CN118141973A - 一种用于止血的可注射水凝胶粘合剂及其制备方法和应用 - Google Patents
一种用于止血的可注射水凝胶粘合剂及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于止血的可注射水凝胶粘合剂及其制备方法和应用。所述可注射水凝胶粘合剂包括由聚(丙烯酰胺‑多巴胺)网络和羧甲基壳聚糖‑氧化透明质酸网络组成的双网络体系。本发明提供的可注射水凝胶粘合剂具有可注射性、强粘附性、优异的力学性能和防术后组织粘连性能，表现出对多种生物组织的强大封闭能力，可实现对多种内脏严重出血的完全封闭止血。并且本发明所提供的水凝胶粘合剂的制备方法简单，成本低廉，该可注射水凝胶粘合剂在严重出血的快速有效止血和伤口的长效防护领域具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种水凝胶粘合剂，具体涉及一种用于止血的可注射水凝胶粘合剂及其制备方法和应用，属于医用高分子生物材料技术领域。
背景技术
血液对机体的基本功能起着重要的作用，因此，血液流失会引起机体一系列功能紊乱。由战争、手术、意外事故、犯罪、灾难造成严重出血会导致极高的死亡率。因此，控制出血在医学领域具有重大的意义，目前大量的研究集中于发展止血技术和止血材料，期望能够更加高效地控制出血。
在止血材料中，对伤口具有封闭作用的止血粘合剂在外伤和手术止血中显示出了独特的优势。目前，临床应用最广泛的商品化止血粘合剂中纤维蛋白胶和氰基丙烯酸酯类粘合剂表现出较好的止血效果。发明名称为“用于大量出血的冻干纤维蛋白封闭剂”，专利申请公布号CN105007841A，专利公开公告时间为2015年10月28日的专利公开了一种冻干的纤维蛋白止血剂，可用于腹部手术切口的封闭剂和止血剂，该止血剂中的纤维蛋白在切口处发生交联形成纤维蛋白胶封闭伤口，纤维蛋白凝块的附着性是其封闭能力的来源。但是纤维蛋白粘合剂的粘合力较弱，难以控制严重出血。且其提取于动物，所以免疫原性和病毒污染一直是其重要问题。保存时间较短同样是其需要解决的问题。
发明名称为“一种抗菌型快速止血医用胶材料及其制备方法”，专利申请公布号CN112316201A，专利公开公告时间为2021年2月5日的专利公开了一种α-氰基丙烯酸酯类快速止血医用胶，该发明所述医用胶材料，以α-氰基丙烯酸正辛酯和α-氰基丙烯酸正丁酯混合物作为基质，结合抗菌材料制备具有抗菌活性的止血医用胶，可适用于多种医用场景。氰基丙烯酸酯类粘合剂存在生物安全性较差的问题，且氰基丙烯酸酯粘合剂与血液混合会形成一层坚硬的凝块，影响机体正常的生理功能或造成不适感。
因此，针对外伤或手术中的严重出血，需要开发出具有粘合力强、安全、对机体正常生理功能产生较小影响的止血用粘合剂。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种用于止血的可注射水凝胶粘合剂及其制备方法，以克服现有技术中的不足。
本发明的另一个目的在于提供所述用于止血的可注射水凝胶粘合剂的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明实施例提供了一种用于止血的可注射水凝胶粘合剂，包括由聚(丙烯酰胺-多巴胺)网络和羧甲基壳聚糖-氧化透明质酸网络组成的双网络体系。
在一些实施例中，所述聚(丙烯酰胺-多巴胺)网络由丙烯酰胺、甲基丙烯酰化多巴胺和双键化γ-聚谷氨酸交联所得。
进一步地，所述羧甲基壳聚糖-氧化透明质酸网络由羧甲基壳聚糖和氧化透明质酸交联所得。
本发明实施例还提供了一种用于止血的可注射水凝胶粘合剂的制备方法，其包括：
将氧化透明质酸、丙烯酰胺、双键化γ-聚谷氨酸、甲基丙烯酰化多巴胺和四甲基乙二胺溶解于液体体系中，制得第一混合液；将羧甲基壳聚糖和过硫酸铵溶解于液体体系中，制得第二混合液；
将所述第一混合液、第二混合液混合成胶，使在四甲基乙二胺催化过硫酸铵产生的自由基引发下，丙烯酰胺、甲基丙烯酰化多巴胺、双键化γ-聚谷氨酸发生自由基聚合反应交联形成聚(丙烯酰胺-多巴胺)网络；羧甲基壳聚糖和氧化透明质酸经席夫碱反应交联形成羧甲基壳聚糖-氧化透明质酸网络；所述聚(丙烯酰胺-多巴胺)网络、羧甲基壳聚糖-氧化透明质酸网络相互交错形成用于止血的可注射水凝胶粘合剂。
本发明实施例还提供了由前述制备方法制得的用于止血的可注射水凝胶粘合剂。
本发明实施例还提供了前述用于止血的可注射水凝胶粘合剂于止血和伤口的防护、组织封闭、药物递送、损伤防护、损伤修复或生物支架等领域中的用途。
较之现有技术，本发明具有的有益效果在于：
1)本发明提供的可注射水凝胶粘合剂的制备方法中，粘合剂组分分装至两支注射器中，用于止血时通过双注射器注射装置直接注射至出血部位进行原位成胶，该制备工艺简单、使用方法简便，且所有组分可使用前现配现用；
