CN118150716A - 一种组织样品原位交联分析方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种组织样品原位交联分析方法及应用。本发明分析方法具有以下特点：1)组织样品交联前进行灌流或缓冲液充分清洗，去除组织中的血液，避免血液影响组织交联；2)针对不同的样品及数据需求，采用TBSL(2n+5)系列交联剂，提高数据解析效率。本发明组织样品原位交联分析方法应用于蛋白质组学领域，为实现组织样品中蛋白复合体的规模化分析、蛋白质的空间结构解析及蛋白质‑蛋白质相互作用网络提供技术支撑。
Description
技术领域
本发明涉及一种组织样品原位交联分析方法的开发及应用，属于结构蛋白质组学领域。本发明以组织样品为基础，加入交联剂，对新鲜组织样品进行原位化学交联，解析组织样品中蛋白质的结构及相互作用。本发明的组织样品原位交联新方法，在不提取组织蛋白的前提下，直接进行组织样品的原位化学交联，结合后续组织蛋白的提取方法及质谱方法，具有蛋白提取率高，交联深度大，交联密度高的优点。本发明实现了基于化学交联策略的组织样品蛋白质分析，为研究蛋白质的空间结构及蛋白质-蛋白质相互作用网络提供重要的技术支撑。
背景技术
蛋白质是组成人体一切细胞、组织的重要成分，是生命的物质基础。蛋白质以其自身的三维空间结构，以及与其他蛋白质之间的相互作用作为基础，发挥着各种各样的生物学功能。因此，蛋白质结构与功能分析、蛋白质复合物及蛋白质相互作用的研究，一直是生命科学极为重要的研究领域。
虽然现代结构生物学技术极大地扩展了现在可以研究的蛋白质复合物的大小和类型，但实际上不存在获得组织中存在的蛋白质和复合物的大规模结构信息的能力。新技术和新方法的发展一直是推动蛋白质功能研究的关键和强大动力。近年来，化学交联剂结合质谱技术兴起，成为一种研究蛋白质复合物结构以及蛋白质-蛋白质相互作用的有力工具。该方法相比酵母双杂交、免疫共沉淀、蛋白质结晶X射线衍射等传统方法(TrendsBiotechnol,2016,34,825-834.；Journal of Cellular Biochemistry,2016,117,2109-2117.)具有分析迅速、灵敏度高、通量高及可处理复杂蛋白样品等优点，因而成为持续增长的新的研究热点(Current Opinion in Chemical Biology,2005,9,509–516；MassSpectrometry Reviews,2010,29,862-876；Analytical Chemistry,2016,88,7930-7937.)。
因此，针对组织样品交联的问题，Bruce课题组在2017年首次提出了心脏组织样品交联(Devin K.Schweppe,Juan D.Chavez,Chi Fung Lee,Arianne Caudal,ShaneE.Kruse,Rudy Stuppard,David J.Marcinek,Gerald S.Shadel,Rong Tian,and JamesE.Bruce.PNAS,2017,2)。但是由于技术的局限，只做到了提取心脏组织线粒体的交联，而并不是实际意义上的组织样品原位交联。于是2018年，Biuce课题组对其进行了改进，最终实现了PIR交联剂原位交联心脏组织样品(JuanD.Chavez,Chi Fung Lee,Arianne Caudal,Andrew Keller,Rong Tian,and James E.Bruce.Cell Systerms.2018,1)。但是该工作目前只是对获得的数据进行了简单的结构分析，并没有涉及蛋白质的相互作用网络。
针对现有组织样品交联方法所存在的问题，本发明专利，针对不同的组织样品及需求，设计了高通量的组织样品交联方法，用于组织样品中蛋白质的结构解析，蛋白质-蛋白质相互作用。同时，为疾病的发生发展机制研究提供技术支持。
发明内容
