CN118146930A - 一种基于离心微流控的单盘全提取芯片 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种基于离心微流控的单盘全提取芯片，包括裸片，以及与裸片连接的底板，所述裸片上设有至少一储液腔、液体加样腔、石蜡阀、缓冲腔、硅胶膜区、分选区、废液区、收集腔、至少一测量腔、气溶胶腔、至少一扩增腔；每一所述扩增腔与一测量腔连接，硅胶膜区连接于缓冲腔与分选区之间；每一所述储液腔上还粘结有试剂囊泡，试剂囊泡内装有预置试剂；所述裸片上还设有气路流道、液体流道、虹吸流道；所述收集腔经虹吸流道与测量腔连通。本发明利用离心微流控技术实现上述分子诊断所需流程，以提供快速且精准的检测结果。

Description

一种基于离心微流控的单盘全提取芯片

技术领域

本发明涉及微流控技术领域，尤其涉及一种基于离心微流控的单盘全提取芯片。

背景技术

离心微流控(Centrifugal Microfluidics)是一种微流体操控技术。它利用离心力场的作用，通过旋转平台或芯片，将流体操纵到不同的区域，从而实现样品处理、混合、分选、检测等操作。离心微流控具有结构简单、紧凑、检测快速、低成本和高度集成化等优势。它可以在微量样品下进行多步骤的流程控制，实现样品处理的自动化和高通量操作。离心微流控技术在生物医学、生物分析、环境监测、食品安全等领域具有广泛的应用前景。

PCR(Polymerase Chain Reaction)是一种重要的分子生物学技术，用于在体外扩增特定DNA序列。PCR反应通过反复进行一系列温度循环，包括DNA的变性、引物的结合和DNA的延伸，以产生大量特定的DNA片段。基于PCR扩增的分子诊断是利用PCR技术来特异性扩增目的基因，从而检测内源性(遗传或变异)或外源性(病原体)目的基因的存在与否。PCR分子诊断具有高度敏感性和特异性，能够在短时间内检测到微量的目标基因或DNA序列。它在病原体检测、遗传病诊断、基因突变分析、药物敏感性检测等方面广泛应用。

离心微流控平台可以将分子诊断的一般步骤，包括样本裂解、核酸纯化、PCR反应扩增和荧光信号采集与分析，集成在一个微流控芯片上，从而实现样本进结果出的全自动检测。目前，现有技术存在以下不足之处：

1)传统PCR实验室为减少气溶胶污染，一般采用分区实验室进行核酸提取和扩增，实验室搭建成本大，且需要专业的实验人员进行操作，样本处理分析流程复杂，时间成本和人工成本较高；

2)工作站式PCR仪可实现一体化分子诊断操作，但仪器体积相对较大，仍存在气溶胶污染等风险；

3)现有POCT的分子诊断产品多为卡盒式，组装零件多，需要额外的驱动泵来操控流体，且卡盒式设计难以保证扩增区域多腔室设计的均一性，在超多重检测应用中具有一定的局限性。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于离心微流控的单盘全提取芯片，其利用离心微流控技术实现上述分子诊断所需流程，以提供快速且精准的检测结果。

为实现上述目的，采用以下技术方案：

一种基于离心微流控的单盘全提取芯片，包括裸片，以及与裸片连接的底板，所述裸片上设有至少一储液腔、液体加样腔、石蜡阀、缓冲腔、硅胶膜区、分选区、废液区、收集腔、至少一测量腔、气溶胶腔、至少一扩增腔；每一所述扩增腔与一测量腔连接，硅胶膜区连接于缓冲腔与分选区之间；每一所述储液腔上还粘结有试剂囊泡，试剂囊泡内装有预置试剂；

所述裸片上还设有气路流道、液体流道、虹吸流道；所述气溶胶腔、测量腔、收集腔、分选区、废液区、缓冲腔经气路流道连通；所述液体加样腔、石蜡阀、储液腔、缓冲腔经液体流道连通；所述收集腔经虹吸流道与测量腔连通。

