡黄色固体C，将固体C与含有1,4‑丁磺酸内酯的丙酮溶液反应，获得化合物G，然后将化合物H和化合物G加入到水溶液中，在常温下搅拌3天，得到主客体复合物HG。主客体复合物HG通过与细菌的非共价相互作用提高细菌膜的通透性，实现大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀灭；主客体复合物HG自组装形成的纳米颗粒可以抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生物膜的形成。
Description
技术领域
本发明属于抗菌材料技术领域，尤其涉及一种基于柱芳烃和两性离子客体分子构筑抗菌材料及其制备方法。
背景技术
细菌感染已成为威胁人类健康的全球性问题，也是当今人类高发病率和高死亡率的主要原因。然而新型抗生素的研发速度却远远跟不上细菌耐药性的发展速度，因此我们迫切需要开发不同的方法来对抗浮游细菌和破坏生物膜，以解决全球抗菌素耐药性危机。
近年来，利用超分子大环构筑新型抗菌材料已经显示出巨大的潜力。大环分子便捷的合成、独特的空腔结构、丰富的主客体络合能力等特性赋予了超分子大环在构筑抗菌材料中得天独厚的优势。两性离子分子具有抑制细菌粘附和防止生物膜形成的作用，其分子结构中含有一对带相反电荷的基团，因此在抗菌领域受到广泛关注。近期研究表明两性离子柱[5]芳烃分子它可以自组装成带弱正电荷的纳米颗粒，表现出优异的抗菌活性和生物膜破坏行为。然而两性离子基团和大环分子在抗菌行为中的作用尚不清楚。
发明内容
本发明的目的是实现对浮游细节的杀灭，抑制细节生物膜的生成和分散细菌已形成的生物膜，从而弥补传统抗生素的不足以及延缓细菌耐药性的发展。
为实现上述目的，本发明提供了基于柱芳烃和两性离子客体分子构筑抗菌材料的制备方法，具体步骤如下：
化合物A：将7.93g，40.00mmol的1,4-双(2-羟乙氧基)苯与23.61g，90.00mmol的三苯基磷加入到三颈烧瓶中，再溶解于乙腈中并通过冰浴冷却。向250ml乙腈中缓慢滴加29.85g，90.00mmol的四溴化碳，滴加完毕后撤去冰浴，反应4h。将溶液倒入冰水中，静置沉淀，抽滤后真空干燥获得固体，将得到的固体用甲醇与水的混合溶剂(3：1，v/v)进行洗涤并干燥，得到化合物A。
化合物B：将10.37g，32.00mmol化合物A与2.89g，96.00mmol多聚甲醛加入到300ml的1,2-二氯乙烷中，再向其中加入9.37ml，74.00mmol的催化剂三氟化硼乙醚，并置于30℃温度下反应约5h后，加水淬灭反应。萃取有机相后旋干过柱，分离纯化得到白色粉末状化合物B。
化合物H：将化合物B(1.00g，0.57mmol)溶解于100ml无水乙醇中，再加入过量的二乙胺(4.00mL，85.21mmol)，90℃加热回流3d。反应结束后将溶液旋干，随后将粗产物溶于二氯甲烷中，加入饱和碳酸钾溶液搅拌3h，萃取有机相，旋干并干燥，产物H为棕红色油状液体。
柱[5]芳烃-二乙胺盐主体H的合成路线如下：
化合物C：将4.02g，12.41mmol的1,4-二(2-乙氧基溴)苯和5.07g，74.44mmol的咪唑加入三颈烧瓶中，再向烧杯中加入100ml的DMF溶解，再加入10.29g，74.44mmol的无水碳酸钾，加热回流，加热温度为80℃，反应时间约3d。反应完全后，将DMF旋出，加入水和二氯甲烷，萃取分液出有机相，再将有机相中的二氯甲烷旋出，得到淡黄色固体C。
化合物G：将化合物C加入到两颈烧瓶中，冰浴冷却后缓慢滴加含有0.73mL的1,4-丁磺酸内酯的50ml丙酮溶液，滴加完毕后撤去冰浴，继续在室温下搅拌5d，将溶液旋干后，粗产物用乙酸乙酯反复超声洗涤5-6次，抽干后获得产物G。
两性离子客体G的合成路线如下：
主客体复合物HG：将相同摩尔比的主体H和客体G加入到水溶液中，将溶液在常温条件下搅拌3天变为黄色，得到主客体复合物HG的水溶液。
本发明提供了上述技术方案所述的制备方法制备得到的柱芳烃和两性离子客体分子构筑的抗菌材料。