2)本发明提供的可注射水凝胶粘合剂具有粘合强度高、力学性能优异和防术后组织粘连效果好的特点。因此，该可注射水凝胶粘合剂对生物组织伤口可实现强大的封闭能力。基于该可注射水凝胶粘合剂上述特征，其应用范围可拓展至组织封闭、药物递送、损伤防护、损伤修复和生物支架等领域；
3)本发明提供的可注射水凝胶粘合剂具有良好的细胞相容性和血液相容性，且由该粘合剂成胶后具有极好的弹性性能，对机体组织和器官的正常功能和生理环境产生较小的影响；
4)本发明提供的可注射水凝胶粘合剂在伤口表面成胶的过程与伤口处组织发生粘合，成胶后未粘合部分完全不表现粘合性，因此，该可注射水凝胶粘合剂可实现内脏外科手术封闭的同时防止组织黏连。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1a是本发明一典型实施例中所述可注射水凝胶粘合剂的双网络合成路线图。
图1b是本发明一典型实施例中所述可注射水凝胶粘合剂的粘合机理图。
图2是本发明一典型实施例中所述可注射水凝胶粘合剂所用交联剂双键化γ-聚谷氨酸的核磁共振氢谱图。
图3为本发明一典型实施例中所述可注射水凝胶粘合剂组分氧化透明质酸的红外光谱图。
图4为本发明一典型实施例中所述可注射水凝胶粘合剂组分甲基丙烯酰化多巴胺核的磁共振氢谱图。
图5为本发明实施例1中所述可注射水凝胶粘合剂的成胶效果图。
图6a为本发明测试例1中所述可注射水凝胶粘合剂的断裂强度测试结果图。
图6b-图6e为本发明测试例2中所述可注射水凝胶粘合剂的循环拉伸应力-应变变化特征图。
图7为本发明测试例3中所述可注射水凝胶粘合剂在猪皮上的搭接剪切测试中的粘合强度测试结果图。
图8a-图8c为本发明测试例4中所述可注射水凝胶粘合剂对猪皮切口的封闭能力测试结果图。
图9为本发明测试例5中所述可注射水凝胶粘合剂对大鼠心脏心室全层损伤出血模型的止血效果图。
具体实施方式
针对现有止血粘合剂存在的粘合力弱、力学性能差和副作用大的问题，本发明提供了一种可注射性、高粘合性和高强韧度的水凝胶粘合剂，本发明通过自由基聚合反应将丙烯酰胺、甲基丙烯酰化多巴胺和双键化γ-聚谷氨酸交联成聚(丙烯酰胺-多巴胺)，通过席夫碱反应将羧甲基壳聚糖和氧化透明质酸交联形成羧甲基壳聚糖-氧化透明质酸网络，两网络间相互交错形成双网络水凝胶粘合剂。该水凝胶粘合剂具有可注射性、强粘附性、优异的力学性能和防术后组织粘连性能，可推广至外伤和外科手术中严重出血的止血。
如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
作为本发明技术方案的一个方面，其所涉及的系一种用于止血的可注射水凝胶粘合剂包括由聚(丙烯酰胺-多巴胺)网络和羧甲基壳聚糖-氧化透明质酸网络组成的双网络体系。
在一些实施例中，所述聚(丙烯酰胺-多巴胺)网络由丙烯酰胺、甲基丙烯酰化多巴胺和双键化γ-聚谷氨酸交联所得。
进一步地，所述羧甲基壳聚糖-氧化透明质酸网络由羧甲基壳聚糖和氧化透明质酸交联所得。
进一步地，所述用于止血的可注射水凝胶粘合剂的成胶时间小于100s。
进一步地，所述用于止血的可注射水凝胶粘合剂的断裂强度达100～160kPa。
进一步地，所述用于止血的可注射水凝胶粘合剂在猪皮表面粘合的剪切强度达20～30kPa。
进一步地，所述用于止血的可注射水凝胶粘合剂粘合完成后非粘合面粘合强度接近0kPa。
请参阅图1a所示，作为本发明技术方案的另一个方面，其所涉及的系一种用于止血的可注射水凝胶粘合剂的制备方法，其包括：
将氧化透明质酸、丙烯酰胺、双键化γ-聚谷氨酸、甲基丙烯酰化多巴胺和四甲基乙二胺溶解于同一液体体系中，制备第一混合液(亦可称为“储备液1”)。将羧甲基壳聚糖和过硫酸铵溶解于同一液体体系中，制备第二混合液(亦可称为“储备液2”)。储备液1与储备液2充分混合成胶得到水凝胶粘合剂。
储备液1与储备液2的混合液中，在四甲基乙二胺催化过硫酸铵产生的自由基引发下，丙烯酰胺、甲基丙烯酰化多巴胺、双键化γ-聚谷氨酸发生自由基聚合反应交联形成聚(丙烯酰胺-多巴胺)网络；
储备液1与储备液2的混合液中，羧甲基壳聚糖和氧化透明质酸经席夫碱反应交联形成羧甲基壳聚糖-氧化透明质酸网络；
使聚(丙烯酰胺-多巴胺)网络、羧甲基壳聚糖-氧化透明质酸网络相互交错形成用于止血的可注射水凝胶粘合剂。
在一些实施例中，所述的双键化γ-聚谷氨酸(交联剂)的制备方法包括：在2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液中，经1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺活化的γ-聚谷氨酸与3-(氨基丙基)甲基丙烯酰胺发生酰胺化反应，制得双键化γ-聚谷氨酸。