进一步地，所述储液腔内设有尖刺；所述储液腔内还开设有与液体流道连通的流道口。

进一步地，所述测量腔与扩增腔经毛细阀组件连接。

进一步地，所述毛细阀组件包括开设于裸片底部的第一流道和第二流道、开设于裸片顶部的第一通孔和第二通孔，以及覆盖于第一通孔、第二通孔上的采用柔性材料制成的柔性密封膜；所述测量腔经第一流道与第一通孔连通，扩增腔经第二流道与第二通孔连通。

进一步地，所述裸片顶部的边缘处设有槽口，槽口上依次覆盖有粘结层、密封层；所述扩增腔、第一通孔、和第二通孔开设于槽口上；所述底板与裸片的底部连接，底板至少用于将扩增腔的底部、第一流道和第二流道密封。

进一步地，所述裸片上还开设有第一定位孔，底板上与第一定位孔对应处还开设有第二定位孔。

进一步地，所述底板上开设有第一凹槽，第一凹槽位于分选区的正下方并与分选区连通。

进一步地，所述裸片上还设有光电开关口。

进一步地，所述缓冲腔呈倒三角形的漏斗状构造，缓冲腔的漏斗状较小的一端开口经硅胶膜区与分选区连通，缓冲腔的漏斗状较大的一端开口与气路流道、液体流道连通。

进一步地，所述虹吸流道呈“∧”构造。

采用上述方案，本发明的有益效果是：

1)本发明提出一种新型的单盘微流控全提取芯片设计，配合全自动核酸分析仪，可提供快速精准的分子诊断方案，同时，在该设计中，预置试剂采用囊泡式存储方式，极大地保证了试剂存放的稳定性；

2)利用离心力和科式力，通过硅胶膜法对样本进行核酸提取，操作简便，同时确保了提取的效率；

3)扁平式扩增腔设计及柔性层堵膜结构，便于实现稳定快速的核酸扩增；

4)通过各个模块的有效配合，为单样本的超快速分子检测提供解决方案，同时全密封的芯片设计，减小了污染的可能性，且芯片采用多腔室设计，配合3个荧光通道，最多可实现24个指标的同时检测，即使有超多重检测需求，也可进行腔室数量的增加和荧光通道的增加，快速地进行芯片和仪器升级，为多病原体筛查提供可能。

附图说明

图1为本发明的爆炸图；

图2为本发明的结构示意图；

图3为图2省却部分结构的结构示意图；

图4为本发明的底板的结构示意图；

图5为本发明的试剂存储区域的局部放大示意图；

图6为本发明的试剂囊泡的局部剖面图；

图7为本发明的扩增区域的局部放大示意图；

图8为本发明的测量腔、毛细阀组件和扩增腔的局部剖面图；

其中，附图标识说明：

1—裸片；2—底板；3—试剂囊泡；4—密封层；5—粘结层；6—柔性密封膜；101—第一定位孔；102—储液腔；103—液体加样腔；104—石蜡阀；105—缓冲腔；106—硅胶膜区；107—分选区；108—收集腔；109—测量腔；110—扩增腔；111—废液区；112—气溶胶腔；113—光电开关口；114—液体流道；115—气路流道；116—虹吸流道；201—第二定位孔；202—第一凹槽；1021—尖刺；1022—流道口；1101—第一流道；1102—第二流道；1103—第一通孔；1104—第二通孔。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例，对本发明进行详细说明。

参照图1至8所示，本发明提供一种基于离心微流控的单盘全提取芯片，包括裸片1，以及与裸片1连接的底板2，一实施例中，

所述裸片1上设有至少一储液腔102、液体加样腔103、石蜡阀104、缓冲腔105、硅胶膜区106、分选区107、废液区111、收集腔108、至少一测量腔109、气溶胶腔112、至少一扩增腔110；每一所述扩增腔110与一测量腔109连接，硅胶膜区106连接于缓冲腔105与分选区107之间；每一所述储液腔102上还粘结有试剂囊泡3，试剂囊泡3内装有预置试剂；

