CN118165093A - 抗Aβ药物筛选靶标及筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗Aβ药物筛选靶标及药物筛选方法。本发明提供的筛选方法利用模拟体内环境和条件制备出的不同的Aβ聚集体为靶标可更准确、更有效地筛选得到抗Aβ候选药物；本发明提供的筛选方法涉及的Aβ靶标在接近体内不同微环境条件下进行聚集孵育，不需对其做任何标记和修饰，同时所筛选的药物分子也无需进行任何修饰标记，且不局限于某类药物，可广泛应用于抗体、多肽、小分子等不同药物类型，真实反映靶点与这些药物分子间的相互作用，大大减少假阳性、假阴性或结合模式有误等问题出现的几率。

Description

抗Aβ药物筛选靶标及筛选方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及抗Aβ药物筛选靶标及筛选方法。
背景技术
随着人口老龄化问题的日益加深，阿尔茨海默症(Alzheimer disease，AD)导致的经济负担和社会问题也日益严重，已成为全人类面临的巨大挑战之一。β-淀粉样蛋白(amyloidβ-protein，Aβ)的聚集是AD发生的最重要假说，防止Aβ的聚集已被证实是治疗AD的一种有效方法。已有的研究证明，可溶性Aβ多聚体是主要的毒性来源，主要通过影响细胞膜离子通道，产生氧化应激，激活神经胶质细胞引发炎症反应等途径在AD的发生发展中发挥重要作用。而Aβ在人体中有多种存在形式，主要以Aβ42和Aβ40为主，其中Aβ42因为其毒性更大和更易发生聚集而成为研究重点，但其它形式的Aβ，如N端截短和修饰的N3pE等形式也被认为与AD病理高度相关。因此针对脑内Aβ清除是研究最为广泛的药物作用机制，Aβ单抗是目前在AD患者中验证最多且唯一被批准上市的新型AD治疗药物，多项试验结果表明，Aβ单抗可以清除Aβ斑块，一定程度上减缓认知和生活能力下降。虽然某些单抗因为血脑屏障通过率差、疗效不显著、脑水肿或微出血等不良事件而中止研究，目前仍有十多种Aβ单克隆抗体处于临床试验的不同阶段。
针对Aβ的各类药物开发方法基本都会使用一定条件下制备的Aβ作为药物靶点，为了筛选开发可与各种Aβ特异性结合的药物分子就需要有各种不同序列、不同聚集程度、不同比例混合的聚集体等不同Aβ多聚体作为筛选底物，而Aβ的制备方式总体上可分为三类，第一种是使用体内来源的经提取纯化获得的Aβ，该方法可最大限度地获得接近体内真实状态的各种Aβ聚集体，但很显然从死后AD患者脑内提取并不现实，不能用于药物筛选，而转基因小鼠来源的Aβ受限于基因型的限制，很难反应人脑内复杂的Aβ类型，同时其提取纯化过程繁杂费力，提取质量易受多种条件影响，同样很难应用于大规模药物筛选。第二类方法是通过转染细胞表达的Aβ进行提取纯化，该方法比第一种方法更容易获得足量的Aβ，但该方法需要严格的无菌生物培养和操作和较复杂的质粒构建等过程，同时也无法简便快速的同时获得多种Aβ序列及其混合形式。第三类方法则是使用人工合成的Aβ，固相合成多肽的技术已经非常成熟，利用该技术可以快速简便高纯度地获得各种不同Aβ序列，但如何利用这些Aβ序列制备用于药物筛选的各类Aβ多聚体仍未有统一标准。发明人发现Aβ聚集体在各类文献中的制备方法繁多，但这些方法大多基于简单的缓冲液或培养基条件，对不同条件下所制备的Aβ多聚体形态和聚集情况缺乏系统比较与分析，而Aβ不像其它常见蛋白靶点具有相对确定的结合位点和确定的立体结构，Aβ的多态性使其作为靶点的研究难度大大增加，由于体内存在不同长度及末端修饰的多种Aβ，现有技术中报道各个Aβ的聚集特性存在显著差别，不同的孵育条件也会对Aβ的聚集行为有显著影响，而Aβ的聚集过程本身也呈现不同程度、不同形态和大小的动态聚集，具有极强的异质性，因此抗Aβ药物研发成功率极低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种Aβ聚集体的制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种抗Aβ药物筛选靶标。
本发明的另一目的在于提供一种抗Aβ药物筛选方法。
为解决上述技术问题，本发明的第一方面，提供了一种Aβ聚集体的制备方法，所述Aβ聚集体的制备方法包括步骤：
S1，将Aβ冻干粉末溶解并干燥去除溶剂获得Aβ肽膜；
S2，使所述Aβ肽膜和缓冲液混合，得到浓度为0.2-100uM的Aβ溶液；
S3，对所述Aβ溶液进行孵育，得到Aβ聚集体；和
步骤S1中，所述Aβ冻干粉末为Aβ40、Aβ42、N3pE42、Aβ38或其组合；