进一步地，所述γ-聚谷氨酸的数均分子量大于1000kDa。
进一步地，所述酰胺化反应均在室温下进行完成。
进一步地，所述2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液的pH值为5～6。
进一步地，所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺与γ-聚谷氨酸分子中的羧基的摩尔比为(0.5～1.5):(0.5～1.5):(0.5～1.5)。
进一步地，所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺对γ-聚谷氨酸分子中的羧基的活化时间为10～60min。
进一步地，所述γ-聚谷氨酸与3-(氨基丙基)甲基丙烯酰胺的酰胺化反应的时间为9～18h。
在一些实施例中，所述的氧化透明质酸的制备方法包括：在避光条件下，将透明质酸溶于水(优选去离子水)中，搅拌溶解后加入高碘酸钠，发生氧化反应，制得所述氧化透明质酸。
进一步地，所述透明质酸的分子量大于1000kDa。
进一步地，所述透明质酸于水中进行搅拌溶解的时间为6～18h。
进一步地，所述高碘酸钠的浓度为0.25～0.85mol/L。
进一步地，所述透明质酸的浓度为1～5wt％。
进一步地，所述高碘酸钠与透明质酸的用量比例为(0.0005-0.0035)mol:(0.5-1.5)g透明质酸。
进一步地，，所述反应在避光条件下进行。
进一步地，所述氧化反应的时间1～2h，氧化反应的温度为25～35℃。
进一步地，所述高碘酸钠对透明质酸的氧化反应由丙三醇淬灭，丙三醇用量为总体积的0.05％。
在一些实施例中，所述的甲基丙烯酰化多巴胺的制备方法包括：在氮气保护下，将多巴胺溶解于硼酸钠-碳酸氢钠缓冲液中，逐滴加入甲基丙烯酸酐，在室温下反应6-15h，制得甲基丙烯酰化多巴胺。其中，儿茶酚基的引入方式为甲基丙烯酰化多巴胺参与丙烯酰胺的自由基聚合过程。
进一步地，所述甲基丙烯酰化多巴胺的制备反应在氮气保护下进行，所述用于配制缓冲溶液的去离子水经煮沸去除其中氧气。
进一步地，所述甲基丙烯酰化多巴胺的制备反应全程在室温下进行。
进一步地，所述硼酸钠-碳酸氢钠缓冲液中硼酸钠的浓度为5～20wt％，碳酸氢钠的浓度为2～8wt％，多巴胺的浓度为2～8wt％。
进一步地，所述甲基丙烯酸酐与多巴胺的摩尔比为(0.5～1.5):(0.5～1.5)。
进一步地，所述甲基丙烯酸酐和多巴胺反应10～14h后，所得反应液需经2mol/L的盐酸溶液调节至pH＝1-3，然后依次经乙酸乙酯萃取、无水硫酸钠干燥、浓缩、正己烷沉淀、乙酸乙酯重结晶，即得甲基丙烯酰化多巴胺。
作为优选方案之一，所述可注射水凝胶粘合剂的制备方法包括以下步骤：
(1)将双网络组分分装至两支注射器中，一支注射器中含有丙烯酰胺(500μL，27wt.％)、双键化γ-聚谷氨酸(100μL，0.75wt.％)、甲基丙烯酰化多巴胺(100μL)、四甲基乙二胺(5μL)和氧化透明质酸(250μL，6wt.％)，得到储备液1。另一支注射器含有羧甲基壳聚糖(250μL，6wt.％)和过硫酸铵(100μL)，得到储备液2。
(2)将步骤(1)中所制备的储备液1和储备液2充分混合并注射至指定位置即可形成水凝胶粘合剂。
进一步地，所述丙烯酰胺、甲基丙烯酰化多巴胺与双键化γ-聚谷氨酸交联剂的质量比为(135～270)：(0.25～1)：(0.5～1.5)。
进一步地，所述甲基丙烯酰化多巴胺在储备液1和储备液2的混合液中的浓度为0.05wt％～0.2wt％，例如具体可以是0.05wt％、0.1wt％、0.15wt％和0.2wt％等。
进一步地，所述甲基丙烯酰化多巴胺的浓度为0.05wt％～0.2wt％，例如具体可以是0.05wt％、0.1wt％、0.15wt％和0.2wt％等，分别对应过硫酸铵与甲基丙烯酰化多巴胺的摩尔比为25:1、15.5:1、10:1和6.5:1时，该可注射水凝胶粘合剂的成胶时间<100s。
进一步地，所述组分均是溶解于D-Hanks缓冲溶液，D-Hanks缓冲溶液的pH值为7.4。
进一步地，所述自由基聚合反应的温度为25～40℃，时间为0.3～5min。
进一步地，所述羧甲基壳聚糖与氧化透明质酸的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)。
进一步地，所述席夫碱反应的温度为25～40℃，时间为0.3～5min。
综上所述，本发明提供的可注射水凝胶粘合剂制备方法中，粘合剂组分分装至两支注射器中，用于止血时通过双注射器注射装置直接注射至出血部位进行原位成胶，该制备工艺简单、使用方法简便，且所有组分可使用前现配现用。