所述裸片1上还设有气路流道115、液体流道114、虹吸流道116；所述气溶胶腔112、测量腔109、收集腔108、分选区107、废液区111、缓冲腔105经气路流道115连通；所述液体加样腔103、石蜡阀104、储液腔102、缓冲腔105经液体流道114连通；所述收集腔108经虹吸流道116与测量腔109连通。

继续参照图1至8所示，在该实施例中，该芯片整体为一个直径120mm的圆盘，芯片主要包括裸片1和底板2；裸片1可以用高分子材料注塑而成，材料可为聚碳酸酯PC、聚丙烯PP、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA等，或由雕刻机CNC机加而成；底板2和裸片1为同一材料，也可通过注塑或机加而成；两者可用双面胶层进行粘连，也可用激光焊接、热压或超声焊接的方式进行粘连；一般情况下，底板2的材料为透明材料，裸片1可用透明或非透明材料。

芯片的中间区域为试剂存储区，与装有预置试剂的试剂囊泡3通过胶粘的方式粘连；边缘区域为扩增区域，加样后，样本与囊泡内的试剂依次作用，提取出样本内的核酸片段，并在扩增腔110室内进行PCR扩增，最后由荧光检测装置进行信号采集和分析，从而判断样本中是否含有目标基因片段。

在该实施例中，裸片1上还开设有第一定位孔101，底板2上与第一定位孔101对应处还开设有第二定位孔201，第一定位孔101位于裸片1的中心，通过中心的圆孔(第一定位孔101、第二定位孔201)与仪器上的托盘中心固定，电机带动托盘运动，因托盘与单盘芯片相对静止，从而实现对芯片上液体运动的控制。

试剂存储区包括至少一储液腔102、液体加样腔103、石蜡阀104、缓冲腔105、硅胶膜区106、分选区107、废液区111、收集腔108、至少一测量腔109、气溶胶腔112；其中，储液腔102的数量设置为5个(可根据实际使用需求，增加或减少其数量)，5个储液腔102环绕第一定位孔101布置，液体加样腔103和气溶胶腔112位于裸片1中心区域的上方，缓冲腔105和分选区107位于裸片1中心区域的下方，废液区111位于裸片1左方的边缘区域，测量腔109和扩增腔110位于裸片1右方的边缘区域，收集腔108位于测量腔109与分选区107之间；在该实施例中，测量腔109和扩增腔110均设有8个(可根据实际使用需求，增加或减少其数量)，配合四通道光学检测模块，可实现最多32个指标的同时检测，为超多联检的临床应用提供可能。

一实施例中，所述裸片1顶部的边缘处设有槽口，槽口上依次覆盖有粘结层5、密封层4；所述扩增腔110、第一通孔1103、和第二通孔1104开设于槽口上；所述底板2与裸片1的底部连接，底板2至少用于将扩增腔110的底部、第一流道1101和第二流道1102密封；在该实施例中，扩增腔110的上侧由粘接层将密封层4和柔性密封膜6粘连到裸片1上进行密封，下侧由底板2进行密封，同时，裸片1上还设有光电开关口113，以便于对芯片定位。

一实施例中，所述底板2上开设有第一凹槽202，第一凹槽202位于分选区107的正下方并与分选区107连通。当底板2与裸片1粘连后，第一定位孔101与第二定位孔201对齐，并与底部托盘的中间突起结构相扣，同时，仪器顶部中央有下杵装置可压住定位孔位置，使得芯片在动过程中始终与底部托盘保持相对静止；第一凹槽202位于裸片1上的分选区107的正下方，保证硅胶膜出口的液体只在科式力的影响下进行偏转。