有益效果：
1、利用超分子大环主体分子柱[5]芳烃和两性离子分子构筑的纳米抗菌材料，可以实现杀灭浮游细菌、抑制细菌生物膜的形成和分散已形成的生物膜。通过抗菌机理的研究，两性离子分子可以通过静电和疏水相互作用与细菌相结合，导致细胞生物膜的通透性增加和胞内蛋白质等小分子的泄漏，导致细菌的死亡。与此同时，主客体复合物自组装形成的纳米颗粒会进一步帮助材料与细菌的结合，增强体系的抗菌活性。
2、本发明中通过二乙胺修饰的柱芳烃制备了一类基于合成便捷的柱芳烃作为抗菌复合物的主体分子，与抗菌两性壳体分子实现主客体复合物的构筑。利用两性离子的抗菌特性和主客体复合物形成的纳米颗粒，通过与细菌的非共价相互作用提高细菌细胞膜的通透性，实现浮游细菌的杀灭、细菌生物膜的抑制和分散，并兼具良好的生物相容性，为新型抗菌材料的设计提供新的设计思路。
附图说明
图1是本发明提供的主客体复合物HG的制备流程图；
图2是本发明提供的客体G或者主客体复合物HG与两种细菌共培养前后细菌数量及形貌的变化；
其中(a)为大肠杆菌菌液与不同浓度的客体G或者主客体复合物HG孵育24小时后细菌的数量；
其中(b)为金黄色葡萄球菌菌液与不同浓度的客体G或者主客体复合物HG孵育24小时后细菌的数量；
其中(c)为大肠杆菌或者金黄色葡萄球菌与PBS、主体H、客体G或者主客体复合物HG孵育3小时后细菌的形貌；
图3是本发明提供的化合物HG对大肠杆菌的细胞膜通透性改变图；
其中(a)为大肠杆菌与PBS、主体H、客体G、主客体复合物HG或者1％曲拉通溶液孵育3小时后细菌内N-苯基-1-萘胺(NPN)荧光吸收；
其中(b)为大肠杆菌与PBS、主体H、客体G、主客体复合物HG或者1％曲拉通溶孵育3小时后细菌碘化丙啶(PI)荧光吸收；
其中(c)为大肠杆菌与PBS、主体H、客体G、主客体复合物HG或者1％曲拉通溶液孵育3小时后菌液上清液中蛋白质的释放；
其中(d)为大肠杆菌与PBS、主体H、客体G、主客体复合物HG或者1％曲拉通溶液孵育3小时后菌液上清液在260nm处的紫外吸收；
图4是本发明提供的化合物HG对金黄色葡萄球菌的细胞膜通透性改变图；
其中(a)为金黄色葡萄球菌与PBS、主体H、客体G、主客体复合物HG或者1％曲拉通溶孵育3小时后细菌内N-苯基-1-萘胺(NPN)荧光吸收；
其中(b)为金黄色葡萄球菌与PBS、主体H、客体G、主客体复合物HG或者1％曲拉通溶液孵育3小时后细菌碘化丙啶(PI)荧光吸收；
其中(c)为金黄色葡萄球菌与PBS、主体H、客体G、主客体复合物HG或者1％曲拉通溶孵育3小时菌液上清液中蛋白质的释放；
其中(d)为金黄色葡萄球菌与PBS、主体H、客体G、主客体复合物HG或者1％曲拉通溶液孵育3小时后菌液上清液在260nm处的紫外吸收；
图5是本发明提供的生物膜抑制和分散结果；
其中(a)大肠杆菌菌液与不同浓度的客体G或者主客体复合物HG孵育24小时后生物膜的形成量；
其中(b)为金黄色葡萄球菌菌液与不同浓度的客体G或者主客体复合物HG孵育24小时后生物膜的形成量；
其中(c)为大肠杆菌生物膜与不同浓度的客体G或者主客体复合物HG孵育24小时后生物膜的残留生物量；
其中(d)为金黄色葡萄球菌生物膜与不同浓度的客体G或者主客体复合物HG孵育24小时后生物膜的残留生物量。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
实施例1：
如图1所示，基于柱芳烃和两性离子客体分子构筑抗菌材料，具体合成步骤如下：
化合物A：将7.93g，40.00mmol的1,4-双(2-羟乙氧基)苯与23.61g，90.00mmol的三苯基磷加入到三颈烧瓶中，再溶解于乙腈中并通过冰浴冷却。向250ml乙腈中缓慢滴加29.85g，90.00mmol的四溴化碳，滴加完毕后撤去冰浴，反应4h。将溶液倒入冰水中，静置沉淀，抽滤后真空干燥获得固体，将得到的固体用甲醇与水的混合溶剂(3：1，v/v)进行洗涤并干燥，得到化合物A。