本发明实施例的另一个方面还提供了由前述制备方法制得的用于止血的可注射水凝胶粘合剂。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述用于止血的可注射水凝胶粘合剂于止血和伤口的防护、组织封闭、药物递送、损伤防护、损伤修复或生物支架等领域中的用途。
藉由上述技术方案，本发明提供的可注射水凝胶粘合剂具有粘合强度高、力学性能优异和防术后组织粘连效果好的特点。因此，该可注射水凝胶粘合剂对生物组织伤口可实现强大的封闭能力。基于该可注射水凝胶粘合剂上述特征，其应用范围可拓展至组织封闭、药物递送、损伤防护、损伤修复和生物支架等领域。
同时，本发明提供的可注射水凝胶粘合剂具有良好的细胞相容性和血液相容性，且由该粘合剂成胶后具有极好的弹性性能，对机体组织和器官的正常功能和生理环境产生较小的影响。
进一步地，本发明所提供的可注射水凝胶粘合剂在伤口表面成胶的过程与伤口处组织发生粘合，成胶后未粘合部分完全不表现粘合性，因此，该可注射水凝胶粘合剂可实现内脏外科手术封闭的同时防止组织黏连，其粘合机理请参阅图1b所示。
下面结合若干优选实施例及附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。需要注意的是，以下制备例和实施例中所采用的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法，制备例和实施例中所使用的试剂，若无特说明，均为常规试剂商供应的试剂。
实施例1
本制备例提供一种可注射水凝胶粘合剂，所述可注射水凝胶粘合剂的制备方法包括以下步骤：
1.双键化γ-聚谷氨酸交联剂的制备方法包括以下步骤：
(1)称取0.1gγ-聚谷氨酸(γ-PGA)溶解于10mL 2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液(MES,0.1M)缓冲溶液(pH＝5)中，然后向溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，0.093g)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC，0.096g)，室温下搅拌10min活化羧基；
(2)向步骤(1)中溶液加入N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺(APMA，0.1g)，室温下搅拌9h；
(3)将步骤(2)所得反应液转移至透析袋中(8000～14000Da)，室温下透析3天；
(4)将步骤(3)所得透析液于-20℃环境冷冻12h，使用冷冻干燥浓缩设备(Alpha4Dplus)进行冷冻干燥，得到双键化γ-PGA。
如图2所示，成功地将双键引入γ-PGA分子中，其化学反应式如下所示：
2.氧化透明质酸的制备方法包括以下步骤：
(1)将2.5g透明质酸钠溶解在去离子H2O(250mL)中，25℃水浴搅拌过夜使透明质酸完全溶解；
(2)在不断搅拌下向步骤(1)的透明质酸溶液中逐滴加入高碘酸钠(3mL 0.25M)，避光，在25℃水浴和搅拌条件下反应1h；
(3)向步骤(2)所得反应液中逐滴加入丙三醇(最终浓度为0.01％，v/v)以终止氧化反应。
(4)将步骤(3)所得反应液转移至透析袋(8000～14000Da)，室温下透析3天；
(5)对步骤(4)透析液进行冷冻干燥，即获得氧化的透明质酸(OHA)。
如图3所示，成功地在透明质酸分子中引入了醛基，其化学反应式如下所示：
3.甲基丙烯酰化多巴胺的制备方法包括以下步骤：
(1)将硼酸钠(0.5g)和碳酸氢钠(200mg)溶解在去氧去离子H2O(10mL)中，然后在氮气保护下加入盐酸多巴胺(0.2g)，室温下搅拌溶解；
(2)使用注射器向步骤(1)所得溶液中滴加甲基丙烯酸酐(0.188mL)，室温下搅拌过夜；
(3)用稀盐酸溶液(2M)将步骤(2)所得反应液调节至pH＝1；
(4)步骤(3)所得反应液依次经乙酸乙酯萃取、无水硫酸钠干燥、浓缩、正己烷沉淀、乙酸乙酯重结晶，得到甲基丙烯酰化多巴胺(DA-MA)。
如图4所示，成功的制备出甲基丙烯酰化多巴胺，其化学反应式如下所示：
4.将以上制备的产物双键化γ-聚谷氨酸、氧化透明质酸、甲基丙烯酰化多巴胺，与其他可注射水凝胶粘合剂组分分装至两支注射器中，将两支注射器中的组分充分混合即注射至指定位置即得到水凝胶粘合剂。具体步骤如下：