一实施例中，所述储液腔102内设有尖刺1021；所述储液腔102内还开设有与液体流道114连通的流道口1022。在该实施例中，试剂囊泡3采用铝箔材料，5个试剂囊泡3分别装有裂解液、蛋白酶K、溶菌酶、清洗液、洗脱液等预置试剂；试剂囊泡3通过胶粘的方式与储液腔102连接，储液腔102内设有尖刺1021和流道口1022；当液体释放时，仪器内的下杵装置挤压试剂囊泡3，试剂囊泡3底面的铝箔被尖刺1021刺破，在离心力的作用下，试剂囊泡3内的液体可通过刺破口进入储液腔102，并通过流道口1022进入缓冲腔105，在该设计中，有一个储液腔102与液体加样腔103连通，可根据不同应用，增加或减小与液体加样腔103连接的储液腔102数量。

同时，在该实施例中，所述缓冲腔105呈倒三角形的漏斗状构造，缓冲腔105的漏斗状较小的一端开口经硅胶膜区106与分选区107连通，缓冲腔105的漏斗状较大的一端开口与气路流道115、液体流道114连通。

测试时，将样本加入液体加样腔103，试剂囊泡3内的试剂释放后进入液体加样腔103与其混合，对样本进行裂解；裂解过程中，底部托盘可升温，加速裂解效率；石蜡阀104的融化温度高于裂解过程的孵育温度，以确保液体加样腔103内的液体在加热过程中不会流出腔室；裂解完成后，底部托盘继续升温至石蜡阀104的熔化温度，电机转动，混合液体在离心力的作用下突破石蜡阀104，通过液体流道114进入缓冲腔105。

缓冲腔105经硅胶膜区106与分选区107相连，液体在进入缓冲腔105后，因电机转动方向和转速的不同，以不同的速度冲刷硅胶膜，并在硅胶膜出口因科式力作用，进行不同角度的偏转；通常情况下，裂解液过膜后，样本中的核酸片被吸附在硅胶模上，分选后，裂解液进入废液腔；清洗液过膜后冲刷硅胶膜上残留的裂解液和其他杂质，分选后，进入废液腔；洗脱液过膜后使得硅胶模上吸附的核酸片段被释放，并携带核酸片段分选后进入收集腔108。

收集腔108与测量腔109通过虹吸流道116(该实施例中，虹吸流道116呈“∧”构造)相连，洗脱液在分选进收集腔108时，电机高速转动，收集腔108的液体始终在最外径的位置，无法进入虹吸流道116的近心端拐点；分选结束后，电机静止，液体因虹吸流道116内的亲水涂层，顺着虹吸流道116经过近心端拐点；电机顺时针低速启动后，收集腔108内的液体则会沿着虹吸流道116进入测量腔109，多余液体进入废液腔。

此外，一实施例中，所述测量腔109与扩增腔110经毛细阀组件连接；所述毛细阀组件包括开设于裸片1底部的第一流道1101和第二流道1102、开设于裸片1顶部的第一通孔1103和第二通孔1104，以及覆盖于第一通孔1103、第二通孔1104上的采用柔性材料制成的柔性密封膜6；所述测量腔109经第一流道1101与第一通孔1103连通，扩增腔110经第二流道1102与第二通孔1104连通。

在洗脱液低速填充满测量腔109后，因测量腔109与扩增腔110之间通过毛细阀组件相连，液体所受离心力不足以突破毛细阀，故无法进入扩增腔110；电机转速提高后，增大的离心力大于毛细阀中的压力，液体突破毛细阀，通过第一流道1101和第一通孔1103，顶开由柔性材料制成的柔性密封膜6，再经过第二通孔1104和第二流道1102，进入扩增腔110。

扩增过程中，仪器内上下两片制冷片夹紧扩增区域，对上层密封层4和下层底板2进行温度控制，实现扩增腔110内核酸序列的快速复制；每次循环结束后，制冷片松开，电机带动芯片转动，四个荧光通道分别进行八个腔室内的荧光信号采集，结束后扩增腔110重新被制冷片夹紧，进行下一轮的扩增循环。