步骤S2中，所述缓冲液选自不含钙镁元素的杜氏磷酸缓冲盐溶液(DPBS)、含有8-12mM HEPES和140-160mM NaCl的HBS缓冲液、人工脑脊液(aCSF)、DMEM、FBS、endosome模拟液和lysosome模拟液中至少一种；
步骤S3中，所述孵育的温度为30-43℃，所述孵育的转速为0-2500rpm，所述孵育的时间不少于一天。
在一些优选的方案中，步骤S1中，所述溶剂为六氟异丙醇。
在一些优选的方案中，步骤S3中，所述孵育的时间为1-7天。
在一些优选的方案中，步骤S3中，所述孵育在恒温均匀仪中进行，所述恒温均匀仪的转速为0-2500rpm。
在一些优选的方案中，所述Aβ溶液的浓度为0.5-50uM，更优选为1-20uM。
在一些优选的方案中，所述缓冲液为不含钙镁元素的杜氏磷酸缓冲盐溶液(DPBS)、含有8-12mM HEPES和140-160mM NaCl的HBS缓冲液或人工脑脊液(aCSF)。
在一些优选的方案中，所述endosome模拟液为浓度为18-22mM的pH为5.5的柠檬酸钠缓冲液、浓度为75-85mM的NaCl溶液和浓度为18-22mM的KCl溶液的混合液。
在一些优选的方案中，所述lysosome模拟液为浓度为18-22mM的pH为4.5的柠檬酸钠缓冲液、浓度为45-55mM的NaCl溶液和浓度为45-55mM的KCl溶液的混合液。
在一些优选的方案中，所述Aβ冻干粉末为Aβ40和Aβ42的组合，或Aβ40和N3pE42的组合，或Aβ40、Aβ42、N3pE42的组合。优选地，所述组合中，Aβ40的摩尔百分含量不低于50％。在一些优选的方案中，所述组合中，Aβ40和其他Aβ以摩尔比为(5-9)：(1-5)。
在一些优选的方案中，所述Aβ冻干粉末为Aβ40和Aβ42的组合，其中Aβ40和Aβ42的摩尔比为9:1、8:2、7:3、6:4或5:5。
在一些优选的方案中，所述Aβ冻干粉末为Aβ40和N3pE42的组合，其中Aβ40和N3pE42的摩尔比为9:1。在一些优选的方案中，所述Aβ冻干粉末为Aβ40、Aβ42和N3pE42的组合，其中，Aβ40、Aβ42和N3pE42的摩尔比为5:4:1。
在一些优选的方案中，所述孵育的温度为36-41℃。所述孵育的转速为1500-2500rpm。
本发明的第二方面，提供了Aβ聚集体作为抗Aβ药物筛选靶标的用途，所述Aβ聚集体通过本发明第一方面中所述的方法制备。
本发明的第三方面，提供了一种抗Aβ药物筛选靶标，所述靶标为Aβ聚集体，所述Aβ聚集体通过本发明第一方面中所述的方法制备。
本发明的第四方面，提供了一种抗Aβ药物筛选方法，所述方法包括步骤：使用本发明第三方面所述的抗Aβ药物筛选靶标筛选抗Aβ药物。
在一些优选的方案中，所述方法包括步骤：筛选能够使Aβ聚集体解聚、或者能够与Aβ聚集体结合、或者能够抑制Aβ聚集体聚合的药物，所述药物选自抗体、多肽和小分子化合物中至少一种。
本发明的第五方面，提供了一种抗Aβ药物，所述抗Aβ药物由本发明第四方面所述的方法筛选得到。
在一些优选的方案中，所述化合物为式I化合物，
本发明第六方面，提供了式I化合物的用途，用于体外非治疗性地(i)抑制Aβ多聚体的形成；(ii)促进Aβ多聚体的解聚；和/或(iii)与Aβ多聚体结合；
本发明相对于现有技术而言，至少具有下述优势：
(1)本发明提供的筛选方法利用模拟体内环境和条件制备出的不同的Aβ聚集体为靶标可更准确、更有效地筛选得到抗Aβ候选药物；
(2)本发明提供的筛选方法涉及的Aβ靶标在接近体内不同微环境条件下进行的聚集孵育，不需对其任何标记和修饰，同时所筛选的药物分子也无需进行任何修饰标记；
(3)本发明提供的筛选方法能够更直观地筛选获得活性良好的抗Aβ候选药物；
(4)本发明提供的筛选方法不局限于某类药物，可广泛应用于抗体、多肽、小分子等不同药物类型，真实反映靶点与这些药物分子间的相互作用，大大减少假阳性、假阴性或结合模式有误等问题出现的几率。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。
图1是根据本发明实施例中典型Aβ多聚体的代表性AFM图(左：Aβ42寡聚体；右：Aβ42斑块)；
图2是根据本发明实施例中代表性AFM图，左：Aβ40，右：Aβ42(50uM,37℃,2000rpm,HBS孵育24h)；
图3是根据本发明实施例中代表性AFM图，左：Aβ40，右：Aβ42(10uM,37℃,2000rpm,HBS孵育24h)；
图4是根据本发明实施例中代表性AFM图，左：Aβ40，右：Aβ42(2uM,37℃,2000rpm,HBS孵育24h)；
图5是根据本发明实施例中代表性AFM图，左：Aβ40，右：Aβ42(50uM,37℃,2000rpm,HBS孵育1周)；