(1)将双网络组分分装至两支注射器中，一支注射器中含有丙烯酰胺(500μL，27wt％)、双键化γ-聚谷氨酸(100μL，0.5wt％)、甲基丙烯酰化多巴胺(100μL，0.05％)、四甲基乙二胺(3μL)和氧化透明质酸(250μL，4wt％)，得到储备液1。另一支注射器含有羧甲基壳聚糖(250μL，4wt％)和过硫酸铵(100μL)，得到储备液2。在四甲基乙二胺催化过硫酸铵产生的自由基引发下，丙烯酰胺、甲基丙烯酰化多巴胺、双键化γ-聚谷氨酸发生自由基聚合反应交联形成聚(丙烯酰胺-多巴胺)网络，所述自由基聚合反应的温度为25℃，时间为5min；羧甲基壳聚糖和氧化透明质酸经席夫碱反应交联形成羧甲基壳聚糖-氧化透明质酸网络，所述席夫碱反应的温度为25℃，时间为5min。
其中，过硫酸铵与甲基丙烯酰化多巴胺的摩尔比为25:1，水凝胶粘合剂的成胶时间<100s，适合用于止血。
(2)将步骤(1)中所制备的储备液1和储备液2充分混合并注射至指定位置即可形成水凝胶粘合剂，如图5所示。
实施例2
本制备例提供一种可注射水凝胶粘合剂，所述可注射水凝胶粘合剂的制备方法包括以下步骤：
1.双键化γ-聚谷氨酸交联剂的制备方法包括以下步骤：
(1)称取0.1gγ-PGA溶解于10mL 2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液(MES,0.1M)缓冲溶液(pH＝6)中，然后向溶液中加入NHS 0.279g和EDC 0.288g，室温下搅拌60min活化羧基；
(2)向步骤(1)中溶液加入APMA0.1g，室温下搅拌18h；
(3)将步骤(2)所得反应液转移至透析袋中(8000～14000Da)，室温下透析3天；
(4)将步骤(3)所得透析液于-20℃环境冷冻12h，使用冷冻干燥浓缩设备(Alpha4Dplus)进行冷冻干燥，得到双键化γ-PGA。
2.氧化透明质酸的制备方法包括以下步骤：
(1)将2.5g透明质酸钠溶解在去离子H2O(250mL)中，35℃水浴搅拌过夜使透明质酸完全溶解；
(2)在不断搅拌下向步骤(1)的透明质酸溶液中逐滴加入高碘酸钠(3mL 0.85M)，避光，在35℃水浴和搅拌条件下反应2h；
(3)向步骤(2)所得反应液中逐滴加入丙三醇(最终浓度为0.1％，v/v)以终止氧化反应。
(4)将步骤(3)所得反应液转移至透析袋(8000～14000Da)，室温下透析3天；
(5)对步骤(4)透析液进行冷冻干燥，即获得OHA。
3.甲基丙烯酰化多巴胺的制备方法包括以下步骤：
(1)将硼酸钠(2g)和碳酸氢钠(800mg)溶解在去氧去离子H2O(10mL)中，然后在氮气保护下加入盐酸多巴胺(0.8g)，室温下搅拌溶解；
(2)使用注射器向步骤(1)所得溶液中滴加甲基丙烯酸酐(0.725mL)，室温下搅拌过夜；
(3)用稀盐酸溶液(2M)将步骤(2)所得反应液调节至pH＝3；
(4)步骤(3)所得反应液依次经乙酸乙酯萃取、无水硫酸钠干燥、浓缩、正己烷沉淀、乙酸乙酯重结晶，得到DA-MA。
4.将以上制备的产物双键化γ-聚谷氨酸、氧化透明质酸、甲基丙烯酰化多巴胺，与其他可注射水凝胶粘合剂组分分装至两支注射器中，将两支注射器中的组分充分混合即注射至指定位置即得到水凝胶粘合剂。具体步骤如下：
(1)将双网络组分分装至两支注射器中，一支注射器中含有丙烯酰胺(500μL，54wt％)、双键化γ-聚谷氨酸(100μL，1wt％)、甲基丙烯酰化多巴胺(100μL，0.2％)、四甲基乙二胺(7μL)和氧化透明质酸(250μL，8wt％)，得到储备液1。另一支注射器含有羧甲基壳聚糖(250μL，8wt％)和过硫酸铵(100μL)，得到储备液2。另一支注射器含有羧甲基壳聚糖(250μL，4wt％)和过硫酸铵(100μL)，得到储备液2。在四甲基乙二胺催化过硫酸铵产生的自由基引发下，丙烯酰胺、甲基丙烯酰化多巴胺、双键化γ-聚谷氨酸发生自由基聚合反应交联形成聚(丙烯酰胺-多巴胺)网络，所述自由基聚合反应的温度为40℃，时间为0.3min；羧甲基壳聚糖和氧化透明质酸经席夫碱反应交联形成羧甲基壳聚糖-氧化透明质酸网络，所述席夫碱反应的温度为40℃，时间为0.3min。
其中，过硫酸铵与甲基丙烯酰化多巴胺的摩尔比为6.5:1，水凝胶粘合剂的成胶时间<100s，适合用于止血。
(2)将步骤(1)中所制备的储备液1和储备液2充分混合并注射至指定位置即可形成水凝胶粘合剂。
实施例3
本制备例提供一种可注射水凝胶粘合剂，所述可注射水凝胶粘合剂的制备方法包括以下步骤：
1.双键化γ-聚谷氨酸交联剂的制备方法包括以下步骤：
(1)称取0.1gγ-PGA溶解于10mL 2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液(MES,0.1M)缓冲溶液(pH＝5.5)中，然后向溶液中加入NHS 0.186g和EDC 0.192g，室温下搅拌30min活化羧基；
(2)向步骤(1)中溶液加入APMA0.138g，室温下搅拌12h；