化合物B：将10.37g，32.00mmol化合物A与2.89g，96.00mmol多聚甲醛加入到300ml的1,2-二氯乙烷中，再向其中加入9.37ml，74.00mmol的催化剂三氟化硼乙醚，并置于30℃温度下反应约5h后，加水淬灭反应。萃取有机相后旋干过柱，分离纯化得到白色粉末状化合物B。
化合物H：将化合物B(1.00g，0.57mmol)溶解于100ml无水乙醇中，再加入过量的二乙胺(4.00mL，85.21mmol)，90℃加热回流3d。反应结束后将溶液旋干，随后将粗产物溶于二氯甲烷中，加入饱和碳酸钾溶液搅拌3h，萃取有机相，旋干并干燥，产物H为棕红色油状液体。
柱[5]芳烃-二乙胺盐主体H的合成路线如下：
化合物C：将4.02g，12.41mmol的1,4-二(2-乙氧基溴)苯和5.07g，74.44mmol的咪唑加入三颈烧瓶中，再向烧杯中加入100ml的DMF溶解，再加入10.29g，74.44mmol的无水碳酸钾，加热回流，加热温度为80℃，反应时间约3d。反应完全后，将DMF旋出，加入水和二氯甲烷，萃取分液出有机相，再将有机相中的二氯甲烷旋出，得到淡黄色固体C。
化合物G：将化合物C加入到两颈烧瓶中，冰浴冷却后缓慢滴加含有0.73mL的1,4-丁磺酸内酯的50ml丙酮溶液，滴加完毕后撤去冰浴，继续在室温下搅拌5d，将溶液旋干后，粗产物用乙酸乙酯反复超声洗涤5-6次，抽干后获得产物G。
两性离子客体G的合成路线如下：
主客体复合物HG：将相同摩尔比的主体H和客体G加入到水溶液中，将溶液在常温条件下搅拌3天变为黄色，得到主客体复合物HG的水溶液。
本发明提供了上述技术方案所述的制备方法制备得到的柱芳烃和两性离子客体分子构筑的抗菌材料。
实验1：
采用最低抑菌浓度的评估实验评估化合物对革兰氏阴性菌大肠杆菌法和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的抑菌能力。如图1中的(a)和图1中的(b)所述，与H和G相比，复合物HG对于大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)表现出最低抑菌浓度分别为19.5μM和9.7μM。结果表明，水溶性柱芳烃和咪唑磺酸盐相结合构建的主客体复合物HG即使在较低剂量下，仍然保持优异的抗菌能力，可以与细菌相互作用并干扰细菌的正常状态。
实验2：
为了进一步研究探讨HG的抗菌机理，使用扫描电子显微镜观察不同样品的细菌细胞表面形貌，研究样品与细菌之间的相互作用。如图2中(c)所示，未处理的大肠杆菌与金黄色葡萄球菌未观察到细菌外膜的变形或是破损，仍然分别表现出其完整的杆状(大肠杆菌)和球状(金黄色葡萄球菌)形貌。同时与主体H共培养的两个细菌也没有表现出明显的形貌变化。不同的是与在客体G共培养的两种细菌，细菌膜的表面形貌出现了明显塌陷和变形；主客体HG与大肠杆菌共培养后，出现了明显塌陷和变形，与金黄色葡萄球菌共培养后细菌出现轻微的破损，说明G或者HG通过对细菌细胞膜产生影响进而实现杀菌效果。
实验3：
为探究复合物HG的可能抗菌机理，进一步开展了荧光分子摄取实验，探究细菌内外膜通透性的改变。如图3中(a)、图2中(b)、图4中(a)和图4中(b)，通过NPN和PI摄取实验，证实了化合物HG可以导致大肠杆菌和金黄色葡萄球菌外膜和内膜通透性增加。如图4中(c)、图4中(d)、图5中(c)和图5中(d)蛋白质和DNA的吸光值实验证实了在HG引起细胞壁的内膜破损后可以进一步导致小分子，例如膜内蛋白质的泄漏，但是无法促使大分子，例如DNA和RNA分子从破损的细胞膜中泄漏。
实验4：
