CN118178322A

CN118178322A - 一种核酸药物递药系统及应用

Info

Publication number: CN118178322A
Application number: CN202211599808.7A
Authority: CN
Inventors: 高小玲; 余人和; 宋清香; 章倩; 江淦; 陈红专
Original assignee: Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Current assignee: Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority date: 2022-12-14
Filing date: 2022-12-14
Publication date: 2024-06-14

Abstract

本发明提供一种核酸药物递药系统及应用，所述递药系统由脂质和磷酸镁内核组成，所述磷酸镁内核由不溶性磷酸镁构成，核酸药物分子包载在磷酸镁内核中。本发明提供了核酸药物递药系统和核酸药物组合物在制备治疗线粒体相关疾病药物中的应用，针对线粒体相关疾病中线粒体Ca²⁺超载的病理情况，本发明的核酸药物递药系统不含钙离子，同时Mg²⁺具有富集到线粒体的特性，并可与产生生物能量的多种酶结合发挥激酶作用促进ATP合成，对线粒体具有保护作用。采用磷酸镁核心递送CypD的siRNA，在抑制损伤线粒体Ca²⁺超载的同时降低CypD表达，抑制mPTP持续开放的病理过程，协同修复线粒体损伤，改善AD的认知损伤。

Description

一种核酸药物递药系统及应用

技术领域

本发明涉及药物递送系统领域，尤其涉及一种具有线粒体保护功能的核酸药物递药系统。

背景技术

线粒体作为细胞能量供应器和代谢中心，通过协调能量代谢、Ca²⁺稳态和氧化还原稳态以及凋亡途径在细胞存活和死亡中发挥重要作用。线粒体功能障碍会导致许多常见疾病的病理学，包括神经变性、癌症、代谢疾病、心力衰竭、缺血-再灌注损伤和原生动物感染等。因此，线粒体是这些广泛流行的疾病的重要治疗靶点。以中枢神经系统疾病为例，阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森氏病(Parkinson’s disease,PD)、肌萎缩性侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)、缺血性脑卒中(ischemic cerebralstroke，ICS)包含卒中后认知障碍(Post-stroke cognitive impairment PSCI)、颅脑损伤(traumatic brain injury，TBI)等疾病中普遍发生线粒体功能障碍在这些疾病的发生发展过程中，疾病相关致病因素会破坏线粒体的形态、结构和功能，反过来线粒体功能的减退或丧失和自由基引起的氧化损伤对细胞的慢性、程序化死亡和疾病的发生发展起着重要的促成和加重的作用。因此，通过干预和修复线粒体损伤将为多种疾病提供干预策略。

以AD为例，多项研究表明，AD中线粒体损伤有以下两个重要特征：Ca²⁺稳态失调和mPTP过表达并持续开放。线粒体呼吸链是超氧物的主要来源，而超氧物又会促进过氧化氢和其他破坏性ROS的生成。人体老化过程中伴随ROS产生增加，线粒体内膜富集的不饱和脂肪酸、密集的蛋白质和线粒体功能所必需的DNA分子都易与来自超氧物的ROS发生反应，导致氧化损伤，破坏线粒体功能。当线粒体结构功能受损，也会继发性引起腺嘌呤核苷三磷酸(Adenosine triphosphate,ATP)合成受阻，导致线粒体内ATP供应降低。在AD等多种疾病病理进程中，ATP的异常降低促进Ca²⁺向线粒体内转移，以增强Ca²⁺敏感酶的活性进而刺激ATP的产生。当线粒体内Ca²⁺稳态失调，达到病理性浓度，会进一步引起超氧化物产生增加，线粒体膜电位降低。同时，机体为调节Ca²⁺稳态，mPTP的结构蛋白CypD表达增加并由基质内转移到线粒体内膜上从而促进mPTP的开放，mPTP的持续开放会导致线粒体肿胀、膜去极化、ATP合成停止和细胞色素C等促凋亡因子释放进入胞质，导致细胞凋亡，形成恶性循环，促进疾病的发生发展，提示阻断CypD可能是一种有效的线粒体损伤的治疗策略。

又如在缺血性脑卒和卒中后认知障碍中，脑缺血损伤机制主要包括:氧化应激、线粒体功能障碍、兴奋性氨基酸、钙离子超载、炎症反应、酸中毒、细胞凋亡等。线粒体的动态变化在脑缺血多种损伤与修复阶段起到重要作用，其与脑缺血关系主要表现在：1)线粒体能量生成不足与脑缺血损伤；2)ROS“爆发”与脑缺血损伤；3)线粒体途径细胞凋亡与脑缺血损伤；4)线粒体兴奋性氨基酸毒性与脑缺血损伤；5)线粒体自噬与脑缺血损伤等。针对线粒体Ca²⁺超载和mPTP表达升高和持续开放的策略将提供脑内缺血病灶及病灶附近区域的细胞的线粒体修复作用进而实现疾病干预。

再如，氧化损伤和线粒体功能异常是ALS发生和发展的重要原因。ALS的主要特征是脊髓前角和大脑的运动神经元退化，导致进行性肌无力、肌肉萎缩和呼吸衰竭等。运动神经元退化的致病机制包括RNA毒性、兴奋性毒性、蛋白质稳定的破坏、轴突转运的缺陷、氧化应激和线粒体功能障碍等。其中，ROS的变化及其引起的线粒体损伤和凋亡程序的启动是ALS致病的重要因素之一。脊髓和肌肉解剖/活检标本的超微结构研究显示，ALS患者的线粒体形态存在明显缺陷。在SOD1基因突变的ALS患者的成纤维细胞内，出现SOD1蛋白在细胞质异常聚集、线粒体功能异常及ROS水平改变，提示内源过量的ROS可能对线粒体产生毒性作用，而其中mPTP过表达和异常开放是促进线粒体生成ROS的关键因素，提示抗氧化系统的重要意义。加之，过量的ROS会影响线粒体代谢功能，导致线粒体内抗氧化系统失衡，干扰mtDNA的转录与翻译，改变线粒体膜的通透性，使mPTP不可逆开放从而产生更多的ROS，诱导线粒体介导的细胞凋亡，最终引起神经元的退化和肌肉的萎缩，加剧ALS进程。综上所述，在ALS进程中ROS的水平及其介导的线粒体损伤是非常重要的致病因素，针对线粒体mPTP过表达和异常开放的策略将为ALS提供干预方案。

目前正在临床试验评估中的线粒体药物包括补充烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD⁺)的药物，如烟酰胺单核苷酸；线粒体靶向保护性化合物，如MitoQ和Bendavia(SS31)；抗氧化剂，如辅酶Q10(CoQ10)；和线粒体通透性转换孔(Permeability transition pore,mPTP)抑制剂，如环孢素A等。作用于线粒体的药物的开发和应用仍处于起步阶段，上述的NAD⁺补充药物的在体内能达到的药物浓度仍在评价中；而Bendavia(SS31)的在人体的药效试验结果还未发布；抗氧化剂的针对性和靶向性不足；环孢素A则存在药理活性复杂，选择性差，体内作用广泛，肝肾副作用较大等问题，因此基于线粒体的干预策略的开发仍然任重道远。