(3)将步骤(2)所得反应液转移至透析袋中(8000～14000Da)，室温下透析3天；
(4)将步骤(3)所得透析液于-20℃环境冷冻12h，使用冷冻干燥浓缩设备(Alpha4Dplus)进行冷冻干燥，得到双键化γ-PGA。
2.氧化透明质酸的制备方法包括以下步骤：
(1)将5g透明质酸钠溶解在去离子H2O(250mL)中，30℃水浴搅拌过夜使透明质酸完全溶解；
(2)在不断搅拌下向步骤(1)的透明质酸溶液中逐滴加入高碘酸钠(3mL 0.5M)，避光，在30℃水浴和搅拌条件下反应1.5h；
(3)向步骤(2)所得反应液中逐滴加入丙三醇(最终浓度为0.05％，v/v)以终止氧化反应。
(4)将步骤(3)所得反应液转移至透析袋(8000～14000Da)，室温下透析3天；
(5)对步骤(4)透析液进行冷冻干燥，即获得OHA。
3.甲基丙烯酰化多巴胺的制备方法包括以下步骤：
(1)将硼酸钠(1g)和碳酸氢钠(400mg)溶解在去氧去离子H2O(10mL)中，然后在氮气保护下加入盐酸多巴胺(0.5g)，室温下搅拌溶解；
(2)使用注射器向步骤(1)所得溶液中滴加甲基丙烯酸酐(0.47mL)，室温下搅拌过夜；
(3)用稀盐酸溶液(2M)将步骤(2)所得反应液调节至pH＝2；
(4)步骤(3)所得反应液依次经乙酸乙酯萃取、无水硫酸钠干燥、浓缩、正己烷沉淀、乙酸乙酯重结晶，得到DA-MA。
4.将以上制备的产物双键化γ-聚谷氨酸、氧化透明质酸、甲基丙烯酰化多巴胺，与其他可注射水凝胶粘合剂组分分装至两支注射器中，将两支注射器中的组分充分混合即注射至指定位置即得到水凝胶粘合剂。具体步骤如下：
(1)将双网络组分分装至两支注射器中，一支注射器中含有丙烯酰胺(500μL，27wt％)、双键化γ-聚谷氨酸(100μL，0.75wt％)、甲基丙烯酰化多巴胺(100μL，0.1％)、四甲基乙二胺(5μL)和氧化透明质酸(250μL，6wt％)，得到储备液1。另一支注射器含有羧甲基壳聚糖(250μL，6wt％)和过硫酸铵(100μL)，得到储备液2。另一支注射器含有羧甲基壳聚糖(250μL，4wt％)和过硫酸铵(100μL)，得到储备液2。在四甲基乙二胺催化过硫酸铵产生的自由基引发下，丙烯酰胺、甲基丙烯酰化多巴胺、双键化γ-聚谷氨酸发生自由基聚合反应交联形成聚(丙烯酰胺-多巴胺)网络，所述自由基聚合反应的温度为30℃，时间为3min；羧甲基壳聚糖和氧化透明质酸经席夫碱反应交联形成羧甲基壳聚糖-氧化透明质酸网络，所述席夫碱反应的温度为30℃，时间为2min。
其中，过硫酸铵与甲基丙烯酰化多巴胺的摩尔比为15.5:1，水凝胶粘合剂的成胶时间<100s，适合用于止血。
(2)将步骤(1)中所制备的储备液1和储备液2充分混合并注射至指定位置即可形成水凝胶粘合剂。
测试例1
评价实施例3制备得到的可注射水凝胶粘合剂的力学强度。
评价方法：将实施例1制备得到的储备液1和储备液2充分混合(约1.5mL)浇筑至聚四氟乙烯模具中，室温下放置10min成胶，便制备出规格为长3.5cm，宽1cm，厚0.25cm的水凝胶粘合剂。4℃环境保存24h。使用材料试验机(Instron 3365)进行拉伸实验，测试条件：传感器量程10N，夹具间距离1.5cm，拉伸速度10mm/min。水凝胶粘合剂断裂时的强度即为断裂强度。
性能表征：如图6a所示，水凝胶粘合剂中，甲基丙烯酰化多巴胺的浓度为0.05％时，水凝胶粘合剂断裂强度最高，然后随甲基丙烯酰化多巴胺浓度的增加，水凝胶粘合剂的断裂强度逐渐下降。
测试例2
评价实施例3制备得到的可注射水凝胶粘合剂的弹性性能。
评价方法：水凝胶粘合剂的样品制备和处理方法与实施例2相同，测试条件为：传感器量程10N，夹具间距离1.5cm，拉伸速度25mm/min，拉伸应变为100％，然后恢复至原长度，为一个循环，每个样品进行10个循环。根据应力应变的特征评价其弹性。
性能表征：如图6b所示，粘合性水凝胶在10次拉伸循环中应力随应变变化的特征曲线稳定，各个循环间无明显的应力损耗，说明该发明所提供的粘合性水凝胶具有优异的弹性性能。
测试例3
评价实施例3制备得到的可注射水凝胶粘合剂对猪皮的粘合性能。
评价方法：采用搭接剪切实验对其粘合性水凝胶的粘合性能进行评价。将新鲜猪皮切割成长5.5cm，宽1cm的长条状。将两片猪皮以长3.5cm，宽1cm的接触面积搭接在一起，两片猪皮接触面以水凝胶粘合剂进行粘合连接，粘合剂规格为长3.5cm，宽1cm，厚0.25cm。将未猪皮未搭接部分固定在材料机夹具上。使用10N传感器，以10mm/min的恒定拉伸速度进行测试。剪切强度通过最大载荷力除以粘附面积来确定。搭接剪切强度通过一下公式进行计算：Shear strength＝FL/(w×l)，其中FL为拉伸过程中最大载荷力，w和l分别为猪皮和水凝胶粘合剂粘合面的宽和长。