为了保证扩增过程中试剂的密封，上方制冷片上，同时装有八个圆柱体顶杵部件，分别对应扩增区八个柔性层的圆孔位置(柔性密封膜6)，在制冷片夹紧的过程中，顶杵部件会挤压柔性密封膜6，堵住第一通孔1103和第二通孔1104，防止扩增腔110内的试剂逆流回测量腔109；采集荧光信号时，制冷片松开，此时扩增试剂处于延伸阶段，温度较低，扩增腔110内的液体不会逆流，此外，扩增区域的上层密封层4也可通过激光焊接或热压等方式与扩增腔110粘连；扩增区域的柔性层也可采用其他设计，确保液体进入扩增腔110后不会逆流，如石蜡封堵流道等。

下面以一个具体的实施例进行说明：

呼吸道感染是一种常见的健康问题，通常由病毒或细菌引起，影响呼吸道系统的不同部分，包括鼻子、喉咙、气管和肺部。分子诊断具有高度特异性和敏感性，因此，可以快速、准确地确定感染的病原体，而无需依赖于症状或体征。这对于早期治疗和采取必要的控制措施非常重要，以防止感染的传播。

该微流控全提取单盘芯片完全适用于呼吸道病原体的检测，以呼吸道病原体的检测流程为例，其具体检测流程如下：

1)样本(鼻咽拭子或喉咙拭子)通过加样孔进入液体加样腔103中，盖上加样盖，将芯片放入全提取检测仪器中，开始检测；

2)下杵装置挤压裂解液试剂囊泡3，试剂囊泡3刺破后，电机逆时针以2000转/分钟带动芯片，裂解液通过液体流道114进入液体加样腔103，2分钟后，电机停止，裂解液释放结束；

3)电机以200转/分钟带动芯片顺时针和逆时针方向交替转动，每个方向转动时间为5s，持续6个循环，使液体加样腔103内的样本和裂解液可以充分混合；

4)混合完毕后，芯片托盘升温至50℃，电机以500转/分钟逆时针方向转动，持续10分钟，该过程中，液体加样腔103内的样本被孵育裂解；

5)裂解过程结束后，芯片托盘升温至65℃，石蜡阀104融化，电机以3000转/分钟逆时针转动，混合液体通过液体流道114进入缓冲腔105，缓冲腔105出口填充了硅胶膜，用于吸附样本内的核酸，在高速离心力的作用下，混合液体通过硅胶膜，在分选区107内，因科式力作用，向一侧偏转，通过液体流道114进入废液腔，停留在硅胶膜上的核酸待后续的纯化和提取，分选结束后，电机停止；

6)下杵装置挤压装有清洗液的试剂囊泡3，电机以3000转/分钟开始逆时针转动，清洗液经过液体流道114进入缓冲区，冲洗硅胶膜，同样的，在科式力的作用下被分选进入废液腔；冲洗过程中，清洗液可以有效洗涤硅胶模上的残留的裂解液和其他杂质，分选结束后，电机停止。

7)同样的，其余清洗液分别被释放，清洗硅胶膜，最后分选进入废液腔；

8)下杵装置挤压装有洗脱液的试剂囊泡3，电机以3000转/分钟开始顺时针转动，洗脱液经过液体流道114进入缓冲腔105，冲洗硅胶模，此过程中，硅胶模上的核酸片段被洗脱液冲刷带走，经过分选区107偏转后，通过液体流道114进入收集腔108，分选结束后，电机停止；

9)芯片静置30s，收集腔108内的洗脱液在虹吸流道116中亲水材料的作用下，进入虹吸流道116内，并通过虹吸流道116的近心端的位置；

10)电机以600转/分钟带动芯片顺时针转动，收集腔108内的液体陆续通过虹吸流道116进入分发扩增区域，液体依次填满该区域的测量腔109，多余液体进入废液腔内，测量腔109和扩增腔110由毛细阀组件连接，低转速下，液体无法突破毛细阀，故停留在测量腔109内；