基因疗法是利用基因进行治疗或预防疾病的技术，展现出了巨大的潜力，目前主要针对遗传性疾病、部分癌症和病毒性感染等。基因治疗的方式大体分为以下三种：一是将正常基因运输到患者体内细胞以替代突变基因；二是激活或敲除细胞内功能异常的突变基因；三是导入新基因到体内以治疗相应疾病。基因疗法也是线粒体干预的重要方式，将质粒DNA(pDNA)引入线粒体或向细胞内递送mRNA是利用基因治疗方法提供必需的线粒体蛋白的最为直接的方法。通过向细胞内递送siRNA来降低相关线粒体蛋白的表达也可以用于线粒体疾病的治疗。通过增加野生型mtDNA或者利用基因组编辑修复突变的mtDNA以及消除突变的mtDNA来改善线粒体异质性也是一种有效的策略。

核酸分子，特别是RNA在体内不稳定性，易被体内的核酸酶降解。同时，核酸药物分子结构较大，且带有负电荷，穿透细胞膜的难度较高。而在进入细胞后也需要从内吞体中逃逸至细胞质中，再加上外源的核酸分子具有免疫原性，会激活人体免疫系统的反应，因此需要合适的递送载体。

现有的RNA递送载体中，磷酸钙(Calcium phosphate,CaP)载体利用钙离子和带负电的磷酸根之间的强相互作用使siRNA和钙离子形成纳米尺寸的沉淀核心，构造一个稳定的内核封装在纳米颗粒中，在体内外具有良好的安全性和核酸递送特性。但在线粒体损伤疾病中，线粒体中Ca²⁺已处于超载状态，CaP纳米载体可能会加剧线粒体损伤。因此，亟需一种具有线粒体保护功能的核酸药物递药系统。

发明内容

本发明的第一个目的在于，提供一种基于磷酸镁核心的核酸药物递药系统，该递药系统针对疾病中线粒体Ca²⁺超载的病理情况，创新性利用镁离子本身可同磷酸根之间强产生相互作用，使核酸药物和镁离子形成纳米尺寸的沉淀核心，构造一个稳定的内核封装在纳米载体中，同时Mg²⁺具有富集到线粒体的特性，并可与产生生物能量的多种酶结合发挥激酶作用促进ATP合成，对线粒体具有保护作用。

本发明的第二个目的在于提供核酸药物递药系统在制备治疗线粒体相关疾病药物中的应用。

本发明的第三个目的在于提供一种修复线粒体损伤的核酸药物组合物，采用磷酸镁核心递送CypD的siRNA，在抑制损伤线粒体Ca²⁺超载的同时降低CypD表达，进而抑制mPTP持续开放的病理过程，修复线粒体损伤。

本发明第四个目的在于提供核酸药物组合物在制备治疗线粒体相关疾病药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明提供了一种核酸药物递药系统，所述递药系统由脂质和磷酸镁内核组成，所述磷酸镁内核由不溶性磷酸镁构成，核酸药物分子包载在磷酸镁内核中。利用镁离子本身可同磷酸根之间强产生相互作用，使核酸药物和镁离子形成纳米尺寸的沉淀核心，构造一个稳定的内核封装在纳米载体中。

作为一个优选方案，磷酸镁内核中Mg²⁺和PO₄ ^3-的摩尔比为8:1—100:1，Mg²⁺和PO₄ ^3-的摩尔比是一个关键的参数，合适的镁磷比例使得磷酸镁内核具有较好的分散性和较好的药物包封率。

作为一个优选方案，所述脂质是指卵磷脂、豆磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酸、心磷脂、溶血磷脂、鞘氨醇、神经酰胺、鞘磷脂、脑苷脂、神经节苷脂、胆固醇、胆固醇酯、甘油酯及其衍生物中的一种或多种。

为了实现本发明第二个目的，本发明提供了核酸药物递药系统在制备治疗线粒体相关疾病药物中的应用，所述线粒体相关疾病为阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化和缺血性脑卒中。针对线粒体相关疾病中线粒体Ca²⁺超载的病理情况，本发明的核酸药物递药系统不含钙离子，同时Mg²⁺具有富集到线粒体的特性，并可与产生生物能量的多种酶结合发挥激酶作用促进ATP合成，对线粒体具有保护作用。

为了实现本发明第三个目的，本发明提供了一种核酸药物组合物，所述药物组合物包括上述核酸药物递药系统，所述核酸药物指CypD的siRNA。采用磷酸镁核心递送CypD的siRNA，在抑制损伤线粒体Ca²⁺超载的同时降低CypD表达，进而抑制mPTP持续开放的病理过程，在修复线粒体损伤中具有协同效应。

作为一个优选方案，所述核酸药物组合物由靶向多肽修饰，所述靶向多肽的序列如SEQ ID NO.1—SEQ ID NO.3任一所示。

MAP-1:Ac-FAEKFKEAVKDYFAKFWD-GSG-RRRRRRRRR-PVGLIG-EG GEGGEGG,(SEQ IDNO.1)；

MAP-2:Ac-FAEKFKEAVKDYFAKFWD-GSGGSG-RRRRRRRRR-PVGLIG-EGGEGGEGG,(SEQ IDNO.2)；

MAP-3:Ac-FAEKFKEAVKDYFAKFWD-GSGGSG-RRRRRRRRR-PVGLIG-GGGGGGGGG,(SEQ IDNO.3)。

针对AD受损NVU中血管高表达MMP9的病理特征，本发明设计了MMP9特异性剪切的功能性穿膜靶向多肽MAP(包括MAP1，MAP2，MAP3)，此靶向多肽可被病灶部位高表达的MMP9特异性剪切，暴露出富精氨酸穿膜肽结构域，进而将药物带进受损部位的细胞内，靶向多肽的修饰提高了药物的病灶靶向性，增强了Mg²⁺和CypD的siRNA修复线粒体的协同作用。

作为一个优选方案，所述靶向多肽与脂质的摩尔比为1:10—1:300，优选1:30—1:100。

为了实现本发明第四个目的，本发明提供了核酸药物组合物在制备治疗线粒体相关疾病药物中的应用，所述线粒体相关疾病为阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化和缺血性脑卒中。

本发明中核酸药物指具有不同功能的寡聚核糖核苷酸(RNA)或寡聚脱氧核糖核苷酸(DNA)，包括siRNA、shRNA、microRNA、mRNA、长链非编码RNA、DNA和反义寡核苷酸等。

本发明含有磷酸镁载带的核酸药物递药系统，通过以下步骤制备获得：

a)制备包载核酸药物的磷酸镁内核；

b)制备包载磷酸镁内核的脂质体。

本发明中靶向多肽修饰的核酸药物递药系统，通过以下步骤制备获得：

a)制备包载核酸药物的磷酸镁内核；

b)制备包载磷酸镁内核的脂质体；

c)通过在上述制备的含磷酸镁内核脂质体溶液中加入功能性靶向多肽或蛋白，制备得到具有靶向特性的磷酸镁载带的核酸类药物纳米递药系统。

制备含固相内核的普通脂质体或含固相内核的脂蛋白纳米递药系统的方法为薄膜水化法、微流控连续流法、直接混合法、反相微乳法、注入法、复乳法、熔融法、冷冻干燥法、逆向蒸发法、高压乳匀法、超声法或Mg²⁺融合法。