图6是根据本发明实施例中代表性AFM图，左：Aβ40，右：Aβ42(50uM,37℃,2000rpm,aCSF孵育24h)；
图7是根据本发明实施例中代表性AFM图，左：Aβ40，右：Aβ42(10uM,37℃,2000rpm,aCSF孵育24h)；
图8是根据本发明实施例中代表性AFM图，左：Aβ40，右：Aβ42(2uM,37℃,2000rpm,aCSF孵育24h)；
图9是根据本发明实施例中代表性AFM图，左：Aβ40，右：Aβ42(50uM,37℃,2000rpm,aCSF孵育1周)；
图10是根据本发明实施例中代表性AFM图，左：Aβ40，右：Aβ42(10uM,37℃,2000rpm,aCSF孵育1周)；
图11是根据本发明实施例中代表性AFM图(Aβ40/42＝5/5uM,37℃,2000rpm,aCSF孵育24h)；
图12是根据本发明实施例中代表性AFM图(Aβ40/42＝5/5uM,37℃,2000rpm,aCSF孵育1周)；
图13是根据本发明实施例中ThT监测Aβ聚集动力学的代表性示例，其中Aβ聚集体孵育条件为25uM Aβ42+40uM ThT，DPBS，37℃；
图14是根据本发明实施例中ThT与Aβ聚集体结合示例，其中Aβ聚集体孵育条件为5uM Aβ42在37℃的DPBS中孵育78h，40uM ThT)
图15是根据本发明实施例中AFM筛选可抑制Aβ多聚化的化合物，其中Aβ多聚体孵育条件为10mM HCl+150mM NaCl，37℃，孵育48h；
图16是根据本发明实施例中AFM筛选可抑制Aβ多聚化的化合物，其中Aβ多聚体孵育条件为DPBS，37℃，孵育78h；
图17是根据本发明实施例中AFM观测加入化合物前后的聚集情况，其中，左为25uMN3pE42聚集体(DPBS，70h)，右为25uM N3pE42聚集体(DPBS，70h)+40uM化合物1，再孵育90h。
图18是根据本发明实施例中代表性AFM图，Aβ38(10uM,37℃,2000rpm,aCSF孵育24h)；
图19是根据本发明实施例中代表性AFM图，Aβ38(2uM,41℃,2000rpm,aCSF孵育24h)；
图20是根据本发明实施例中代表性AFM图，Aβ38(2uM,41℃,2000rpm,Lysosome模拟液孵育24h)；
图21是根据本发明实施例中代表性AFM图，Aβ42(10uM,37℃,0rpm,HBS孵育24h)；
图22是根据本发明实施例中代表性AFM图，Aβ40(50uM,37℃,0rpm,HBS孵育24h)；
图23是根据本发明实施例中代表性AFM图，Aβ40(50uM,37℃,0rpm,HBS孵育1周)。
具体实施方式
现有技术中研发抗Aβ药物成功率较低，本发明人意外发现所用靶标Aβ聚集体的形态、大小、聚集态均会对筛选方法的效率和所筛药物是否有效有影响，而现有技术中所用的Aβ聚集体所使用的孵育条件各不相同且与体内环境相差较大，本发明人认为该因素是抗Aβ药物研发成功率低的原因之一。进一步地，本发明人模拟人脑内不同微环境制备不同Aβ聚集体，包括模拟中性细胞外环境的DPBS、HBS、aCSF等以及模拟endosome/lysosome内环境的缓冲液，37℃、38.5℃、41℃等不同温度下模拟人体常见体温、脑内浅层部位温度、脑内深层区域温度等，通过0-2000rpm等不同转速条件模拟人体静止、运动及血流影响等多种不同条件，在上述不同条件组合下孵育制备各单一序列的Aβ聚集体用于结合特异性筛选、以Aβ40为主体混合孵育其它Aβ序列的聚集体用于模拟体内复杂Aβ聚集体用于广泛性筛选。
Aβ聚集体的制备方法
本发明涉及Aβ聚集体的制备方法，包括步骤：S1，将Aβ冻干粉末溶解于六氟异丙醇，并干燥去除六氟异丙醇获得Aβ肽膜；S2，使Aβ肽膜和缓冲液混合，得到浓度为0.2-100uM的Aβ溶液；和S3，对Aβ溶液进行孵育，得到Aβ聚集体。
作为Aβ冻干粉末，可选自一种或几种Aβ亚型，如Aβ40、Aβ42、Aβ38、N3pE42或其组合，这些Aβ亚型序列均是已知的，市售可得。例如是Aβ40多聚体、Aβ42多聚体、或者Aβ40、Aβ42、Aβ38、N3pE42任意两者或全部三者的形成的多聚体。当多种Aβ亚型混合孵育时，较佳地，至少一种亚型为Aβ40，更佳地，使Aβ40作为主体。在本发明的一些实施方式中，使用Aβ40和其他Aβ的混合物共同孵育以模拟脑内不同生理病理状态，例如是Aβ40和Aβ42的混合物，或Aβ40和N3pE42的混合物，或Aβ40和Aβ38的混合物、或Aβ40、Aβ42、N3pE42的混合物。当多种Aβ亚型混合孵育时，较佳地，Aβ40的摩尔百分含量不低于50％。在本发明的一些实施方式中，Aβ40和其他Aβ以摩尔比为(5-9)：(1-5)，例如(下括号内均为摩尔比)Aβ40/42(9:1)、Aβ40/42(8:2)、Aβ40/42(7:3)、Aβ40/42(6:4)、Aβ40/42(5:5)、Aβ40/N3pE42(9:1)、Aβ40/42/N3pE42(5:4:1)、Aβ