基于现有组织样品原位交联的方法，本发明设计了一种适用于不同样品、具有不同数据需求的组织样品原位交联新方法。本发明选择本课题组开发的TBSL(2n+5)系列交联剂，对于解析蛋白质-蛋白质相互作用的需求，我们可以选择n＝4的交联。对于解析蛋白质结构及动态变化的需求，可以选择n＝1～5的混合交联剂。对于蛋白质的定量，可以选择具有同位素标记的n＝4交联剂。
本发明选择本课题组开发的交联剂TBSL(2n+5)，具体结构如下所示：
交联剂碳链长度n为1时，对应的名称为TBSL7；交联剂碳链长度n为2时，对应的名称为TBSL9；交联剂碳链长度n为3时，对应的名称为TBSL11；交联剂碳链长度n为4时，对应的名称为TBSL13；交联剂碳链长度n为5时，对应的名称为TBSL15。针对不同的数据解析需求，可以选择不同臂长的交联剂。
一种组织样品原位交联分析方法，包括以下步骤：
组织样品在取出前，要进行灌注除血，取出的新鲜组织要充分冲洗进一步除血，用1×DPBS(磷酸盐缓冲液)缓冲液或者1×HEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)缓冲液中的一种，pH的范围为7到7.5；
洗净的组织用组织剪剪碎，剪成边长0.1～0.5cm的小块，并用1×DPBS或1×HEPES分散均匀。
交联剂溶解于DMSO中形成终浓度为0.1～1M的交联剂溶液；在组织样品中加入交联剂终浓度为1～10mM的交联剂溶液；在20-25℃的温度下，端到端交联反应30分钟到120分钟；
加入10-50mM碳酸氢铵溶液终止反应，在20-25℃的温度下，端到端终止反应10分钟到60分钟。
终止反应液中加入细胞裂解液(4％ SDS或1-十二烷基-3-甲基咪唑氯盐(C12Im-Cl)离子液体)，并加入细胞裂解液体积含量1％的全蛋白酶抑制剂，细胞裂解液的加入量为细胞体积的5-10倍，使用低温高速组织研磨仪提取蛋白质，温度-30～-40℃，转速3.5～4.5m/s，运转60s，休息60s，共10～20个循环，至样品澄清透明得到的蛋白。蛋白经过丙酮沉淀或者fasp(或者i-fasp)的方式获得不含细胞裂解液和淬灭交联剂的蛋白，再经过5-8M尿素变性，10-50mM二硫苏糖醇(DTT或者三(2-羧乙基)膦(TCEP)还原，20-100mM的碘乙酰胺(IAA)烷基化，蛋白和蛋白酶质量比为1:50～1:100进行酶解，得到肽段样品；
酶解可以采用胰蛋白酶多次平行酶切或者将胰蛋白酶酶切后的样品联合其他蛋白酶进行顺序酶切；其他蛋白酶选自ArgC、LysC和LysN为代表的胰蛋白酶“增强型”酶或以AspN、GluC为代表的胰蛋白酶“正交型”酶，蛋白和其他蛋白酶质量比为1:100～1:200。
所得到的肽段再采用固定化抗TMT抗体树脂进行样品，将被交联剂修饰的肽段富集下来降低样品复杂度，以便于后续的质谱分析；
还可以通过高pH反相分离或者C18色谱柱进行分级和除盐处理，进一步降低样品复杂度，提高鉴定质量及数目；
处理后的肽段样品进行液相色谱联用质谱分析，质谱分析采集模式为二级质谱，二级质谱碎裂模式为HCD，能量为32％～35％；质谱采集中采集价态为3-12价；离子注入时间为30-50毫秒；
与现有组织样品原位较量方法相比，本发明交联剂具有如下优点：
1.针对组织样品交联前的处理，采用的灌注的方法去除了组织中的血液，以避免血液对交联造成影响。
2.对于交联剂，采用了具有不同臂长，富集基团，高反应活性，且能够进行同位素标记的TBSL(2n+5)系列交联剂，可以实现不同的数据解析需求。
3.对于交联后的组织样品蛋白质提取，选择了低温高速组织研磨仪，在保证蛋白质活性的条件下，高效的将组织蛋白提取出来，组织蛋白提取率20％以上。
4.对于组织蛋白处理方法，采用多种方式中的一种，包括丙酮沉淀，fasp，i-fasp等，可以针对不同量级的交联蛋白质。
5.对于获得的交联蛋白，胰蛋白酶多次平行酶切或者将胰蛋白酶酶切后的样品联合其他蛋白酶进行顺序酶切，以提高酶切效率，减少多级交联的概率，方便后续质谱数据的解析。
6.对于获得的交联肽段，通过高pH反相分离或者C18色谱柱进行分级和除盐处理，进一步降低样品复杂度，提高鉴定质量及数目。