本发明的优点在于，本发明构建了含磷酸镁的核酸类药物递药系统，针对AD中线粒体Ca²⁺超载的病理情况，创新性利用镁离子本身可同磷酸根之间强产生相互作用，使siRNA和镁离子形成纳米尺寸的沉淀核心，构造一个稳定的内核封装在纳米载体中。采用磷酸镁核心递送CypD的siRNA，在抑制损伤线粒体Ca²⁺超载的同时降低CypD表达，进而抑制mPTP持续开放的病理过程，协同修复线粒体损伤，改善AD的认知损伤。

附图说明

图1为不同镁离子、磷酸根离子比例的处方Mg-siRNA-LNC的粒径(A)，zeta电势(B)，siRNA的包封率(C)和Mg²⁺含量(D)。

图2为不同镁离子、磷酸根离子比例处方的磷酸镁核心MgP的透射电镜图(A)，载NCsiRNA磷酸镁固相内核的脂质纳米载体的粒径及透射电镜图(B)。标尺为50nm。

图3为载CypD siRNA磷酸镁固相内核的脂质纳米载体与10％ FBS共孵育，考察不同时间点磷酸镁固相内核包载CypD siRNA的稳定性，凝胶电泳图(A)和定量统计(B)。

图4为不同比例3种靶向多肽(MAP1，MAP2，MAP3)修饰后的荧光标记脂质纳米载体的粒径(A)电势(B)，小鼠脑微血管内皮细胞的摄取情况(C)以及MAP1修饰的荧光标记脂质纳米载体被小鼠脑微血管内皮细胞摄取图片，标尺25μm(D)。

图5为载micro-RNA脂质纳米载体的粒径(A)电势(B)和透射电镜图片(C)，标尺50nm。

图6为载cy3-siRNA的磷酸镁固相内核包裹于脂质纳米载体，并与小鼠脑微血管内皮细胞共孵育，观察溶酶体逃逸及载体释药。(A)bEnd.3细胞与不同制剂分别处理0.5h，1h，2h和3h后的激光共聚焦图片，以及不同制剂内载带的cy3-siRNA和溶酶体(LAMP1表征)的位置关系。标尺为20μm。(B)bEnd.3细胞与不同制剂分别处理0.5h，1h，2h和3h后不同处理组细胞内cy3-siRNA的荧光强度。(C)溶酶体和siRNA共定位统计。

图7为载CypD-siRNA的脂质纳米载体，对经Aβ寡聚体损伤的小鼠脑微血管内皮细胞的损伤线粒体的保护作用。(A)不同处理组MitoSox(标示线粒体ROS)的激光共聚焦成像，标尺为20μm。(B)不同处理组TMRM(标示线粒体膜电位)的激光共聚焦成像，标尺20μm。(C)和(D)分别为MitoSox和TMRM的数据统计。

图8为脂质纳米载体增加其入脑效率。5xFAD小鼠和野生型同窝对照WT小鼠尾静脉分别给DiR荧光标记的磷酸镁固相内核的脂质纳米载体。(A)脂质纳米载体跨过5xFAD小鼠脑血管，标尺40μm。(B)不同处理组小鼠脑切片DiI荧光，标尺150μm。(C)不同处理组小鼠脑切片DiI荧光定量统计。(D)不同处理组小鼠大脑活体成像图片，其中脑内荧光强度为对数坐标颜色标尺。(E)不同处理组小鼠大脑活体成像脑内荧光量定量统计。

图9为脂质纳米载体降低脑中CypD的表达。(A)不同处理组小鼠皮层CypD的蛋白质印迹法结果。(B)不同处理组小鼠皮层CypD的蛋白质印迹法结果的数据统计。

图10为载CypD-siRNA的脂质纳米载体重建5xFAD小鼠神经血管单元。(A)葡萄糖转运体1(GLUT1，红色，标记脑微血管)在不同治疗组小鼠脑血管上的免疫荧光图像，比例尺，50μm。(B)统计不同治疗组小鼠单位面积以GLUT1为特征的脑血管长度。(C)不同治疗组小鼠海马Iba1(标记激活的小胶质细胞)的免疫组织化学图像，比例尺，100μm。(D)不同治疗组小鼠海马Iba1阳性面积统计。(E)不同治疗组小鼠皮层中GFAP(标记激活的星形胶质细胞)的免疫组化图像。(F)不同治疗组小鼠皮层中NeuN(标记神经元胞体)的免疫荧光图像，比例尺，100μm。(G)不同治疗组小鼠皮层GFAP阳性面积统计。(H)不同治疗组小鼠皮层中NeuN的免疫荧光定量结果。

图11为载CypD-siRNA的脂质纳米载体有效改善5xFAD小鼠认知。(A)水迷宫定位航行实验的潜伏期，n＝10。(B)空间探索实验中90s穿越平台的次数，n＝9-10。(C)探测试验中目标平台象限的探测时间百分比，n＝9。(D)空间探索实验中各组小鼠的典型游泳轨迹。(E)新物体识别实验各给药处理组5xFAD小鼠在训练日对两个相同物体的偏好，n＝9。(F)新物体识别实验各给药处理组5xFAD小鼠在测试日对新物体的偏好，n＝9。

图12为载CypD-siRNA的脂质纳米载体对经Aβ寡聚体损伤的人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)的损伤线粒体的保护作用。(A)不同处理组MitoSox(标示线粒体ROS)的激光共聚焦成像，标尺为20μm。(B)不同处理组TMRM(标示线粒体膜电位)的激光共聚焦成像，标尺20μm。(C)和(D)分别为MitoSox和TMRM的数据统计。

图13为载CypD-siRNA的脂质纳米载体对经Aβ寡聚体损伤的小鼠小胶质细胞(BV-2细胞)的损伤线粒体的保护作用。(A)不同处理组MitoSox(标示线粒体ROS)的激光共聚焦成像，标尺为20μm。(B)不同处理组TMRM(标示线粒体膜电位)的激光共聚焦成像，标尺20μm。(C)和(D)分别为MitoSox和TMRM的数据统计。

图14为载CypD-siRNA的脂质纳米载体有效改善ALS模型动物SOD转基因小鼠转棒实验潜伏期。n＝6。

图15为载CypD-siRNA的脂质纳米载体有效改善脑缺血模型动物MCAO小鼠认知。(A)水迷宫定位航行实验的潜伏期，n＝6。(B)探测试验中目标平台象限的探测时间百分比，n＝6。(C)空间探索实验中穿越平台的次数，n＝6。

具体实施方式

以下，结合具体实施方式对本发明的技术进行详细描述。应当知道的是，以下具体实施方式仅用于帮助本领域技术人员理解本发明，而非对本发明的限制。

实施例1.磷酸镁脂质体和靶向多肽修饰的磷酸镁脂质体的制备和表征

制备

采用反相微乳法制备载药的磷酸镁固相内核。首先制备镁相，将140μLMgCl₂溶液和siRNA共孵育，分散于20mL油相中，形成油包水反相微乳。磷相的制备为将300μL Na₂HPO₄溶液缓慢滴加至油相溶液中，搅拌5min后，向磷相中加入2μmol DOPA溶液，搅拌20min后，将Mg相和P相两相混合搅拌45min后加入20ml无水乙醇破乳。破乳后的混合液体通过高速离心(12500rcf)约20min。在同样离心操作三次后，离心得到的沉淀即为载药磷酸镁，将其分散于氯仿中存放于-20℃用于后续实验。