40/42/N3pE42(5:4:1)等。
作为缓冲液，可选地是模拟人脑内不同微环境的缓冲液，优选地是不含钙镁元素的杜氏磷酸缓冲盐溶液(DPBS)、含有8-12mM HEPES和140-160mM NaCl的HBS缓冲液、人工脑脊液(aCSF)、DMEM、FBS、endosome模拟液和lysosome模拟液中至少一种。在本发明的一些实施方式中，使用不含钙镁元素的杜氏磷酸缓冲盐溶液(DPBS)、人工脑脊液(aCSF)或含有8-12mM HEPES和140-160mM NaCl的HBS缓冲液作为缓冲液。
作为孵育条件，孵育的温度为36-41℃，优选地是37℃、38.5℃、41℃，分别模拟人体常见体温、脑内浅层部位温度、脑内深层区域温度等。孵育的转速为0-2500rpm，例如0或2000rmp分别模拟静止和运动状态等情况。
本发明中，术语“Aβ聚集体”指的是一种或多种β-淀粉样蛋白单体发生聚集形成的多聚体。
Aβ聚集体的用途
本发明还涉及上述方法所制备的Aβ聚集体的用途，作为抗Aβ药物筛选靶标筛选药物。由于Aβ聚集体的多态性，不同方法制备得到的Aβ聚集体实质不同，类似于不同靶标，根据本发明方法制备得到的Aβ聚集体相比经典文献中得到的Aβ聚集体能够更直观快捷地筛选得到有效候选药物，AFM图显示所筛药物对Aβ聚集体具有解聚作用，这是通过其他方法无法直接判定的候选药物性质。
抗Aβ药物筛选靶标
本发明还涉及抗Aβ药物筛选靶标，该靶标为上述方法制备得到的Aβ聚集体，通过代表性AFM图可观察到本发明得到的Aβ聚集体与典型Aβ单体、典型Aβ寡聚体、典型Aβ纤维、典型Aβ斑块明显不同，属于不同靶标。术语“典型Aβ单体”、“典型Aβ寡聚体”、“典型Aβ纤维”和“典型Aβ斑块”指的是本发明对比例所述(经典文献中的方法)的方法制备得到的典型Aβ单体、典型Aβ寡聚体、典型Aβ纤维和典型Aβ斑块。
抗Aβ药物筛选方法
本发明还涉及抗Aβ药物筛选方法，包括步骤：上述抗Aβ药物筛选靶标筛选抗Aβ药物。优选地，筛选能够使Aβ聚集体解聚、或者能够与Aβ聚集体结合、或者能够抑制Aβ聚集体聚合的药物。前述药物的类型不作限定，可选地如抗体、多肽和小分子化合物等。
抗Aβ药物
本发明还涉及通过本发明方法所筛的抗Aβ药物，如下式I所示：
本发明还通过SPR实验和ThT竞争结合实验确定了式I化合物能够与Aβ结合，且结合作用与Flutemetamol和AZD4694相当。
本发明还涉及式I化合物的体外非治疗用途，用于(i)抑制Aβ多聚体的形成；(ii)促进Aβ多聚体的解聚；和/或(iii)与Aβ多聚体结合。
本发明优选的实施方式中，“抗Aβ药物”指的是能够使Aβ多聚体解聚或能够阻止Aβ多聚体形成的药物。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
除非另有指明，本文所用的技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义，需要注意的是，本文所用的术语仅为了描述具体实施方式，而非意图限制本申请的示例性实施方式。
除非另有指明，否则术语“或”意指术语“和/或”并且可与术语“和/或”互换使用。
如本文使用的，包括所附权利要求，除非上下文另外明确说明，否则例如“一个”、“一种”和“所述”在内的词语的单数形式包括它们相应的复数指代物。
实施例1
本实施例中，制备得到了Aβ多聚体。具体方法如下：
(1)Aβ肽膜的制备和储存：向人工合成的Aβ冻干粉末Aβ40、Aβ42、Aβ38(购自吉尔生化)中分别加入HFIP(六氟异丙醇)配制为1mM溶液，室温孵育30分钟，将其按10ul分装至0.5ml低吸附微量离心管中，在通风橱中放置过夜以使HFIP挥发，再转移至真空离心装置(SpeedVac)干燥1小时以去除残留HFIP和水分得到Aβ肽膜，将其与干燥剂密封后存放于-20℃备用。
(2)AβDMSO储液的制备
将Aβ肽膜取出平衡至室温，加入无水DMSO(二甲基亚砜)配置为5mM储液，涡旋30秒后超声10分钟，该储液作为起始材料用于制备各Aβ聚集体。
(3)接近体内真实条件下的单一序列Aβ聚集体制备：
取(2)制备的5mM Aβ的AβDMSO储液，加入HBS配置为100uM的Aβ溶液，再用HBS缓冲液稀释至50uM，转移至37℃，2000rpm下孵育，孵育24小时后使用，AFM确定其聚集形态，获得相应聚集程度和形态的Aβ聚集体。图2为Aβ40和Aβ42的AFM形态图。
实施例2