7.对于质谱采集，针对定量等问题，采用HCD的质谱碎裂模式，以及相应质谱能量、价态、离子注入时间等，可以显著提高交联肽段的鉴定数目，获得更多的交联信息。
附图说明
图1为交联剂结构式。
图2为组织样品原位交联流程图。
图3为实施例1中TBSL13细胞原位交联鉴定到的蛋白相互作用网络。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。
实施例1
本实施例公开了小鼠海马体组织样品原位交联分析过程。
(1)深度麻醉/处死小鼠。待小鼠深度麻醉/停止吸呼后，立刻背朝下在解剖台放平小鼠，小心剖开胸腔防止过多出血，小心并迅速切开肋骨，剪去横隔膜，暴露并游离心脏。
(2)经左心室插入灌流针，针头要从心轴方向进针，刺入心尖3～4mm。先灌注无菌生理盐水约40ml,开始灌流后剪破右心耳。
(3)当多数血液已流出后，右心室流出液澄清后，灌流多聚甲醛针管插入左心室，同一进针处，以20ml固定液缓慢灌流小鼠。
(4)灌流后，断头取脑，并剥离海马体，置于1×DPBS缓冲液中并反复冲洗3～5遍。
(5)组织剪将组织剪碎成边长0.5mm的小块，并用～10倍组织体积的1×DPBS缓冲液分散均匀。
(6)加入TBSL13交联剂10mM，25℃，端到端交联60分钟，加入碳酸氢铵溶液至其终浓度为50mM，25℃，端到端终止20分钟。
(7)加入8倍体积4％ SDS(1％全蛋白酶抑制剂cocktail)，使用低温高速组织研磨仪提取蛋白质，温度-40℃，转速4.5m/s，运转60s，休息60s，共20个循环，至样品澄清透明。
(8)使用8倍体积预冷纯丙酮，-20℃过夜沉淀蛋白质。
(9)沉淀后的蛋白使用200～500μL 8M尿素复溶，加入TCEP至终浓度为10mM，37℃，200rpm，还原1小时，再加入IAA至终浓度为20mM，37℃，200rpm，避光烷基化30分钟。
(10)以蛋白:胰酶质量比为50:1的比例，37℃，酶切12小时加6小时。
(11)酶解后的肽段采用固定化抗TMT抗体树脂富集被交联剂修饰的肽段。
(12)以肽段和填料(Durashell C18)质量比为1:100的比例称取填料，400μL甲醇活化填料，400μL A相(98％纯水，2％乙腈，0.1％三氟乙酸，pH 10)平衡填料，将富集后肽段加载到填料上，400μL A相除盐，200μL不同体积浓度B相(98％乙腈，2％纯水，0.1％三氟乙酸，pH 10)分别洗脱富集肽段，流动相B相的体积浓度包括6％，9％，12％，15％，18％，21％，25％，30％，80％，最后将上述样品合并成6个级分，级分1为6％+80％，级分2为9％+30％，级分3为12％+25％，级分4为15％，级分5位18％，级分6为21％。
(13)将得到的6个级分采用离心浓缩机冻干，0.1％甲酸复溶样品，14000rpm离心取上清液用于后续质谱分析。
(14)采用OrtitrapExploris 480高精度质谱仪进行质谱数据采集，质谱采用二级质谱方法，二级质谱碎裂模式为HCD，能量为35％，采集价态为3-12价，离子注入时间为50毫秒。
(15)质谱数据采用pLink 2.0进行解析。
上述数据结果表明，通过使用TBSL13作为化学交联剂对小鼠海马体组织进行原位交联，共鉴定到1656条交联肽段，876种蛋白质，鉴定到的交联蛋白涉及到较多的核糖体蛋白、RNA(DNA)结合蛋白、分子伴侣蛋白、钙离子结合蛋白、肌动蛋白、蛋白因子、生物酶等。KEGG通路分析鉴定到的蛋白与众多神经退行性疾病(如帕金森病、朊病毒病、阿尔兹海默症等)高度相关，并涉及酒精中毒、氧化磷酸化、三羧酸循环等生物化学过程。实现了蛋白质复合物的规模化分析，加深了人们对神经元内蛋白质的组成、功能及参与的生物过程的了解，对于揭示一些重大疾病发生发展的分子机制具有十分重要的意义。
Claims (9)
1.一种组织样品原位交联分析方法：其特征在于，包括以下步骤：