采用薄膜水化法制备载药脂质体：称取脂质(2—10mg)置于500mL圆底烧瓶中，加入2mL乙醚挥干，向圆底烧瓶中加入2mL氯仿和磷酸镁核心，摇匀。将圆底烧瓶置于37℃旋转蒸发仪上，抽真空1h旋蒸挥干有机溶剂，获得脂质薄膜，向旋蒸后的圆底烧瓶内加入4mL生理盐水，并在37℃水浴条件下振摇10min使脂质薄膜完全脱落形成脂质体，探头超声进一步减小脂质体粒径，得到含载药磷酸镁的普通脂质体(MgP-LNC)。

靶向多肽由五部分构成：第一部分，最前端为一段α-helix结构用于嵌入纳米载体的脂质膜；第二部分为一段桥接肽，连接α-helix与后续穿膜肽段；第三部分为9个精氨酸组成的高正点性穿膜肽，将纳米载体带进细胞；第四部分为一段MMP9敏感肽，旨在AD损伤脑血管处被表达量增高的MMP9特异性水解剪切，暴露出富精氨酸穿膜肽，进而将纳米带进受损部位的细胞内，改进精氨酸寡肽的高正电性使其对细胞缺乏特异性；最后连接一段聚阴离子抑制肽，通过正负电荷作用，使精氨酸寡肽的正电荷在循环过程中保持被屏蔽的状态，增强MAP穿膜肽的稳定性。采用固相多肽合成法，合成靶向多肽MAP-1(Ac-FAEKFKEAVKDYFAKFWD-GSG-RRRRRRRRR-PVGLIG-EGGEG GEGG，SEQ ID NO.1)、MAP-2(Ac-FAEKFKEAVKDYFAKFWD-GSGGSG-RRRRRRRRR-PVGLIG-EG GEGGEGG，SEQ ID NO.2)以及MAP-3(Ac-FAEKFKEAVKDYFAKFWD-GSGGSG-RRRRRRRRR-PVGLIG-GG GGGGGGG，SEQ ID NO.3)。最后，依据制备的纳米载体的粒径、电势和细胞摄取量等指标筛选优势肽段。

具体方法：在氯甲基聚苯乙烯树脂上接入氨基酸，在三氟乙酸的保护下脱氨基保护基团。而后通过氟化氢进行切割，乙醚冰浴沉淀，乙腈溶解后旋蒸，并采用乙腈水体系进一步纯化。将制得靶向多肽与磷脂加入普通脂质体中，120rpm，37℃，孵育24h，得到靶向多肽修饰的载siRNA药物的脂质纳米载体。

实施例2.磷酸镁内核的Mg²⁺和PO₄ ^3-的摩尔比

同实施例1，采用反相微乳法制备载药的磷酸镁固相内核，调整Mg²⁺和PO₄ ^3-的摩尔比为1:1,2:1,8:1,12.5:1,15:1,20:1,25:1,50:1,100:1,200:1和400:1，制备得到的上述不同比例的MgP核心，测定粒径、电势和siRNA包封率。结果如图1显示，其中比例为8:1、12.5:1、25:1和50:1的处方组Mg-siRNA-LNC激光粒度仪测定的粒径为25nm—45nm，电势为-25mV—-12mV。采用透射电子显微镜观察形态Mg-siRNA，结果如图2A显示，其中比例为8:1、12.5:1、25:1和50:1的处方组Mg-siRNA核心分散性好，成规则球形和椭球形，粒径均一，电镜下干燥的磷酸镁纳米核心直径在15nm左右，说明确实形成了磷酸镁纳米核心。镁磷比例为8:1、12.5:1、25:1和50:1的处方组中siRNA包封率为26％—63％，为优选处方。

含载药磷酸镁脂质纳米载体磷钨酸负染，透射电镜观察形态，如图2B所示，与未孵育靶向肽的含载药磷酸镁脂质纳米载体比较，未孵育靶向肽的脂质体和靶向肽修饰的脂质体都成规则的球形，分散性好，激光粒度仪测定其粒径约为25—30nm。

实施例3.载shRNA，micro-RNA磷酸镁固相内核的脂质纳米载体制备和表征

同实施例1，采用反相微乳法制备载药的磷酸镁固相内核。首先制备镁相，将140μLMgCl₂溶液和NC-siRNA或micro-RNA共孵育，分散于20mL油相中，形成油包水反相微乳。磷相的制备为将300μL Na₂HPO₄溶液缓慢滴加至油相溶液中，搅拌5min后，向磷相中加入2μmolDOPA溶液，搅拌20min后，将Mg相和P相两相混合搅拌45min后加入20mL无水乙醇破乳。破乳后的混合液体通过高速离心(12500rcf)约20min。在同样离心操作三次后，离心得到的沉淀即为载载药磷酸镁，将其分散于氯仿中存放于-20℃用于后续实验。

采用薄膜水化法制备载药脂质体：称取脂质(2—10mg)置于500mL圆底烧瓶中，加入2mL乙醚，挥干，向圆底烧瓶中加入2mL氯仿和磷酸镁核心，摇匀。将圆底烧瓶置于37℃旋转蒸发仪上，抽真空1h旋蒸挥干，获得脂质薄膜，向旋蒸后的圆底烧瓶内加入4mL生理盐水，并在37℃水浴条件下间歇振摇10min使脂质薄膜完全脱落形成脂质体，探头超声进一步减小脂质体粒径，得到含载NC siRNA磷酸镁固相内核或micro-RNA磷酸镁固相内核的脂质纳米载体(Mg-RNA-LNC)。

实施例4.载CypD siRNA磷酸镁固相内核的脂质纳米载体的血清稳定性考察

制备

同实施例1采用反相微乳法制备载CypD siRNA磷酸镁固相内核，后续采用薄膜水化法制备载药的普通脂质体，称取DMPC(2-10mg)放入500mL圆底烧瓶中，同实施例1制备普通脂质体，取一部分普通脂质体按照磷脂/靶向多肽质量比100:1的比例加入一定量的靶向多肽，120rpm，37℃孵育24小时，得到靶向多肽修饰的载药脂质纳米载体。

血清稳定性考察

1)制样：将制备好的制剂浓缩7倍，取浓缩后的制剂15μL加入15μL FBS，分别于37℃孵育0h，0.5h，2h，4h和8h，每管加入5μL上样缓冲液(6x)。

2)配胶：2％琼脂糖凝胶，60mL胶板，18孔梳。称1.2g琼脂糖于250mL烧杯中，加入60mL 1xTAE，微波炉高火加热1min后取出搅拌，再加热1-2min。待胶呈透明状，冷却至70℃(等待约2-3min)。加入6μL核酸染料，搅拌均匀后倒入胶板架中，插入梳子，等待30min。

3)拔除梳子，取出配制好的琼脂糖凝胶及胶板。

4)上样：100bp DNA marker每孔加5μL，样品每孔加15μL。

5)电泳：90V电泳30min。

6)显影：取出凝胶，置于托盘上，奥德赛成像仪器，600nm波长，曝光时长2min。

结果如图3所示裸露的siRNA会受到血清中核酸酶的攻击，进而发生降解，无法发挥其生物学功能。而siRNA在同磷酸镁产生沉淀，并被磷脂包被后可有效保护siRNA不被血清中的核酸酶降解。在同10％的胎牛血清共孵育8h后，靶向多肽修饰的脂质体和普通脂质体中siRNA的条带依旧清晰可见，说明仍有相对量的siRNA完好保存，而未包载的siRNA条带几乎无法辨别。说明载NC siRNA磷酸镁固相内核的脂质纳米载体结构稳定，更加有利于siRNA的保护和稳定性。