本实施例制备Aβ多聚体的方法与实施例1大致相同，不同在于孵育条件有部分调整。
取(2)制备的5mM Aβ的AβDMSO储液，加入HBS配置为100uM的Aβ溶液，再用HBS缓冲液稀释至10uM，转移至37℃，2000rpm下孵育，孵育24小时后使用，AFM确定其聚集形态，获得相应聚集程度和形态的Aβ聚集体。图3为Aβ40和Aβ42的AFM形态图。
实施例3
本实施例制备Aβ多聚体的方法与实施例1大致相同，不同在于孵育条件有部分调整。
取(2)制备的5mM Aβ的DMSO储液，加入HBS配置为100uM的Aβ溶液，再用HBS缓冲液稀释至2uM，转移至37℃，2000rpm下孵育，孵育24小时后使用，AFM确定其聚集形态，获得相应聚集程度和形态的Aβ聚集体。图4为Aβ40和Aβ42的AFM形态图。
实施例4
本实施例制备Aβ多聚体的方法与实施例1大致相同，不同在于孵育条件有部分调整。
取(2)制备的5mM Aβ的AβDMSO储液，加入HBS配置为100uM的Aβ溶液，再用HBS缓冲液稀释至50uM，转移至37℃，2000rpm下孵育，孵育1周后使用，AFM确定其聚集形态，获得相应聚集程度和形态的Aβ聚集体。图5为Aβ40和Aβ42的AFM形态图。
实施例5
本实施例制备Aβ多聚体的方法与实施例1大致相同，不同在于孵育条件有部分调整。
取(2)制备的5mM Aβ的DMSO储液，加入aCSF配置为100uM的Aβ溶液，再用aCSF缓冲液稀释至50uM，转移至37℃，2000rpm下孵育，孵育24小时后使用，AFM确定其聚集形态，获得相应聚集程度和形态的Aβ聚集体。图6为Aβ40和Aβ42的AFM形态图。
实施例6
本实施例制备Aβ多聚体的方法与实施例1大致相同，不同在于孵育条件有部分调整。
取(2)制备的5mM Aβ的DMSO储液，加入aCSF配置为100uM的Aβ溶液，再用aCSF缓冲液稀释至10uM，转移至37℃，2000rpm下孵育，孵育24小时后使用，AFM确定其聚集形态，获得相应聚集程度和形态的Aβ聚集体。图7为Aβ40和Aβ42的AFM形态图。
实施例7
本实施例制备Aβ多聚体的方法与实施例1大致相同，不同在于孵育条件有部分调整。
取(2)制备的5mM Aβ的DMSO储液，加入aCSF配置为100uM的Aβ溶液，再用aCSF缓冲液稀释至2uM，转移至37℃，2000rpm下孵育，孵育24小时后使用，AFM确定其聚集形态，获得相应聚集程度和形态的Aβ聚集体。图8为Aβ40和Aβ42的AFM形态图。
实施例8
本实施例制备Aβ多聚体的方法与实施例1大致相同，不同在于孵育条件有部分调整。
取(2)制备的5mM Aβ的DMSO储液，加入aCSF配置为100uM的Aβ溶液，再用aCSF缓冲液稀释至50uM，转移至37℃，2000rpm下孵育，孵育1周后使用，AFM确定其聚集形态，获得相应聚集程度和形态的Aβ聚集体。图9为Aβ40和Aβ42的AFM形态图。
实施例9
本实施例制备Aβ多聚体的方法与实施例1大致相同，不同在于孵育条件有部分调整。
取(2)制备的5mM Aβ的DMSO储液，加入aCSF配置为100uM的Aβ溶液，再用aCSF缓冲液稀释至10uM，转移至37℃，2000rpm下孵育，孵育1周后使用，AFM确定其聚集形态，获得相应聚集程度和形态的Aβ聚集体。图10为Aβ40和Aβ42的AFM形态图。
实施例10
本实施例制备Aβ多聚体的方法与实施例1大致相同，不同在于孵育条件有部分调整。以Aβ40为本底，分别与Aβ42以一定比例混合加入aCSF配置为Aβ40和Aβ42的比例为5uM：5uM的溶液，转移至37℃，2000rpm下孵育，孵育24小时后使用，AFM确定其聚集形态，获得相应聚集程度和形态的Aβ聚集体。图11为Aβ40和Aβ42的AFM形态图。
实施例11
本实施例制备Aβ多聚体的方法与实施例1大致相同，不同在于孵育条件有部分调整。
以Aβ40为本底，分别与Aβ42以一定比例混合加入aCSF配置为Aβ40和Aβ42的比例为5uM：5uM的溶液，转移至37℃，2000rpm下孵育，孵育1周后使用，AFM确定其聚集形态，获得相应聚集程度和形态的Aβ聚集体。图12为Aβ40和Aβ42的AFM形态图。
实施例12
本实施例制备Aβ多聚体参考经典文献中形成Aβ典型斑块的方法进行。。
取(2)制备的5mM Aβ的DMSO储液，加入10mM HCl+150mM NaCl的混合液配置为100uM的Aβ溶液，再用10mM HCl+150mM NaCl混合液稀释至5uM，转移至37℃，0rpm下孵育，孵育48小时后使用，AFM确定其聚集形态，获得相应聚集程度和形态的Aβ聚集体。图15左图为Aβ42的AFM形态图。
实施例13