1)组织样品前处理后，加入交联剂溶液进行交联反应，反应结束后，加入终浓度为10～50mM碳酸氢铵溶液终止反应；
2)向步骤1)的终止反应液中加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，使用低温高速组织研磨仪提取组织蛋白质；
3)步骤2)的组织蛋白经丙酮沉淀或者fasp(或者i-fasp)的方式获得不含细胞裂解液和淬灭交联剂的交联蛋白，交联蛋白经变性、还原、烷基化、酶解得到肽段样品；
4)将步骤3)得到的肽段样品进行富集，获得被交联剂修饰的肽段，并进行液相色谱联用质谱分析。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤1)中组织样品取出前进行灌注除血，取出的新鲜组织样品用缓冲液冲洗进一步除血，除血后的组织样品剪碎，均匀分散于缓冲液中；所述缓冲液为：1×磷酸盐缓冲液(DPBS)或1×羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)缓冲液中的一种，pH的范围为7-7.5，组织样品用组织剪剪成边长0.1～0.5cm的小块。
3.按照权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤1)中的交联剂为交联剂TBSL(2n+5)，n为1-5的整数，结构如下：
交联剂碳链长度n为1时，对应的名称为TBSL7；交联剂碳链长度n为2时，对应的名称为TBSL9；交联剂碳链长度n为3时，对应的名称为TBSL11；交联剂碳链长度n为4时，对应的名称为TBSL13；交联剂碳链长度n为5时，对应的名称为TBSL15。
4.按照权利要求1所述的分析方法，其特征在于，将交联剂溶解于DMSO中，形成终浓度为0.1～1M的交联剂溶液，加入组织样品至交联剂终浓度为1～10mM进行组织样品交联反应；20-25℃的温度下，反应30-120分钟；终止反应在20-25℃的温度下，反应10-60分钟。
5.按照权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤2)中加入的细胞裂解液为4％SDS或1-十二烷基-3-甲基咪唑氯盐(C12Im-Cl)离子液体，并加入细胞裂解液体积含量1％的全蛋白酶抑制剂，细胞裂解液的加入量为细胞体积的5-10倍，低温高速组织研磨仪提取蛋白质的条件为：温度-30～-40℃，转速3.5～4.5m/s，运转60s，休息60s，共10～20个循环，至样品澄清透明。
6.按照权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤3)的交联蛋白中加入终浓度为5-8M尿素变性，加入终浓度为10-50mM二硫苏糖醇(DTT)或者三(2-羧乙基)膦(TCEP)还原，加入20-100mM的碘乙酰胺(IAA)烷基化，加入蛋白和蛋白酶质量比为1:50～1:100的蛋白酶进行酶解，得到肽段样品；酶解可以采用胰蛋白酶多次平行酶切或者将胰蛋白酶酶切后的样品联合其他蛋白酶进行顺序酶切，所述其他蛋白酶选自蛋白酶ArgC、LysC、LysN、AspN或GluC中的一种，蛋白和其他蛋白酶质量比为1:100～1:200。
7.按照权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤4)的肽段样品采用固定化抗TMT抗体树脂进行富集，得到被交联剂修饰的肽段，再通过高pH反相分离或者C18色谱柱进行分级或除盐处理，获得待测肽段样品。
8.按照权利要求1所述的分析方法，其特征在于，质谱分析采集模式为二级质谱，二级质谱碎裂模式为HCD，能量为32％～35％；质谱采集价态为3-12价；离子注入时间为30-50毫秒。
9.按照权利要求1所述的分析方法，其特征在于，该方法可用于对组织蛋白进行规模化分析、蛋白质的空间结构解析或构建蛋白质-蛋白质相互作用网络。
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