实施例5.不同靶向多肽(MAP1，MAP2，MAP3)修饰后的荧光标记脂质纳米载体的粒径、电势

制备

同实施例1采用反相微乳法制备载药磷酸镁，后续采用薄膜水化法制备载药的普通脂质体，称取DMPC(2—10mg)和荧光染料(20-100μg)放入500mL圆底烧瓶中，同实施例1制备荧光标记的普通脂质体，将各不同比例(1000:1,300:1,100:1,30:1,10:1和3:1，脂质与多肽的质量比)的靶向多肽(MAP1，MAP2，MAP3)分别与普通脂质体共孵育，120rpm，37℃，24小时，得到靶向多肽修饰的荧光标记脂质纳米载体(MAP1-Mg-LNC，MAP2-Mg-LNC，MAP3-Mg-LNC)。

(2)测定采用激光粒度仪测定各脂质纳米载体的粒径、电势

结果如图4A、B所示，脂质纳米载体粒径在脂质与多肽质量比30:1和3:1时，MAP3-Mg-LNC组粒径显著大于其他处方；在脂质与多肽质量比30:1，10:1和3:1时，MAP3-Mg-LNC组的电势呈正电性；在脂质与多肽质量比为1000:1-3:1范围内，MAP1-Mg-LNC、MAP2-Mg-LNC的粒径均小于60nm，zeta电位均为负值。

实施例6.小鼠脑微血管内皮细胞对不同比例靶向多肽修饰后的荧光标记纳米载体的细胞摄取

制备

同实施例1采用反相微乳法制备载药磷酸镁，后续采用薄膜水化法制备载药的普通脂质体，称取DMPC(2—10mg)和荧光染料(20—100μg)放入500mL圆底烧瓶中，同实施例1制备荧光标记的普通脂质体，将各不同比例的靶向多肽加入普通脂质体中，120rpm，37℃孵育24小时，得到靶向多肽修饰的荧光标记载药脂质纳米载体。

血管内皮细胞的摄取。

同实施例5，bEnd.3细胞,培养至汇合度约90％。将MMP9蛋白用三蒸水溶解为100μg/mL，取10μL备用。加入MMP9处理过的纳米载体，共孵育3h后，弃去96孔板中纳米载体，PBS漂洗，甲醛溶液固定，染核。采用高内涵药物筛选系统拍照并分析细胞内的DiI荧光信号，对比bEnd.3细胞摄取各处方纳米载体的差异。

结果如图4C，D所示，MAP因其含有一段可被MMP9激活的细胞穿膜肽，可促进纳米载体被细胞快速摄取，这是该纳米载体发挥其MMP9响应型脑靶向特征的结构基础。从细胞摄取的角度考察不同比例MAP的细胞摄取促进作用：1)含有MAP3的纳米载体，在高比例30:1，10:1和3:1时，摄取非常高，可能是此三种比例下纳米载体表面电势呈正电性所致(图4B)；2)含有MAP2肽段的纳米载体的细胞摄取呈“钟形”分布，在30:1—100:1之间摄取较高；3)含有MAP1的纳米载体，当脂质与多肽质量比为100:1时，促细胞摄取效应已达到最大，随着MAP1的增加，细胞摄取效率反而呈现轻微下降。结合其粒径和电势数据分析，推测可能是MAP1比例上升后α-helix结构难以全部以最好的构象与脂质组装，同时因为空间位阻大，MAP1难以被有效切割，暴露出穿膜肽端。综上，选择30:1—100:1之间的比例作为靶向肽的优选孵育比例。在后面的实施例中，MAP主要以MAP1肽段为例，含有靶向肽的纳米载体统一命名为MAP-Mg-siRNA-LNC。

实施例7.载micro-RNA脂质纳米载体的制备和表征

(1)制备

同实施例1采用反相微乳法制备载micro-RNA磷酸镁固相内核，选取miR-34作为代表性micro-RNA，镁磷比例为25:1，后续采用薄膜水化法制备载miR-34的普通脂质体，同实施例1制备普通脂质体，取一部分普通脂质体按照磷脂/靶向多肽质量比100:1的比例加入靶向多肽，120rpm，37℃孵育24小时，得到靶向多肽修饰的载micro-RNA脂质纳米载体。

(2)表征

动态光散射粒度仪测定载micro-RNA脂质纳米载体的粒径为30.5±3.3nm，电势为-17.4±5mV。透射电镜观察，载micro-RNA脂质纳米载体呈圆球形，分散良好，粒径约为30nm(图5)。表明此载体结构可用于micro-RNA的包载与递送。

实施例8.载cy3-siRNA的磷酸镁固相脂质纳米载体的溶酶体逃逸及载体释药情况

(1)制备

同实施例1制备得到DiD荧光标记的载cy3-siRNA的脂质纳米载体。

(2)将bEnd.3细胞接种于玻璃底96孔板中，同实施例3进行制剂摄取后细胞进行固定和染核。加入10％山羊血清室温封闭1h。弃去封闭液，加入40μL LAMP抗体(1:1000稀释在一抗稀释液中)，4℃孵育过夜。吸去抗体，PBS洗3次。加入20μL抗小鼠Alex-488二抗(1:2000)，室温避光孵育1h，弃去二抗，PBS洗3次，每孔加入100μL PBS。激光共聚焦显微镜拍照。

结果如图6所示，MAP-Mg-siRNA-LNC在经过MMP9蛋白处理后，能被bEnd.3细胞高效摄取，在0.5h，1h，2h和3h时间点，绿色荧光的siRNA强度都显著强于Mg-siRNA-LNC组和未经MMP9处理过的MAP-Mg-siRNA-LNC组。说明经MMP9处理后，MAP-Mg-siRNA-LNC可被细胞快速摄取，明确了MAP-Mg-siRNA-LNC的病灶MMP响应性内皮细胞摄取。进一步统计和溶酶体有共定位情况的siRNA比例，结果表明MAP-Mg-siRNA-LNC在摄取0.5h和3h后，同溶酶体共定位比例分别为3.74±0.68％和6.34±0.73％，共定位程度低，此结果提示MAP-Mg-siRNA-LNC和Mg-siRNA-LNC可能未经过溶酶体途径。进一步考察摄取3h后，MAP-Mg-siRNA-LNC在胞内的分布特征，结果显示，经过MMP9蛋白处理的MAP-Mg-siRNA-LNC内siRNA从点状分布转向为弥散状，分布于细胞胞浆内。上述结果提示，随着摄取时间的延长，siRNA从细胞器中逃逸，弥散状分布于胞浆内，有利于其发挥生物学功能。

实施例9.载CypD-siRNA(MAP-Mg-CypD-LNC)的脂质纳米载体的体外药效评价

制备

同实施例1用反相微乳法制备分别制备载CypD-siRNA磷酸镁和磷酸钙固相内核以及空载的磷酸镁固相内核。后续采用薄膜水化法制备载药或空载的普通脂质体。得到如下四组脂质纳米载体：MAP-Mg-LNC，Mg-CypD-LNC，MAP-Ca-CypD-LNC(以磷酸钙核心替代磷酸镁核心载带siRNA)和MAP-Mg-CypD-LNC。