本实施例制备Aβ多聚体的方法与实施例1大致相同，不同在于孵育条件有部分调整。
取(2)制备的5mM Aβ的DMSO储液，加入DPBS配置为100uM的Aβ溶液，再用DPBS缓冲液稀释至25uM，转移至37℃，0rpm下孵育，孵育78小时后使用，AFM确定其聚集形态，获得相应聚集程度和形态的Aβ聚集体。图16左图为Aβ42的AFM形态图。
实施例14
本实施例制备Aβ多聚体的方法与实施例1大致相同，不同在于孵育条件有部分调整。
取(2)制备的5mM Aβ38的DMSO储液，加入aCSF配置为100uM的Aβ溶液，再用aCSF缓冲液稀释至10uM，转移至37℃，2000rpm下孵育，孵育24小时后使用，AFM确定其聚集形态，获得相应聚集程度和形态的Aβ聚集体。图18为Aβ38的AFM形态图。
实施例15
本实施例制备Aβ多聚体的方法与实施例1大致相同，不同在于孵育条件有部分调整。
取(2)制备的5mM Aβ38的DMSO储液，加入aCSF配置为100uM的Aβ溶液，再用aCSF缓冲液稀释至2uM，转移至41℃，2000rpm下孵育，孵育24小时后使用，AFM确定其聚集形态，获得相应聚集程度和形态的Aβ聚集体。图19为Aβ38的AFM形态图。
实施例16
本实施例制备Aβ多聚体的方法与实施例1大致相同，不同在于孵育条件有部分调整。
取(2)制备的5mM Aβ38的DMSO储液，加入Lysosome配置为100uM的Aβ溶液，再用Lysosome缓冲液稀释至2uM，转移至41℃，2000rpm下孵育，孵育24小时后使用，AFM确定其聚集形态，获得相应聚集程度和形态的Aβ聚集体。图20为Aβ38的AFM形态图。
实施例17
本实施例制备Aβ多聚体的方法与实施例1大致相同，不同在于孵育条件有部分调整。
取(2)制备的5mM Aβ42的DMSO储液，加入HBS配置为100uM的Aβ溶液，再用HBS缓冲液稀释至10uM，转移至37℃，0rpm下孵育，孵育24小时后，使用AFM确定其聚集形态，获得相应聚集程度和形态的Aβ聚集体。图21为Aβ42的AFM形态图。
与其他条件相同转速为2000rpm的孵育样品相比(图3右)，转速为0rpm孵育的样品聚合程度略低。
实施例18
本实施例制备Aβ多聚体的方法与实施例1大致相同，不同在于孵育条件有部分调整。
取(2)制备的5mM Aβ40的DMSO储液，加入HBS配置为100uM的Aβ溶液，再用HBS缓冲液稀释至50uM，转移至37℃，0rpm下孵育，孵育24小时后，使用AFM确定其聚集形态，获得相应聚集程度和形态的Aβ聚集体。图22为Aβ40的AFM形态图。
与其他条件相同转速为2000rpm的孵育样品相比(图2左)，转速为0rpm孵育的样品聚合程度显著更低。
实施例19
本实施例制备Aβ多聚体的方法与实施例1大致相同，不同在于孵育条件有部分调整。
取(2)制备的5mM Aβ40的DMSO储液，加入HBS配置为100uM的Aβ溶液，再用HBS缓冲液稀释至50uM，转移至37℃，0rpm下孵育，孵育1周后，使用AFM确定其聚集形态，获得相应聚集程度和形态的Aβ聚集体。图22为Aβ40的AFM形态图。
与其他条件相同转速为2000rpm的孵育样品相比(图5左)，转速为0rpm孵育的样品聚合程度显著更低。
下对比例中提供了经典文献中的制备Aβ的方法。
对比例1
典型Aβ单体的制备
取实施例1中制备的Aβ储液加入冰水至100uMAβ终浓度，涡旋15秒后立即作为Aβ单体使用。
对比例2
典型Aβ寡聚体的制备
向Aβ储液中加入冷的F12培养基将Aβ稀释至100uM，涡旋15秒，转移至4℃孵育24h，即得典型Aβ寡聚体，如图1左图。
对比例3
典型Aβ纤维的制备
向Aβ储液中加入10mM HCl使Aβ稀释至100uM，涡旋15秒，转移至37℃孵育24h，得典型Aβ纤维，典型Aβ纤维形成细长弯曲纤维状聚集体。
对比例4
典型Aβ斑块的制备
向Aβ储液中加入10mM HCl+50-100mM NaCl，使Aβ浓度为100uM，涡旋15秒，转移至37℃孵育24h，即得Aβ斑块，如图1右图。
由上图1、图2-12、图15、16、图18-23可知，实施例1-14中人脑内细胞外基质环境(生理盐浓度、中性)条件下孵育制备得到的Aβ聚集体的形态和对比例中的典型Aβ斑块不同。如图2、3、5、6、9所示，Aβ40的聚集形态偏向形成纤维状聚集体，Aβ42则偏向于形成小类球形聚集体及由此堆积而成的不规则团块。本发明Aβ40和Aβ42聚集体与其各自对比例经典文献种的形态显著不同。二者聚集速度也不同，文献中的Aβ40在100uM时也只偶见短纤维，而在生理盐浓度条件下50uM甚至10uM的Aβ40在24h内即可形成纤维状聚集体(图2、3、6)，其纤维的形态与文献(The Journal of Biological Chemistry,2002,277(35),32046-32053.)中的Aβ40和Aβ42也均不相同。因此以这些聚集体分别进行药物筛选将导致不同的筛选结果，类似于针对不同的靶标进行药物筛选，本发明中所用接近体内微环境制备的Aβ聚集体进行筛选具有更高的研究价值和应用前景。