性能表征：如图7所示，在水凝胶体系中引入甲基丙烯酰化多巴胺后，其粘合能力显著增强，其中甲基丙烯酰化多巴胺浓度为0.05％时显示出最大的剪切强度27.5kPa。说明甲基丙烯酰化多巴胺的引入成功地赋予了DNAH粘合能力。
测试例4
评价实施例3制备得到的可注射水凝胶粘合剂对猪皮切口的封闭能力。
评价方法：选用甲基丙烯酰胺多巴胺浓度为0.05％的水凝胶粘合剂进行爆破压力测试。将猪皮切割成直径12.5cm的圆形，以外表面朝向外侧的形式固定在测试装置上。在猪皮表面做一个长8mm的切口，保持表面湿润。然后将实施例1中所述储备液1与储备液2充分混合，混合液总体积1305μL注射至切口处，使混合液完全覆盖切口形成厚4mm的水凝胶粘合剂。在水凝胶粘合剂成胶后测量爆破压力。压力下降前的峰值压力被视为爆破压力。使用纤维蛋白胶(浙江赛灵特医药科技有限公司)和氰基丙烯酸酯粘合剂(广州白云医用胶有限公司)作为对照组，纤维蛋白胶测试参数和条件与水凝胶粘合剂组相同；氰基丙烯酸酯粘合剂使用量为250μL，其他测试参数与条件与水凝胶粘合剂组相同。
性能表征：如图8a、图8b、图8c所示，水凝胶粘合剂的爆破压力(286.5±37.3mmHg)明显高于纤维蛋白胶(79.7±11.2mmHg)和氰基丙烯酸酯粘合剂(2±0.9mmHg)，且明显高于人体心脏正常收缩压(120mmHg)。所述爆破压力测试结果表明水凝胶粘合剂的封闭能力完全满足人体止血要求。
测试例5
评价实施例3制备得到的可注射水凝胶粘合剂对大鼠心脏心室全层损伤出血模型的止血能力。
评价方法：选用甲基丙烯酰胺多巴胺浓度为0.05％的水凝胶粘合剂对大鼠心脏心室全层损伤出血模型进行止血。腹腔注射戊巴比妥钠溶液(1％，wt.％)对SD大鼠(220-250g)进行麻醉处理(50mg/kg)。麻醉后将大鼠以仰卧位固定，去除大鼠胸腹部的鼠毛。对大鼠进行开胸手术爆露心脏。用镊子去除心包膜。使用直径为1.2mm的打孔器对左心室或右心室壁进行打孔，打孔直径为1.2mm，建立大鼠心室全层损伤出血模型。模型建立后，立即将实施例1中的储备液1和储备液2的混合液1mL缓慢注射至出血部位，直至伤口完全止血；纤维蛋白胶组使用专用注射装置将纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液同时注射至伤口部位，用量以完全止血为标准；氰基丙烯酸酯粘合剂组，使用移液枪吸取250μL粘合剂，缓慢滴加至出血部位。比较各组止血效果。
性能表征：如图9所示，三种粘合剂均可实现对大鼠心室全层损伤出血模型的止血，水凝胶粘合剂在心脏表面形成一层薄薄的凝胶层，且水凝胶粘合剂具有较好的弹性，故对心脏的功能和生理环境产生较小的影响；氰基丙烯酸酯粘合剂在心脏表面结成硬块影响心脏正常功能，纤维蛋白胶在心脏表面形成大体积血液凝块，增加失血量且大体积凝块会影响心脏的正常功能。所以水凝胶粘合剂在严重出血的控制中具有更大的应用潜力。
对照例1
与实施例3相比，本对照例缺少储备液2。所获产物表现为液体状态，无法成胶，对生物组织亦不表现粘合性。
对照例2
与实施例3相比，本对照例的储备液1中缺少丙烯酰胺。所获水凝胶粘合剂力学强度和弹性性能较差，对生物组织亦不表现粘合性。
对照例3
与实施例3相比，本对照例的储备液1中缺少双键化γ-聚谷氨酸。所获水凝胶粘合剂的力学强度有所下降。
对照例4
与实施例3相比，本对照例的储备液1中缺少甲基丙烯酰化多巴胺。所获水凝胶粘合剂无粘合性。
对照例5
与实施例3相比，本对照例的储备液1中缺少氧化透明质酸，储备液2中缺少羧甲基壳聚糖。所获水凝胶粘合剂弹性性能较差，对湿组织的粘合性能下降。
对照例6
与实施例3相比，本对照例的储备液1中缺少丙烯酰胺、甲基丙烯酰化多巴胺和双键化聚谷氨酸。所获水凝胶粘合剂力学强度、弹性性能较差，对生物组织不表现粘合性。
此外，本案发明人还参照实施例1-3的方式，以本说明书中列出的其它原料和条件等进行了试验，并同样制得了性能基本一致的用于止血的可注射水凝胶粘合剂。
应当理解，以上所述实例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (12)
1.一种用于止血的可注射水凝胶粘合剂，其特征在于，包括由聚(丙烯酰胺-多巴胺)网络和羧甲基壳聚糖-氧化透明质酸网络组成的双网络体系。
2.根据权利要求1所述的用于止血的可注射水凝胶粘合剂，其特征在于：所述聚(丙烯酰胺-多巴胺)网络由丙烯酰胺、甲基丙烯酰化多巴胺和双键化γ-聚谷氨酸交联所得；和/或，所述羧甲基壳聚糖-氧化透明质酸网络由羧甲基壳聚糖和氧化透明质酸交联所得；
和/或，所述用于止血的可注射水凝胶粘合剂的成胶时间小于100s；