(2)将MMP9处理后的MAP-Mg-CypD-LNC，MAP-Ca-CypD-LNC，MAP-Mg-LNC和Mg-CypD-LNC分别同bEnd.3细胞共孵育，同时加入5μMAβ_1-42寡聚体诱导线粒体损伤。48h后，考察各组线粒体膜电位和线粒体内超氧化物含量。如图7所示，MAP-Mg-CypD-LNC组的TMRM荧光强度最高，和正常对照组几乎持平，提示线粒体膜电位损伤得到有效逆转。Ca-CypD-LNC对损伤后线粒体膜电位降低无影响，而Mg-CypD-LNC，MAP-Ca-CypD-LNC和MAP-Mg-LNC对损伤后线粒体膜电位降低有一定缓解作用，TMRM荧光强度分别提高18.20％，17.48％和38.70％，其中MAP-Mg-LNC改善明显，但效果不及MAP-Mg-CypD-LNC(提高54.38％)。如图7所示，在给与MAP-Mg-CypD-LNC治疗后，MitoSOX荧光强度降低48.50％，说明线粒体内的氧化损伤得到有效缓解。MAP-Ca-CypD-LNC治疗后，荧光强度降低37.69％，效果不及MAP-Mg-CypD-LNC(降低59.00％)。此外，MAP-Mg-LNC治疗后，荧光强度降低21.26％，提示镁离子也可能发挥部分抗氧化损伤效应。以上结果表明MAP-Mg-CypD-LNC有效修复内皮细胞损伤线粒体的超氧化物水平和线粒体膜电位。

实施例10.载siRNA脂质纳米载体的入脑情况

制备

同实施例3，制备DiI荧光染料修饰的脂质纳米载体，即4％-DiI-MAP-Mg-CypD-LNC，4％-DiI-MAP-Mg-LNC和4％-DiI-Mg-CypD-LNC。

(2)采用6月龄，5xFAD和野生型同窝对照WT小鼠，按41.3μg/kg siRNA剂量尾静脉给药。小鼠分组如下：

A)5xFAD+4％-DiI-MAP-Mg-siRNA-LNC

B)5xFAD+4％-DiI-Mg-siRNA-LNC

C)WT+4％-DiI-MAP-Mg-siRNA-LNC

采用活体双光子显微镜进行观察，如图8A所示，在给药后40min，即可观察到MAP-Mg-siRNA-LNC在血管周围富集，且随观察时间延长而增加。给药4h后，灌注取脑，用激光共聚焦显微镜观察5xFAD小鼠脑内的DiI分布情况。5xFAD在给与MAP-Mg-siRNA-LNC处理后，相较于5xFAD+Mg-siRNA-LNC组和WT+MAP-Mg-siRNA-LNC组，脑部分布荧光强度显著升高，脑血管部位呈现富集现象，表明MAP-Mg-siRNA-LNC首先在AD损伤血管处富集，并可透过脑血管壁到达脑实质部位。对不同组脑内制剂荧光强度进行定量，结果显示，5xFAD+MAP-Mg-siRNA-LNC组脑内荧光强度分别是5xFAD+Mg-siRNA-LNC组和WT+MAP-Mg-siRNA-LNC组的4.17和3.57倍(图8B,C)。为进一步证实和评价这种促入脑效应的发生，尾静脉给与4％ DiR标记的纳米载体，在0.5h，4h，8h和24h分别考察不同给药组小鼠脑内的制剂荧光量。5xFAD在给与MAP-Mg-siRNA-LNC处理后，相较于5xFAD+Mg-siRNA-LNC组和WT+MAP-Mg-siRNA-LNC组，3个观察时间点荧光强度都有一定量升高，进一步说明MAP1多肽可以有效提高纳米载体的入脑效率(图8C)。以上结果表明MAP1多肽可以有效促进纳米载体的入脑效率。

(3)采用5xFAD和野生型同窝对照WT小鼠，6月龄，按82.5μg/kg siRNA剂量尾静脉给药。小鼠分组如下：

A)5xFAD+4％-DiR-MAP-Mg-siRNA-LNC

B)5xFAD+4％-DiR-Mg-siRNA-LNC

C)WT+4％-DiR-MAP-Mg-siRNA-LNC

给药0.5h，4h，8h，24h后，腹腔注射氯丙嗪(100mg/kg)和咪达唑仑(5mg/kg)将小鼠麻醉。小鼠右眼球后静脉丛放血完成后取脑组织。小动物断层光学成像系统考察不同时间点，不同处理组小鼠脑内制剂荧光强度。如图8D，E(图中脑内荧光强度为对数坐标颜色标尺)所示，5xFAD在给与MAP-Mg-siRNA-LNC处理后，相较于5xFAD+Mg-siRNA-LNC组和WT+MAP-Mg-siRNA-LNC组，3个观察时间点荧光强度都有一定量升高，特别是8h脑内荧光强度远高于其他两个给药组，进一步说明MAP1多肽可有效提高纳米载体的入脑效率。

实施例11.载CypD-siRNA脂质纳米载体降低脑中CypD的表达

(1)制备

同实施例1用反相微乳法制备分别制备载CypD-siRNA磷酸镁和磷酸钙固相内核以及空载的磷酸镁固相内核。后续采用薄膜水化法制备载药或空载的普通脂质体。得到如下四组脂质纳米载体：MAP-Mg-LNC，Mg-CypD-LNC，MAP-Ca-CypD-LNC和MAP-Mg-CypD-LNC。

(2)给药

6月龄5xFAD小鼠分别尾静脉给药MAP-Mg-CypD-LNC，MAP-Mg-LNC，Mg-CypD-LNC和MAP-Ca-CypD-LNC(82.5μg/kg siRNA)，生理盐水处理的野生型同窝对照WT小鼠和5xFAD小鼠分别作为阳性和阴性对照。给药4周后，取脑组织称重后，加入预冷的RIPA裂解液(含1mMPMSF)，转移入研磨管中，放入研磨磁珠，置于组织研磨匀浆仪中充分裂解3min。裂解液一部分用于上样前的BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度，另一部分加入1/4体积的5×SDS上样缓冲液并与之混匀。95℃蛋白质变性10min，于-80℃冰箱保存。

Western Blot简要步骤如下：上样，60V电泳至染料条带进入分离胶后将电压改为90V，继续电泳至溴酚蓝将要泳出分离胶时停止。按顺序摆放，湿转膜至PVDF膜，200mA，2.5h。转膜后的PVDF膜加TBST溶液漂洗5min，加入封闭液(5％milk-TBS)，室温封闭1h，用漂洗液1％milk-TBST振荡洗涤5min。按1:1000的比例稀释CypD一抗(Tublin做内参，稀释比例1:1000)，转移置于杂交袋，4℃冰箱内振荡孵育过夜。移去一抗孵育液，TBST漂洗液洗涤5min，1％milk-TBST漂洗5min，重复三次。将荧光标记的二抗按1:5000比例室温振荡孵育1h。移去二抗孵育液，TBST漂洗5min并重复三次。曝光适当时间后保存曝光图片，ImageStudio Lite Ver 5.2软件进行条带荧光值定量。