测试例1
通过ThT结合实验检测Aβ聚集体的形成。
ThT可与Aβ聚集体结合从而显示出荧光增强的特性，通过以下实验分别监测Aβ的聚集程度和ThT与Aβ聚集体的结合。
a)Aβ聚集过程动力学监测：将实施例14中方法配制的起始Aβ溶液(5-100uM)立即加至96孔板中，同时加入一定量ThT(5-100uM)，用荧光分光光度计(BioTek，Cytation3)定时测定荧光值以监测其聚集过程(Ex/Em：440nm/490nm)，各组设3个平行，GraphPad Prism统计分析，见图13。
b)Aβ聚集体加入ThT荧光变化：将实施例14制备的Aβ聚集体加至96孔板中，Aβ浓度为5-100μM，用荧光分光光度计(BioTek，Cytation3)测定荧光值，加入ThT(终浓度5-100μM)后孵育10-30分钟，再次测定荧光值(Ex/Em：440nm/490nm)，各组设3个平行，GraphPadPrism统计分析。如下图14所示，Aβ多聚体加入ThT后荧光值显著增强。
测试例2
通过原子力显微镜(AFM)监测制备的各Aβ聚集体的形态。
a)注射器中注入超纯水，使用0.02毫米的过滤器过滤，丢弃最初的1–2mL，所有后续步骤均使用0.02毫米的过滤水。
b)将各Aβ样品稀释至10uM或直接使用终浓度低于10uM的样品，用于在云母上制备待测样品。
c)用胶带将顶部的一到四层云母去除，露出干净平整的云母表面。
d)将样品滴到云母上静置30秒，用200-400ul水冲洗，压缩空气吹干。
e)室温置于洁净柜内(可盖上盖子以防尘)，直到进行分析。
f)使用Bruker FastScan原子力显微镜的智能轻敲模式(peakforce)和SNL-A探针进行扫描，至少扫描4个区域以确保采样的代表性。
g)使用NanoScope软件进行数据处理和图像呈现。
实施例14
本实施例中，SPR测定化合物1与Aβ结合的能力。
采用表面等离子体共振仪Biacore 8K来测定化合物和Aβ的相互作用。系统温度设为25℃，流速设为10μL/min，通道2(FC-2)设为偶联蛋白通道，通道1(FC-1)设为对照通道，检测是否有非专一性结合反应存在，用于扣除背景信号。
预处理-偶联pH值的选择：未活化芯片表面的情况下，将Aβ样品(吉尔生化，Cat#52487)溶解在不同pH值(pH＝4.0，4.5，5.0，5.5)的醋酸钠缓冲液中，使其带上不同量的正电荷再将蛋白样品以10μL/min的流速流过芯片表面，通过结合曲线确定合适的pH值条件。
Aβ的偶联：选择CM5芯片，蛋白的偶联是根据氨基偶联的方法操作，偶联步骤如下：
(1)活化：流速10μL/min进样NHS/EDC混合液(0.1M NHS和0.4MEDC，使用前体积比1:1混合，立即使用)，用于活化芯片表面葡聚糖的羧基；
(2)偶联：根据预处理中确定的pH值的缓冲液分别配制50μg/mL的Aβ溶液(制备方法参考Alzheimer’s Disease and Frontotemporal Dementia 2010,610,13-32)，以流速10μL/min进样，直至达到固定化约3000RU的水平；
(3)封闭：用1M的盐酸乙醇胺封闭，完成蛋白的偶联过程。
结合实验：将待检测的分析物溶解在DMSO中，并配成10mM浓度，然后用PBS-P+(Cytiva)稀释至所需系列浓度，以流速30μL/min进样5分钟，结合(kon)持续60s，解离(koff)持续60s。经过溶剂矫正后分析实验结果，从样品传感图中减去参比通道传感图。
在SPR实验中，当分析化合物溶液流到芯片表面时，分析物会结合到芯片表面的蛋白偶联物上，引起芯片表面质量的变化，从而引起共振信号的改变，其相互作用结果用传感图来表示，纵坐标表示小分子与蛋白的结合水平，用响应信号(RU)连续记录，横坐标表示时间。通过拟合得到的解离平衡常数(KD)，部分相关实施例结果如下表1所示。分析物浓度分别为3.91，7.81，15.63，31.25，62.50和125.0μM。动力学参数是假设1:1结合模拟所得。由表可知，化合物1、对照品1和对照品2均能够与Aβ结合。
表1.化合物与Aβ结合能力结果
实施例15
本实施例中，ThT竞争结合实验测定化合物与Aβ的结合。