基于复合物HG在MIC实验表现出对浮游细菌的出色抗菌活性，接下来通过最低生物膜抑制浓度(MBIC50)值来评估复合物HG对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生物膜生长的抑制能力，MBIC50定义为使生物膜形成至少减少50％的化合物最低浓度。结果可以看出，在主体H对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MBIC50都为1.25mM，抑制两种细菌生物膜的生长能力较低。客体G对于大肠杆菌的MBIC50为39.1μM，对于金黄色葡萄球菌的MBIC50为39.1μM，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌表现出良好的生物膜抑制能力，与此同时，发现在HG对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生物膜的抑制能力有所增加，MBIC值分别为19.5μM和9.7μM。如图5中(a)和图5中(b)，结果表明基于H和G结合后，所形成复合物HG大大增加了抑制生物膜能力。
实验5：
基于复合物HG和MIC实验表现对浮游细菌的出色抗菌活性，以及抑制生物膜形成的性质，进一步通过结晶紫染色实验评估了复合物HG对于生物膜的分散能力进行分析。相较于单独主体H对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌MBEC值为1250μM，分散生物膜能力较弱，单独壳体G和复合壳体HG均具有较好的分散能力，通过对剩余生物膜的百分比的分析，单独客体G处理过后的两种细菌在39.1μM的条件下生物膜含量显著减少，值得注意的是主客体复合物HG对大肠杆菌浓度为19.5μM和金黄色葡萄球菌浓度为9.7μM的情况下，如图5中(c)和图5中(d)观察到生物膜产生明显的分散，因此构筑的复合物HG具有较好的生物膜抑制和分散能力。主客体复合物形成的纳米颗粒有利于其更好的渗透进入生物膜内部，实现其对生物膜更好的分散能力。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.基于柱芳烃和两性离子客体分子构筑新型抗菌材料的制备方法，其特征在于，步骤如下：
化合物A：将7.93g，40.00mmol的1,4-双苯与23.61g，90.00mmol的三苯基磷加入到三颈烧瓶中，再溶解于乙腈中并通过冰浴冷却；向250ml乙腈中滴加29.85g，90.00mmol的四溴化碳并撤去冰浴，反应4h；将溶液倒入冰水中，静置沉淀，抽滤后真空干燥获得固体，将得到的固体用甲醇与水的混合溶剂进行洗涤并干燥，得到化合物A；
化合物B：将10.37g，32.00mmol化合物A与2.89g，96.00mmol多聚甲醛加入到300ml的1,2-二氯乙烷中，再向其中加入9.37ml，74.00mmol的催化剂三氟化硼乙醚，并置于30℃温度下反应约5h后，加水淬灭反应；萃取有机相后旋干过柱，分离纯化得到化合物B；
化合物H：将1.00g，0.57mmol化合物B溶解于100ml无水乙醇中，再加入4.00mL，85.21mmol的二乙胺，90℃加热回流3d；反应结束后将溶液旋干，随后将粗产物溶于二氯甲烷中，加入饱和碳酸钾溶液搅拌3h，萃取有机相，旋干并干燥，得到产物H；
化合物C：将4.02g，12.41mmol的1,4-二苯和5.07g，74.44mmol的咪唑加入三颈烧瓶中，再向烧杯中加入100ml的DMF溶解，再加入10.29g，74.44mmol的无水碳酸钾，加热回流，加热温度为80℃，反应时间约3d；反应完后，将DMF旋出，加入水和二氯甲烷，萃取分液出有机相，再将有机相中的二氯甲烷旋出，得到淡黄色固体C；
化合物G：将化合物C加入到两颈烧瓶中，冰浴冷却后滴加含有0.73mL的1,4-丁磺酸内酯的50ml丙酮溶液，撤去冰浴，继续在室温下搅拌5d，将溶液旋干后，粗产物用乙酸乙酯反复超声洗涤5-6次，抽干后获得产物G；
主客体复合物HG：将相同摩尔比的主体H和客体G加入到水溶液中，将溶液在常温条件下搅拌3天变为黄色，得到主客体复合物HG的水溶液。
2.一种由权利要求1所述的基于柱芳烃和两性离子客体分子构筑新型抗菌材料的制备方法制得的基于柱芳烃和两性离子客体分子构筑的抗菌材料。
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