和/或，所述用于止血的可注射水凝胶粘合剂的断裂强度为100～160kPa；
和/或，所述用于止血的可注射水凝胶粘合剂在猪皮表面粘合的剪切强度为20～30kPa。
3.一种用于止血的可注射水凝胶粘合剂的制备方法，其特征在于，包括：
将氧化透明质酸、丙烯酰胺、双键化γ-聚谷氨酸、甲基丙烯酰化多巴胺和四甲基乙二胺溶解于液体体系中，制得第一混合液；将羧甲基壳聚糖和过硫酸铵溶解于液体体系中，制得第二混合液；
将所述第一混合液、第二混合液混合成胶，使在四甲基乙二胺催化过硫酸铵产生的自由基引发下，丙烯酰胺、甲基丙烯酰化多巴胺、双键化γ-聚谷氨酸发生自由基聚合反应交联形成聚(丙烯酰胺-多巴胺)网络；羧甲基壳聚糖和氧化透明质酸经席夫碱反应交联形成羧甲基壳聚糖-氧化透明质酸网络；所述聚(丙烯酰胺-多巴胺)网络、羧甲基壳聚糖-氧化透明质酸网络相互交错形成用于止血的可注射水凝胶粘合剂。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，包括：在2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液中，经1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺活化的γ-聚谷氨酸与3-(氨基丙基)甲基丙烯酰胺发生酰胺化反应，制得双键化γ-聚谷氨酸。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述γ-聚谷氨酸的数均分子量大于1000kDa；和/或，所述酰胺化反应在室温下进行；和/或，所述2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液的pH值为5～6；和/或，所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺与γ-聚谷氨酸分子中的羧基的摩尔比为(0.5～1.5):(0.5～1.5):(0.5～1.5)；
和/或，所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺对γ-聚谷氨酸分子中的羧基的活化时间为10～60min；
和/或，所述酰胺化反应的时间为9～18h。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，包括：在氮气保护下，将多巴胺溶解于硼酸钠-碳酸氢钠缓冲液中，逐滴加入甲基丙烯酸酐，在室温下反应6-15h，制得甲基丙烯酰化多巴胺。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述硼酸钠-碳酸氢钠缓冲液中硼酸钠的浓度为5～20wt％，碳酸氢钠的浓度为2～8wt％，多巴胺的浓度为2～8wt％；
和/或，所述甲基丙烯酸酐与多巴胺的摩尔比为(0.5～1.5):(0.5～1.5)。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，包括：在避光条件下，将透明质酸溶于水中，搅拌溶解后加入高碘酸钠，发生氧化反应，制得所述氧化透明质酸。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述透明质酸的数均分子量大于1000kDa；和/或，所述搅拌溶解的时间为6～18h；和/或，所述高碘酸钠的浓度为0.25～0.85mol/L；和/或，所述透明质酸的浓度为1～5wt％；和/或，所述高碘酸钠与透明质酸的用量比例为(0.0005～0.0035)mol:(0.5～1.5)g；
和/或，所述氧化反应的时间1～2h，氧化反应的温度为25～35℃。
10.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述丙烯酰胺、甲基丙烯酰化多巴胺与双键化γ-聚谷氨酸交联剂的质量比为(135～270)：(0.25～1)：(0.5～1.5)；
和/或，所述自由基聚合反应的温度为25～40℃，时间为0.3～5min；
和/或，所述羧甲基壳聚糖与氧化透明质酸的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；
和/或，所述席夫碱反应的温度为25～40℃，时间为0.3～5min。
11.由权利要求3-10中任一项所述制备方法制得的用于止血的可注射水凝胶粘合剂。
12.权利要求1-2、11中任一项所述用于止血的可注射水凝胶粘合剂于止血和伤口的防护、组织封闭、药物递送、损伤防护、损伤修复或生物支架领域中的用途。
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