将实施例14中制备的Aβ42聚集体(DPBS，37℃，孵育60h)加至96孔板中，分别加入1mM标准化合物的DMSO溶液和同体积不含标准化合物的DMSO，Aβ42浓度为5μM，标准化合物浓度为40μM，37℃，用荧光分光光度计(BioTek，Cytation3)测定荧光值(Ex/Em：440nm/490nm)，各孔再分别加入ThT(终浓度40μM)后测定荧光值(Ex/Em：440nm/490nm)。各组设3个平行，GraphPad Prism统计分析。
在硫黄素T(ThT)竞争结合实验中，示例化合物1和与硫黄素T(ThT)竞争结合Aβ聚集体，化合物本身在测定条件下无明显荧光，同时化合物与Aβ聚合物孵育后再加入ThT，其荧光显著低于未加入化合物的对照组，说明化合物1可与ThT竞争性结合Aβ聚集体。
表2.化合物与ThT竞争结合Aβ结果
使用AFM观测加入活性化合物对Aβ聚集的抑制作用和/或对Aβ聚集体的解聚作用。
抑制Aβ聚合：Aβ单体与化合物共同孵育一定时间后用AFM观测两组各自的聚集情况，代表性实施结果如图15和图16。
测试例3
使用典型Aβ斑块和本发明中制备的Aβ聚集体筛选活性化合物1。
使用典型Aβ斑块形成条件下(10mM HCl+150mM NaCl，37℃)，即使将Aβ浓度从100uM降至5uM，与化合物1孵育后，对Aβ的聚集只有轻微抑制作用，如图15所示。该结果说明形成典型Aβ斑块的溶液条件下制备的Aβ聚集体作为靶标无法有效筛选得到化合物1。
而使用本发明实施例13中提供的更接近体内环境的条件孵育(DPBS，37℃，0rpm)，即使在较高浓度下(25uM)，相同浓度的化合物1也能显著抑制Aβ的聚集，如图16中右图所示化合物1与Aβ共孵育可显著抑制Aβ聚集体形成，说明本发明Aβ聚集体能够作为靶标筛选得到活性化合物1，且结果更直观。
此外，发明人还发现，使用实施例中制备得到的Aβ聚集体与化合物共同孵育一定时间后用AFM观测比较加入化合物前后的聚集情况，化合物1还能够明显促进Aβ聚集体的解聚，代表性实施结果如图17。
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。

Claims (10)

1.一种Aβ聚集体的制备方法，其特征在于，所述Aβ聚集体的制备方法包括步骤：
S1，将Aβ冻干粉末溶解，并干燥去除溶剂得到Aβ肽膜；
S2，使所述Aβ肽膜和缓冲液混合，得到浓度为0.2-100uM的Aβ溶液；
S3，对所述Aβ溶液进行孵育，得到Aβ聚集体；和
步骤S1中，所述Aβ冻干粉末为Aβ40、Aβ42、N3pE42、Aβ38或其组合；
步骤S2中，所述缓冲液选自不含钙镁元素的杜氏磷酸缓冲盐溶液、含有8-12mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和140-160mM NaCl的HBS缓冲液、人工脑脊液、DMEM、FBS、endosome模拟液和lysosome模拟液中至少一种；
步骤S3中，所述孵育的温度为30-43℃，所述孵育的时间不少于1天，所述孵育的转速为0-2500rpm。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3中，所述孵育的时间为1-7天。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3中，所述孵育在恒温均匀仪中进行，所述恒温均匀仪的转速为0-2500rpm。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为不含钙镁元素的杜氏磷酸缓冲盐溶液(DPBS)、含有8-12mM HEPES和140-160mM NaCl的HBS缓冲液或人工脑脊液(aCSF)。
5.一种抗Aβ药物筛选靶标，其特征在于，所述靶标为Aβ聚集体，所述Aβ聚集体通过如权利要求1-4中任一项所述的方法制备。
6.Aβ聚集体作为抗Aβ药物筛选靶标的用途，其特征在于，所述Aβ聚集体通过如权利要求1-4中任一项所述的方法制备。
7.一种抗Aβ药物筛选方法，其特征在于，所述方法包括步骤：使用如权利要求5所述的靶标筛选所述抗Aβ药物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，筛选能够使Aβ聚集体解聚，或者能够抑制Aβ聚合形成聚集体的药物，所述药物选自抗体、多肽和小分子化合物中至少一种。
9.一种抗Aβ药物，其特征在于，所述抗Aβ药物由如权利要求7或8所述方法得到。
10.式I化合物的用途，其特征在于，用于体外非治疗性地(i)抑制Aβ多聚体的形成；(ii)促进Aβ多聚体的解聚；和/或(iii)与Aβ多聚体结合；
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