11)电机提速至3000转/分钟，测量腔109内的液体在离心力的作用下突破毛细阀进入扩增腔110，分发结束后，电机停止；扩增腔110是内预置了扩增试剂冻干球，液体进入扩增腔110后，与冻干球复溶，形成扩增试剂，测量腔109体积比扩增腔110室略小，液体进入扩增腔110后，冻干球溶解，液体体积增大，最终扩增试剂刚好填满扩增腔110室；

12)电机转动芯片，通过光电开关进行定位，使扩增区域与仪器内制冷片区域重合；电机停止，上下制冷片夹紧扩增区域，开始扩增过程的循环加热，加热过程中，制冷片前端的顶杵结构件抵住扩增区域的圆形柔性层，从而堵住第一通孔1103和第二通孔1104，避免加热过程中的液体流出；

13)每次加热循环结束后，制冷片松开，电机以200转/分钟带动芯片进行转动，三个光学模块分别对扩增腔110室进行荧光信号采集，信号采集技术后，芯片重新定位，制冷片加紧扩增区，重复以上步骤。

以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于离心微流控的单盘全提取芯片，包括裸片，以及与裸片连接的底板，其特征在于，

所述裸片上设有至少一储液腔、液体加样腔、石蜡阀、缓冲腔、硅胶膜区、分选区、废液区、收集腔、至少一测量腔、气溶胶腔、至少一扩增腔；每一所述扩增腔与一测量腔连接，硅胶膜区连接于缓冲腔与分选区之间；每一所述储液腔上还粘结有试剂囊泡，试剂囊泡内装有预置试剂；

所述裸片上还设有气路流道、液体流道、虹吸流道；所述气溶胶腔、测量腔、收集腔、分选区、废液区、缓冲腔经气路流道连通；所述液体加样腔、石蜡阀、储液腔、缓冲腔经液体流道连通；所述收集腔经虹吸流道与测量腔连通。

2.根据权利要求1所述的基于离心微流控的单盘全提取芯片，其特征在于，所述储液腔内设有尖刺；所述储液腔内还开设有与液体流道连通的流道口。

3.根据权利要求1所述的基于离心微流控的单盘全提取芯片，其特征在于，所述测量腔与扩增腔经毛细阀组件连接。

4.根据权利要求3所述的基于离心微流控的单盘全提取芯片，其特征在于，所述毛细阀组件包括开设于裸片底部的第一流道和第二流道、开设于裸片顶部的第一通孔和第二通孔，以及覆盖于第一通孔、第二通孔上的采用柔性材料制成的柔性密封膜；所述测量腔经第一流道与第一通孔连通，扩增腔经第二流道与第二通孔连通。

5.根据权利要求4所述的基于离心微流控的单盘全提取芯片，其特征在于，所述裸片顶部的边缘处设有槽口，槽口上依次覆盖有粘结层、密封层；所述扩增腔、第一通孔、和第二通孔开设于槽口上；所述底板与裸片的底部连接，底板至少用于将扩增腔的底部、第一流道和第二流道密封。

6.根据权利要求1所述的基于离心微流控的单盘全提取芯片，其特征在于，所述裸片上还开设有第一定位孔，底板上与第一定位孔对应处还开设有第二定位孔。

7.根据权利要求1所述的基于离心微流控的单盘全提取芯片，其特征在于，所述底板上开设有第一凹槽，第一凹槽位于分选区的正下方并与分选区连通。

8.根据权利要求1所述的基于离心微流控的单盘全提取芯片，其特征在于，所述裸片上还设有光电开关口。

9.根据权利要求1所述的基于离心微流控的单盘全提取芯片，其特征在于，所述缓冲腔呈倒三角形的漏斗状构造，缓冲腔的漏斗状较小的一端开口经硅胶膜区与分选区连通，缓冲腔的漏斗状较大的一端开口与气路流道、液体流道连通。

10.根据权利要求1所述的基于离心微流控的单盘全提取芯片，其特征在于，所述虹吸流道呈“∧”构造。