模型小鼠脑内的CypD表达水平如图9所示。相对于WT组，生理盐水处理的5xFAD阴性对照组CypD表达量升高46.19％，说明AD病理状态下CypD确实异常升高。相对于5xFAD阴性对照组，MAP-Mg-CypD-LNC，MAP-Mg-LNC，和MAP-Ca-CypD-LNC均可以显著性降低CypD表达。其中MAP-Mg-CypD-LNC组降低41.68％，表达量同WT组无显著性差异，显著优于采用钙核心递送CypD siRNA的纳米制剂(MAP-Ca-CypD-LNC)。

实施例12.载CypD-siRNA脂质纳米载体重建神经血管单元

(1)制备

同实施例1用反相微乳法制备分别制备载CypD-siRNA磷酸镁和磷酸钙固相内核以及空载的磷酸镁固相内核。后续采用薄膜水化法制备载药或空载的普通脂质体。得到如下四组脂质纳米载体：MAP-Mg-LNC，Mg-CypD-LNC MAP-Ca-CypD-LNC和MAP-Mg-CypD-LNC。

(2)给药

6月龄5xFAD小鼠以82.5μg/kg siRNA的剂量连续给药28天，5xFAD和WT小鼠给予生理盐水分别作为阳性和阴性对照。给药结束后，4％多聚甲醛心脏灌流固定，并取脑组织后固定36h。石蜡包埋，4μm厚度切片，复水后免疫荧光染色GLUT1和NeuN，免疫组化染色Iba1和GFAP。

(3)MAP-Mg-CypD-LNC促进脑血管GLUT1表达

图8脑靶向数据观察到MAP-Mg-siRNA-LNC主要分布在血管和血管旁的脑实质内，提示MAP-Mg-siRNA-LNC的主要作用部位是神经血管单元(Neurovascular unit,NVU)。我们采用GLUT1表征脑血管，如图10A所示，相对于WT组，生理盐水处理的5xFAD阴性对照组GLUT1荧光强度显著降低，但在给与MAP-Mg-siRNA-LNC治疗后，视野中GLUT1荧光强度恢复，和WT组相当。进一步对脑片中GLUT1阳性的毛细血管长度进行统计，如图10B所示，相对于WT组(10681±834μm/mm²)，生理盐水处理的5xFAD阴性对照组皮层单位面积内毛细血管长度为4538±49μm/mm²，降低了57.5％。MAP-Mg-CypD-LNC治疗后，单位面积内毛细血管长度提高44.0％，该结果提示脑毛细血管得到了有效修复，而钙核心的制剂则没有毛细血管修复效果。

(4)MAP-Mg-CypD-LNC减少星形胶质细胞激活

以胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)表征星形胶质细胞的活化水平，如图10C所示，相对于WT组，生理盐水处理的5xFAD阴性对照组GFAP免疫组化染色强度和面积显著上升，但在给与MAP-Mg-CypD-LNC治疗后，GFAP的表达显著降低。以上结果提示MAP-Mg-CypD-LNC可通过降低CypD表达和Mg²⁺本身的生物学效应，缓解星形胶质细胞激活。

(5)MAP-Mg-CypD-LNC修复神经元结构损伤

以NeuN的免疫染色来评价神经元的健康程度，图10D显示，相较于WT组，5xFAD阴性对照组NeuN荧光强度降低33.3％，提示神经元受损。而经过MAP-Mg-CypD-LNC治疗后，荧光强度恢复到和WT组相当。为进一步考察MAP-Mg-CypD-LNC对神经元的修复作用。统计神经元中NeuN面积，如图10E所示，MAP-Mg-CypD-LNC组单位面积的神经元数量显著高于5xFAD阴性对照组，再次说明其神经元保护作用。

实施例13.载CypD-siRNA脂质纳米载体改善5xFAD小鼠认知

(1)制备和给药

给药6月龄5xFAD小鼠以82.5μg/kg siRNA的剂量连续给药28天，5xFAD和WT小鼠给予生理盐水分别作为阳性和阴性对照，从7月龄开始测试进行各项行为学实验，包括：新物体识别(Novel object recognition,NOR)实验和Morris水迷宫(Morris water maze,MWM)实验

(2)MWM实验：各组小鼠给药28天后采用MWM对小鼠进行行为学训练及测试。水迷宫由圆形水池、平台和录像系统三部分组成；水池直径120cm，高80cm，水池分为4个象限(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ象限)，水深50cm，加入白色食用色素使水体不透明，使实验小鼠无法直接看见平台以及池部。水池四周设置空间参照物，以供小鼠定位以及记忆平台的位置。圆形白色平台直径9cm，放置于Ⅳ象限，没于水面下1cm。摄像头置于水池中央上方，采集动物游泳轨迹。定位航行实验：历时5天。每次训练的入水点为按随机原则排列的4个象限，小鼠面向池壁放入水中，计算机监测并记录小鼠从入水开始寻找至爬上黑色平台的路线以及所需时间(潜伏期)。采用MWM视频分析软件分析游泳轨迹、潜伏期等。每只小鼠每天训练4次，每次训练90s，如若小鼠90s内未找到平台，将其引领至平台，并停留30s让其学习平台位置,这时潜伏期记为90s。

结果如图11A所示，与WT小鼠相比，生理盐水处理的5xFAD小鼠在空间学习和记忆功能方面表现出明显的缺陷。用MAP-Mg-CypD-LNC进行为期4周的治疗，小鼠潜伏期从65.03±7.14s下降到21.73±5.57s，潜伏期下降水平和WT组相当，相较于生理盐水组差异显著。空间探索实验中，MAP-Mg-CypD-LNC组平均次数为6.9±0.4和WT组(4.80±0.70)相当，相较于生理盐水组差异显著。空间探索实验中MAP-Mg-CypD-LNC组目标平台象限停留时间百分比为48.61±5.28％，相较于生理盐水组差异显著(图11B，C)。游泳轨迹和WT组类似，游泳轨迹大多集中于目标平台象限周围，探索目的性强，钙核心的制剂则在各个实验中均未表现出学习记忆改善功能。以上结果表明MAP-Mg-CypD-LNC可有效提高5xFAD小鼠空间学习记忆能力，且镁核心的递送载体显著优于钙核心载体(图11D)。

(3)NOR实验：新物体测试设备为一个底部为白色的立方体盒子(35cm×35cm)。测试过程分为三个阶段：适应阶段、训练阶段和测试阶段。在适应日，每只老鼠都被轻轻地放在盒子内的开阔的场地上，没有任何物体，可以自由地探索场地。5min后，将小鼠放回鼠笼，并用75％酒精清洁该区域以消除异味，再测试下一只小鼠。训练日，两个相同的物体被放置在开阔场地的不同位置。将一只小鼠背对物体5min放在盒子中。在测试日，将两个相同的物体中的一个替换为同材质不同形状的新物体，将小鼠按先前方法放置5min。如图11E,F所示，在训练日，对于两个相同的物体，每组小鼠对同一个物体的探索时间比例没有显著性差异，分辨比都在50％附近，说明小鼠不存在对两个相同物体的位置偏好。在测试日，将其中一个物体换成新物体后，任小鼠自由探索，考察小鼠对新物体的偏好性。MAP-Ca-CypD-LNC(48.7±5.7％)，MAP-Mg-LNC(47.9±1.9％)和Mg-CypD-LNC(53.9±3.1％)组分辨比较生理盐水组(45.8±2.5％)无显著性差异。而MAP-Mg-CypD-LNC组分辨率为59.3±3.8％和WT组(58.1±3.1％)相当，相较于生理盐水组差异显著。这些结果表明MAP-Mg-CypD-LNC可有效提高5xFAD小鼠空间学习记忆能力。

实施例14.载CypD-siRNA脂质纳米载体神经细胞和小胶质细胞的Aβ寡聚体损伤

(1)制备

同实施例1用反相微乳法分别制备载CypD-siRNA磷酸镁和磷酸钙固相内核以及空载的磷酸镁固相内核。后续采用薄膜水化法制备载药或空载的普通脂质体。得到如下四组脂质纳米载体：MAP-Mg-LNC，Mg-CypD-LNC，MAP-Ca-CypD-LNC和MAP-Mg-CypD-LNC。

(2)将MMP9处理后的MAP-Mg-CypD-LNC，MAP-Ca-CypD-LNC，MAP-Mg-LNC和Mg-CypD-LNC分别同人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞共孵育，同时加入5μM Aβ_1-42寡聚体诱导线粒体损伤。48h后，考察各组线粒体膜电位和线粒体内超氧化物含量。如图12所示，MAP-Mg-CypD-LNC组的MitoSOX和TMRM荧光均降至正常对照组几乎持平，提示线粒体氧化损伤和膜电位损伤得到有效逆转。以上结果表明MAP-Mg-CypD-LNC有效修复神经细胞损伤线粒体的超氧化物水平和线粒体膜电位。

(3)将MMP9处理后的MAP-Mg-CypD-LNC，MAP-Ca-CypD-LNC，MAP-Mg-LNC和Mg-CypD-LNC分别同小鼠小胶质细胞系BV-2细胞共孵育，同时加入5μM Aβ_1-42寡聚体诱导线粒体损伤。48h后，考察各组线粒体膜电位和线粒体内超氧化物含量。如图13所示，MAP-Mg-CypD-LNC组的MitoSOX和TMRM荧光均降至正常对照组水平，提示线粒体氧化损伤和膜电位损伤得到有效逆转。以上结果表明MAP-Mg-CypD-LNC有效修复小胶质细胞细胞损伤线粒体的超氧化物水平和线粒体膜电位，缓解脑内线粒体损伤相关的炎症状态。

实施例15.载CypD-siRNA脂质纳米载体改善ALS模型动物SOD转基因小鼠认知

(1)制备

同实施例1用反相微乳法分别制备载CypD-siRNA磷酸镁和磷酸钙固相内核以及空载的磷酸镁固相内核。后续采用薄膜水化法制备载药脂质体MAP-Mg-CypD-LNC。

(2)75日龄SOD小鼠以82.5μg/kg siRNA的剂量连续给药54天，SOD小鼠给予生理盐水分别作为阳性和阴性对照，从75日龄开始进行每6—8天做一次转棒实验，用于评价ALS疾病中运动功能的退化。转棒实验设置，转棒仪器设置为转速14rpm，小鼠在转棒上停留3min被定义为无症状，小鼠不能在转棒上停留3min的第一天被定义为临床疾病发病时间，并记录小鼠具体停留时间(掉落潜伏期)，每周训练或者测试2—3次。

结果如图14所示，SOD小鼠100日龄开始出现明显的运动缺陷。与生理盐水组相比，MAP-Mg-CypD-LNC治疗后，SOD小鼠在不同的运动功能测试中均表现出更好的运动能力恢复，在不同的测试时间段悬挂维持时间更长，后肢握紧行为显著优于生理盐水组，从转棒上的掉落潜伏期显著增长。以上结果表明MAP-Mg-CypD-LNC可有效提高SOD小鼠运动功能。

实施例16.载CypD-siRNA脂质纳米载体改善MCAO小鼠认知

(1)制备

同实施例13用反相微乳法制备载CypD-siRNA磷酸镁脂质纳米载体MAP-Mg-CypD-LNC。

小鼠MCAO模型制备：采用氯胺酮(100mg/kg)和咪达唑仑(5mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，仰卧位固定，颈正中线切口，沿胸锁乳突肌内缘分离肌肉和筋膜，分离左侧颈总动脉(CCA)，颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)，在左侧颈总动脉远心端和近心端与颈外动脉外挂线备用。用微动脉夹暂时夹闭颈内动脉，然后近心端结扎颈总动脉、颈外动脉。然后在距颈总动脉分叉部4mm处剪一小口将拴线插入到颈内动脉，这时用绕在颈总动脉远心端的细线轻轻系牢拴线。移开动脉夹，缓慢推入线栓至约深入1.8cm，计时MCAO 1h后拔出线栓，缝合。已相同操作，但不插入线栓的小鼠为Sham组，给药生理盐水作为阴性对照。已MCAO模型小鼠给药生理盐水作为阳性对照。待小鼠麻醉恢复后3h，开始给药，每天一次以82.5μg/kgsiRNA的剂量连续给药28天。给药结束后，参照实施例12进行水迷宫实验。

结果如图15所示，与Sham小鼠相比，生理盐水处理的MACO小鼠在空间学习和记忆功能方面表现出明显的缺陷。用MAP-Mg-CypD-LNC进行为期4周治疗小鼠的潜伏期为35±2s较于生理盐水MCAO组52±3s显著下降，已和Sham组(28±6s)相当。空间探索实验中，MAP-Mg-CypD-LNC组平均次数为4.4±1.3和Sham组(6.2±1.9)相当，相较于生理盐水MCAO组差异显著。空间探索实验中MAP-Mg-CypD-LNC组平台象限停留时间百分比为54±8％，相较于生理盐水组处理的MCAO组差异显著。以上结果表明MAP-Mg-CypD-LNC可有效提高缺血性脑卒中及其引起的认知功能障碍，改善其空间学习记忆能力。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种核酸药物递药系统，其特征在于，所述递药系统由脂质和磷酸镁内核组成，所述磷酸镁内核由不溶性磷酸镁构成，核酸药物分子包载在磷酸镁内核中。

2.根据权利要求1所述的一种核酸药物递药系统，其特征在于，磷酸镁内核中Mg²⁺和PO₄ ^3-的摩尔比为8:1—100:1。

3.根据权利要求1所述的一种核酸药物递药系统，其特征在于，所述脂质是指卵磷脂、豆磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酸、心磷脂、溶血磷脂、鞘氨醇、神经酰胺、鞘磷脂、脑苷脂、神经节苷脂、胆固醇、胆固醇酯、甘油酯及其衍生物中的一种或多种。

4.权利要求1所述核酸药物递药系统在制备治疗线粒体相关疾病药物中的应用，其特征在于，所述线粒体相关疾病为阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化和缺血性脑卒中。

5.一种核酸药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1—3任一所述核酸药物递药系统，所述核酸药物指CypD的siRNA，其他siRNA和microRNA。

6.根据权利要求5所述一种核酸药物组合物，其特征在于，所述核酸药物组合物由靶向多肽修饰，所述靶向多肽的序列如SEQ ID NO.1—SEQ ID NO.3任一所示。

7.根据权利要求6所述一种核酸药物组合物，其特征在于，所述靶向多肽与脂质的摩尔比为1:10—1:300。

8.根据权利要求7所述一种核酸药物组合物，其特征在于，所述靶向多肽与脂质的摩尔比为1:30—1:100。

9.权利要求5—8任一所述核酸药物组合物在制备治疗线粒体相关疾病药物中的应用，其特征在于，所述线粒体相关疾病为阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化和缺血性脑卒中。